우리는 박사 앤드류 홀랜더, 사라 데이비스, 리 Shuman, 팀 젠킨스와 전문가 도움 박사 Xiangsheng 슈에 감사하고 있습니다. 우리는 박사 앤 케네디의 지원을 인정합니다. BCB는 방사선 생물학 교육 기금 C5T32CA009677에서 지원되었습니다. JFD는 의료 과학자 (1006792)에 대한 버로우즈 웰컴 경력 상에 지원되었다. JLB은 슈퍼 히어로 부여 (5 R25 CA140116-03)에서 지원되었습니다. 우리는 그의 격려와 지원을 우리의 연구가 가능하게 도움이되었습니다 박사 스티브 돼야 해 한이을 인정하고 싶습니다. 우리는 또한 격려와 도움이 의견 펜실베니아 나노 바이오 인터페이스 센터 (NBIC) 및 박사 데니스 Discher 대학을 감사드립니다. 우리는 자신의 MRI 및 광학 / Bioluminescence 핵심 시설 사용을 위해 펜실베니아 대학에서 소형 동물 이미징 시설 (사이프)을 인정합니다. 이 기술은 국립 보건원 (RC1 CA145075 및 K08 NS076548 -에 의해 지원 된 프로젝트의 일환으로 개발01).

A. 사전 수술 종양 세포 준비 <ol><li> lentiviral 발현 벡터 (pGreenFire, 시스템 Biosciences)와 Transduce U251 glioblastoma multiforme의 전지는 안정적 반딧불의 루시 페라 제 유전자를 표현합니다. </li><li> 이러한 세포 10 % 소 태아 혈청, 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신과에 잠복기가 T75 조직 배양 플라스크에 1퍼센트 불필요한 아미노산을 보충 DMEM으로 구성 이글 배지 (DMEM)의 전체 Dulbecco의 수정의 10 ML에서 재배 된 5% C0 2, 37 ° C. </li><li> 표준 세포 배양을 수행 인산염으로 세포를 세척으로 시작하는 생리 (PBS)는 trypsinizing 다음 버퍼. </li><li> 전체 DMEM으로 트립신을 해소, 50 ML 원뿔 플라스크에 솔루션을 전송하고 보습 바로 앞에 달린 풀 베는 날 카운터를 사용하여 세포 농도를 결정한다. </li><li> 분당 약 3,000 회전에서 3 분에 완료 DMEM에서 수확 한 세포를 원심 분리기. </li><li> 원심 분리 후, 중 대기음50 ML 원뿔 플라스크의 하단에있는 세포 만 펠렛을 떠날 F 미디어. </li><li> 신선한 완료 DMEM의 볼륨에서 셀을 다시 일시 중지 50,000 세포 / μl과 얼음에 위치 2 ML 멸균 유리 병에 송금 원하는 농도를 달성하기 위해, 나가 건조에서 세포를 방지하기 위해 신속하게 작업. </li><li> 얼음에 세포가 간략하게 낮은 설정 세포 부착을 방지하기 위해 모든 ~ 20 분에 vortexed해야합니다. 세포는 안전하게 얼음에 게재 한 후 두 시간 intracranial 주입에 사용하실 수 있습니다. </li></ol> B. Orthotopic 이종 이식 주입 <ol><li> 기준, 사전 주입 중량을 수립 누드 athymic NCR 마우스 (뉴 / 뉴)를 무게. 우리는 보통 17 24g 사이의 무게와 마우스에게 시대의 6~10주을 선택합니다. </li><li> 주입하기 전에 1 시간은 수술 통증과 염증에 대한 치료로 피하 주입을 통해 비 steroidal 항 염증성 약물 meloxicam의 5 밀리그램 / kg으로 마우스를 사전 ...에 의료를 베풀다. </li><li> Anesthetiz전자 140 MG / kg 각각 10 밀리그램 / kg의 복용량에서 xylazine / 케타민 혼합물의 intraperitoneal 주사와 동물. </li><li> 마우스가 발가락 핀치에 동물의 자발적인 응답을 평가하여 충분히 anesthetized인지 확인합니다. 동물이 냄새가 핀치에 응답하면 마취을 적용하거나 추가 마취 (원본 금액의 &lt;25 %) 주입 고려 할 수있을 때까지 그 과정을 지연. </li><li> 코의 restrainer의 물린 바에서 마우스의 앞니 치아에 훅을 넣었하고 마우스의 머리가 있다는 확보하면서 코를 통해 코 클램프를 강화하여 그냥 마우스 Stereotactic 플랫폼 (Stoelting 주식회사)에 대한 Stoelting 디지털에 위치에 대한 anesthetized 마우스를 준비 레벨 비행기. </li><li> 귀 막대의 도움말 귀 운하의 꼬리 끝 부분에 있습니다 있도록 동물의 위치를​​ 조정 Stoelting stereotactic 플랫폼에 절제된 마우스를 전송합니다. 동물의 두개골 - 투 - 꼬리 위치는 adjus되면테드, stereotactic 프레임에 물린 줄을 고정하십시오. 마우스가 수술하는 동안 피드백 제어 온도 규정을 제공 할 수있는 Stoelting 플랫폼에 테이프로 고정 확고한 플라스틱 가열 플레이트 (하버드 장치)에 휴식을해야합니다. </li><li> 필요에 따라 귀 바의 높이를 조정 한 후 귀 운하의 꼬리 부분에 귀 바을 향상 마우스의 머리가 레벨 비행기에 있으며 손가락 터치에 고정되도록을 확보. 귀 바의 위치 후 호흡 곤란의 증상에 대해주의 깊게 모니터링합니다. 