이 작품은 암 연구 온타리오 연구소 (OICR), 테리 폭스 재단과 신경 외과의 미국 협회의 지원을받는되었다.

1. 뇌 종양 조직의 문화 <ol><li> 37 ° C의 물을 욕조에 15 인조 CSF의 ML (aCSF - 참조 표 1)과 장소에 200 μl 해동 Liberase (로슈 응용 과학)을 추가합니다. Liberase TM는 기본 조직 샘플뿐만 아니라 교양 tumorspheres을 떼어 놓다하는 데 사용 proteolytic 효소의 혼합입니다. 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)과는 달리, Liberase 방법은 표면 항원 CD133을 보존합니다. 약 0.5 cm 3의 조직 샘플의 경우, 우리는 Liberase 200 μl를 사용합니다. 조직이 작 으면, 우리는 100 UL을 사용합니다. </li><li> 객실 온도 염화 암모늄 용액 (줄기 세포 기술)를 가져와. 염화 암모늄 솔루션은 부드럽게 다른 세포에 최소한의 영향으로 적혈구를 lyses. 이 정착액 포함되어 있지 않습니다. </li><li> 무균 생물 안전 캐비닛에서 해제 피펫 후, 조직을 씻어하기 위해 표본 용기, 소용돌이에 aCSF의 5 ML을 추가합니다. 이 단계는 적혈구 (RBC)를 제거하는 데 도움이됩니다. </li><li> 멸균 100mm 페트리 디에 뇌 종양 조직을 전송쉬. </li><li> 고급 가위 또는 메스와 집게를 사용 슬러리의 일관성에 조직을 disaggregate. </li><li> Liberase으로 사전 예열 aCSF을 포함하는 튜브에 10 ML 일반 피펫 또는 포셉 및 전송 조각을 사용하여 샘​​플을 수집합니다. </li><li> 보육-흔드는 (30 RPM)에 장소 37로 설정 ° C, 15 분에. </li><li> 50 ML 팔콘 튜브에 70 μm 전지 스트레이너를 통해 조직 lysate를 필터링합니다. </li><li> 5 분에 280 XG에서 여과를 봐. </li><li> 조심스럽게 표면에 뜨는을 제거하고 그 결과 세포 펠렛의 크기와 색상을 평가 : 분홍색 또는 빨간색 펠릿가 빨간색으로 혈액 세포의 증가 숫자를 나타냅니다. </li><li> 1 ML PBS에 Resuspend 펠릿. </li><li> 펠렛 크기와 적혈구 오염에 따라 염화 암모늄 용액 (4-12 ML)의 적절한 금액을 추가 (염화 암모늄 솔루션은 매우 부드러운이며 증가 금액은 붉은 색 세포가 아닌 다른 세포에 해로운되지 않습니다.) </li><li> 5 분 동안 실온에서 알을 품다. </li><li> 스핀 세포5 분에 280 XG에서 내려. </li><li> 멸균 PBS의 10 ML에 한 번 씻으십시오. </li><li> 5 ML NSC 전체 매체 (표 2)와 매우 낮은 바인딩 60mm 조직 문화 판 (코닝)에 양도 Resuspend. 우리는 친수성과 중립적 세포 첨부 파일로 인한 차별화를 최소화하기 위해 부과됩니다 covalently 보세 히드로 겔 표면과 초저 구속력 문화 접시를 사용합니다. </li></ol> 문화의 초기 일 동안 미디어를 변경하지 마십시오 : 미디어의 색깔이 약간 노란색되면 최고 오직 필요에 따라 1-2 ML의 미디어 다음 문화와 변화 미디어를 관찰하고 있습니다. 2. 유동 세포 계측법에 대한 Tumorsphere 분리 <ol><li> 현미경으로 tumorspheres을 평가 : 영역의 크기가&gt; 100 μm 인 경우 큰 분야는 중앙에 괴사 될 수 있으므로, 분리하는 것이 좋습니다. </li><li> 15 ML 원뿔 튜브에 문화를 전송할 수 있습니다. </li><li> 2-3 ML 멸균 P를 추가합니다BS는 철저하게 판을 씻어 원뿔 튜브에 추가 할 수 있습니다. </li><li> 5 분에 280 XG에 원심 분리기. </li><li> 1 표면에 뜨는 및 resuspend 제거 - 2 ML 멸균 PBS. </li><li> 10 μl Liberase을 추가합니다. </li><li> 3 분에 37 ° C의 물을 욕조에 품다. 여러 clumps가 본 경우 정지를 제거하고 시각적으로 평가, 1000 μl 피펫 팁을 사용하여 부드럽게 가루로 빻다. </li><li> 거리며 걷게가 지속되면 추가 1-2 분 동안 배양을 계속합니다. </li><li> 5 ML 멸균 PBS를 추가하고 5 분에 280 XG에 centrifuging하여 세포를 씻으십시오. </li><li> 500-1,000 μl 멸균 PBS 2 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)에 표면에 뜨는 및 resuspend 제거합니다. </li><li> 휴대폰 번호와 trypan 파랑을 사용하여 생존을 평가합니다. </li><li> PBS 2 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)에서 1,000,000 / ML로 세포 수를 조정합니다. </li></ol> 3. 표면 착색 <ol><li> 12x75 mm 유동 튜브로 테스트 당 1x10 6 / ML 세포 현탁액 100 μl를 전송합니다. </li><li> 항체의 적절한 금액을 추가합니다. 일치하는 Isotype 컨트롤은 각각에 대해 사용되어야합니다항체 (표 3 참조). </li><li> 얼음에 30 분에 품다. </li><li> 각 유동 튜브에 2 ML PBS 2 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)을 추가합니다. </li><li> 4 분, 가만히 따르다과 얼룩에 대해 200 XG에 원심 분리기. </li><li> 300 μl PBS 2 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)에 Resuspend 펠릿. </li><li> 각 튜브에 10 μl 7AAD 생존의 염료를 추가하고 얼음에 적어도 15 분에 품다. </li><li> 유동 세포 계측법에 의해 분석 할 수 있습니다. </li></ol> 4. 유동 세포 계측법의 수집 및 분석 흐름 데이터의 수집 및 분석의 세부 사항은 악기에 따라 달라집니다. 대표 부정적인 샘플은 실행하고 악기 설정은 앞으로 (크기) 및 측면 (단위) 분산을 위해 설립되어 있습니다. 이 분산 패턴은 최종 사용자가 쓰레기를 포함하여 샘플에있는 모든 셀을 볼 수 있습니다. 지역은 일반적으로 관심의 셀 주위에 그려집니다. (그림 4A) 설정은 다음 AF의 첫 10 년 내에 부정적인 셀을 배치하는 데 필요한 모든 형광 검출기에 설치되어luorescence 강도 줄거리. 하나 이상의 염색을하거나 fluorochrome를 사용하는 경우, 하나의 스테인드 컨트롤 색상 보상 값을 (형광 방출을 방해 빼기) 수립 실행해야합니다. 