이 작품은 암 연구의 온타리오 연구소 (# 08NOV230), 혁신에 대한 캐나다 재단 (# 13199), 전립선 암, 캐나다, 얀센 종양학, 런던 지역 암 프로그램, 존 도나 브리스톨에서 기증자의 지원을 통해에서 교부금에 의해 지원되었다 (ALA에) 런던 건강 과학 재단. LEL은 프레 더릭 밴팅과 찰스 베스트 캐나다 대학원 장학금 박사 수상에 의해 지원됩니다. ALA는 CIHR 새로운 탐정 수상 및 연구와 혁신의 온타리오 교육부에서 조기 연구원 상에 의해 지원됩니다.

이 논문에 기술 된 모든 인간의 연구는 웨스턴 대학의 인간 연구 윤리위원회의 승인을 프로토콜에 따라 수행되었다. 모든 동물 실험은 웨스턴 대학교 동물 사용 분과위원회에 의해 승인 된 프로토콜에 따라, 동물 보호에 캐나다위원회의 권고에 따라 실시되었다. 1. CSS를 사용하여 환자의 혈액 샘플에서 표준 CTC 열거 1. 제조 장비에 대한 인간의 혈액 샘플 수집 및 처리를위한 준비 <ol><li> 표준 무균 정맥 절개 기술을 사용하여, 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA) 및 독점적 셀룰러 방부제를 포함 (이하 CTC 방부제 튜브 라 칭함) 10 ㎖ CellSave 튜브에 인간 혈액 8.0 ㎖가 최소값을 그린다. 응고에서 혈액을 방지하기 위해 튜브의 5 배를 반전. 샘플은 즉시 처리 또는 최대 96 시간 동안 실온에서 저장 될 수있다. </li><li> Remov전자 CSS의 냉장고에서 시약 및이를 사용하기 전에 실온으로 가온하도록 허용한다. </li><li> 일회용 10 ㎖ 피펫 및 자동 피펫을 사용하여, CTC 방부제 튜브에서 혈액의 7.5 ML를 수집하고 천천히 적절하게 레이블이 지정된 준비 악기 처리 튜브에 혈액을 분배. </li><li> 각 샘플에 희석 버퍼의 6.5 ML을 추가합니다. 샘플 5X를 반전시킴으로써 섞는다. &quot;OFF&quot;위치에 브레이크 10 분 800 XG에 샘플을 원심 분리기. 처리를 위해 시스템에 모든 환자의 샘플을로드 할 준비 기기에 화면의 지시 사항을 따르십시오. 샘플 준비의 1 시간 이내에 처리해야합니다. </li></ol> 2. 제조 장비에 대한 처리에 대한 제어 준비 <ol><li> 조심스럽게 제어 유리 병 와동 혼합하는 배 반전. </li><li> 조심스럽게 제어 유리 병에서 뚜껑을 제거하고 세척제 유리 병 위에 거꾸로 준비 기계 가공 튜브를 놓습니다. 하나의 빠른 움직임에 반전바이알을 제어하고, 상기 처리 튜브에 내용물을 붓는다. 반전하면서 부드럽게 남아있는 내용을 공개하는 제어 유리 병의 측면을 가볍게. </li><li> 조심스럽게, 처리 관에서 반전 제어 유리 병을 제거 할 때 아무 액체가 손실되지 않도록 보장하고 옆에 놓습니다. 1000 μL 피펫을 사용하여 병 뚜껑에 남아있는 내용을 수집하고 부드럽게 처리 튜브에 피펫. </li><li> 처리를 위해 시스템에 컨트롤을로드 할 준비 기기에 화면의 지시 사항을 따르십시오. </li></ol> 3. 분석 기기에 대한 샘플 스캔 <ol><li> 시스템에서 모든 샘플을 언로드 할 준비 기기에 화면의 지시 사항을 따르십시오. 느슨하게 각각 자기 장치 카트리지를 모자와 카트리지의 가장자리에 붙어있는 모든 거품을 해제 손이나 실험실 벤치를 사용하여 자기 장치를 누릅니다. 모든 거품이 제거되고 나면, 단단히 난 카트리지를 모자 평면 자기 장치를 마련하고,상온에서 적어도 20 분 동안 어둠 속에서 ncubate. 샘플 준비 24 시간 내에 스캔해야합니다. </li><li> 분석 기기의 전원을 켜고 램프를 초기화합니다. 일단 (~ 15 분)을 따뜻하게, 분석 기기에 시스템 검증 카트리지를로드하고 QC 테스트 탭을 선택합니다. 필요한 품질 관리 측정을 수행하려면 화면의 지시를 따릅니다. </li><li> 분석 기기에 샘플을로드하고 환자 테스트 ​​탭을 선택합니다. 준비 기기에서 저장된 모든 정보가 표시됩니다. 샘플 검사를 초기화하려면 시작을 클릭하십시오. 시스템은 자기 소자 카트리지 거친 포커스 및 에지 검출을 수행한다. </li><li> 방향 키를 사용하여 필요에 따라 모든 모서리를 조정합니다. 선택에 동의합니다. 이 시스템은 미세 초점을 수행하고 샘플 검사를 시작합니다. </li><li> 결과를 스캔에 따라 제어가 높은 (CK + DA에서 아군 세포에 대해 정의 된 기준을 사용하여 유효성을 검사해야PI + CD45 - APC +)과 낮은 (CK + DAPI + CD45 - FITC +)의 농도. 결과를 스캔에 따라 환자의 샘플은 정의 CTC 기준 (CK + DAPI + CD45을 -)를 사용하여 캡처 한 CTCs를 검토해야한다. </li></ol> 2. CSS를 사용하여 사용자 정의 마커에 대한 CTC의 특성 1. 사용자 정의 마커 및 기기 초기화의 준비 <ol><li> 작업 농도는 샘플 및 스톡 농도로 첨가 한 후, 항체의 농도는 다음 식을 이용하여 마커 시약 컵에 원하는 농도로 본드 차 항체 희석액을 사용하여 관심의 항체 희석있는 항체의 농도는 시약 컵. 다수의 샘플은 표 1에 기재된 바와 같이 항체 볼륨을 조정한다. 시약 카트리지와 L의 1의 위치에 마커 시약 컵을 놓고CSS에 카트리지 OAD. 주식 농도 = (근무 농도 X 850 μL) / 150 μL </li><li> 혈액 수집 샘플을 준비하고, CSS 프로토콜을 사용하여 환자의 혈액 샘플로부터 기본 CTC 열거 상기에서 설명한대로 제조 기기를로드. 준비 악기 메시지가 표시되면 사용자 지정 마커 추가를 사용하려면 선택 사용자는 분석을 정의. 입력 마커 이름과 저장을 선택합니다. 