풀어 동물이 고통에있는 경우 재 위치. </li><li> 동안 동물의 온도를 모니터링하기 위해 36에서 동물의 체온을 유지하기 위해 마우스 아래에 위치 가열 판에 피드백 제어를 제공하는 TCAT - 2DF 온도 컨트롤러 (하버드 장치)에 연결 직장 온도 프로브의 윤활 팁 ° C를 삽입 절차. </li><li> preve에 눈 안과 연고를 적용NT는 건조. </li><li> 눈을 피하기 위해 관리하고, 절개 사이트를 소독 할 수있는 마우스의 머리 위로 betadine 솔루션을 적용합니다. </li><li> 마우스가 추가 케타민 / xylazine (초기 복용량의 &lt;25 %) 필요한 경우 소량의 제공, 의식이 확인 발가락 핀치을 수행합니다. </li><li> 0.45 mm 버 드릴 비트 (Stoelting) 알코올 패드를 사용하여 드릴 (Foredom Microdrill)에 부착 한 후에 만​​ 드릴 비트를 immersing 15 초에 유리 구슬 살균기 (Germinator 500, CellPoint 과학)에 드릴 비트를 소독을 깨끗이 살균기의 구슬. </li><li> 멸균 메스를 사용 caudally 눈의 수준에서 연장 중반 두피에 길이 방향으로 0.75 cm의 절개를합니다. bregma의 시각화를 확인합니다. </li><li> Stoelting 플랫폼에 드릴 홀더를 첨부하여 드릴 홀더에서 0.45 mm 버 드릴 비트 (Stoelting)와 훈련 (Foredom Microdrill)를 배치, 위치에 고정. </li><li> 정확히 t 이상 드릴 비트를 삽입그는 bregma하고 제로 아웃 z는 디지털 stereotactic 디스플레이의 좌표 X, Y,. 만 뼈를 피어싱, 위치 뒤쪽 2mm와 Foredom 훈련과 동물의 두개골에 오른쪽 대뇌 반구와 드릴의 bregma에 측면 1.5 mm의 드릴의 끝을 이동합니다. 멸균 면봉을 부드럽게 두개골의 시각화를 촉진하기 절개의 가장자리를 철회 할 수 있습니다. </li><li> stereotactic 플랫폼에서 드릴과 드릴 홀더를 제거합니다. </li><li> stereotactic 플랫폼에 Nanomite 주입기 주사기 펌프 (하버드 장치)를 연결합니다. </li><li> 얼음에서 세포를 제거하고 부드럽게 간단한 펄스와 종양 세포를 포함하는 유리 병 또는 셀을 다시 일시 중지 할 수있는 병을 버려야지 중 부드럽게 소용돌이. 10 μl 주사기 (해밀턴 주사기)에 첨부 된 30 게이지 1 &quot;긴 평면 베벨 바늘을 통해 세포 현탁액 7 μl를 그립니다. 주사기에서 큰 기포를 사용하지 마십시오. 유체의 초기 6 μl에 기포가 없는지 확인 어ich는 마우스에 주입 전체 볼륨 될 것입니다. 나머지 1 μl의 작은 기포가 신경 쓸 일이 아냐 수 있습니다. 세포에 손상을 최소화하기 위해 가능하면 세포 현탁액의 반복 추첨 업을 피하십시오. </li><li> 주사기 주입기에로드 된 주사기를 배치합니다. 알코올 패드를 사용하여 extracranial 공간에서 성장하는 종양이 발생할 수 있습니다 암 세포와 절개 사이트의 오염을 방지하기 위해 바늘의 끝에서 나타나는 세포 현탁액의 유체 중 하나를 제거합니다. </li><li> 0.5 μl / 분의 속도로 6.0 μl를 제공하기 위해 연료 분사 펌프를 설정합니다. 주입 한 후 주사기에 남아 세포 현탁액의 1 μl 자주 주사기에 수집 된 기포가 동물에 주입되지 않도록 보장합니다. 기포의 주입은 치명적인 공기 색전증이 발생할 수 있습니다. </li><li> 두개골에 바늘 직각 (90도)를 유지 버 구멍에 주사기 바늘을 부활​​ 시켰습니다. 바늘은 coordin 밖으로 두개골, 영 통과되면이 2.5 mm의 깊이에 도달 할 때까지 stereotactic 디지털 디스플레이 및 ates는 천천히 4 분의 기간 동안 바늘의 끝을 부활 시켰습니다. 바늘은 뒤쪽 해마의 피질과 영역을 통해 전달됩니다. X, Y, Z는 stereotactic 주입에 대한 좌표 등의 시상하므로 종양 세포와 중추 신경계을 퍼 뜨리고 가능성을 감소 심실에 근접 등의 중요한 뇌 구조에 부상을 피하는 동안 대뇌 반구 내에 측면 위치 종양을 생성하기 위해 선정되었습니다 바람직하지 않은 척추 종양을 야기 할 수도있다. bregma에 비해 뒤쪽 위치가 궤도에 ulcerating 대형 로컬 고급 종양의 가능성을 줄이기 위해 선정되었다. 그런 다음 2 분에 대해 깊이에서 바늘로 일시 정지하고 세포의 주입을 시작합니다. </li><li> 주입하는 동안, 동안 버 구멍에서 빠져 refluxed 수 있습니다 모든 종양이 함유 유체를 제거하는 microsurgical의 스폰지 창을 반복적으로 두개골을 건조주입. microsurgical 스폰지로 바늘을 방해하지 마십시오. 이 액체를 제거하면 extracranial 공간에서 성장하는 종양의 가능성을 줄일 수 있습니다. </li><li> 사출이 완료되면 약 2 분 동안 뇌에 바늘을두고 천천히 3-4 분에 걸쳐 바늘을 철회 할 수 있습니다. </li><li> 귀 바, 주둥이의 restrainer를 풀어 stereotactic 장치에서 마우스를 제거합니다. </li><li> 멸균 뼈 왁스로 머리에 버 구멍을 닫고는 살균면 - 날붙이 작은 주걱의 목조 끝에서 버 홀에서 앞뒤로 왁스를 문질러에 의해 증착. 구멍이 완전히 봉쇄하고 버 구멍을 밀폐 뼈 왁스가 인접 두개골과 수세식입니다 때까지 뼈 왁스를 적용 계속. </li><li> 다시 대략 멸균 면봉으로 절개의 가장자리와 동물의 눈에 접착제 노출을 피하기 위해 관리하고, 상처를 밀봉하기 위해 동물 조직 접착제를 적용합니다. </li><li> 마지막으로, 37로 설정 가열 패드에 마우스를 °동물까지 C는 의식을 복구합니다. 마우스 알림 및 응답되면 원래 케이지로 동물을 전송합니다. </li></ol> C. 