사용되며, 죽은 세포 (그림 4B) 제외 그려 두 번째 지역 - 라이브 세포 등 7 AAD (여기 488/emission 655 7 - 아미노 actinomycin D)과 같은 생존의 염료를 실행합니다. 이 지역은 모두 샘플 추가 분석에 적용됩니다. 5. 자기 갱신 분석 크게 clonal 영역의 성장에 의해 촉진되는 키 검정은 자기 갱신 용량 제한 희석 분석의의 체외 시험입니다. Tumorspheres는 dissociated 잘 당 하나의 셀에 dilutions에 다운 배포 있으며, 문화에 7 일 이후의 영역 형성의 비율이 계산됩니다. 일 7 각 셀 도금 밀도에 대한 분야를 (F 0) 포함하지 않는 우물의 비율이 계산하고 도시된다잘 당 세포 (x)의 수에 대한. 모든 잘에 최소 하나의 tumorsphere을 형성하는 데 필요한 셀의 수는 줄은 0.37 수준 (F 0 = 전자 x)를 교차하는 시점에서 결정됩니다. 세포의 푸 아송 분포,이 계산은 (37 %는 교차) 전체 세포 인구 (그림 5)에서 clonogenic 줄기 세포의 빈도를 반영하도록 잘 당 하나의 셀의 희석에 F 0 = 0.37에 해당. 6. 단일 셀 RT-PCR 다른 인구의 싱글 셀은 AmpliGrid 슬라이드 (Beckman 보습 바로 앞에 달린 풀 베는 날 고양이 # AG480F)에 반응 사이트에서 Beckman 보습 바로 앞에 달린 풀 베는 날 MoFlo XDP에 의해 정렬됩니다. 단일 셀 RT-PCR은 제조업체의 사양에 따라 AmpliGrid 단일 한 단계 RT-PCR 시스템 (Beckman 보습 바로 앞에 달린 풀 베는 날 고양이 # OAX04515)를 사용하여 수행됩니다. 간단히, 단일 세포는 AmpliGrid 슬라이드의 각 반응 사이트에 증착되는, 각각에 하나의 세포의 존재를반응 사이트는 현미경으로 확인했다. 역 전사 (RT)이 손상되지 않도록 샘플을 방지하기 위해 정렬 후 즉시 수행됩니다. RT 마스터 믹스는 키트 지침 (표 4)에 의하면, 신선한 준비가되어 있습니다. 우리는 반응 당 25 μM 무작위 프리 머 (Promega)의 0.03 μl를 사용, 마스터 믹스 1 μl은 각 반응 사이트의 중심에 추가됩니다. 이것은 즉시 밀봉 솔루션 (Beckman 보습 바로 앞에 달린 풀 베는 날 고양이 # OAX04503)의 5 μl으로 코팅되어 있습니다. AmpliSpeed​​ 슬라이드 자전거 타는 사람 (Beckman 보습 바로 앞에 달린 풀 베는 날, 고양이 # OAX04101)를 사용, 슬라이드는 25 incubated 아르 ° 10 분, 42에 C ° C 10 분, 55 ° C에 45 분을위한. 역 스크립트, DNase / RNase 무료 생수 3 μl은 각 반응 사이트에 추가하고, 전체 혼합물은 PCR 튜브 (1 관 / 사이트)로 이동 한 후. 8 μl qPCR 마스터 믹스 (5 μl Sybr 녹색 (콴타), 1 μl 물, 10 앞으로 μM 및 역방향 프라이머 믹스 1 μl)와 2 &amp; : PCR 플레이트에 10 μl의 반응 볼륨이 정량 PCR에 사용됩니다무, RT 혼합물의 리터. 실시간 정량화를 들어, 샘플은 다음과 같은 프로그램을 사용하여 BioRad 자전거 타는 사람에 게재됩니다 : 60 초에 60 초, 72 ° C 30 초 95 ° C 10 분, 95 ° C의 45주기, 60 ° C를 따라 72시 10 분에 의해 ° C 및 용해 곡선 분석. CT 값은 Opticon 모니터 3 (BioRad)를 사용하여 결정됩니다. 세 유전자는 하우스 키핑 유전자로 GAPDH를 포함, 셀 당 평가 할 수 있습니다. 유전자 발현은 2 ΔCt에 의하면, GAPDH 식으로 표준화되어 있습니다. 생물학적 기술은 복제의 부족을 보완하기 위해 복제와 같은 종류의 같은 인구 중 적어도 12 하나의 셀을 사용할 수 있습니다. 7. 대표 결과 그림 1은 GBM으로 대표 환자의 자기 공명 영상 (MRI) 스캔을 보여줍니다. 뇌 종양 샘플은 해밀턴 건강 과학 / McMaster 건강 S에서와 같은 승인 즉시 수술 후 동의 환자에서 얻은ciences 연구 윤리위원회. 각 표본의 일부는 일상적인 임상 진단 neuropathologist로 제공됩니다. 그림 2와 같이 나머지 샘플 처리됩니다. 그림 3과 같이 한 번 성장 요인, 양식 tumorspheres과 함께 완벽한 신경 줄기 세포 미디어에 도금 종양 세포. 종양 세포는 신경 표면 줄기 세포 마커 CD133과 CD15를 표시하고 그림 4와 같이 유동 세포 계측법에 의해 분석됩니다. 예를 들어, CD15 + / CD133에 대해 서로 다른 인구에서 단일 세포 +, CD15 + / CD133-, CD15-/CD133 +, CD15-/CD133- 후 96 잘 플레이트 (그림 5A)로 또는 AmpliGrid 슬라이드 (그림 6A)로 정렬됩니다. 96 잘 판에 자기 갱신 용량 (예 : CD133 + 세포), (그림 5B)를 가지고 하나의 세포는 incu 다음 (그림 5C) tumorspheres를 형성 할 수bation. 자기 갱신 그래프가 잘 형성 당 분야의 수를 계산하여 (5 일 그림) 역모를 할 수 있습니다. 싱글 셀 Ampligrid 슬라이드 (그림 6A)의 반응 사이트에 정렬. 하나의 세포에서 추출한 RNA는 역 Advalytix AmpliSpeed ​​(그림 6B)를 사용하여 베꼈 할 수 있습니다. 얻은 cDNA는 실시간 RT-PCR (그림 6C)를 수행하는 데 사용됩니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/4111/4111fig1.jpg" /> 1 그림. 환자 GBM의 자기 공명 영상 (MRI). 두통의 달 오랜 역사와 구토, 혼수 및 시각 흐리게의 1 주간의 역사를 가진 16 세 소녀의 뇌의 MRI 스캔. 축 방향 감각 시퀀스은 대형 이중 반구형 ( &quot;나비&quot;) GBM을 보여줍니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/4111/4111fig2.jpg" /> 그림 2. 뇌 종양 처리. 뇌 종양 샘플 obta 아르즉시 수술 후 환자 동의에서 ined. 그들은 (A)와 같이 기계적으로 dissociated이며 15 분 (B)를 37 ° C에서 30 RPM 흔들 보육에 잠복기로 Liberase과 aCSF에서 다음 효소 dissociated 있습니다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/4111/4111fig3.jpg" /> 그림 3. BTIC 인구는 문화에 tumorspheres를 형성하고 있습니다. 성장 요소와 함께 완벽한 신경 줄기 세포 미디어에 도금 Dissociated 뇌 종양 세포가 tumorspheres를 형성하고 있습니다. