저자는이 일을 지원하고 비판적으로 원고를 읽기 위해 교수 M. Dietel와 더크 슈마허 감사드립니다. 이러한 결과로 이어지는 연구 보조금 협정 N 아래의 혁신적인 의약품 사업 공동 인수 ° 115,234, 유럽 연합 (EU)의 7 번째 프레임 워크 프로그램 (FP7/2007-2013)와 EFPIA 회사 &#39;에서의 금전적 인 기부로 구성되는 자원의 지원을받은 친절한 기여. 이 작품은 베를린 Krebsgesellschaft (BKG)에 의해 지원되었다.

기본 세포 배양, 섬유 아세포 고갈과 CD133의 자기 세포 정렬의 종양 조직, 특성의 기본 단일 세포의 준비를 포함하여 실험의 전체 계획은 +와 CD133 - 흑색 증 세포는 그림 1에 표시됩니다. 1. 샘플 취득 <ol><li> 다음 단계를 고려하기 전에 윤리적 승인을 확인합니다. </li><li> 멸균 PBS가 수술 또는 팀 이상 1퍼센트 페니실린 - 스트렙토 마이신 최종 농도와 손으로 보충과 함께 50 ML 튜브를 준비합니다. </li><li> 4 ° C.에서 수술에서 세포 배양 연구소로 종양 조직의 빠른 전송을 구성 </li></ol> 2. 종양 조직에서 기본 흑종 단일 세포를 준비 <ol><li> 무균 조건 하에서 모든 단계를 수행합니다. </li><li> 종양을 절제하기 전에, 하나는 해리 믹스를 준비해야합니다. 2-4g 조직 당 10 ML 해리 혼합이 필요합니다. 믹스는 immedia를 사용할 수 있습니다tely 또는 나중에 사용하기 위해 -20 ° C에서 10 ML aliquots에 저장됩니다. <ol><li> 150 밀리미터 나트륨 염화물을 포함하는 솔루션을 준비합니다. 솔루션이 명확 할 때까지 소용돌이를 사용하여 섞는다. 만약 0.22 μm 필터를 사용하여 필요한 멸균 - 여과 나트륨 염화물 솔루션입니다. </li><li> DNase I을 무게 10 밀리그램 / 150mM 나트륨 염화물에 ML DNase I을 포함하는 솔루션을 준비합니다. 솔루션이 명확 할 때까지 버팅으로 섞는다. </li><li> PBS에서 100mg/ml Collagenase IV를 포함하는 솔루션을 준비합니다. 솔루션이 명확 할 때까지 버팅으로 섞는다. collagenase 솔루션의 Aliquots은 몇 달 동안 -20 ° C에 저장할 수 있습니다. </li><li> 1퍼센트 페니실린 - 스트렙토 마이신, 1 MG / ML Collagenase IV 및 0.1 밀리그램 / 양자 263 매체에서 ML DNase I의 최종 농도로 해리 믹스를 준비합니다. 소용돌이를 사용하여 섞는다. 선택 사항 : 1.5 μg / ML Amphotericin B.의 최종 농도로 분리 믹스로 피부를 추가 Amphotericin B 솔루션에서 파생 흑색 증 세포를 사용하는 경우 </li></ol></li><li> 사전 따뜻한 req37 해리 믹스, PBS 및 양자 263 매체의 uired 양 ° C. </li><li> 멸균 페트리 접시에 장소 종양 조직. 조직에서 과도한 솔루션을 기음 500 μl 분리 믹스를 추가합니다. 신선한, 멸균 메스를 사용하여 2-4밀리미터 작은 조각으로 종양을 이기다. </li><li> 전송 2~4그램 5 ML 해리 혼합을 포함하는 gentleMACS C 관에 종양 조직을 다진. 추가 4.5 ML 분리 믹스로 페트리 접시를 씻어 gentleMACS C 튜브에 남아있는 조직 조각을 추가 할 수 있습니다. </li><li> gentleMACS C 관을 닫고 gentleMACS의 Dissociator의 소매에 거꾸로을 첨부합니다. gentleMACS 프로그램 &quot;h_tumor_01&quot;를 실행합니다. </li><li> dissociator에서 gentleMACS C 관을 분리하고 37 30 분의 샘플을 배양 ° C 정착 조직 조각을 resuspend하기 위해 최선을 5 분 가장 높은 실행 속도 (12 RPM) 또는 수동으로 튜브를 회전하여 MACSmix 튜브 회선 근을 사용하여 연속 회전에 따라 . </li><li> t의 소매에 거꾸로 gentleMACS C 관을 첨부그는 gentleMACS Dissociator하고 gentleMACS 프로그램 &quot;h_tumor_02&quot;를 실행합니다. </li><li> dissociator에서 gentleMACS C 관을 분리하고 37 30 분의 샘플을 배양 ° C 정착 조직 조각을 resuspend하기 위해 최선을 5 분 가장 높은 실행 속도 (12 RPM) 또는 수동으로 튜브를 회전하여 MACSmix 튜브 회선 근을 사용하여 연속 회전에 따라 . </li><li> gentleMACS의 Dissociator의 소매에 거꾸로 gentleMACS C 관을 첨부하여 gentleMACS 프로그램 &quot;h_tumor_03&quot;를 실행합니다. </li><li> dissociator, resuspend 샘플에서 gentleMACS C 관을 분리하고 50 ML 튜브에 위치 70 μm 세포 스트레이너에 세포 현탁액을 적용합니다. 필터의 막힘 것이 발생하면 전체 현탁액을 통해 실행까지 살균 필터 팁과 세포 현탁액을 젓는다. </li><li> 5 ML 양자 263 매체와 셀 스트레이너를 씻어. </li><li> 선택 사항 : 당신은 여전히​​ 양자 263 매체와 적절한 세포 배양 말요에 씨앗을에 필터를 resuspend 조각에 남아있는 조직 조각이있는 경우H. 37 조각을 길러 ° C 5 % CO 2. </li><li> 셀 스트레이너을 취소하고 소화 세포 현탁액으로 50 ML 튜브를 닫습니다. 300 XG에서 5 분에 세포 현탁액을 원심 분리기하고 표면에 뜨는 폐기하십시오. </li><li> 선택 사항 : 셀 펠렛 인해 적혈구 500 μl PBS로 두 번 증류수, resuspend 세포 펠렛의 10 배 솔루션 1시 10분을 diluting하여 1X 적혈구 용해 용액을 준비하는 높은 금액으로, 5 ML 1X 적혈구 용해를 추가 빨간색 표시되는 경우 솔루션입니다. 