샘플을 기기에 탑재되면, 운전자는 필요가 없음 예를 선택하거나 선택하여 사용자 지정 표시를 수신해야하는 묻는 메시지가 표시됩니다. </li></ol> 2. 분석 기기에 대한 사용자 정의 마커의 샘플 스캔 <ol><li> , 분석 기기를 켜고 램프를 초기화하고, CSS를 사용하여 환자의 혈액 샘플에서 표준 CTC 열거의 3.2 절에 설명 된대로 품질 관리 및 시스템 검증을 수행 </strong&gt; 프로토콜입니다. </li><li> 분석 기기에 샘플을로드하고 설정 탭을 선택합니다. FITC 채널을 초기화하려면, 테스트 프로토콜 섹션의 키트 ID로 CellSearch CTC를 선택합니다. 이 메뉴에서 선택 CTC 연구, 편집 버튼을 클릭하고 원하는대로 노출 시간을 설정합니다. 그것은이 CTC 식별에 이용 다른 형광 채널로 비쳐을 높일 수있는 CSS CTC 키트를 사용할 때 1.0 초의 노출 시간을 초과하지 않는 것이 권장된다. </li></ol> 3. 전임상 마우스 모델에서 사용하기위한 표준 CSSProtocol의 적응 * Veridex 마우스 / 쥐 CellCapture 키트에서 적응 (더 이상 상업적으로 가능) 1. 마우스 혈액 수집 및 저장 <ol><li> 종래 채혈에, 0.5 M EDTA 30 ㎕를가 허브 EDTA 소량 남게 앞뒤로 22 G 바늘을 통해 실행 ~. </li><li>이전 동소, 꼬리 정맥, 또는 심장 내 경로를 통해 인간의 종양 세포를 주입 한 생쥐에서 마우스 혈액의 50 μL의 최소 수집합니다. (시리얼 CTC 분석) 복재 정맥이나 (터미널 CTC 분석) 심장 천자하여 혈액을 수집합니다. 바늘을 제거하고 1 ㎖의 EDTA의 microtainer 혈관에 혈액을 분배. 응고에서 혈액을 방지하기 위해 반전 또는 부드럽게 영화 튜브로 섞는다. 혈액 CytoChex 셀룰러 방부제의 동일 부피의 또 다음 최대 48 시간 동안 즉시 처리 또는 실온에서 저장 될 수있다. </li></ol> 2. CTC 심화 <ol><li> 냉장고에서 CSS 시약을 제거하고 사용하기 전에 실온으로 따뜻하게 할 수 있습니다. </li><li> 관 세포 계측법 12mm X 75mm의 흐름에 전체 혈액의 50 μL의 등가를 전송합니다. 튜브의 측면에 남아있는 혈액을 세척, 각각의 샘플에 희석 버퍼 500 μl를 추가합니다. 필요한 경우, 짧은 원심 스핀남아있는 혈액을 수집하기 위해 사용될 수있다. </li><li> 부드럽게 안티 EpCAM의 자성 유체 와동 직접 샘플로 피펫의 팁을 배치하여 각 샘플에 25 μl를 추가합니다. 부드럽게 섞어 캡처 향상 시약와 소용돌이의 25 μl를 추가합니다. 실온에서 15 분 동안 샘플을 배양한다. </li><li> 자석에 샘플 튜브를 삽입하고 10 분 동안 품어. 샘플 튜브 자석에 여전히 있지만, 조심스럽게 옆에 자석 관의 벽에 닿지 않고 잔류 액체를 대기음 및 폐기 유리 피펫을 사용합니다. </li></ol> 3. CTC 염색 <ol><li> 핵산 염료, 염색 시약, 항 마우스 CD45-APC, 안티 - 인간의 HLA-알렉사 플 루어 488, 및 Permeabilization 100 μL의 5.0 μL의 1.5 μL의 50 μL의 50 μL에서 자석에 resuspend에서 샘플 튜브를 제거 시약. 다수의 샘플의 경우, 이러한 시약은 예비 혼합 될 수 있고, 혼합물의 206.5 ㎕를 각 튜브에 첨가 될 수있다. 부드럽게 섞어 소용돌이및 어둠 속에서 실온에서 20 분 동안 배양한다. </li><li> 자석으로 500 부드럽게 희석 버퍼의 μL, 소용돌이, 장소 샘플 튜브를 추가하고 10 분 동안 품어. 샘플 튜브 자석에 여전히 있지만, 조심스럽게 옆에 자석 관의 벽에 닿지 않고 잔류 액체를 대기음 및 폐기 유리 피펫을 사용합니다. 자석에서 샘플 튜브를 제거하고 희석 버퍼 350 μL에 재현 탁. 소용돌이 가볍게 혼합한다. </li></ol> 4. 자석 장치로드 <ol><li> 젤 로딩 팁을 사용하여 조심스럽게 자기 장치에 카트리지에 샘플 튜브에서 전체 볼륨을 전송합니다. 카트리지의 하단에서 시작하고 샘플이 분배된다 천천히 팁을 철회. </li><li> 전체 샘플이 전송되면, 느슨하게 자기 장치 카트리지를 모자와 Sectio에 설명 된대로 카트리지의 가장자리에 붙어있는 모든 거품을 해제 손이나 실험실 벤치를 사용하여 자기 장치를 누릅니다n은 CSS를 사용하여 환자의 혈액 샘플에서 표준 CTC 열거 형 3.1. </li><li> 베벨 및 카트리지의 가장자리 사이들을 포착하여 멸균 22 G 바늘을 사용하여 기포를 팝. 모든 거품이 제거되고 나면, 확실히, 카트리지 캡 평면 자기 장치를 마련하고, 적어도 10 분 동안 어둠 속에서 부화. 샘플 준비 24 시간 내에 스캔해야합니다. </li></ol> 5. 분석 기기에 수동으로 분리 된 샘플의 스캐닝 <ol><li> , 분석 기기를 켜고 램프를 초기화하고, CSS 프로토콜을 사용하여 환자의 혈액 샘플에서 표준 CTC 열거의 3.2 절에 설명 된대로 품질 관리 및 시스템 검증을 수행합니다. </li><li> 분석 기기에 샘플을로드하고 설정 탭을 선택합니다. 서식 샘플 버튼을 클릭하여 자기 장치 데이터 버튼에 기존 데이터를 지 웁니다. FITC 채널 사용CSS를 사용하여 사용자 정의 마커에 대한 CTC 특성의 2.2 절에 설명 된대로 차 1.0 초에 노출 시간을 설정합니다. </li><li> 환자 테스트 ​​탭을 클릭하고 입력에 샘플 정보를 편집을 선택합니다. 테스트 프로토콜로 키트 ID로 CellSearch CTC 및 CTC 연구를 선택합니다. 입력은 별표로 표시로 나머지 필요한 정보. 샘플 정보를 저장하고 시작을 클릭합니다. </li></ol>