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/4111/4111fig4.jpg" /> 4 그림. BTIC 인구의 흐름 cytometric 분석. () 전달 측면 분산 특성 비교 (b)는 생존의 염료 7 AAD으로 얼룩 세포는 분석에서 제외됩니다 부스러기를 포함한 모든 세포의 이미지를 제공합니다. (C) 통계 당장 자리의 위치는 (d)에 종양 세포 표면 mA 물들 적절한 Isotype 컨트롤을 사용하여 결정됩니다rkers CD15-PE와 CD133-APC. (D) Moflo XDP 셀 정렬이 있습니다. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4111/4111fig4large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/4111/4111fig5.jpg" /> 그림 5. BTICs의 희석 분석을 제한하면 스스로 갱신 능력을 보여준다. (A) 다양한 dilutions의 세포가 잘 당 (b)는 하나의 셀에 NSC 200 μl를 포함하는 96 우물로 정렬됩니다. (C) 7 일 잠복기 후, tumorsphere가 형성된다. 보조 tumorspheres의 형태가 기본 tumorspheres의 동일합니다. (D) 평균 X-절편 값은 당, 적어도 한 tumorsphere을 형성하는 데 필요한 세포의 수를 표시하는 방법으로 각 종양 하위 유형에 대한 희석 분석을 제한으로부터 계산 될 수있다. <img alt="그림 6" src="/files/ftp_upload/4111/4111fig6.jpg" /> 6 그림. 하나의 BTIC 세포의 유전자 발현 분석가능한 단일 셀 RT-PCR 기술을 사용하고 있습니다. (A) BTIC 인구의 싱글 셀이 AmpliGrid 슬라이드에 정렬 할 수 있습니다. (B) cDNA 합성은 Advalytix AmpliSpeed​​를 사용하여 AmpliGrid 슬라이드에 하나의 셀에 수행됩니다. (C) 수량 실시간 PCR은 단일 BTIC 세포에서 합성 cDNA에 수행됩니다. <table border="1"><tbody><tr><td> 2M NaCl </td><td> 62 ML </td></tr><tr><td> 1M KCl </td><td> 5 ML </td></tr><tr><td> 100 MgCl 2 </td><td> 3.2 ML </td></tr><tr><td> 155 MM NaHCO 3 </td><td> 169 ML </td></tr><tr><td> 1M 포도당 </td><td> 10 ML </td></tr><tr><td> 108 MM CaCl 2 </td><td> 0.9256 ML </td></tr><tr><td> Purelab 울트라 H 2 0 </td><td> 749.84 ML </td></tr></tbody></table> 표 1 인공 뇌척수 (aCSF) -. 1,000 ML. <table border="1"><tbody><tr><td> 주식 자연적으로 흐르는 것과 미디어 </td><td> 500 ML </td></tr><tr><td> 1시 1분 DMEM : F12 </td><td> 480 ML </td></tr><tr><td> N2 보충 </td><td> 5 ML </td></tr><tr><td> 100 HEPES </td><td> 5 ML </td></tr><tr><td> 포도당 </td><td> 3.0 g </td></tr><tr><td> N-acetylcysteine​​ (60 μg / ML) </td><td> 한 ML </td></tr><tr><td> 신경 생존 인자 - 1 (NSF-1) </td><td> 10 ML </td></tr></tbody></table> 표 2. 신경 줄기 세포 미디어. NSC 전체 미디어 (사용하기 전에 새로운 한) : NSC 기저 미디어 + 20 NG / ML EGF (표피 성장 인자) + 20 NG / ML bFGF (기본 섬유 아세포 성장 인자) + 10 NG / ML 난생 (백혈병 억제 인자) * + 10 ML / μl 항생제 - antimycotic * 백혈병 억제 인자 (난생) : Millipore의이 시약은 인터루킨 6 급 시토 킨, 홍보를 포함줄기 세포 문화의 장기간 유지를 촉진 줄기 세포의 자연 차별화를 억제 otein. <table border="1"><tbody><tr><td> 항체 </td><td> 공급 업체 / CAT # </td><td> μl / 테스트 (100 μl)를 </td></tr><tr><td> CD133 / 2 APC (293C3) </td><td> Miltenyi Biotec/130-090-854 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> IgG2b APC (Isotype 제어) </td><td> Miltenyi Biotec/130-092-217 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> CD15PE </td><td> Beckman Coulter/IM1954U </td><td> 5 </td></tr><tr><td> IgG2a PE (Isotype 제어) </td><td> Beckman Coulter/A09141 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> 7AAD </td><td> Beckman Coulter/A07704 </td><td> 10 </td></tr></tbody></table> 표 3. 흐름 항체. <table border="1"><tbody><tr><td> 구성 요소 </td><td> 볼륨 (1 반응) </td><td> 볼륨 (48 반응) </td></tr><tr><td> 단일 셀 RT 반응 버퍼를 2 배 </td><td> 0.50 μl </td><td> 30.0 μl </td></tr><tr><td> RNase 억제제 (10 U / μl) </td><td> 0.02 μl </td><td> 1.2 μl </td></tr><tr><td> 5 배 싱글 셀 RT 증강 </td><td> 0.15 μl </td><td> 9.00 μl </td></tr><tr><td> 싱글 셀 RT 효소 믹스 </td><td> 0.04 μl </td><td> 2.4 μl </td></tr><tr><td> Advablue (OAX04227) </td><td> μl 0.1 </td><td> 6.00 μl </td></tr><tr><td> Nuclease 무료 물 </td><td> 1 μl까지 확인 </td><td> 60 μl까지 확인 </td></tr></tbody></table> 표 4. 단일 셀 RTPCR (고양이 # OAX04515)에 대한 RT 마스터 믹스의 구성.