10 분 동안 실온에서 소용돌이 5 초 및 품다. 300 XG에서 5 분 동안 원심 분리기와 표면에 뜨는 폐기하십시오. </li><li> 양자 263과 씨앗 적절한 세포 배양 플라스크에 세포와 종양 세포를 Resuspend. 37 번 문화 종양 세포 ° C 5 % CO 2가 80 % 합류에 도달 정기적으로 통로 세포. </li></ol> 3. 기본 셀 문화와 섬유 아세포 고갈의 특성 <ol><li> phenotypically microsco를 사용하여 기본 세포 배양를 분석PE. </li><li> 기본 세포 배양의 작은 양 (0.5x 10 6 세포)를 수확하고 neoplastic -, 흑색 증 -, 줄기 세포와 기질 세포 마커 유전자에 대한 프리 머와 RT-PCR을 수행합니다. 분석 할 수있는 가장 중요한 유전자는 CD90 (섬유 아세포 마커), 티르 (흑색 증 / melanocyte 마커), CD133 (암 줄기 세포 마커), CD83 (성숙 수지상 세포 마커) 및 하우스 키핑 유전자 (예 : HPRT 또는 GAPDH)입니다. </li><li> RT-PCR 동안 현미경 분석과 CD90의 높은 표현이 섬유 아세포와 기본 흑색 증 문화의 높은 오염을 공개하는 경우, 당신은 Miltenyi에서 안티 섬유 아세포의 MicroBeads 및 D 열을 사용하여 섬유 아세포를 고갈해야합니다. </li></ol> 4. 자기 세포 CD133의 정렬 +와 CD133 - LS 열을 사용하여 흑종 셀 <ol><li> PBS 2 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 5 % FCS를 포함하는 맥 버퍼를 준비합니다. 0.22 μm Steritop-GP 필터 유닛을 사용하여 반전 및 살균 - 여과 버퍼로 섞는다. 4-8 ° C에 칠 버퍼사용하기 전에 및 가스를 제거하다. </li><li> 37 미리 따뜻한 Accutase, PBS 및 양자 263 매체 ° C. </li><li> PBS로 80% 합류 세포를 씻으십시오. Accutase의 적절한 금액을 추가하고 셀 문화 표면에서 분리 될 때까지 알을 품다. 양자 263 매체를 사용하여 50 ML 튜브에 세포를 수집합니다. </li><li> 휴대폰 번호를 결정하고시 5 분에 세포의 필요한 번호 (배 10 9 셀의 최대 수는 LS 칼럼 당로드 할 수 있습니다. 셀 라인을 특정 최적의 번호가 결정되어야하며 상당히 낮을 수 있습니다 Miltenyi의 프로토콜에 따라.) 원심 분리기 300 XG와 4-8 ° C. 완전히 표면에 뜨는 대기음. </li><li> 350 μl 맥 버퍼와 1X 10 8 셀의 최대 (높은 세포 숫자가 따라 모든 다음 맥 버퍼를 확장, FcR 차단 시약, CD133/1-Biotin 및 안티 - 비오틴 MicroBeads은 볼륨 용) Resuspend. </li><li> 100 μl FcR 차단 시약을 추가합니다. </li><li> 50 μl CD133/1-Biotin을 추가합니다. 4-8에서 소용돌이과 품다를 사용하여 잘 혼합 ° C F또는 10 분. </li><li> 300 XG와 4-8 ° C.에서 5 분 10 ML 맥 버퍼와 원심 분리기를 추가하여 세포를 씻으십시오 완전히 표면에 뜨는 대기음. </li><li> 세척 단계 (4.8)을 반복 </li><li> 400 μl 맥 버퍼와 Resuspend 세포 펠릿. </li><li> 100 μl 방지 비오틴 MicroBeads을 추가합니다. 15 분에 4-8 ° C에서 소용돌이과 품다를 사용하여 잘 섞는다. </li><li> 한편, 자기 분리의 맥 구분 기호를 준비합니다. 맥 격리 멀티 스탠드에 QuadroMACS을 첨부합니다. QuadroMACS의 자기장의 전면에 열 날개와 LS 열 필요한 번호를 삽입합니다. 각 항목 아래 각 LS 열 및 적절한 수집 관 (15 ML 50 ML)로 사전 분리 필터 (30 μm 나일론 메쉬 포함) 놓습니다. 3 ML 맥 버퍼와 린스에 의해 필터 항목을 준비합니다. 흐름을 통해 폐기하십시오. </li><li> 300 XG와 4-8 ° C.에서 5 분 10 ML 맥 버퍼와 원심 분리기를 추가하여 세포를 씻으십시오 완전히 표면에 뜨는 대기음. </li><li> 500 μl와 세포를 Resuspend맥 사전 분리 필터와 함께 LS 열에 세포 현탁액을 버퍼와 적용됩니다. </li><li> 열 당 3 ML 맥 버퍼로 세 번 씻으십시오. 열 저장소가 비어있는 경우에만 새로운 버퍼를 추가 할 수 있습니다. </li><li> 세포 분율 - 수집 된 총 유출은 라벨이 지정되지 않은 CD133이 포함되어 있습니다. </li><li> 사전 분리 필터를 삭제 하시겠습니까, 구분 기호에서 열을 제거하고 적절한 회수 관에 배치. </li><li> 5 ML 맥 버퍼를 적용 할 수 있습니다. 즉시 단단히 열로 플런저를 밀어 레이블 CD133 + 세포를 제거. </li><li> 부정적인 분수의 순도를 높이기 위해 QuadroMACS에 삽입하는 equilibrated LS 칼럼에 세포 현탁액을 적용합니다. 분수 - 유출은 CD133이 포함되어 있습니다. </li><li> 열을 폐기하십시오. </li></ol>