발광 생물 이미징 (BLI)는 종양 성장과 치료에 대한 응답을 모니터링 할 간략한 지침 발광 생물 이미징에 따르십시오. <ol><li> 이전 2퍼센트 isoflurane과 산소와 챔버에 종양을 이식 생쥐를 마취. </li><li> 쥐가 anesthetized 있지만, 50 MG / ML의 농도로 PBS에 희석 D-luciferin의 칼륨 소금의 60 μl로 피하 또는 intraperitoneally 하나를 주입. </li><li> 발광 생물 이미징 스캐너에서 코 콘에 마취의 흐름을 켜고 빠르게 코 콘에서 자신의 코를 게재하는 스캐너로 쥐를 전송합니다. </li><li> 훨씬 낮은 신호 인접한 종양에 높은 신호 강도와 종양의 발광 생물 신호의 출혈을 제한 할 쥐 사이의 검은 색 디바이더를 배치합니다. </li><li> 사용생활 이미지 소프트웨어, D-luciferin의 주입의 시간 후 30 분까지 총 기간 동안 자주 직렬 노출을. 우리는 이하 이상 노출 이미지의 가능성을 제한하는 &quot;자동&quot;으로 노출 시간을 설정 선호. 단일 노출&gt; 5 분 할 수 없습니다. </li><li> 적절한 간격으로 발광 생물 이미징를 반복 수행합니다. 시리얼 주간 영상 치료에 대한 응답을 테스트 많은 종 실험에 대한 합리적인 방법입니다. </li><li> 이미지의 취득 후, 발광 생물 이미징 세션 중에 취득한 각 이미지에있는 각 종양 주변 관심 (ROI)의 영역을 그림으로써 종양을 분석 생활 이미지 소프트웨어 프로그램을 사용합니다. 배경 발광 생물 신호 강도의 정도에 따라 종양의 발광 생물 신호를 해결하기위한 관심 배경 영역으로 각 이미지의 각 마우스의 하단 측면에 관심 두 번째, 작은 지역을 적용합니다. 우리는 &#39;래디언스&#39;설정보다는 출력으로 &quot;계산&quot;을 사용 선호발광 생물 신호에 대한 값. </li><li> Excel로 투자 수익 (ROI) 결과를 수출하고 각 마우스의 최대 배경 - 조정 발광 생물 신호를 결정합니다. </li><li> 종양 성장의 시리얼 모니터링 표시된대로 발광 생물 이미징를 반복합니다. 우리의 실험에서, 우리는 매주 BLI을 수행합니다. D-luciferin 주입 후 30 분 - 우리는 5 이상 자주 노출을 복용하여 주어진 영상 세션의 최대 BLI 신호를 결정하는 선호합니다. </li></ol> D. 대표 결과 이 stereotactic 주입 기술은 90-100%의 성공적인 종양 - 소요될 속도로 5 % 이상 보통 이하 낮은 perioperative 사망률과 연관되어 있습니다. 의도하지 않은 부작용의 위험이 종양 세포 또는 버 구멍의 부족 폐쇄​​와 절개 중 하나 심는에서 심실 또는 extracranial 종양 성장에 이식 종양 세포에서 척수의 심는 등의 합병증을 포함, 또한이 기술 부족두개골의 개구를 통해 확장 할 intracranial 종양을 llowing. 종양 xenografts의 예를 생체 분석은 hypoxia의 예상 지역 증가 VEGF 발현 및 괴사을 보여 주었다. 안정적 우리 GBM 세포 라인에 의해 표현 녹색 형광 단백질 (GFP)의 형광 현미경은 이러한 xenografts의 infiltrative 자연을 공개했다. 그림 1은 마우스의 뇌에 GBM 세포의 전형적인 성공 stereotactic 주입의 결과를 보여줍니다. 이 21일 여기에서 설명한 기술을 주입 한 후 9.4 테슬라 자석으로 수행 마우스 뇌의 T2 - 가중 뇌 MRI 검사입니다. 그림 1은 19mm 3 측정 오른쪽 뇌 (분홍색 contoured)에 종양의 단일 초점을 나타 그 주입 사이트의 정확한 좌표에 localizes. 그림 2는 techn를 사용하여 발광 생물 이미징의 결과를 보여줍니다<html> iques 중 하나 두개골 조사 (4 GY × 4 매일 분수) 또는 전혀 치료를받지 최대 발광 생물 신호 강도에 따라 균일하게 층을 이루게했다 stereotactically 이식 종양과 10 쥐의 그룹은 여기를 설명했다. 이 실험에서 발광 생물 이미징은 신호가 실질적으로 암 세포의 확인란의 선택을 취소 한 확산으로 인한 모방 - 방사능 제어 종양에서 증가하는 반면 방사선 치료가 감지 발광 생물 신호에서 더 증가의 결과로, 주입 된 종양의 확산을 억제 것으로 나타났습니다. 그림 1 (비디오). 종양 볼륨 (핑크)의 윤곽과 U251 glioblastoma multiforme의 종양을 포함하는 마우스 뇌의 MRI 코로나 섹션. 스캔은 9.4 테 슬러 스캐너에 스핀 에코 T2 가중 프로토콜을 사용하여 수행되었습니다. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4089/4089movie1.m4v" target="_blank">동영상을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . 재 2 &quot;SRC =&quot;/ files/ftp_upload/4089/4089fig2.jpg &quot;/&gt; 그림 2. stereotactically 이식 glioblastoma multiforme의 종양을 갖춘 10 개 마우스는 외부 빔 방사선 (4) 분수 16 GY으로 치료 또는 전혀 치료 중로 치료했다. 마우스는 치료의 시작 이후 이전에 치료와 매주 발광 생물 이미징과 이미징했다. 그래프는 배 변화가 전처리 최대 BLI 값으로 현재의 최​​대 BLI 가치의 비율로 정의됩니다 중간 배 변화로 계산 상대 bioluminescence를 제공​​합니다.