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관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

백혈병 21 일을 기준으로 암 줄기 세포 가설 (10), 유방암은 암 11, 뇌 암 4,5는 종양의 세포 만 상대적으로 작은 부분, 칭했다 암 줄기 세포가 광범위하게 세포 분열 따위에 의해 번식과 자기 할 수있는 능력을 가지고하는 것이 좋습니다 갱신. 종양 세포의 대부분은 세포 분열 따위에 의해 번식하고 종양의 phenotypic 서명 될 세포로 분화으로 자기 갱신 할 수있는 능력을...

뇌 종양은 인간에 알려진 것 중 가장 공격적이고 이기종 암 등이 있습니다. 자신의 이전 감지 및 진단 현대적인 신경 영상 기술에 의해 촉진 된 있지만, 우리는 여전히 특히 확산, 침해들 또는 뇌 깊숙히 자리 분들을 위해, 많은 뇌 종양에 대한 치료 요법을 부족합니다. 뇌 종양은 매우 공격적이고 종종 불치의 특성으로 인해 아동 암 사망률의 주요 원인을 나타냅니다. Glioblastoma (GBM), 성인에서 가장 흔한 주요 뇌 종양은 그 균일하게 치명적인 예후 (豫后) 1 두려웠 가장 공격적인 인간 암의 하나입니다. 이 높은 악성 astrocytic 종양 (WHO가 4 학년) 일반적으로 성인의 대뇌 반구에서 발생하며 어린이와 유아에 발생할 수 있습니다. 의 성장은 신속하고 infiltrative이며, 진단 병리학 기능은 핵 pleomorphism, microvascular 확산 및 괴사 2,3가 포함되어 있습니다. adul에 대한TS 새로 진단 GBM과 함께 평균 생존은 거의 모든 치료 modalities에 일반적으로 가난한 응답과 함께, 12 개월 1 이상으로 확장하지 않습니다. 우리는 체세포의 줄기 세포와 암 세포에 의해 공유 많은 기능과 유전자 유사성이 있다는 것을 지적하고, 정상적인 뇌 발달을 조절 분자 경로는 종종 암으로 dysregulated됩니다. 뇌 종양의 연구에 줄기 세포 생물학의 패러다임을 적용에서, 우리는 prospectively 식별과 확산, 자기 갱신의 줄기 세포 특성을 전시 인간 GBMs 세포 subpopulation을 정화하는 최초의 연구했고, 체외 4과의 차별화 생체 5. 우리는 원래 여러 소아 및 성인 뇌 종양에 체외 6,7에서 정상적인 신경 줄기 세포 (NSCs)를 특징하는 데 사용 문화 조건과 assays을 적용하고, CD133 8 신경 전구 세포 표면 마커에 대한 정렬 셀하여이 줄기 같은 세포에 풍부 ,9. CD133 + 뇌 종양 비율 NOD-SCID 마우스 머리 5,10에서 CD133-분율보다 종양 개시의 훨씬 더 높은 주파수를 가지고 세포가 포함되어 있습니다. 이 공식적으로 줄기 세포 특성을 가진 뇌 종양 세포 만 드문 일부는 종양 - 시작의 이름 &quot;뇌 종양 세포를 시작&quot;을 수입 또는 &quot;BTICs &#39;이라는 설립했다. BTICs의 소설 식별는 많은 고체 종양에 대한 기준으로 암 줄기 세포 가설 10-13에 대한 강력한 지원을 제공 인간의 뇌 tumorigenesis에 새로운 통찰력을 제공하고보다 효과적인 암 치료 14-20를위한 새로운 휴대 목표를 설정합니다. 종양의 대부분을 죽이고에 초점이 종양 성장을 계속 할 수 있도록 희귀 한 줄기와 같은 일부를 놓칠 수 있다는 요법. 암 줄기 세포를 죽이는에 초점이 뇌 종양 환자에게 더 나은 치료 및 예후 (豫 后)를 제공 할 수 있다는 요법. BTIC 인구를 공부하기 위해, 우리는 우리의 cultu를 수정특히 줄기 세포 특성을 가지고 인간의 뇌 종양 내의 세포 집단을 위해 선택할 수있는 프로토콜을 다시. 세럼 - 무료 신경 줄기 매체가 undifferentiated 줄기 세포 상태의 유지를위한 수 셀 (NSC) 및 기본 섬유 아세포 성장 인자 (bFGF), 표피 성장 인자 (EGF) 및 백혈병 억제 인자를 추가합니다 (난생)을 할 수 있습니다 멀티 강력한, 자기 갱신과 확장 인간 tumorspheres의 확산. 여기, 우리는 기본 뇌 종양과 BTIC 인구에 풍부하게하기 위해 NSC 매체에서 배양를 처리에 관련된 방법을 설명합니다. 우리 실험 모델 시스템을 이러한 세포 만이 최소한 줄기에서 배양 있다는 사실을 강조하기 위해 &quot;BTIC 환자 격리&quot;라고했습니다 줄기 세포 집단을위한 선택 셀 조건은. 등 CD133과 CD15 및 유동 세포 계측법 분석 등의 주요 줄기 세포 마커에 대한 BTIC 인구 이후에 immunolabelling도 설명되어 있습니다. 우리는 제한 희석 분석을 논의이는 BTICs의 자기 갱신 잠재력을 공부에 에이즈. 마지막으로, 우리는 AmpliGrid 슬라이드에 하나의 세포를 정렬 및 단일 셀 RT-PCR을 수행하여 이러한 희귀 한 세포의 유전자 발현 분석을 탐험 해보세요. 이 기술은 또한 medulloblastoma, ependymoma 및 소아 gliomas 같은 다른 뇌 종양에 적용됩니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td></tr><tr><td> 1시 1분 DMEM : F12 </td><td> Invitrogen </td><td> 11320-082 </td></tr><tr><td> N2 보충 </td><td> Invitrogen </td><td> 17502-048 </td></tr><tr><td> 100 HEPES </td><td> Wisent </td><td> 330-050 ​​- EL </td></tr><tr><td> 포도당 </td><td> Invitrogen </td><td> 15023-021 </td></tr><tr><td> N-acetylcysteine </td><td> 시그마 알드리치 </td><td> A9165-25g </td></tr><tr><td> 신경 생존 요소 -1 (NSF-1) </td><td> Lonza Clonetics </td><td> CC-4323 </td></tr><tr><td> 표피 성장 인자 (EGF) </td><td> 시그마 알드리치 </td><td> E9644 </td></tr><tr><td> 기본 섬유 아세포 성장 인자 (bFGF) </td><td> Invitrogen </td><td> PHG0261 </td></tr><tr><td> 백혈병 억제 인자 (난생) </td><td> Millipore </td><td> LIF1010 </td></tr><tr><td> mycotic / 항생제 </td><td> Wisent </td><td> 450-115 - EL </td></tr><tr><td> Liberase TM </td><td> 로슈 </td><td> 05 401 119 001 </td></tr><tr><td> 염화 암모늄 솔루션 </td><td> 셀 기술을 줄기 </td><td> 07,850 </td></tr></tbody></table>