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제작자들은 더 경쟁 금융 이익이 없다는 점 선언합니다.

종양 세포 펠렛에서 적혈구 contaminations를 제거하기 위해 우리는 매우 Miltenyi에서 적혈구 용해 용액을 사용하는 것이 좋습니다. 기존의 Ficoll 밀도 기울기 원심 분리를 통해 적혈구를 lysing의 장점은 빠르고 간단는 것입니다. 또한, Ficoll 또는 적혈구와 종양 세포의 손실과 contaminations을 피할 수 있습니다. 너무 오래 대기 할 때 일반적으로 종양 세포를 ...보다 빨리 자라다 이후이 기본 세포 배양에서 ?...

피부 악성 melanomas 피부 암의 가장 일반적인, 아직 대부분의 치명적인 유형입니다. 증가 발생, 사망의 1,2을 관련 악성 피부 종양의 75 %를 종과 빠른 보급의 높은 학년, 지금 melanomas 계정으로 인해. 기본 종양, 화학 요법, 방사선 치료, immunotherapy와 metastasized 흑색 증의 결합 화학 및 immunotherapy의 수술 절단 외에 흑색 증 치료 3,4의 최신 전략입니다. 그러나, 악성 흑색 증은 chemotherapeutics에 가난한 응답 (5-12%) 5,6,하고 vemurafenib 7 치료 등 새로운 타겟 치료를 약속에서 BRAF V600E 유전자 변이 혜택을 들고 흑색 증 환자 만 50-70%에 의해 특징입니다 전체 생존을 개선, 흑색 증의 tumorigenesis의 메커니즘을 훨씬 더 이해가 필요합니다. 과거 잘 알려진 commer에 그 메커니즘을 연구하기 위해cially 가능한 셀 라인은 사용되었습니다. 암 개시 및 진행의​​ 분자 이벤트를 공부하는 최근의 접근 방법은 종양 조직에서 직접 파생 된 주요 문화 활용 - 전략 베어링 매니 폴드 혜택을 : 연구원은 환자 및 조직 선택에 대한 모든 권한이 있습니다. 샘플 셀 전문적 선택 종양 조직에서 얻은, 모든 이질성과 종양과 유사하고 후속 환자의 데이터와 자세한 병리는 문화의 특성을 원래의 종양 (8)의 사람들과 비교 할 수 있도록 할 수 있습니다. 반면, 암 연구에 관련 모델 시스템과 같은 설립 세포 라인의 사용은 controversially 설명되어 있습니다. 이미 1987 년에 오스본과 동료는 다른 실험실 9 일부터 MCF-7 인간 유방암 세포 라인 간의 중요한 생물학적 차이를 설명했다. 하위 문화 중 RNA의 발현에있는이 광범위한 게놈의 불안정과 유사 공동했습니다Hiorns 외로 nfirmed.와 셀 라인으로써 인간의 암 (10)의 모델 등의 설립 문화의 직접적인 관련성을 약화, 문화 발전 않는 증거에 대한 지원 데이터를 제공했습니다. 크게 년 동안 무시되었습니다 또 다른 중요한 고려 사항은, 세포 라인의 큰 번호가 헬러에 의해 오염 된 것으로 첫번째 시연에서 20 년 이상 전에 강조했다 무관 &#39;false&#39;로 세포와 문화의 오염이나 전면에 자라 난의 위험이 세포 8,11. &#39;false&#39;로 셀 라인의 데이터 오해는 최근 다시 문학에 불하게되었습니다. DNA 프로파일과 분자 cytogenetics의 조합을 사용하여, MacLeod 외이 있습니다. 252 새로운 종양 파생 인간의 세포 라인, 미생물 및 세포 문화 (DSMZ)의 독일 모음에서 입금 거의 18%이 intraspecies이 발견되거나 교차 interspecies 것으로 밝혀 - 오염 물질 12,13. 이러한 문제를 방지하고 위에서 언급 한 장점을 이용하기 위해, 우리는 신선한 excised metastases에서 낮은 통로 흑색 증 세포 라인을 구축하기로 결정했습니다. 강력한 세포 분리 및 분석 기술은 동시에 독특한 표면 단백질의 세포 죽음과 파괴를 제한하면서 단일 셀 준비가 생성되어야합니다. 단일 셀 중지로 조직의 자동화 분리에 대한 benchtop 악기는 Miltenyi에 의해 제조 gentleMACS의 Dissociator입니다. 항원 epitopes을 보존하고 셀 손실을 줄이면서 gentleMACS C 튜브 및 최적화 된 분리 솔루션 폐쇄 된 시스템에서 종양 조직의 효과적이고 부드러운 해리와 함께 사용하면 달성된다. 악기가 특정 어플리케이션과 guaranties 흑색 증 조직 14 일부터 단일 셀 현탁액의 표준화 준비 다양한 최적화 된 사전 설정 프로그램을 제공합니다. &lt;P 클래스 = &quot;jove_content&quot;&gt; 종양의 대부분이 독점적으로 종양 - 시작 및 용량을 자기 갱신을 전시라는 암 줄기 세포 (CSCs)의 작은 subpopulation을 품다 것으로 밝혀 최근보고합니다. 피부의 진피에 melanocyte - 생산 줄기 세포의 식별은 UVA 방사선에 노출은 악성 변형 15 셀을 수상 할 수 있기 때문에 이러한 세포가 흑색 증의 암 줄기 세포 (CSCs)의 근원이 될 수 있다는 가설을 이끌었다. 이러한 유전자 병변의 결과는 종양과 줄기 세포 특성의 조합을 가지고 있고, 셀 것입니다. 흑색 증에 CSCs의 subpopulation을 표현하기 위해 제안 된 주요 마커 중 하나는 CD133 16-20입니다. CD133 (또한 Prominin 1로 알려져 있음), pentaspan transmembrane의 glycoproteins의 회원은 조혈 줄기 세포, 내피 전구 세포, neuronal 및 glial 줄기 세포 21-23에 표시됩니다. CD133의 표현이과 상관있다비대칭 세포 분열 24, 및 CD133의 glycosylated 에피토프는 세포 분화 25시 downregulated로 표시했습니다. 최근 CD133 + 흑색 증 세포는 자기 갱신과 종양 - 개시 용량 19,20가 게재되었습니다. CD133 + putative 흑색 증 CSCs의 기능을 연구하기 위해, 우리는 수정 및 CD133의 매우 풍부하고 가능한 인구 +와 CD133 얻을 수 Miltenyi 생명 공학에서 자기가 활성화 된 셀 정렬 (맥) 시스템 최적화 - 세포를. Matheu 외하여 그림과 같이 자석 구슬 기반의 세포 분리도 부정적인 선택할 수 있습니다. 26 긍정적 인 선택 우리가 여기에 표시로. 긍정적 인 선택하는 동안 특정 대상 셀 유형, 예를 들어 CD133 표현 세포는 자기 (磁气)에 대한 매우 구체적인 항체에 복합 아르 MicroBeads, 50 나노 미터 superparamagnetic 입자으로 표시됩니다특정 세포 표면 항원. 라벨이없는 세포를 통해 유동 반면 분리하는 동안 자기 (磁 气) 라벨 세포는 분리의 자기장의 항목에서 유지됩니다. 세척 단계 후, 열 구분 기호의 자기장에서 제거되고, 대상 셀은 열에서 용출되어 있습니다. LS 또는 MS 항목은 고순도로 표시하고 라벨이없는 세포의 분수에 긍정적 인 선택 결과 중에 사용됩니다. 한편, 부정적인 선택에 사용되는 LD 열, 레이블 분수의 약간 낮은 순도하는 결과를 가져올 수도 있습니다. 자신의 매트릭스의 포장 밀도로 인해이 항목에 유속은 열에 갇힌 할 레이블이 지정되지 않은 세포의 높은 위험이 낮은 결과로 수 있습니다. LD 열 따라서 원치 않는 세포 subpopulation의 엄격한 고갈 용으로 만 사용되어야합니다. 긍정적 인 선택은 incubatio 다음 MicroBeads와 함께 직접 (MicroBeads에 커플 링 된 항체) 또는 간접적으로 자기 라벨 (부화에 의해 수행 될 수N 차 항체로). 특정 맥의 MicroBeads은 전립선이나 흑색 증 27 등의 주요 종양 세포의 다양한 세포 유형의 긍정적 인 선택하실 수 있습니다.