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	<li>Stupp, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiotherapy+plus+concomitant+and+adjuvant+temozolomide+for+glioblastoma.">Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma.</a> N. Engl. J. Med. 352, 987-996 (2005).</li><li>Jacobs, V. L., Valdes, P. A., Hickey, W. F., De Leo, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+review+of+in+vivo+GBM+rodent+models:+emphasis+on+the+CNS-1+tumour+model.">Current review of in vivo GBM rodent models: emphasis on the CNS-1 tumour model.</a> ASN Neuro. 3, e00063 (2011).</li><li>Shelton, L. 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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+Intracranial+Brain+Tumor+Xenografts+With+Subsequent+Analysis+of+Tumor+Growth+and+Response+to+Therapy+using+Bioluminescence+Imaging.">Establishing Intracranial Brain Tumor Xenografts With Subsequent Analysis of Tumor Growth and Response to Therapy using Bioluminescence Imaging.</a> J. Vis. Exp. 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관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

이 글에 설명 된 쥐 암 세포의 stereotactic 주입의 방법은 reproducibly 합리적으로 임상 glioblastoma multiforme 2, 6-8의 infiltrative 및 빠른 성장 패턴을 요점을 되풀이 종양을 생성합니다. 이 기술은 특히 비교 크기와 생물학적 특성 및 특정 해부학 위치에서 재현 종양 바람직 다른 치료 그룹에 균등하게 쥐를 stratifying 실험에 잘 적합합니다. 우리가 설명하는 기술을 사용하여 종양 세포의 Stereotactic 주?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 기술 </td><td> 공급 업체 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 </td></tr><tr><td> 그냥 마우스 Stereotaxic 악기를위한 디지털 </td><td> Stoelting </td><td> 51730D </td><td> 마우스 주입을위한 Stereotactic 플랫폼 </td></tr><tr><td> 케타민 / xylazine </td><td></td><td></td><td> Injectable 마취 </td></tr><tr><td> Puralube 용사의 연고 (안과) </td><td> Amazon.com </td><td></td><td> 마우스의 눈 건조를 방지하려면 </td></tr><tr><td> stereotactic 플랫폼 홀더를 드릴 </td><td> Stoelting </td><td> 51,681 </td><td></td></tr><tr><td> Micromotor 전기 드릴 </td><td> Stoelting </td><td> 51,449 </td><td> 두개골을 통해 드릴을위한 </td></tr><tr><td> 0.45 mm 초경 드릴 비트 </td><td> Stoelting </td><td> 514551 </td><td></td></tr><tr><td> 멸균 면봉 </td><td> 피셔 과학 </td><td> 23-400-100 </td><td></td></tr><tr><td> 유리 구슬 건조 살균기 (Germinator 500) </td><td> Braintree 과학 </td><td> GER-5287 </td><td> 금속 수술기구를 소독하기 </td></tr><tr><td> 마우스 직장 프로브 </td><td> Braintree 과학 </td><td> RET-3-ISO </td><td> 온도 컨트롤러와 호환 </td></tr><tr><td> 온도 컨트롤러 (TCAT-2DF) </td><td> 하버드 장치 </td><td> 727561 </td><td> 수술하는 동안 동물의 온도를 유지하기 위해 온도 컨트롤러 </td></tr><tr><td> 소형 가열 플레이트 </td><td> 하버드 장치 </td><td> 727617 </td><td> 수술하는 동안 마우스를 따뜻하게 온도 컨트롤러와 함께 사용. 가열 플레이트는 stereotaxic 플랫폼에서 마우스 아래에 맞출 수 있습니다. </td></tr><tr><td> 일회용 메스 </td><td> BD 음유 시인 - 파커 </td><td> 2015-11 </td><td> # 10 메스 </td></tr><tr><td> 10 마이크로 리터 주사기 </td><td> 해밀턴 </td><td> 7635-01 </td><td> 종양 세포의 주입을 위해 </td></tr><tr><td> 평면 포인트 1 &quot;길이 30 게이지 바늘, </td><td> 해밀턴 </td><td> 여러 </td><td> 10 μl 주사기와 호환되어야 함 </td></tr><tr><td> 프로그램 주사기 펌프를 Nanomite </td><td> 하버드 장치 </td><td> 704507 </td><td> stereotaxic 장치에 대한 디지털 전동 주사기 주사기 </td></tr><tr><td> 셀룰로오스 무균 수술 창 스폰지 </td><td> Ultracell </td><td> 40,410 </td><td> 수술 필드를 건조하려면 </td></tr><tr><td> 뼈 왁스 </td><td> Ethicon </td><td> W31 </td><td> 버 구멍을 밀봉하는 방법 </td></tr><tr><td> Tissumend II 합성 흡수성 조직 접착제 </td><td> 수의학 제품 연구소 </td><td> 3002931 </td><td> 절개를 밀봉하는 방법 </td></tr><tr><td> 온난화 패드와 온수 펌프 </td><td> Gayma연구 </td><td> TP-650 </td><td> 수술 기간에 온도가 올라 마우스 </td></tr><tr><td> IVIS Lumina II </td><td> 캘리퍼스 생명 과학 </td><td></td><td> 발광 생물 영상 </td></tr><tr><td> D-Luciferin의 칼륨 소금 </td><td> 골드 생명 공학 </td><td> 빕니다-1 </td><td> 발광 생물 이미징에 대한 Luciferin </td></tr></tbody></table>