processing of primary brain tumor tissue for stem cell assays and flow sorting

뇌 종양은 일반적으로 신경 계통 마커의 다양한 표현 morphologically 다양한 세포로 구성되어 있습니다. 줄기 세포 특성을 가진 종양의 세포 만 상대적으로 작은 부분, 칭했다 뇌 종양 세포 시작 (BTICs)는 여러 lineages 따라 차별화 자기 갱신, 그리고 생체에 종양을 시작할 수있는 능력을 가지고 있습니다. 우리는 원래 인간의 뇌 종양의 다양한 일반 신경 줄기 세포 (NSCs)에 사용이 문화 방법은 특히 줄기처럼 인구에 대한 선택을 발견 문화 조건을 적용했습니다. 혈청 무료 매체 (NSC)는 undifferentiated 줄기 세포 상태의 유지를위한 수 있으며, bFGF와 EGF의 추가는 멀티 강력한, 자기 갱신의 확산, 그리고 확장 tumorspheres 할 수 있습니다. 추가로 각 종양의 BTIC 인구 특성화하기 위해, 우리는 유동 세포 계측법에 의해 세포 표면 마커를 평가합니다. 우리는 또한보다 구체적인 characteriz에 대한 관심 인구를 정​​렬 할 수도 있습니다ation. 자기 갱신 assays는 96도 판으로 정렬 한 BTICs에서 수행되며, 37 부화에 따라 tumorspheres의 형성은 ° C는 막대 또는 전구 세포의 존재를 나타냅니다. 특정 인구의 다수의 전화 번호도 자기 갱신 능력을 분석하기 위해 희석 분석을 제한에 대해 서로 다른 우물으로 정렬 할 수 있습니다. 우리는 또한 단일 셀 RT-PCR을 사용하여 특정 세포 인구에서 차동 유전자 발현을 연구 할 수 있습니다. 다음 프로토콜 BTIC 인구뿐만 아니라 tumorspheres의 분리에 대해 풍부하게하기 위해 기본 인간의 샘플 분리 및 배양을위한 우리의 절차를 설명합니다. 또한 유동 세포 계측법 분석이나 정렬, 자기 갱신 assays, 단일 셀 RT-PCR에 얼룩을위한 프로토콜입니다 포함되어 있습니다.

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Processing of Primary Brain Tumor Tissue for Stem Cell Assays and Flow Sorting

뇌 종양 세포 시작 (BTICs), 이기종 종양이 가진 줄기 세포의 속성 내에있는 희귀 한 세포의 식별은 인간의 뇌 종양의 pathogenesis에 새로운 통찰력을 제공합니다. 우리는 BTICs에 풍부하게 특정 문화 조건을 정제 한, 우리는 정기적으로 더 이러한 인구 풍부 유동 세포 계측법을 사용합니다. 단일 셀 RT-PCR에 의한 자기 갱신 assays 및 성적표 분석은 이후 이러한 절연 셀에 수행 할 수 있습니다.

정렬 줄기 세포 Assays 및 흐름에 대한 기본 뇌 종양 조직의 처리

Brain tumors are typically comprised of morphologically diverse cells that express a variety of neural lineage markers. Only a relatively small fraction ...

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17.9K 조회수.  McMaster University. 뇌 종양 세포 시작 (BTICs), 이기종 종양이 가진 줄기 세포의 속성 내에있는 희귀 한 세포의 식별은 인간의 뇌 종양의 pathogenesis에 새로운 통찰력을 제공합니다. 우리는 BTICs에 풍부하게 특정 문화 조건을 정제 한, 우리는 정기적으로 더 이러한 인구 풍부 유동 세포 계측법을 사용합니다. 단일 셀 RT-PCR에 의한 자기 갱신 assays 및 성적표 분석은 이후 이러한 절연 셀?...