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> 시약 </td></tr><tr><td> Accutase </td><td> PAA Laboratories의 GmbH의 </td><td> L11-007 </td><td></td></tr><tr><td> Amphotericin B 솔루션을 250 μg / 탈 이온수에 ML </td><td> 시그마 - 알드리치 주식회사 </td><td> A2942-50ml </td><td></td></tr><tr><td> 안티 섬유 아세포의 microbeads </td><td> Miltenyi Biotec GmbH의 </td><td> 130-050-601 </td><td></td></tr><tr><td> CD133 / 1 (W6B3C1) </td><td> Miltenyi Biotec GmbH의 </td><td> 130-092-395 </td><td></td></tr><tr><td> Collagenase IV </td><td> 시그마 - 알드리치 주식회사 </td><td> C5138 </td><td></td></tr><tr><td> DNase I </td><td> Applichem GmbH의 </td><td> A3778.0050 </td><td></td></tr><tr><td> CA, MG없이 D-PBS </td><td> PAA Laboratories의 GmbH의 </td><td> H15-002 </td><td></td></tR&gt; <tr><td> Ethylenediaminetetraacetic 산 나트륨 소금 탈수 (EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)) </td><td> 시그마 - 알드리치 주식회사 </td><td> E-7889 </td><td></td></tr><tr><td> FBS 수 페리 어 </td><td> Biochrom </td><td> S0615 </td><td></td></tr><tr><td> 간접 CD133 마이크로 비드 키트 사람 </td><td> Miltenyi Biotec GmbH의 </td><td> 130-091-895 </td><td> 포함 : CD133 / 1 (AC133) 비오틴, 항 비오틴 MicroBeads 및 FcR 차단 시약 </td></tr><tr><td> 페니실린 - 스트렙토 마이신, 액체 (100x) </td><td> Invitrogen GmbH의 </td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td> 양자 263 </td><td> PAA Laboratories의 GmbH의 </td><td> U15-815 </td><td></td></tr><tr><td> 적혈구 용해 용액 (10 배) </td><td> Miltenyi Biotec GmbH의 </td><td> 130-094-183 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 장비 </td></tr><tr> &lt;TD&gt; 셀 스트레이너 (70 μm) </td><td> BD Biosciences </td><td> 352350 </td><td></td></tr><tr><td> gentleMACS C 튜브 </td><td> Miltenyi Biotec GmbH의 </td><td> 130-093-237 </td><td></td></tr><tr><td> gentleMACS dissociator </td><td> Miltenyi Biotec GmbH의 </td><td> 130-093-235 </td><td></td></tr><tr><td> 맥 구분 기호 멀티 스탠드 </td><td> Miltenyi Biotec GmbH의 </td><td> 130-042-303 </td><td></td></tr><tr><td> 맥 간격 열 25 LS 열 </td><td> Miltenyi Biotec GmbH의 </td><td> 130-042-401 </td><td></td></tr><tr><td> MACSmix 튜브 회전하는 것 </td><td> Miltenyi Biotec GmbH의 </td><td> 130-090-753 </td><td></td></tr><tr><td> Natriumchlo​​ride </td><td> 머크 KGaA </td><td> 567440-1KG </td><td></td></tr><tr><td> 사전 분리 필터 </td><td> Miltenyi Biotec GmbH의 </td><td> 130-041-407 </td><td></TD&gt; </tr><tr><td> QuadroMACS 구분 </td><td> Miltenyi Biotec GmbH의 </td><td> 130-090-976 </td><td></td></tr><tr><td> Rotilabo - 주사기 필터 (0.22 μm, PES) </td><td> 칼 로스 GmbH의 앤 컴퍼니 KG </td><td> P668.1 </td><td></td></tr><tr><td> Steritop-GP 필터 유닛 500 ML </td><td> Miltenyi Biotec GmbH의 </td><td> SCGPS05RE </td><td></td></tr></tbody></table>