stereotactic intracranial implantation and in vivo bioluminescent imaging of tumor xenografts in a mouse model system of glioblastoma multiforme

Glioblastoma multiforme의 (GBM)은 수술 절제술, 수술 방사선 요법 및 화학 요법 temozolomide 하나를 구성하는 표준 트라이 양상 치료에도 불구하고 인간 만 14.6 개월 평균 생존과 고급 차 뇌 암입니다. 새로운 치료 방법이 명확하게 삶의 환자의 생존과 품질을 개선하기 위해 필요합니다. 보다 효과적인 치료 전략의 개발은 인간의 질병을 요점을 되풀이 아직 종양의 성장과 치료 반응을 모니터링하기 위해 일련의 이미지를 허용 GBM의 동물 모델에 의해 도왔됩니다. 이 논문에서, 우리는 GBM 2의 주요 임상 기능을 요점을 되풀이 종양 xenografts의 결과로 누드 마우스의 뇌에 생체 이미지 형성 GBM 암 세포의 정확한 stereotactic 주입을위한 우리의 기술을 설명합니다. 이 방법은 재현 아르 종양을 산출하고 순차적 내부를 모니터링하는 생체 발광 생물 이미징에서 허용하는 동시에 정확한 해부학 위치에 자리 잡고 있습니다두개골 이종 이식의 성장과 치료 3-5에 대응. 이 방법은 낮은 perioperative 병적 상태와 사망률과 동물하여 잘 용납입니다.

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Stereotactic Intracranial Implantation and In vivo Bioluminescent Imaging of Tumor Xenografts in a Mouse Model System of Glioblastoma Multiforme

우리는 누드 마우스 및 이후 일련의 뇌에 인간 glioblastoma multiforme의 세포의 정확한, stereotactic 주입을위한 통합 방법을 설명<em&gt; 생체 내</em&gt; 이미징의 성장과 결과 xenografts의 치료에 대한 반응을 모니터링합니다.

Stereotactic Intracranial 주입 및<em&gt; 생체에</emGlioblastoma의 Multiforme의 마우스 모델 시스템에서 종양 Xenografts의&gt; 발광 생물 이미징

Glioblastoma multiforme (GBM) is a high-grade primary brain cancer with a median survival of only 14.6 months in humans despite standard tri-modality ...

stereotactic-intracranial-implantation-vivo-bioluminescent-imaging

Research

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Medicine

Stereotactic Intracranial Implantation and In vivo Bioluminescent Imaging of Tumor Xenografts in a Mouse Model System of Glioblastoma Multiforme

25.4K 조회수.  University of Pennsylvania. 우리는 누드 마우스 및 이후 일련의 뇌에 인간 glioblastoma multiforme의 세포의 정확한, stereotactic 주입을위한 통합 방법을 설명 생체 내 이미징의 성장과 결과 xenografts의 치료에 대한 반응을 모니터링합니다.

비디오: Stereotactic Intracranial Implantation and In vivo Bioluminescent Imaging of Tumor Xenografts in a Mouse Model System of Glioblastoma Multiforme

Multi-photon Imaging of Tumor Cell Invasion in an Orthotopic Mouse Model of Oral Squamous Cell Carcinoma

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient management strategies. Orthotopic mouse models of oral cancer have been developed to facilitate the study of factors that impact invasion and serve as model system for evaluating anti-tumor therapeutics. In these systems, visualization of disseminated tumor cells within oral cavity tissues has typically been conducted by either conventional histology or with in vivo bioluminescent methods. A primary drawback of these techniques is the inherent inability to accurately visualize and quantify early tumor cell invasion arising from the primary site in three dimensions. Here we describe a protocol that combines an established model for squamous cell carcinoma of the tongue (SCOT) with two-photon imaging to allow multi-vectorial visualization of lingual tumor spread. The OSC-19 head and neck tumor cell line was stably engineered to express the F-actin binding peptide LifeAct fused to the mCherry fluorescent protein (LifeAct-mCherry). Fox1nu/nu mice injected with these cells reliably form tumors that allow the tongue to be visualized by ex-vivo application of two-photon microscopy. This technique allows for the orthotopic visualization of the tumor mass and locally invading cells in excised tongues without disruption of the regional tumor microenvironment. In addition, this system allows for the quantification of tumor cell invasion by calculating distances that invaded cells move from the primary tumor site. Overall this procedure provides an enhanced model system for analyzing factors that contribute to SCOT invasion and therapeutic treatments tailored to prevent local invasion and distant metastatic spread. This method also has the potential to be ultimately combined with other imaging modalities in an in vivo setting.