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Preparation of Myeloid Derived Suppressor Cells (MDSC) from Naive and Pancreatic Tumor-bearing Mice using Flow Cytometry and Automated Magnetic Activated Cell Sorting (AutoMACS)

MDSC are a heterogeneous population of immature macrophages, dendritic cells and granulocytes that accumulate in lymphoid organs in pathological conditions including parasitic infection, inflammation, traumatic stress, graft-versus-host disease, diabetes and cancer1-7. In mice, MDSC express Mac-1 (CD11b) and Gr-1 (Ly6G and Ly6C) surface antigens7. It is important to note that MDSC are well studied in various tumor-bearing hosts where they are significantly expanded and suppress anti-tumor immune responses compared to na&iuml;ve counterparts7-10. However, depending on the pathological condition, there are different subpopulations of MDSC with distinct mechanisms and targets of suppression11,12. Therefore, effective methods to isolate viable MDSC populations are important in elucidating their different molecular mechanisms of suppression in vitro and in vivo.
Recently, the Ghansah group has reported the expansion of MDSC in a murine pancreatic cancer model. Our tumor-bearing MDSC display a loss of homeostasis and increased suppressive function compared to na&iuml;ve MDSC 13. MDSC percentages are significantly less in lymphoid compartments of na&iuml;ve vs. tumor-bearing mice. This is a major caveat, which often hinders accurate comparative analyses of these MDSC. Therefore, enriching Gr-1+ leukocytes from na&iuml;ve mice prior to Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) enhances purity, viability and significantly reduces sort time. However, enrichment of Gr-1+ leukocytes from tumor-bearing mice is optional as these are in abundance for quick FACS sorting. Therefore, in this protocol, we describe a highly efficient method of immunophenotyping MDSC and enriching Gr-1+ leukocytes from spleens of na&iuml;ve mice for sorting MDSC in a timely manner. Immunocompetent C57BL/6 mice are inoculated with murine Panc02 cells subcutaneously whereas na&iuml;ve mice receive 1XPBS. Approximately 30 days post inoculation; spleens are harvested and processed into single-cell suspensions using a cell dissociation sieve. Splenocytes are then Red Blood Cell (RBC) lysed and an aliquot of these leukocytes are stained using fluorochrome-conjugated antibodies against Mac-1 and Gr-1 to immunophenotype MDSC percentages using Flow Cytometry. In a parallel experiment, whole leukocytes from na&iuml;ve mice are stained with fluorescent-conjugated Gr-1 antibodies, incubated with PE-MicroBeads and positively selected using an automated Magnetic Activated Cell Sorting (autoMACS) Pro Separator. Next, an aliquot of Gr-1+ leukocytes are stained with Mac-1 antibodies to identify the increase in MDSC percentages using Flow Cytometry. Now, these Gr1+ enriched leukocytes are ready for FACS sorting of MDSC to be used in comparative analyses (na&iuml;ve vs. tumor- bearing) in in vivo and in vitro assays.

Preparation of Myeloid Derived Suppressor Cells MDSC from Naive and Pancreatic Tumor-bearing Mice using Flow Cytometry and Automated Magnetic Activated Cell Sorting AutoMACS

This is a rapid and comprehensive method of immunophenotyping Myeloid Derived Suppressor Cells (MDSC) and enriching Gr-1+ leukocytes from mouse spleens. This method uses flow cytometry and AutoMACS Cell Sorting to enrich for viable Gr-1+ leukocytes prior to FACS sorting of MDSC for use in vivo and in vitro assays.

유동세포계측법 및 자동화된 마그네틱 활성화 셀 정렬 (AutoMACS)를 사용 나이브 및 췌장 종양 베어링 마우스에서 골수양 파생 억제 세포 (MDSC)의 작성

MDSC are a heterogeneous population of immature macrophages, dendritic cells and granulocytes that accumulate in lymphoid organs in pathological ...

연구

의학

Isolation of Cardiomyocyte Nuclei from Post-mortem Tissue

Identification of cardiomyocyte nuclei has been challenging in tissue sections as most strategies rely only on cytoplasmic marker proteins1. Rare events in cardiac myocytes such as proliferation and apoptosis require an accurate identification of cardiac myocyte nuclei to analyze cellular renewal in homeostasis and in pathological conditions2. Here, we provide a method to isolate cardiomyocyte nuclei from post mortem tissue by density sedimentation and immunolabeling with antibodies against pericentriolar material 1 (PCM-1) and subsequent flow cytometry sorting. This strategy allows a high throughput analysis and isolation with the advantage of working equally well on fresh tissue and frozen archival material. This makes it possible to study material already collected in biobanks. This technique is applicable and tested in a wide range of species and suitable for multiple downstream applications such as carbon-14 dating3, cell-cycle analysis4, visualization of thymidine analogues (e.g. BrdU and IdU)4, transcriptome and epigenetic analysis.

Cardiac nuclei are isolated via density sedimentation and immunolabeled with antibodies against pericentriolar material 1 (PCM-1) to identify and sort cardiomyocyte nuclei by flow cytometry.

사후 조직에서 Cardiomyocyte 핵의 분리

Identification of cardiomyocyte nuclei has been challenging in tissue sections as most strategies rely only on cytoplasmic marker proteins1. Rare events ...

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human pulp-derived stem cells (hDPSCs) possess high proliferation potential with multi-lineage differentiation capacity compare to the ordinary source of adult stem cells1-8; therefore, hDPSCs could be the good candidates for autologous transplantation in tissue engineering and regenerative medicine. Along with these benefits, possessing the mesenchymal stem cells (MSC) features, such as immunolodulatory effect, make hDPSCs more valuable, even in the case of allograft transplantation6,9,10. Therefore, the primary step for using this source of stem cells is to select the best protocol for isolating hDPSCs from pulp tissue. In order to achieve this goal, it is crucial to investigate the effect of various isolation conditions on different cellular behaviors, such as their common surface markers &amp; also their differentiation capacity.
Thus, here we separate human pulp tissue from impacted third molar teeth, and then used both existing protocols based on literature, for isolating hDPSCs,11-13 i.e. enzymatic dissociation of pulp tissue (DPSC-ED) or outgrowth from tissue explants (DPSC-OG). In this regards, we tried to facilitate the isolation methods by using dental diamond disk. Then, these cells characterized in terms of stromal-associated Markers (CD73, CD90, CD105 &amp; CD44), hematopoietic/endothelial Markers (CD34, CD45 &amp; CD11b), perivascular marker, like CD146 and also STRO-1. Afterwards, these two protocols were compared based on the differentiation potency into odontoblasts by both quantitative polymerase chain reaction (QPCR) &amp; Alizarin Red Staining. QPCR were used for the assessment of the expression of the mineralization-related genes (alkaline phosphatase; ALP, matrix extracellular phosphoglycoprotein; MEPE &amp; dentin sialophosphoprotein; DSPP).14

The method described isolation and characterization of human Dental Pulp Stem Cells (hDPSCs) by using either enzymatic dissociation of pulp (DPSC-ED) or direct outgrowth of stem cells from pulp tissue explants (DPSC-OG). Then followed by in vitro comparative differentiation of both types of hDPSCs into odontoblasts.