patient derived cell culture and isolation of cd133+ putative cancer stem cells from melanoma

사용 가능한 흑색 증 오늘은 개선 치료 옵션에도 불구하고, 고급 악성 흑색 증 환자는 여전히 진행 무료 및 전반적인 생존 가난한 예후 (豫 后)가 있습니다. 따라서, 병진 연구는 악성 melanomas에 대한 타겟 치료를 개선하기 더 분자 증거를 제공해야합니다. 흑색 증에 관한 과거 종양 발생 메커니즘에 광범위하게 구축 된 세포 라인에서 공부했다. 각각의 유전자 프로파일에 따라 맞춤 치료 regimens로가는 길에, 우리는 환자 파생 세포 라인 대신 일반 세포 라인을 사용하여 제안합니다. 함께 특히 환자 후속에 대한 고품질의 임상 데이터와 함께 이러한 세포는 더 흑색 증의 진행 뒤에 분자 메커니즘을 이해하기 수단이 될 것입니다. 여기, 우리는 해부하는 새로운 종양 조직에서 기본 흑색 증 문화의 설립을 신고합니다. 이 절차는 하나의 셀에 날카과 조직의 분해, 재를 포함적혈구와 섬유 아세포뿐만 아니라 주요 문화와 세포 &#39;흑색 증 원본을 신뢰할 수있는 인증과 contaminations의 moval. 최근 보고서 발표 그 melanomas, 종양의 대부분이 같은 항구 독점적으로 전이성 상태에 대한 종양 개시 및 진행을 연료 것 같습니다 암 줄기 세포 (CSCs)의 작은 subpopulation. 흑색 증의 CSC 식별 및 절연을위한 주요 마커 중 하나는 CD133입니다. 기본 흑색 증의 문화에서 CD133 + CSCs를 분리하기 위해, 우리는 수정과 자기가 활성화 된 셀 높은 정렬 순도의 결과로 Miltenyi에서 정렬 (맥) 절차와 CD133 + CSCs와 CD133의 생존 최적화 - 대량, 재배 및 기능적 분석 할 수 이후.

종양 조직에서 단일 세포의 준비 그림 2 (A)와 (B) 기계 분리 한 후 2~4mm 조각에 전에 늦은 단계 흑색 증 환자의 resected의 림프절 전이의 실천. 70 μm 나일론 메쉬를 통해 조직과 여과의 효소 분해 후, 세포는 pelleted이었고 표면에 뜨는를 삭제했습니다. 이 단계에서 우리는 그림 2C의 셀 펠렛의 붉은 색으로 표시로 적혈구와 높은 오염을 관찰했다. 그 후, 우리...

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Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

이 문서는 기본 셀 문화, 및 종양 세포에서 적혈구와 섬유 아세포의 contaminations를 제거하는 방법에 신선한 얻은 흑색 증 조직의 준비에 대해 설명합니다. 마지막으로, 우리는 어떻게 묘사 CD133<sup&gt; +</sup&gt; putative 흑색 증의 줄기 세포는 CD133에서 정렬되어<sup&gt; -</sup&gt; 자기 활성화 셀 정렬 (맥)를 사용하여 대량.

환자 유래 세포 배양 및 CD133의 절연<sup&gt; +</sup흑종에서&gt; Putative 암 줄기 세포

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for ...

patient-derived-cell-culture-isolation-cd133-putative-cancer-stem

Research

JoVE Journal

Medicine

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

21.1K 조회수.  Charité - Universitätsmedizin Berlin. 이 문서는 기본 셀 문화, 및 종양 세포에서 적혈구와 섬유 아세포의 contaminations를 제거하는 방법에 신선한 얻은 흑색 증 조직의 준비에 대해 설명합니다. 마지막으로, 우리는 어떻게 묘사 CD133 + putative 흑색 증의 줄기 세포는 CD133에서 정렬되어 - 자기 활성화 셀 정렬 (맥)를 사용하여 대량.