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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial-mesenchymal+transitions+in+development+and+disease.">Epithelial-mesenchymal transitions in development and disease.</a> Cell. 139 (5), 871-890 (2009).</li><li>Yang, J., Weinberg, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Epithelial-mesenchymal+transition:+at+the+crossroads+of+development+and+tumor+metastasis.">A Epithelial-mesenchymal transition: at the crossroads of development and tumor metastasis.</a> Dev. Cell. 14 (6), 818-829 (2008).</li><li>Gradilone, A., Raimondi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+tumour+cells+lacking+cytokeratin+in+breast+cancer:+the+importance+of+being+mesenchymal.">Circulating tumour cells lacking cytokeratin in breast cancer: the importance of being mesenchymal.</a> J. Cell. Mol. Med. 15 (5), 1066-1070 (2011).</li><li>K&#246;nigsberg, R., Obermayr, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+EpCAM+positive+and+negative+circulating+tumor+cells+in+metastatic+breast+cancer+patients.">Detection of EpCAM positive and negative circulating tumor cells in metastatic breast cancer patients.</a> Acta Oncol. 50 (5), 700-710 (2011).</li><li>Kasimir-Bauer, S., Hoffmann, O., Wallwiener, D., Kimmig, R., Fehm, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+stem+cell+and+epithelial-mesenchymal+transition+markers+in+primary+breast+cancer+patients+with+circulating+tumor+cells.">Expression of stem cell and epithelial-mesenchymal transition markers in primary breast cancer patients with circulating tumor cells.</a> Breast Cancer Res. 14 (1), (2012).</li><li>Mego, M., Mani, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+epithelial-mesenchymal+transition-inducing+transcription+factors+in+primary+breast+cancer:+The+effect+of+neoadjuvant+therapy.">Expression of epithelial-mesenchymal transition-inducing transcription factors in primary breast cancer: The effect of neoadjuvant therapy.</a> Int. J. Cancer. 130 (4), 808-816 (2012).</li><li>Yu, M., Bardia, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+breast+tumor+cells+exhibit+dynamic+changes+in+epithelial+and+mesenchymal+composition.">Circulating breast tumor cells exhibit dynamic changes in epithelial and mesenchymal composition.</a> Science. 339 (6119), 580-584 (2013).</li><li>Armstrong, A. J., Marengo, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+tumor+cells+from+patients+with+advanced+prostate+and+breast+cancer+display+both+epithelial+and+mesenchymal+markers.">Circulating tumor cells from patients with advanced prostate and breast cancer display both epithelial and mesenchymal markers.</a> Mol. Cancer Res. 9 (8), 997-1007 (2011).</li></ol>

저자 (ALA)는 부모가 회사 존슨 앤 존슨은 또한이 문서에서 사용되는 시약 및 악기를 생산 얀센 진단 LLC를 소유 얀센 종양학가 제공 한 자금을 받았다.

2004 년에 CSS의 도입 이후 많은 새로운 CTC 기술의 발전에도 불구하고,이 기술은 오늘날 시장에서 유일하게 임상 적으로 승인 된 기술이며, 따라서 그것은 CTC 탐지 및 열거 형에 대한 현재 황금 표준으로 간주됩니다. 이 원고는 CSS는 엄격한 품질 관리 기준을 가지고 있지만 그것을 해석 편견의 대상이 될 환자 샘플에서 CTC 식별이 아군 샘플의 식별과 크게 다를 수 있다는 것을 보여 주었다. 일반적으?...