인간 치과 펄프의 줄기 세포의 분리, 특성화 및 비교 차별화 두 가지 방법을 사용하여 영구 치아에서 파생

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for progression-free and overall survival. Therefore, translational research needs to provide further molecular evidence to improve targeted therapies for malignant melanomas. In the past, oncogenic mechanisms related to melanoma were extensively studied in established cell lines. On the way to more personalized treatment regimens based on individual genetic profiles, we propose to use patient-derived cell lines instead of generic cell lines. Together with high quality clinical data, especially on patient follow-up, these cells will be instrumental to better understand the molecular mechanisms behind melanoma progression.
Here, we report the establishment of primary melanoma cultures from dissected fresh tumor tissue. This procedure includes mincing and dissociation of the tissue into single cells, removal of contaminations with erythrocytes and fibroblasts as well as primary culture and reliable verification of the cells' melanoma origin.
Recent reports revealed that melanomas, like the majority of tumors, harbor a small subpopulation of cancer stem cells (CSCs), which seem to exclusively fuel tumor initiation and progression towards the metastatic state. One of the key markers for CSC identification and isolation in melanoma is CD133. To isolate CD133+ CSCs from primary melanoma cultures, we have modified and optimized the Magnetic-Activated Cell Sorting (MACS) procedure from Miltenyi resulting in high sorting purity and viability of CD133+ CSCs and CD133- bulk, which can be cultivated and functionally analyzed thereafter.

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

This article describes the preparation of freshly obtained melanoma tissue into primary cell cultures, and how to remove contaminations of erythrocytes and fibroblasts from the tumor cells. Finally, we describe how CD133+ putative melanoma stem cells are sorted from the CD133- bulk using Magnetic Activated Cell Sorting (MACS).

환자 유래 세포 배양 및 CD133의 절연<sup&gt; +</sup흑종에서&gt; Putative 암 줄기 세포

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for ...

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a novel platform that allows for direct long-term visualization of tissue structure changes intracranially. Imaging at a single cell resolution in a real-time fashion provides supplementary dynamic information beyond that provided by standard end-point histological analysis, which looks solely at 'snap-shot' cross sections of tissue.
Establishing this intravital imaging technique in fluorescent chimeric mice, we are able to image four fluorescent channels simultaneously. By incorporating fluorescently labeled cells, such as GFP+ bone marrow, it is possible to track the fate of these cells studying their long-term migration, integration and differentiation within tissue. Further integration of a secondary reporter cell, such as an mCherry glioma tumor line, allows for characterization of cell:cell interactions. Structural changes in the tissue microenvironment can be highlighted through the addition of intra-vital dyes and antibodies, for example CD31 tagged antibodies and Dextran molecules.
Moreover, we describe the combination of our ICW imaging model with a small animal micro-irradiator that provides stereotactic irradiation, creating a platform through which the dynamic tissue changes that occur following the administration of ionizing irradiation can be assessed.
Current limitations of our model include penetrance of the microscope, which is limited to a depth of up to 900 &mu;m from the sub cortical surface, limiting imaging to the dorsal axis of the brain. The presence of the skull bone makes the ICW a more challenging technical procedure, compared to the more established and utilized chamber models currently used to study mammary tissue and fat pads 5-7. In addition, the ICW provides many challenges when optimizing the imaging.

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

We describe a novel in vivo imaging technique that couples fluorescent chimeric mice with intracranial windows and high-resolution 2-photon microscopy. This imaging platform aids studies of dynamic changes in brain tissue and microvasculature, at a single-cell level, following pathological insults and is adaptable to assess intracranial drug delivery and distribution.

소설 고해상도<em&gt; 생체 내</em종양의 성장과 치료학에 두개 내 구조물의 동적 응답을 공부하기&gt; 이미징 기술

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a ...

Adaptation of Semiautomated Circulating Tumor Cell (CTC) Assays for Clinical and Preclinical Research Applications

The majority of cancer-related deaths occur subsequent to the development of metastatic disease. This highly lethal disease stage is associated with the presence of circulating tumor cells (CTCs). These rare cells have been demonstrated to be of clinical significance in metastatic breast, prostate, and colorectal cancers. The current gold standard in clinical CTC detection and enumeration is the FDA-cleared CellSearch system (CSS). This manuscript outlines the standard protocol utilized by this platform as well as two&#160;additional adapted protocols that describe the detailed process of user-defined marker optimization for protein characterization of patient CTCs and a comparable protocol for CTC capture in very low volumes of blood, using standard CSS reagents, for studying in vivo preclinical mouse models of metastasis. In addition, differences in CTC quality between healthy donor blood spiked with cells from tissue culture versus patient blood samples are highlighted. Finally, several commonly discrepant items that can lead to CTC misclassification errors are outlined. Taken together, these protocols will provide a useful resource for users of this platform interested in preclinical and clinical research pertaining to metastasis and CTCs.

Adaptation of Semiautomated Circulating Tumor Cell CTC Assays for Clinical and Preclinical Research Applications

Circulating tumor cells (CTCs) are prognostic in several metastatic cancers. This manuscript describes the gold standard CellSearch system (CSS) CTC enumeration platform and highlights common misclassification errors. In addition, two&#160;adapted protocols are described for user-defined marker characterization of CTCs and CTC enumeration in preclinical mouse models of metastasis using this technology.

임상 및 전임상 연구 응용 프로그램에 대한 종양 세포 (CTC) 분석 실험을 순환 반자동의 적응

The majority of cancer-related deaths occur subsequent to the development of metastatic disease. This highly lethal disease stage is associated with the ...