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Isolation of Cardiomyocyte Nuclei from Post-mortem Tissue

Identification of cardiomyocyte nuclei has been challenging in tissue sections as most strategies rely only on cytoplasmic marker proteins1. Rare events in cardiac myocytes such as proliferation and apoptosis require an accurate identification of cardiac myocyte nuclei to analyze cellular renewal in homeostasis and in pathological conditions2. Here, we provide a method to isolate cardiomyocyte nuclei from post mortem tissue by density sedimentation and immunolabeling with antibodies against pericentriolar material 1 (PCM-1) and subsequent flow cytometry sorting. This strategy allows a high throughput analysis and isolation with the advantage of working equally well on fresh tissue and frozen archival material. This makes it possible to study material already collected in biobanks. This technique is applicable and tested in a wide range of species and suitable for multiple downstream applications such as carbon-14 dating3, cell-cycle analysis4, visualization of thymidine analogues (e.g. BrdU and IdU)4, transcriptome and epigenetic analysis.

Cardiac nuclei are isolated via density sedimentation and immunolabeled with antibodies against pericentriolar material 1 (PCM-1) to identify and sort cardiomyocyte nuclei by flow cytometry.

사후 조직에서 Cardiomyocyte 핵의 분리

Identification of cardiomyocyte nuclei has been challenging in tissue sections as most strategies rely only on cytoplasmic marker proteins1. Rare events ...

연구

의학

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human pulp-derived stem cells (hDPSCs) possess high proliferation potential with multi-lineage differentiation capacity compare to the ordinary source of adult stem cells1-8; therefore, hDPSCs could be the good candidates for autologous transplantation in tissue engineering and regenerative medicine. Along with these benefits, possessing the mesenchymal stem cells (MSC) features, such as immunolodulatory effect, make hDPSCs more valuable, even in the case of allograft transplantation6,9,10. Therefore, the primary step for using this source of stem cells is to select the best protocol for isolating hDPSCs from pulp tissue. In order to achieve this goal, it is crucial to investigate the effect of various isolation conditions on different cellular behaviors, such as their common surface markers &amp; also their differentiation capacity.
Thus, here we separate human pulp tissue from impacted third molar teeth, and then used both existing protocols based on literature, for isolating hDPSCs,11-13 i.e. enzymatic dissociation of pulp tissue (DPSC-ED) or outgrowth from tissue explants (DPSC-OG). In this regards, we tried to facilitate the isolation methods by using dental diamond disk. Then, these cells characterized in terms of stromal-associated Markers (CD73, CD90, CD105 &amp; CD44), hematopoietic/endothelial Markers (CD34, CD45 &amp; CD11b), perivascular marker, like CD146 and also STRO-1. Afterwards, these two protocols were compared based on the differentiation potency into odontoblasts by both quantitative polymerase chain reaction (QPCR) &amp; Alizarin Red Staining. QPCR were used for the assessment of the expression of the mineralization-related genes (alkaline phosphatase; ALP, matrix extracellular phosphoglycoprotein; MEPE &amp; dentin sialophosphoprotein; DSPP).14

The method described isolation and characterization of human Dental Pulp Stem Cells (hDPSCs) by using either enzymatic dissociation of pulp (DPSC-ED) or direct outgrowth of stem cells from pulp tissue explants (DPSC-OG). Then followed by in vitro comparative differentiation of both types of hDPSCs into odontoblasts.

인간 치과 펄프의 줄기 세포의 분리, 특성화 및 비교 차별화 두 가지 방법을 사용하여 영구 치아에서 파생

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Time-lapse Imaging of Primary Preneoplastic Mammary Epithelial Cells Derived from Genetically Engineered Mouse Models of Breast Cancer

Time-lapse imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic mammary epithelial cells derived from different genetically engineered mouse models of breast cancer. For example, time between cell divisions (cell lifetimes), apoptotic cell numbers, evolution of morphological changes, and mechanism of colony formation can be quantified and compared in cells carrying specific genetic lesions. Primary mammary epithelial cell cultures are generated from mammary glands without palpable tumor. Glands are carefully resected with clear separation from adjacent muscle, lymph nodes are removed, and single-cell suspensions of enriched mammary epithelial cells are generated by mincing mammary tissue followed by enzymatic dissociation and filtration. Single-cell suspensions are plated and placed directly under a microscope within an incubator chamber for live-cell imaging. Sixteen 650 &mu;m x 700 &mu;m fields in a 4x4 configuration from each well of a 6-well plate are imaged every 15 min for 5 days. Time-lapse images are examined directly to measure cellular behaviors that can include mechanism and frequency of cell colony formation within the first 24 hr of plating the cells (aggregation versus cell proliferation), incidence of apoptosis, and phasing of morphological changes. Single-cell tracking is used to generate cell fate maps for measurement of individual cell lifetimes and investigation of cell division patterns. Quantitative data are statistically analyzed to assess for significant differences in behavior correlated with specific genetic lesions.

Time-lapse imaging is used to assess behavior of primary preneoplastic mammary epithelial cells derived from genetically engineered mouse models of breast cancer risk to determine if there are correlations between specific behavioral parameters and distinct genetic lesions.

기본 Preneoplastic 유방 상피 세포의 시간 경과 영상은 유방암의 유전자 변형 마우스 모델에서 파생

Time-lapse  imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic  mammary epithelial cells derived from different genetically ...