2013 년에 그것은 580,350 개인이 암으로 사망 할 것으로 추정되고,이 질병의 1,660,290 새로운 사건이 혼자 1 미국에서 진단을 것입니다. 이 죽음의 대다수는 전이성 질환이 개발 이후 발생한다. 전이 및 전이성 폭포의 제한된 이해를 치료에 효과적인 치료의 현재 부족은 질병의이 단계가 매우 치명적 있습니다. 혈액 내 종양 세포 (의 CTCs)를 순환의 존재는 전이성 질환 3와 상관 관계가 입증되었다. 이 세포는 매우 희귀하고 자신의 검출은 전이성 유방암 4, 전립선 암 5 년 생존율을 나타내는이며, 대장 암 6. 적은 수를 가진 환자 또는 샘 없음 감지 CTCs를 비교할 때 이러한 환자에서의 존재는 ≥ 5 (유방암과 전립선) 또는 혈액의 7.5 ML에서 ≥ 3 (대장)의 CTCs는 가난한 예후를 나타낸다전자 혈액량. 또한, 치료 적 개입 동안이나 후에 CTC 번호의 변화는 종종 빨리 현재 활용 기술보다 7-10, 치료 반응의 예측으로 유용한 것으로 입증되었다. 그것은 전이성 암 환자에서의 CTCs 10 5 -10 7 혈액 단핵 세포 당 약 1 CTC의 주파수에서 발생하고 지역화 된 질병을 가진 환자에서,이 주파수 (1 ~ 8 10 ~) 더 낮은있을 수 있습니다 것으로 추정하고있다. 이러한 세포의 희귀 한 자연 어려운 정확하고 신뢰성의 CTCs (11)를 감지하고 분석 할 수 있습니다. 여러 가지 방법 (이전에 12 ~ 14 리뷰) 혈액 성분을 주변에서 그들을 차별화하는 특성을 이용하여이 세포를 풍부하게하고 감지하기 위해 사용되었다. 일반적으로, CTC 열거 형은 농축 단계와 탐지 단계를 모두 필요로하는 과정은 두 단계로 이루어집니다. 전통적으로 농축 단계 인 phys의 차이에 의존의 CTCs (셀 크기, 밀도, 변형성) 또는 단백질 마커의 발현에 (즉, 상피 세포 접착 분자 [EpCAM] 아세포 [CK])의 iCal의 속성. 농축 후, CTC 검출 핵산 기반 분석 및 / 또는 유세포 접근법 가장 일반적인있는 다른 방법은, 다수로 수행 될 수있다. 이러한 전략은 각각 별개의 장점과 단점을 가지고, 그러나 그들은 모두 표준화 부족, 독특하고 임상에 입학 필요. CellSearch 시스템 (CSS)을 따라서, 형광 현미경 및 항체 기반 기술 4-6을 사용하여 인간의 혈액에있는 드문의 CTCs의 탐지 및 열거하기위한 표준화 된 방법을 제공하기 위해 개발되었다. 이 플랫폼은 현재 CTC 열거 형의 황금 표준으로 간주하고 병원 15에 사용하기 위해 미국 식품 의약청 (FDA)에 의해 승인 된 유일한 기술입니다. CSS는 두 가지 구성 요소 플랫폼 consistin입니다의 g, 사람의 혈액 샘플을 준비하고, 이들을 검사 (이하, 분석 기기 라 함) (2) CellTracks 분석기 II를, 자동화 (이하, 제조 기기 라 함) (1) CellTracks AutoPrep 시스템 준비 다음 샘플. 백혈구에게 준비 기기를 오염의 CTCs를 구별하려면 매개 항체, 자성 유체 기반의 자기 분리 방법 및 차등 형광 염색 사용합니다. 처음에, 시스템은 철 나노 입자에 접합 된 항-EpCAM 항체를 사용의 CTCs 라벨. 시료를 자계에서 배양하고, 모든 비 표지 세포를 흡인한다. 선택된 종양 세포의 형광 표지 된 항체 및 핵 염색 시약을 구성된 차동 형광 염색에 재현 탁하고 인큐베이션. 마지막으로, 시료를 자기 카트리지로 전송 (이하, 자기 장치로 지칭) MagNest 부르고, SC된다분석 기기를 사용 anned. 분석 기기는 10X 대물 렌즈를 이용하여, 서로 다른 형광 필터, 적합한 형광 입자에 최적화 된 각을 이용하여 준비된 시료를 검사하는 데 사용된다. 의 CTCs는 반대로 EpCAM, 안티 팬 CK-피코 에리 트린 (PE)에 의해 결합되어 세포 (CK8, 18, 19), 핵 얼룩 4 &#39;, 6 - diamidino -2 - 페닐 인돌 (DAPI)로 식별됩니다. 반대로, 오염 백혈구는 항 CD45-알로 피코 (APC) 및 DAPI에 구속되는 세포로 식별됩니다. 주사 후, 컴퓨터에 정의 전위 종양 세포가 사용자에게 제시된다. 이러한 이미지로부터, 사용자는 이벤트의 CTCs 있다고 판단하는 상술 정의 파라미터 및 차동 염색법을 사용하여 정성 분석을 채택한다. CTC 열거를위한 표준화 된 방법을 제공하는 것 외에도, CSS는 그 단백질 마커에 기초의 CTCs 분자 특성화를 허용한다. 이 심문 C이 CTC 식별 16에 필요하지 형광 염료 (FITC) 형광 채널을 이용해 단일 셀 레벨에서 수행 될 수있다. 이 플랫폼은 분자 특성의 용량을 제공하지만, 프로토콜 개발 및 최적화의 자세한 과정은 잘 정의되어 있지 않습니다. 세 시판 마커는 표피 성장 인자 수용체 (EGFR), 인간 표피 성장 인자 수용체 2 (HER2), 및 인슐린 - 유사 성장 인자 -1 수용체 (IGF-1R) 등 CSS와 함께 사용하기 위해 제조자에 의해 개발되었다. HER2 분석은 CSS와 함께, 임상 의사 결정을 알리기 위하여 기존 및 잠재적 치료 지침을 변경할 CTC 특성화 가능성을 설명하기 위해 여러 그룹에 의해 이용되었다. 예를 들어, Fehm 등. (17)는 HER2-기본 종양 유방암 환자의 약 삼분의이 HER2 +의 CTCs이 있었다는 것을 보여 주었다. 또한, 리우 등.(18)는 최근 그녀의 + 전이성 유방암 환자의 50 %가 HER2 +의 CTCs을하지 않았다고 보도했다. 허셉틴, 크게 그 종양 HER2 충분한 수준의 표현, HER2 + 기본 종양 19-21 환자에 대한 일반적으로 사용 치료 환자에게 이익을 보여 단일 클론 항체를 방해 HER2 수용체. 그러나 이러한 연구는 허셉틴이 하위 최적 활용과 CTC의 특성은 치료 반응을 예측하는데 도움이 될 수 있다는 것을 할 수 있다는 것을 권 해드립니다. 궁극적으로, CTC 특성화 개인화 치료를 개선하기위한 가능성을 가지고있다. 그것은 주로 침대 - 투 - 벤치 탑 접근 방식을 활용하고있다 점에서 CTC의 연구는 고유합니다. 이 방법은 종종 환자 치료에 영향을 줄 수 년이 걸릴 수있는 벤치 탑 - 투 - 머리맡의 연구와는 달리, 임상에의 ​​CTCs 빠른 입력을 허용했다. 그러나, 의사는 환자의 치료 결정 MAK에서 CTC 분석 결과를 사용하기 꺼려인해 기본 생물학에 대한 이해의 부족으로 보내고. 따라서 전이 보완 CTC 분석 기술의 적절한 전임상 마우스 모델이 뛰어난 질문을 조사하기 위해 사용되어야합니다. 일반적으로, 전이성 캐스케이드의 모든 단계의 연구를 허용 전이성 캐스케이드를 연구하는 데 전임상 모델의 두 종류 (1) 자발적 전이 모델이있다과는 허용 (2) 실험 전이 모델 이러한 혈관 외 유출 및 보조 종양 형성 (22)과 전이 과정에서 이후 단계의 연구. 자발적 전이 모델은, 적절한 동 소성 명소 (전립선 암 연구 전립선에 전립선 암 세포의 예 주입)으로 종양 세포 주입을 수반한다. 세포는 다음 주 종양을 형성하고 자발적으로 이러한 뼈, 폐, 림프절 등의 보조 사이트에 전이 시간이 주어집니다. 에반면, 실험 전이 모델 (특정 위치에 셀을 대상으로 꼬리 정맥 또는 심장 내 주사 등을 통해) 혈류로 종양 세포의 직접 주입을 포함하기 때문에 보조 기관 (22)에 intravasation 보급의 초기 단계를 건너 뜁니다. 지금까지 생체 내 모델 시스템에서 CTC 분석의 대부분은 세포 계측법 기반 (23) 또는 적응 인간 기반 CTC 기법 (예 AdnaTest) (24)를 사용하여 수행되었다. 유용하지만, 이러한 기술 중 어느 것도 적절 골드 표준 CSS를 사용하여 CTC 열거 형을 반영하지 않습니다. 결과 것과 비교 될 것이라고 임상 승인 표준화 활동 및 CSS의 광범위한 사용에 따라, 상응하는 샘플 준비, 가공을 이용하는 생체 모델링 CTC 포획 및 검출 기술, 및 식별 기준의 개발이 유익 할 것이다 환자 샘플에서 얻은. 그러나, 볼륨 REQ 행제조 장비의 uirements는이 자동화 플랫폼을 사용하여 혈액의 작은 볼륨을 처리 할 수​​ 없다. .로 마우스 편평 상피 세포의 오 분류로 이어질 수 있습니다 - 또한, Eliane 등 (25)에 의해 이전 작업 (또한 표준 CTC 정의 [EpCAM + CK + DAPI + CD45]을 만족) 마우스 상피 세포 샘플의 오염이 있음을 보여 주었다 의 CTCs. 이러한 문제에게 수동 격리 절차와 결합 된 CSS CTC 키트 시약의 활용이 개발 한 수있는 적응 기술을 해결합니다. 상기 분석으로 FITC 표지 된 인간 백혈구 항원 (HLA) 항체의 첨가는 인간 종양 세포는 마우스 편평 상피 세포로부터 구별 될 수있다. 이 원고는 discrepan 포함하여 발생할 수있는 환자의 혈액 샘플 및 일반적인 함정을 처리하기위한 상업적으로 개발 표준 및 CSS 최적화 된 프로토콜을 설명합니다CTC의 오 분류 오류가 발생할 수 있습니다 t 항목. 또한, 촬영의 CTCs과 전이의 전임상 마우스 모델에서 혈액의 작은 볼륨에서의 CTCs 농축 및 탐지를 허용하는 비교 적응 CSS 기술의 사용자 정의 단백질의 특성을 검토하는 CSS 분석의 정의가 설명되어 있습니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="790">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">REAGENTS</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td style="width:188px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">0.5M EDTA</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">Anti-human CD44-FITC</td>