Evaluation of Stem Cell Properties in Human Ovarian Carcinoma Cells Using Multi and Single Cell-based Spheres Assays

Years of research indicates that ovarian cancers harbor a heterogeneous mixture of cells including a subpopulation of so-called &#8220;cancer stem cells&#8221; (CSCs) responsible for tumor initiation, maintenance and relapse following conventional chemotherapies. Identification of ovarian CSCs is therefore an important goal. A commonly used method to assess CSC potential in vitro is the spheres assay in which cells are plated under non-adherent culture conditions in serum-free medium supplemented with growth factors and sphere formation is scored after a few days. Here, we review currently available protocols for human ovarian cancer spheres assays and perform a side-by-side analysis between commonly used multi cell-based assays and a more accurate system based on single cell plating. Our results indicate that both multi cell-based as well as single cell-based spheres assays can be used to investigate sphere formation in vitro. The more laborious and expensive single cell-based assays are more suitable for functional assessment of individual cells and lead to overall more accurate results while multi cell-based assays can be strongly influenced by the density of plated cells and require titration experiments upfront. Methylcellulose supplementation to multi cell-based assays can be effectively used to reduce mechanical artifacts.

In vitro spheres assays are commonly used to identify cancer stem cells. Here we compare single with multi cell-based spheres assays. The more laborious single cell-based assays or methylcellulose supplementation give more accurate results while multi cell-based assays performed in liquid medium can be highly influenced by cell density.

다중 및 단일 세포 기반 분야 분석 실험을 사용하여 인간의 난소 암 세포의 줄기 세포 특성의 평가

Years of research indicates that ovarian cancers harbor a heterogeneous mixture of cells including a subpopulation of so-called &#8220;cancer stem ...

Primary Tumor and MEF Cell Isolation to Study Lung Metastasis

In breast tumorigenesis, the metastatic stage of the disease poses the greatest threat to the affected individual. Normal breast cells with altered genotypes now possess the ability to invade and survive in other tissues. In this protocol, mouse mammary tumors are removed and primary cells are prepared from tumors. The cells isolated from this procedure are then available for gene profiling experiments. For successful metastasis, these cells must be able to intravasate, survive in circulation, extravasate to distant organs, and survive in that new organ system. The lungs are the typical target of breast cancer metastasis. A set of genes have been discovered that mediates the selectivity of metastasis to the lung. Here we describe a method of studying lung metastasis from a genetically engineered mouse model.. Furthermore, another protocol for analyzing mouse embryonic fibroblasts (MEFs) from the mouse embryo is included. MEF cells from the same animal type provide a clue of non-cancer cell gene expression. Together, these techniques are useful in studying mouse mammary tumorigenesis, its associated signaling mechanisms and pathways of the abnormalities in embryos.

The goal of this protocol is to study breast tumorigenesis. With this technique, mouse mammary tumors are removed and primary cells are prepared from tumors. A lung extraction protocol is included for studying lung metastasis. Furthermore, another protocol for analyzing mouse embryonic fibroblasts from the mouse embryo is included.

차 종양과 폐 전이을 연구하기 위해 MEF 세포 격리

In breast tumorigenesis, the metastatic stage of the disease poses the greatest threat to the affected individual. Normal breast cells with altered ...

In Vitro Assays to Assess Blood-brain Barrier Mesh-like Vessel Formation and Disruption

Blood-brain barrier (BBB) coverage plays a central role in the homeostasis of the central nervous system (CNS). The BBB is dynamically maintained by astrocytes, pericytes and brain endothelial cells (BECs). Here, we detail methods to assess BBB coverage using single cultures of immortalized human BECs, single cultures of primary mouse BECs, and a humanized triple culture model (BECs, astrocytes and pericytes) of the BBB. To highlight the applicability of the assays to disease states, we describe the effect of oligomeric amyloid-&#946; (oA&#946;), which is an important contributor to Alzheimer&#39;s disease (AD) progression, on BBB coverage. Further, we utilize the epidermal growth factor (EGF) to illuminate the drug screening potential of the techniques. Our results show that single and triple cultured BECs form meshwork-like structures under basal conditions, and that oA&#946; disrupts this cell meshwork formation and degenerates the preformed mesh structures, but EGF blocks this disruption. Thus, the techniques described are important for dissecting fundamental and disease-relevant processes that modulate BBB coverage.

In Vitro Assays to Assess Blood-brain Barrier Mesh-like Vessel Formation and Disruption

Maintaining blood-brain barrier coverage is key for the homeostasis of the central nervous system. This protocol describes in vitro techniques to delineate the fundamental and pathological processes that modulate blood-brain barrier coverage.

혈액 뇌 장벽 메쉬와 유사한 혈관 형성 및 분열을 평가하기위한 In vitro 시험 법

Blood-brain barrier (BBB) coverage plays a central role in the homeostasis of the central nervous system (CNS). The BBB is dynamically maintained by ...

Sampling Strategies and Processing of Biobank Tissue Samples from Porcine Biomedical Models

In translational medical research, porcine models have steadily become more popular. Considering the high value of individual animals, particularly of genetically modified pig models, and the often-limited number of available animals of these models, establishment of (biobank) collections of adequately processed tissue samples suited for a broad spectrum of subsequent analyses methods, including analyses not specified at the time point of sampling, represent meaningful approaches to take full advantage of the translational value of the model. With respect to the peculiarities of porcine anatomy, comprehensive guidelines have recently been established for standardized generation of representative, high-quality samples from different porcine organs and tissues. These guidelines are essential prerequisites for the reproducibility of results and their comparability between different studies and investigators. The recording of basic data, such as organ weights and volumes, the determination of the sampling locations and of the numbers of tissue samples to be generated, as well as their orientation, size, processing and trimming directions, are relevant factors determining the generalizability and usability of the specimen for molecular, qualitative, and quantitative morphological analyses. Here, an illustrative, practical, step-by-step demonstration of the most important techniques for generation of representative, multi-purpose biobank specimen from porcine tissues is presented. The methods described here include determination of organ/tissue volumes and densities, the application of a volume-weighted systematic random sampling procedure for parenchymal organs by point-counting, determination of the extent of tissue shrinkage related to histological embedding of samples, and generation of randomly oriented samples for quantitative stereological analyses, such as isotropic uniform random (IUR) sections generated by the &#34;Orientator&#34; and &#34;Isector&#34; methods, and vertical uniform random (VUR) sections.

The practical application and performance of methods for generation of representative tissue samples of porcine animal models for a broad spectrum of downstream analyses in biobank projects are demonstrated, including volumetry, systematic random sampling, and differential processing of tissue samples for qualitative and quantitative morphologic and molecular analyses types.

샘플링 전략 및 돼지 생물 의학 모델에서 Biobank 조직 샘플의 처리

In translational medical research, porcine models have steadily become more popular. Considering the high value of individual animals, particularly of ...