Isolation of Cancer Stem Cells From Human Prostate Cancer Samples

The cancer stem cell (CSC) model has been considerably revisited over the last two decades. During this time CSCs have been identified and directly isolated from human tissues and serially propagated in immunodeficient mice, typically through antibody labeling of subpopulations of cells and fractionation by flow cytometry. However, the unique clinical features of prostate cancer have considerably limited the study of prostate CSCs from fresh human tumor samples. We recently reported the isolation of prostate CSCs directly from human tissues by virtue of their HLA class I (HLAI)-negative phenotype. Prostate cancer cells are harvested from surgical specimens and mechanically dissociated. A cell suspension is generated and labeled with fluorescently conjugated HLAI and stromal antibodies. Subpopulations of HLAI-negative cells are finally isolated using a flow cytometer. The principal limitation of this protocol is the frequently microscopic and multifocal nature of primary cancer in prostatectomy specimens. Nonetheless, isolated live prostate CSCs are suitable for molecular characterization and functional validation by transplantation in immunodeficient mice.

The isolation of cancer stem cells (CSCs) directly from human tissues is requisite for their biological characterization. This manuscript describes a methodology for the isolation of prostate CSCs from human tissues, while also providing tips on troubleshooting difficult steps.

인간의 전립선 암 샘플에서 암 줄기 세포의 분리

The cancer stem cell (CSC) model has been considerably revisited over the last two decades. During this time CSCs have been identified and directly ...

Enrichment for Chemoresistant Ovarian Cancer Stem Cells from Human Cell Lines

Cancer stem cells (CSCs) are defined as a subset of slow cycling and undifferentiated cells that divide asymmetrically to generate highly proliferative, invasive, and chemoresistant tumor cells. Therefore, CSCs are an attractive population of cells to target therapeutically. CSCs are predicted to contribute to a number of types of malignancies including those in the blood, brain, lung, gastrointestinal tract, prostate, and ovary. Isolating and enriching a tumor cell population for CSCs will enable researchers to study the properties, genetics, and therapeutic response of CSCs. We generated a protocol that reproducibly enriches for ovarian cancer CSCs from ovarian cancer cell lines (SKOV3 and OVCA429). Cell lines are treated with 20 &#181;M cisplatin for 3 days. Surviving cells are isolated and cultured in a serum-free stem cell media containing cytokines and growth factors. We demonstrate an enrichment of these purified CSCs by analyzing the isolated cells for known stem cell markers Oct4, Nanog, and Prom1 (CD133) and cell surface expression of CD177 and CD133. The CSCs exhibit increased chemoresistance. This method for isolation of CSCs is a useful tool for studying the role of CSCs in chemoresistance and tumor relapse.

Cancer stem cells (CSCs) are&#160;implicated in tumor relapse due to chemoresistance. We have optimized a protocol for selection and expansion of CSCs from ovarian cancer cell lines. By treating cells with the chemotherapeutic cisplatin and culturing&#160;in a stem cell promoting media we enrich for non-adherent CSC cultures.

인간 세포주에서 Chemoresistant 난소 암 줄기 세포에 대한 심화 학습

Cancer stem cells (CSCs) are defined as a subset of slow cycling and undifferentiated cells that divide asymmetrically to generate highly proliferative, ...

Isolation and Immortalization of Patient-derived Cell Lines from Muscle Biopsy for Disease Modeling

The generation of patient-specific cell lines represents an invaluable tool for diagnostic or translational research, and these cells can be collected from skin or muscle biopsy tissue available during the patient&#8217;s diagnostic workup. In this protocol, we describe a technique for live cell isolation from small amounts of muscle or skin tissue for primary cell culture. Additionally, we provide a technique for the immortalization of myogenic cell lines and fibroblast cell lines from primary cells. Once cell lines are immortalized, substantial expansion of patient-derived cells can be achieved. Immortalized cells are amenable to many downstream applications, including drug screening and in vitro correction of the genetic mutation. Altogether, these protocols provide a reliable tool to generate and preserve patient-derived cells for downstream applications.

This protocol describes techniques for live cell isolation and primary culture of myogenic and fibroblast cell lines from muscle or skin tissue. A technique for the immortalization of these cell lines is also described. Altogether, these protocols provide a reliable tool to generate and preserve patient-derived cells for downstream applications.

질병 모델링을위한 근육 조직 검사에서 환자 유래 세포주의 분리 및 멸화

The generation of patient-specific cell lines represents an invaluable tool for diagnostic or translational research, and these cells can be collected ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor initiation, metastasis and resistance to radio- and chemotherapy. Here we describe a specific methodology for culturing primary human pancreatic CSCs as tumor spheres in anchorage-independent conditions. Cells are grown in serum-free, non-adherent conditions in order to enrich for CSCs while their more differentiated progenies do not survive and proliferate during the initial phase following seeding of single cells. This assay can be used to estimate the percentage of CSCs present in a population of tumor cells. Both size (which can range from 35 to 250 micrometers) and number of tumor spheres formed represents CSC activity harbored in either bulk populations of cultured cancer cells or freshly harvested and digested tumors 1,2. Using this assay, we recently found that metformin selectively ablates pancreatic CSCs; a finding that was subsequently further corroborated by demonstrating diminished expression of pluripotency-associated genes/surface markers and reduced in vivo tumorigenicity of metformin-treated cells. As the final step for preclinical development we treated mice bearing established tumors with metformin and found significantly prolonged survival. Clinical studies testing the use of metformin in patients with PDAC are currently underway (e.g., NCT01210911, NCT01167738, and NCT01488552). Mechanistically, we found that metformin induces a fatal energy crisis in CSCs by enhancing reactive oxygen species (ROS) production and reducing mitochondrial transmembrane potential. In contrast, non-CSCs were not eliminated by metformin treatment, but rather underwent reversible cell cycle arrest. Therefore, our study serves as a successful example for the potential of in vitro sphere formation as a screening tool to identify compounds that potentially target CSCs, but this technique will require further in vitro and in vivo validation to eliminate false discoveries.