			<td style="width:175px;">BD Pharmigen&#160;</td>
			<td style="width:161px;">555478</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">Anti-human CD44-PE</td>
			<td style="width:175px;">BD Pharmigen&#160;</td>
			<td style="width:161px;">555479</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">Anti-human HLA-AlexaFluor488</td>
			<td style="width:175px;">BioLegend</td>
			<td style="width:161px;">311415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">Anti-mouse CD45-APC</td>
			<td style="width:175px;">eBioscience</td>
			<td style="width:161px;">17-0451-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">Bond Primary Antibody Diluent</td>
			<td style="width:175px;">Leica</td>
			<td style="width:161px;">AR9352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:267px;">CellSave Preservative Tubes</td>
			<td style="width:175px;">Veridex</td>
			<td style="width:161px;">952820 (20 pack)&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 79100005 (100 pack)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">CellSearch CTC Control Kit</td>
			<td style="width:175px;">Veridex</td>
			<td style="width:161px;">7900003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">CellSearch CTC Kit</td>
			<td style="width:175px;">Veridex</td>
			<td style="width:161px;">7900001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">CellSearch CXC Control Kit</td>
			<td style="width:175px;">Veridex</td>
			<td style="width:161px;">7900018RUO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">CellSearch CXC Kit</td>
			<td style="width:175px;">Veridex</td>
			<td style="width:161px;">7900017RUO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">Instrument Buffer</td>
			<td style="width:175px;">Veridex</td>
			<td style="width:161px;">7901003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:267px;">Streck Cell Preservative (aka CytoChex)</td>
			<td style="width:175px;">Streck</td>
			<td>213350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;"></td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">EQUIPMENT</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">1 ml syringe</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">10 ml serological pipette</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">1000&#181;l pipette</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">1000&#181;l pipette tips</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">12 x 75mm flow tubes</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">200&#181;l gel loading tips</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">200&#181;l pipette</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">22 gauge needle</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">5 3/4&#34; disposible pasteur pipet</td>
			<td style="width:175px;">VWR</td>
			<td style="width:161px;">14672-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:267px;">5 ml serological pipette</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:267px;">Automated pipettor</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:267px;">Capillary Blood Collection Tube (EDTA)</td>
			<td style="width:175px;">BD Microtainer</td>
			<td style="width:161px;">365974</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">CellSearch Analyzer II</td>
			<td style="width:175px;">Veridex</td>
			<td style="width:161px;">9555</td>
			<td rowspan="2" style="width:188px;">Includes magnests and verification cartirdges</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">CellSearch AutoPrep System</td>
			<td style="width:175px;">Veridex</td>
			<td style="width:161px;">9541</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">MagCellect Magnet&#160;</td>
			<td style="width:175px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:161px;">MAG997</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Small Latex Bulb</td>
			<td style="width:175px;">VWR</td>
			<td>82024-550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Vortex</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