A comprehensive overview of the techniques involved in generating a mouse model of oral cancer and quantitative monitoring of tumor invasion within the tongue through multi-photon microscopy of labeled cells is presented. This system can serve as a useful platform for the molecular assessment and drug efficacy of anti-invasive compounds.

구강 편평 세포 암종의 Orthotopic 마우스 모델에서 종양 세포 침략의 다중 광자 이미징

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient ...

연구

의학

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

It is well recognized that tumor hypoxia plays an important role in promoting malignant progression and affecting therapeutic response negatively. There is little knowledge about in situ, in vivo, tumor hypoxia during intracranial development of malignant brain tumors because of lack of efficient means to monitor it in these deep-seated orthotopic tumors. Bioluminescence imaging (BLI), based on the detection of light emitted by living cells expressing a luciferase gene, has been rapidly adopted for cancer research, in particular, to evaluate tumor growth or tumor size changes in response to treatment in preclinical animal studies. Moreover, by expressing a reporter gene under the control of a promoter sequence, the specific gene expression can be monitored non-invasively by BLI. Under hypoxic stress, signaling responses are mediated mainly via the hypoxia inducible factor-1&alpha; (HIF-1&alpha;) to drive transcription of various genes. Therefore, we have used a HIF-1&alpha; reporter construct, 5HRE-ODD-luc, stably transfected into human breast cancer MDA-MB231 cells (MDA-MB231/5HRE-ODD-luc). In vitro HIF-1&alpha; bioluminescence assay is performed by incubating the transfected cells in a hypoxic chamber (0.1% O2) for 24 hr before BLI, while the cells in normoxia (21% O2) serve as a control. Significantly higher photon flux observed for the cells under hypoxia suggests an increased HIF-1&alpha; binding to its promoter (HRE elements), as compared to those in normoxia. Cells are injected directly into the mouse brain to establish a breast cancer brain metastasis model. In vivo bioluminescence imaging of tumor hypoxia dynamics is initiated 2 wks after implantation and repeated once a week. BLI reveals increasing light signals from the brain as the tumor progresses, indicating increased intracranial tumor hypoxia. Histological and immunohistochemical studies are used to confirm the in vivo imaging results. Here, we will introduce approaches of in vitro HIF-1&alpha; bioluminescence assay, surgical establishment of a breast cancer brain metastasis in a nude mouse and application of in vivo bioluminescence imaging to monitor intracranial tumor hypoxia.

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

Bioluminescence imaging of hypoxia inducible factor-1&alpha; activity is applied to monitor intracranial tumor hypoxia development in a breast cancer brain metastasis mouse model.

유방암 뇌 전이의 종양 Hypoxia 역학 생체내의 Bioluminescence 이미징에서는 마우스 모델에서

It is well recognized that tumor hypoxia plays an important role in promoting malignant progression and affecting therapeutic response negatively. There ...

In vivo Dual Substrate Bioluminescent Imaging

Our understanding of how and when breast cancer cells transit from established primary tumors to metastatic sites has increased at an exceptional rate since the advent of in vivo bioluminescent imaging technologies 1-3. Indeed, the ability to locate and quantify tumor growth longitudinally in a single cohort of animals to completion of the study as opposed to sacrificing individual groups of animals at specific assay times has revolutionized how researchers investigate breast cancer metastasis. Unfortunately, current methodologies preclude the real-time assessment of critical changes that transpire in cell signaling systems as breast cancer cells (i) evolve within primary tumors, (ii) disseminate throughout the body, and (iii) reinitiate proliferative programs at sites of a metastatic lesion. However, recent advancements in bioluminescent imaging now make it possible to simultaneously quantify specific spatiotemporal changes in gene expression as a function of tumor development and metastatic progression via the use of dual substrate luminescence reactions. To do so, researchers take advantage for two light-producing luciferase enzymes isolated from the firefly (Photinus pyralis) and sea pansy (Renilla reniformis), both of which react to mutually exclusive substrates that previously facilitated their wide-spread use in in vitro cell-based reporter gene assays 4. Here we demonstrate the in vivo utility of these two enzymes such that one luminescence reaction specifically marks the size and location of a developing tumor, while the second luminescent reaction serves as a means to visualize the activation status of specific signaling systems during distinct stages of tumor and metastasis development. Thus, the objectives of this study are two-fold. First, we will describe the steps necessary to construct dual bioluminescent reporter cell lines, as well as those needed to facilitate their use in visualizing the spatiotemporal regulation of gene expression during specific steps of the metastatic cascade. Using the 4T1 model of breast cancer metastasis, we show that the in vivo activity of a synthetic Smad Binding Element (SBE) promoter was decreased dramatically in pulmonary metastasis as compared to that measured in the primary tumor 4-6. Recently, breast cancer metastasis was shown to be regulated by changes within the primary tumor microenvironment and reactive stroma, including those occurring in fibroblasts and infiltrating immune cells 7-9. Thus, our second objective will be to demonstrate the utility of dual bioluminescent techniques in monitoring the growth and localization of two unique cell populations harbored within a single animal during breast cancer growth and metastasis.

In vivo Dual Substrate Bioluminescent Imaging

Herein we describe the methods to construct, visualize, and quantify the bioluminescent reactions of both firefly and renilla luciferase enzymes expressed in metastatic breast cancer cells during their growth and metastasis in vivo.

생체 듀얼 기판 발광 생물 이미징에

Our understanding of how and when breast cancer cells transit from established primary tumors to metastatic sites has increased at an exceptional rate ...