Pancreatic cancer stem cells (CSCs) can be expanded in vitro using the anchorage-independent sphere culture technique, which represents a powerful tool to study CSC biology and can serve as the first step to develop novel CSC-targeting therapies. Here the methodology for expanding, analyzing and targeting of pancreatic CSCs is provided.

췌장암 새로운 치료 전략을 개발하기위한 전지 특성 줄기 공부

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Isolation and Culture Expansion of Tumor-specific Endothelial Cells

Freshly isolated tumor-specific endothelial cells (TEC) can be used to explore molecular mechanisms of tumor angiogenesis and serve as an in vitro model for developing new angiogenesis inhibitors for cancer. However, long-term in vitro expansion of murine endothelial cells (EC) is challenging due to phenotypic drift in culture (endothelial-to-mesenchymal transition) and contamination with non-EC. This is especially true for TEC which are readily outcompeted by co-purified fibroblasts or tumor cells in culture. Here, a high fidelity isolation method that takes advantage of immunomagnetic enrichment coupled with colony selection and in vitro expansion is described. This approach generates pure EC fractions that are entirely free of contaminating stromal or tumor cells. It is also shown that lineage-traced Cdh5cre:ZsGreenl/s/l reporter mice, used with the protocol described herein, are a valuable tool to verify cell purity as the isolated EC colonies from these mice show durable and brilliant ZsGreen fluorescence in culture.

We report a reliable method to isolate and culture primary tumor-specific endothelial cells from genetically engineered mouse models.

종양 특이 내피 세포의 분리 및 문화 확장

Freshly isolated tumor-specific endothelial cells (TEC) can be used to explore molecular mechanisms of tumor angiogenesis and serve as an in vitro model ...

Generation of Prostate Cancer Patient Derived Xenograft Models from Circulating Tumor Cells

Patient derived xenograft (PDX) models are gaining popularity in cancer research and are used for preclinical drug evaluation, biomarker identification, biologic studies, and personalized medicine strategies. Circulating tumor cells (CTC) play a critical role in tumor metastasis and have been isolated from patients with several tumor types. Recently, CTCs have been used to generate PDX experimental models of breast and prostate cancer. This manuscript details the method for the generation of prostate cancer PDX models from CTCs developed by our group. Advantages of this method over conventional PDX models include independence from surgical sample collection and generating experimental models at various disease stages. Density gradient centrifugation followed by red blood cell lysis and flow cytometry depletion of CD45 positive mononuclear cells is used to enrich CTCs from peripheral blood samples collected from patients with metastatic disease. The CTCs are then injected into immunocompromised mice; subsequently generated xenografts can be used for functional studies or harvested for molecular characterization. The primary limitation of this method is the negative selection method used for CTC enrichment. Despite this limitation, the generation of PDX models from CTCs provides a novel experimental model to be applied to prostate cancer research.

This manuscript details a method used to generate prostate cancer patient derived xenografts (PDXs) from circulating tumor cells (CTCs). The generation of PDX models from CTCs provides an alternative experimental model to study prostate cancer; the most commonly diagnosed tumor and a frequent cause of death from cancer in men.

전립선 암 환자의 발생은 종양 세포를 순환에서 이종 이식 모델을 파생

Patient derived xenograft (PDX) models are gaining popularity in cancer research and are used for preclinical drug evaluation, biomarker identification, ...

Isolation and Cellular Phenotyping of Mesenchymal Stem Cells Derived from Synovial Fluid and Bone Marrow of Minipigs

Mesenchymal stem cells (MSCs) have been established after isolation from various tissue sources, including bone marrow and synovial fluid. Recently, synovial-fluid-derived MSCs were reported to have multi-lineage differentiation potential and immunomodulatory features, which indicates that these cells can be used for tissue engineering and systemic treatments. This study presents a protocol for simple and non-invasive isolation of MSCs derived from the bone marrow and synovial fluid of minipigs to analyze cell surface markers for cell phenotyping and in vitro culturing. Using sexually mature six-month-old minipigs, bone marrow was extracted from the iliac crest bone using a bone marrow extractor, and the synovial fluid was aspirated from the femorotibial joint. Procedures for the collection of samples from both sources were non-invasive. The protocols for effective isolation of MSCs from harvested cell sources and for creating in vitro culture conditions to expand stable MSCs from minipigs and the application of systemic autologous treatments are provided. For cell phenotyping, the cell surface markers of both cells were analyzed using flow cytometry. In the results, the MSCs were isolated from the synovial fluid of the minipigs and showed that synovial-fluid-derived MSCs have a similar morphology and cell phenotype to bone-marrow-derived MSCs. Therefore, non-invasively obtained synovial fluid is a valuable source of MSCs.

A protocol establishing mesenchymal stem cells (MSCs) isolated from the synovial fluid and bone marrow of minipigs and non-invasively collected using syringe aspiration is presented. Cellular phenotyping was performed using flow cytometry after cell isolation and in vitro cultivation of bone marrow and synovial fluids derived from MSCs.

Minipigs의 활액과 골수 유래 중간 엽 줄기 세포의 분리 및 세포 표현형

Mesenchymal stem cells (MSCs) have been established after isolation from various tissue sources, including bone marrow and synovial fluid. Recently, ...