adaptation of semiautomated circulating tumor cell (ctc) assays for clinical and preclinical research applications

암 관련 사망의 대다수는 전이성 질환의 발달 이후 발생한다. 이 높은 치명적인 질병 단계는 종양 세포 (의 CTCs)를 순환의 존재와 연결되어 있습니다. 이 희귀 한 세포는 전이성 유방암, 전립선 암, 대장 암의 임상 적 의미의 것으로 입증되었다. 임상 CTC 탐지 및 열거 형의 현재 금 표준은 FDA의 허가 CellSearch 시스템 (CSS)입니다. 이 원고는 표준이 플랫폼에 의해 사용 프로토콜 등을 설명 표준을 사용하여, 환자의 CTCs 단백질 특성 분석을위한 사용자 정의 마커 최적화 및 혈액의 매우 낮은 볼륨에서 CTC 캡처를위한 동급 프로토콜의 자세한 과정을 설명하는 두 개의 추가 적응 프로토콜 CSS 시약, 전이의 생체 내 전임상 마우스 모델에서 공부하십시오. 또한, 건강한 기증자의 혈액 사이의 CTC 품질의 차이는 환자의 혈액 SAMP 대 조직 배양에서의 세포와 스파이크레는 강조 표시됩니다. 마지막으로, CTC의 오 분류 오류가 발생할 수있는 몇 가지 일반적으로 불일치 항목이 설명되어 있습니다. 이와 함께,이 프로토콜은 전이와의 CTCs에 관한 전임상 및 임상 연구에 관심이 플랫폼의 사용자를위한 유용한 리소스를 제공 할 것입니다.

표준 CTC 열거 분석 CSS의 민감도와 특이도는 물론 문헌에 기록되어있다. 그러나 동등한 CTC 복구의 유효성을 검사, 스파이크 (1,000 된 LNCaP 인간의 전립선 암 세포) 및 건강한 자원 봉사 기증자로부터 unspiked 인간의 혈액 샘플은 표준 CSSCTC 프로토콜을 사용하여 CSS에서 처리되었다. 예상했던대로, unspiked 샘플은 0.00 ± 0.00 %의 CTCs 무료 있었고, CTC 복구는 아군 샘플 (그림 1A)에</st...

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Adaptation of Semiautomated Circulating Tumor Cell CTC Assays for Clinical and Preclinical Research Applications

순환 성 종양 세포 (의 CTCs)는 몇개의 전이성 암에서 예후이다. 이 원고는 금 본위제 CellSearch 시스템 (CSS) CTC 열거 플랫폼과 주요 공통의 오 분류 오류에 대해 설명합니다. 또한, 두 개의 적응 프로토콜은이 기술을 사용하여 전이의 전임상 마우스 모델에서의 CTCs 및 CTC 열거 형의 사용자 정의 마커의 특성에 대해 설명합니다.

임상 및 전임상 연구 응용 프로그램에 대한 종양 세포 (CTC) 분석 실험을 순환 반자동의 적응

The majority of cancer-related deaths occur subsequent to the development of metastatic disease. This highly lethal disease stage is associated with the ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

Adaptation of Semiautomated Circulating Tumor Cell (CTC) Assays for Clinical and Preclinical Research Applications

15.8K 조회수.  London Health Sciences Centre.  순환 성 종양 세포 (의 CTCs)는 몇개의 전이성 암에서 예후이다. 이 원고는 금 본위제 CellSearch 시스템 (CSS) CTC 열거 플랫폼과 주요 공통의 오 분류 오류에 대해 설명합니다. 또한, 두 개의 적응 프로토콜은이 기술을 사용하여 전이의 전임상 마우스 모델에서의 CTCs 및 CTC 열거 형의 사용자 정의 마커의 특성에 대해 설명합니다. 

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Processing of Primary Brain Tumor Tissue for Stem Cell Assays and Flow Sorting

Brain tumors are typically comprised of morphologically diverse cells that express a variety of neural lineage markers. Only a relatively small fraction of cells in the tumor with stem cell properties, termed brain tumor initiating cells (BTICs), possess an ability to differentiate along multiple lineages, self-renew, and initiate tumors in vivo. We applied culture conditions originally used for normal neural stem cells (NSCs) to a variety of human brain tumors and found that this culture method specifically selects for stem-like populations. Serum-free medium (NSC) allows for the maintenance of an undifferentiated stem cell state, and the addition of bFGF and EGF allows for the proliferation of multi-potent, self-renewing, and expandable tumorspheres.
To further characterize each tumor's BTIC population, we evaluate cell surface markers by flow cytometry. We may also sort populations of interest for more specific characterization. Self-renewal assays are performed on single BTICs sorted into 96 well plates; the formation of tumorspheres following incubation at 37 &deg;C indicates the presence of a stem or progenitor cell. Multiple cell numbers of a particular population can also be sorted in different wells for limiting dilution analysis, to analyze self-renewal capacity. We can also study differential gene expression within a particular cell population by using single cell RT-PCR.
The following protocols describe our procedures for the dissociation and culturing of primary human samples to enrich for BTIC populations, as well as the dissociation of tumorspheres. Also included are protocols for staining for flow cytometry analysis or sorting, self-renewal assays, and single cell RT-PCR.

The identification of brain tumor initiating cells (BTICs), the rare cells within a heterogeneous tumor possessing stem cell properties, provides new insights into human brain tumor pathogenesis. We have refined specific culture conditions to enrich for BTICs, and we routinely use flow cytometry to further enrich these populations. Self-renewal assays and transcript analysis by single cell RT-PCR can subsequently be performed on these isolated cells.

정렬 줄기 세포 Assays 및 흐름에 대한 기본 뇌 종양 조직의 처리

Brain tumors are typically comprised of morphologically diverse cells that express a variety of neural lineage markers. Only a relatively small fraction ...

연구

의학

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. Here, we describe a general protocol for cell labeling, imaging, and image processing. The technique is applicable to various cell types and animal models, although here we focus on a typical mouse model for tracking murine immune cells. The most important issues for cell labeling are described, as these are relevant to all models. Similarly, key imaging parameters are listed, although the details will vary depending on the MRI system and the individual setup. Finally, we include an image processing protocol for quantification. Variations for this, and other parts of the protocol, are assessed in the Discussion section. Based on the detailed procedure described here, the user will need to adapt the protocol for each specific cell type, cell label, animal model, and imaging setup. Note that the protocol can also be adapted for human use, as long as clinical restrictions are met.

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

We describe a general protocol for in vivo cell tracking using MRI in a mouse model with ex vivo labeled cells. A typical protocol for cell labeling, image acquisition processing and quantification is included.

세포 추적을위한 생체 19 F MRI에서

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. ...