Intracranial Implantation with Subsequent 3D In Vivo Bioluminescent Imaging of Murine Gliomas

The mouse glioma 261 (GL261) is recognized as an in vivo model system that recapitulates many of the features of human glioblastoma multiforme (GBM). The cell line was originally induced by intracranial injection of 3-methyl-cholantrene into a C57BL/6 syngeneic mouse strain 1; therefore, immunologically competent C57BL/6 mice can be used. While we use GL261, the following protocol can be used for the implantation and monitoring of any intracranial mouse tumor model. GL261 cells were engineered to stably express firefly luciferase (GL261-luc). We also created the brighter GL261-luc2 cell line by stable transfection of the luc2 gene expressed from the CMV promoter. C57BL/6-cBrd/cBrd/Cr mice (albino variant of C57BL/6) from the National Cancer Institute, Frederick, MD were used to eliminate the light attenuation caused by black skin and fur. With the use of albino C57BL/6 mice; in vivo imaging using the IVIS Spectrum in vivo imaging system is possible from the day of implantation (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA). The GL261-luc and GL261-luc2 cell lines showed the same in vivo behavior as the parental GL261 cells. Some of the shared histological features present in human GBMs and this mouse model include: tumor necrosis, pseudopalisades, neovascularization, invasion, hypercellularity, and inflammation 1.
Prior to implantation animals were anesthetized by an intraperitoneal injection of ketamine (50 mg/kg), xylazine (5 mg/kg) and buprenorphine (0.05 mg/kg), placed in a stereotactic apparatus and an incision was made with a scalpel over the cranial midline. A burrhole was made 0.1mm posterior to the bregma and 2.3mm to the right of the midline. A needle was inserted to a depth of 3mm and withdrawn 0.4mm to a depth of 2.6mm. Two &mu;l of GL261-luc or GL261-luc2 cells (107 cells/ml) were infused over the course of 3 minutes. The burrhole was closed with bonewax and the incision was sutured.
Following stereotactic implantation the bioluminescent cells are detectable from the day of implantation and the tumor can be analyzed using the 3D image reconstruction feature of the IVIS Spectrum instrument. Animals receive a subcutaneous injection of 150&mu;g luciferin /kg body weight 20 min prior to imaging. Tumor burden is quantified using mean tumor bioluminescence over time. Tumor-bearing mice were observed daily to assess morbidity and were euthanized when one or more of the following symptoms are present: lethargy, failure to ambulate, hunched posture, failure to groom, anorexia resulting in &gt;10% loss of weight. Tumors were evident in all of the animals on necropsy.

Intracranial Implantation with Subsequent 3D In Vivo Bioluminescent Imaging of Murine Gliomas

Intracranial implantation of GL261 cells into C57BL/6 mice produces malignant gliomas that recapitulate many of the hallmarks of human glioblastoma multiforme. We used GL261 cells stably expressing luciferase to allow us to use in vivo imaging to follow tumor progression. The surgery and 3D in vivo imaging are demonstrated.

이후 3D로 Intracranial 주입 VIVO에서</emMurine Gliomas의> 발광 생물 이미징

The mouse glioma 261 (GL261) is recognized as an in vivo model system that recapitulates many of the features of human glioblastoma multiforme (GBM). The ...

Live Imaging of Drug Responses in the Tumor Microenvironment in Mouse Models of Breast Cancer

The tumor microenvironment plays a pivotal role in tumor initiation, progression, metastasis, and the response to anti-cancer therapies. Three-dimensional co-culture systems are frequently used to explicate tumor-stroma interactions, including their role in drug responses. However, many of the interactions that occur in vivo in the intact microenvironment cannot be completely replicated in these in vitro settings. Thus, direct visualization of these processes in real-time has become an important tool in understanding tumor responses to therapies and identifying the interactions between cancer cells and the stroma that can influence these responses. Here we provide a method for using spinning disk confocal microscopy of live, anesthetized mice to directly observe drug distribution, cancer cell responses and changes in tumor-stroma interactions following administration of systemic therapy in breast cancer models. We describe procedures for labeling different tumor components, treatment of animals for observing therapeutic responses, and the surgical procedure for exposing tumor tissues for imaging up to 40 hours. The results obtained from this protocol are time-lapse movies, in which such processes as drug infiltration, cancer cell death and stromal cell migration can be evaluated using image analysis software.

We describe a method for imaging response to anti-cancer treatment in vivo and at single cell resolution.

유방암의 마우스 모델에서 종양 Microenvironment에 약물 응답의 영상을 라​​이브

The tumor microenvironment plays a pivotal role in tumor initiation, progression, metastasis, and the response to anti-cancer therapies. Three-dimensional ...

A Murine Model of Stent Implantation in the Carotid Artery for the Study of Restenosis

Despite the considerable progress made in the stent development in the last decades, cardiovascular diseases remain the main cause of death in western countries. Beside the benefits offered by the development of different drug-eluting stents, the coronary revascularization bears also the life-threatening risks of in-stent thrombosis and restenosis. Research on new therapeutic strategies is impaired by the lack of appropriate methods to study stent implantation and restenosis processes. Here, we describe a rapid and accessible procedure of stent implantation in mouse carotid artery, which offers the possibility to study in a convenient way the molecular mechanisms of vessel remodeling and the effects of different drug coatings.

A model of stent implantation in mouse carotid artery is described. Compared to other similar methods, this procedure is very rapid, simple and accessible, offering the possibility to study in a convenient way the vascular wall reaction to different drug-eluting stents and the molecular mechanisms of restenosis.

재 협착의 연구에 대한 경동맥 스텐트 시술의 쥐과 모형

Despite  the considerable progress made in the stent development in the last decades,  cardiovascular diseases remain the main cause of death in western ...