A Novel in vivo Gene Transfer Technique and in vitro Cell Based Assays for the Study of Bone Loss in Musculoskeletal Disorders

Differentiation and activation of osteoclasts play a key role in the development of musculoskeletal diseases as these cells are primarily involved in bone resorption. Osteoclasts can be generated in vitro from monocyte/macrophage precursor cells in the presence of certain cytokines, which promote survival and differentiation. Here, both in vivo and in vitro techniques are demonstrated, which allow scientists to study different cytokine contributions towards osteoclast differentiation, signaling, and activation. The minicircle DNA delivery gene transfer system provides an alternative method to establish an osteoporosis-related model is particularly useful to study the efficacy of various pharmacological inhibitors in vivo. Similarly, in vitro culturing protocols for producing osteoclasts from human precursor cells in the presence of specific cytokines enables scientists to study osteoclastogenesis in human cells for translational applications. Combined, these techniques have the potential to accelerate drug discovery efforts for osteoclast-specific targeted therapeutics, which may benefit millions of osteoporosis and arthritis patients worldwide.

A Novel in vivo Gene Transfer Technique and in vitro Cell Based Assays for the Study of Bone Loss in Musculoskeletal Disorders

Differentiation of precursor cells into osteoclasts is regulated by cytokines and growth factors. Here, a novel gene transfer technique for differentiation of osteoclasts in vivo and cell culture protocols for differentiating precursor cells into osteoclasts in vitro as a method to study the effects of cytokines on osteoclastogenesis are described.

소설<em&gt; 생체</em&gt; 유전자 전달 기술과<em&gt; 시험관</em근골격계 질환의 뼈 손실의 연구를위한&gt; 셀 기반 분석 실험

Differentiation and activation of osteoclasts play a key role in the development of musculoskeletal diseases as these cells are primarily involved in bone ...

Isolation, Cryopreservation and Culture of Human Amnion Epithelial Cells for Clinical Applications

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a potential source of cells for regenerative medicine. The reason for this interest is evidence that these cells have highly multipotent differentiation ability, low immunogenicity, and anti-inflammatory functions. These properties have prompted researchers to investigate the potential of hAECs to be used to treat a variety of diseases and disorders in pre-clinical animal studies with much success.
hAECs have found widespread application for the treatment of a range of diseases and disorders. Potential clinical applications of hAECs include the treatment of stroke, multiple sclerosis, liver disease, diabetes and chronic and acute lung diseases. Progressing from pre-clinical animal studies into clinical trials requires a higher standard of quality control and safety for cell therapy products. For safety and quality control considerations, it is preferred that cell isolation protocols use animal product-free reagents. 
We have developed protocols to allow researchers to isolate, cryopreserve and culture hAECs using animal product-free reagents. The advantage of this method is that these cells can be isolated, characterized, cryopreserved and cultured without the risk of delivering potentially harmful animal pathogens to humans, while maintaining suitable cell yields, viabilities and growth potential. For researchers moving from pre-clinical animal studies to clinical trials, these methodologies will greatly accelerate regulatory approval, decrease risks and improve the quality of their therapeutic cell population.

We describe a protocol to isolate and culture human amnion epithelial cells (hAECs) using animal product-free reagents in accordance with current good manufacturing practices (cGMP) guidelines.

분리, 냉동 보존 및 문화 임상 응용 프로그램에 대한 인간 양막 상피 세포

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a ...

Ex Vivo Treatment Response of Primary Tumors and/or Associated Metastases for Preclinical and Clinical Development of Therapeutics

The molecular analysis of established cancer cell lines has been the mainstay of cancer research for the past several decades. Cell culture provides both direct and rapid analysis of therapeutic sensitivity and resistance. However, recent evidence suggests that therapeutic response is not exclusive to the inherent molecular composition of cancer cells but rather is greatly influenced by the tumor cell microenvironment, a feature that cannot be recapitulated by traditional culturing methods. Even implementation of tumor xenografts, though providing a wealth of information on drug delivery/efficacy, cannot capture the tumor cell/microenvironment crosstalk (i.e., soluble factors) that occurs within human tumors and greatly impacts tumor response. To this extent, we have developed an ex vivo (fresh tissue sectioning) technique which allows for the direct assessment of treatment response for preclinical and clinical therapeutics development. This technique maintains tissue integrity and cellular architecture within the tumor cell/microenvironment context throughout treatment response providing a more precise means to assess drug efficacy.

Ex Vivo Treatment Response of Primary Tumors and/or Associated Metastases for Preclinical and Clinical Development of Therapeutics

Established cancer cell lines and xenografts have been the mainstay of cancer research for the past several decades. However, recent evidence suggests that therapeutic response is greatly influenced by the tumor cell microenvironment. Therefore, we have developed an ex vivo analysis of primary tumor specimens for drug development purposes.

기본 종양 및 / 또는 전임상에 대한 관련 전이 및 치료제의 임상 개발의 전 생체 치료 응답

The molecular analysis of established cancer cell lines has been the mainstay of cancer research for the past several decades. Cell culture provides both ...

Isolation and Propagation of Circulating Tumor Cells from a Mouse Cancer Model

Cancer metastasis is the foremost cause of cancer-associated deaths. Recent studies have shown that circulating tumor cells (CTCs) are important in cancer metastasis. Indeed, the number of CTCs correlates with tumor size. Here, a detailed description is provided of a methodology for isolation and propagation of CTCs from a syngeneic mouse model of hepatocellular carcinoma (HCC) which allows for downstream analysis of potentially important molecular mechanisms of solid organ tumor metastasis. This method is efficient and reproducible. It is a non-invasive technique and, therefore, has potential to replace the invasive biopsy of tissues from humans which may be associated with complications. Therefore, the method discussed here allows for the isolation and propagation of CTCs from whole blood samples such that they can be examined and characterized. This has potential for future adaptation for clinical applications such as diagnosis, and personalized targeted therapy.

Circulating tumor cells (CTCs) have been shown to play an important role in tumor metastasis. Here, a method for the isolation and propagation of CTCs from the whole blood of a syngeneic mouse tumor model of hepatocellular carcinoma (HCC) metastasis is described.

마우스 종양 모델에서 종양 세포 순환의 분리 및 전파

Cancer metastasis is the foremost cause of cancer-associated deaths. Recent studies have shown that circulating tumor cells (CTCs) are important in cancer ...