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a novel platform that allows for direct long-term visualization of tissue structure changes intracranially. Imaging at a single cell resolution in a real-time fashion provides supplementary dynamic information beyond that provided by standard end-point histological analysis, which looks solely at 'snap-shot' cross sections of tissue.
Establishing this intravital imaging technique in fluorescent chimeric mice, we are able to image four fluorescent channels simultaneously. By incorporating fluorescently labeled cells, such as GFP+ bone marrow, it is possible to track the fate of these cells studying their long-term migration, integration and differentiation within tissue. Further integration of a secondary reporter cell, such as an mCherry glioma tumor line, allows for characterization of cell:cell interactions. Structural changes in the tissue microenvironment can be highlighted through the addition of intra-vital dyes and antibodies, for example CD31 tagged antibodies and Dextran molecules.
Moreover, we describe the combination of our ICW imaging model with a small animal micro-irradiator that provides stereotactic irradiation, creating a platform through which the dynamic tissue changes that occur following the administration of ionizing irradiation can be assessed.
Current limitations of our model include penetrance of the microscope, which is limited to a depth of up to 900 &mu;m from the sub cortical surface, limiting imaging to the dorsal axis of the brain. The presence of the skull bone makes the ICW a more challenging technical procedure, compared to the more established and utilized chamber models currently used to study mammary tissue and fat pads 5-7. In addition, the ICW provides many challenges when optimizing the imaging.

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

We describe a novel in vivo imaging technique that couples fluorescent chimeric mice with intracranial windows and high-resolution 2-photon microscopy. This imaging platform aids studies of dynamic changes in brain tissue and microvasculature, at a single-cell level, following pathological insults and is adaptable to assess intracranial drug delivery and distribution.

소설 고해상도<em&gt; 생체 내</em종양의 성장과 치료학에 두개 내 구조물의 동적 응답을 공부하기&gt; 이미징 기술

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a ...

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. Here, we describe a general protocol for cell labeling, imaging, and image processing. The technique is applicable to various cell types and animal models, although here we focus on a typical mouse model for tracking murine immune cells. The most important issues for cell labeling are described, as these are relevant to all models. Similarly, key imaging parameters are listed, although the details will vary depending on the MRI system and the individual setup. Finally, we include an image processing protocol for quantification. Variations for this, and other parts of the protocol, are assessed in the Discussion section. Based on the detailed procedure described here, the user will need to adapt the protocol for each specific cell type, cell label, animal model, and imaging setup. Note that the protocol can also be adapted for human use, as long as clinical restrictions are met.

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

We describe a general protocol for in vivo cell tracking using MRI in a mouse model with ex vivo labeled cells. A typical protocol for cell labeling, image acquisition processing and quantification is included.

세포 추적을위한 생체 19 F MRI에서

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. ...

Creating Anatomically Accurate and Reproducible Intracranial Xenografts of Human Brain Tumors

Orthotopic tumor models are currently the best way to study the characteristics of a tumor type, with and without intervention, in the context of a live animal &#8211;&#160;particularly in sites with unique physiological and architectural qualities such as the brain. In vitro and ectopic models cannot account for features such as vasculature, blood brain barrier, metabolism, drug delivery and toxicity, and a host of other relevant factors. Orthotopic models have their limitations too, but with proper technique tumor cells of interest can be accurately engrafted into tissue that most closely mimics conditions in the human brain. By employing methods that deliver precisely measured volumes to accurately defined locations at a consistent rate and pressure, mouse models of human brain tumors with predictable growth rates can be reproducibly created and are suitable for reliable analysis of various interventions. The protocol described here focuses on the technical details of designing and preparing for an intracranial injection, performing the surgery, and ensuring successful and reproducible tumor growth and provides starting points for a variety of conditions that can be customized for a range of different brain tumor models.

The brain is a unique site with qualities that are not well represented by in vitro or ectopic analyses. Orthotopic mouse models with reproducible location and growth characteristics can be reliably created with intracranial injections using a stereotaxic fixation instrument and a low pressure syringe pump.

만들기 해부학 적으로 정확하고 인간의 두뇌 종양의 재현 두개 내 이종 이식

Orthotopic tumor models are currently the best way to study the characteristics of a tumor type, with and without intervention, in the context of a live ...

Intrauterine Telemetry to Measure Mouse Contractile Pressure In Vivo

A complex integration of molecular and electrical signals is needed to transform a quiescent uterus into a contractile organ at the end of pregnancy. Despite the discovery of key regulators of uterine contractility, this process is still not fully understood. Transgenic mice provide an ideal model in which to study parturition. Previously, the only method to study uterine contractility in the mouse was ex vivo isometric tension recordings, which are suboptimal for several reasons. The uterus must be removed from its physiological environment, a limited time course of investigation is possible, and the mice must be sacrificed. The recent development of radiometric telemetry has allowed for longitudinal, real-time measurements of in vivo intrauterine pressure in mice. Here, the implantation of an intrauterine telemeter to measure pressure changes in the mouse uterus from mid-pregnancy until delivery is described. By comparing differences in pressures between wild type and transgenic mice, the physiological impact of a gene of interest can be elucidated. This technique should expedite the development of therapeutics used to treat myometrial disorders during pregnancy, including preterm labor.

Intrauterine Telemetry to Measure Mouse Contractile Pressure In Vivo

This manuscript provides a protocol for implanting telemeters in the mouse for the purpose of measuring intrauterine pressures during pregnancy.

자궁 원격 측정은 마우스 수축 압력을 측정하는<em&gt; 생체</em

A complex integration of molecular and electrical signals is needed to transform a quiescent uterus into a contractile organ at the end of pregnancy. ...