Generation of Prostate Cancer Patient Derived Xenograft Models from Circulating Tumor Cells

Patient derived xenograft (PDX) models are gaining popularity in cancer research and are used for preclinical drug evaluation, biomarker identification, biologic studies, and personalized medicine strategies. Circulating tumor cells (CTC) play a critical role in tumor metastasis and have been isolated from patients with several tumor types. Recently, CTCs have been used to generate PDX experimental models of breast and prostate cancer. This manuscript details the method for the generation of prostate cancer PDX models from CTCs developed by our group. Advantages of this method over conventional PDX models include independence from surgical sample collection and generating experimental models at various disease stages. Density gradient centrifugation followed by red blood cell lysis and flow cytometry depletion of CD45 positive mononuclear cells is used to enrich CTCs from peripheral blood samples collected from patients with metastatic disease. The CTCs are then injected into immunocompromised mice; subsequently generated xenografts can be used for functional studies or harvested for molecular characterization. The primary limitation of this method is the negative selection method used for CTC enrichment. Despite this limitation, the generation of PDX models from CTCs provides a novel experimental model to be applied to prostate cancer research.

This manuscript details a method used to generate prostate cancer patient derived xenografts (PDXs) from circulating tumor cells (CTCs). The generation of PDX models from CTCs provides an alternative experimental model to study prostate cancer; the most commonly diagnosed tumor and a frequent cause of death from cancer in men.

전립선 암 환자의 발생은 종양 세포를 순환에서 이종 이식 모델을 파생

Patient derived xenograft (PDX) models are gaining popularity in cancer research and are used for preclinical drug evaluation, biomarker identification, ...

Proton Therapy Delivery and Its Clinical Application in Select Solid Tumor Malignancies

Radiation therapy is a frequently used modality for the treatment of solid cancers. Although the mechanisms of cell kill are similar for all forms of radiation, the in vivo properties of photon and proton beams differ greatly and maybe exploited to optimize clinical outcomes. In particular, proton particles lose energy in a predictable manner as they pass through the body. This property is used clinically to control the depth at which the proton beam is terminated, and to limit radiation dose beyond the target region. This strategy can allow for substantial reductions in radiation dose to normal tissues located just beyond a tumor target. However, the degradation of proton energy in the body remains highly sensitive to tissue density. As a consequence, any changes in tissue density during the course of treatment may significantly alter proton dosimetry. Such changes may occur through alterations in body weight, respiration, or bowel filling/gas, and may result in unfavorable dose deposition. In this manuscript, we provide a detailed method for the delivery of proton therapy using both passive scatter and pencil beam scanning techniques for prostate cancer. Although the described procedure directly pertains to prostate cancer patients, the method may be adapted and applied for the treatment of virtually all solid tumors. Our aim is to equip readers with a better understanding of proton therapy delivery and outcomes in order to facilitate the appropriate integration of this modality during cancer therapy.

The fundamentals of radiation planning and delivery for proton therapy using prostate cancer as a model are presented. The application of these principles to other selected disease sites highlights how proton radiotherapy may enhance clinical outcomes for cancer patients.

양성자 치료 배달 및 선택 고체 종양 악성 종양에서의 임상 응용

Radiation therapy is a frequently used modality for the treatment of solid cancers. Although the mechanisms of cell kill are similar for all forms of ...

An In Vivo Method for Evaluating the Gut-Blood Barrier and Liver Metabolism of Microbiota Products

The gut-blood barrier (GBB) controls the passage of nutrients, bacterial metabolites and drugs from intestinal lumen to the bloodstream. The GBB integrity is disturbed in gastrointestinal, cardiovascular and metabolic diseases, which may result in easier access of biologically active compounds, such as gut bacterial metabolites, to the bloodstream. Thus, the permeability of the GBB may be a marker of both intestinal and extraintestinal diseases. Furthermore, the increased penetration of bacterial metabolites may affect the functioning of the entire organism.
Commonly used methods for studying the GBB permeability are performed ex vivo. The accuracy of those methods is limited, because the functioning of the GBB depends on intestinal blood flow. On the other hand, commonly used in vivo methods may be biased by liver and kidney performance, as those methods are based on evaluation of urine or/and peripheral blood concentrations of exogenous markers. Here, we present a direct measurement of GBB permeability in rats using an in vivo method based on portal blood sampling, which preserves intestinal blood flow and is virtually not affected by the liver and kidney function. 
Polyurethane catheters are inserted into the portal vein and inferior vena cava just above the hepatic veins confluence. Blood is sampled at baseline and after administration of a selected marker into a desired part of the gastrointestinal tract. Here, we present several applications of the method including (1) evaluation of the colon permeability to TMA, a gut bacterial metabolite, (2) evaluation of liver clearance of TMA, and (3) evaluation of a gut-portal blood-liver-peripheral blood pathway of gut bacteria-derived short-chain fatty acids. Furthermore, the protocol may also be used for tracking intestinal absorption and liver metabolism of drugs or for measurements of portal blood pressure.

An In Vivo Method for Evaluating the Gut-Blood Barrier and Liver Metabolism of Microbiota Products

The access of nutrients, microbiota metabolites and medicines to the circulation is controlled by the gut-blood barrier (GBB). We describe a direct method for measuring the GBB permeability in vivo, which, in contrast to commonly used indirect methods, is virtually not affected by liver and kidney functions.

창 자-혈액 장벽 및 간 대사 Microbiota 제품의 평가 위한 Vivo에서 방법

The gut-blood barrier (GBB) controls the passage of nutrients, bacterial metabolites and drugs from intestinal lumen to the bloodstream. The GBB integrity ...

An Ex Vivo Tissue Culture Model for Fibrovascular Complications in Proliferative Diabetic Retinopathy

Diabetic retinopathy (DR) is the most common microvascular complication of diabetes and one of the leading causes of blindness in working-age adults. No current animal models of diabetes and oxygen-induced retinopathy develop the full-range progressive changes manifested in human proliferative diabetic retinopathy (PDR). Therefore, understanding of the disease pathogenesis and pathophysiology has relied largely on the use of histological sections and vitreous samples in approaches that only provide steady-state information on the involved pathogenic factors. Increasing evidence indicates that dynamic cell-cell and cell-extracellular matrix (ECM) interactions in the context of three-dimensional (3D) microenvironments are essential for the mechanistic and functional studies towards the development of new treatment strategies. Therefore, we hypothesized that the pathological fibrovascular tissue surgically excised from eyes with PDR could be utilized to reliably unravel the cellular and molecular mechanisms of this devastating disease and to test the potential for novel clinical interventions. Towards this end, we developed a novel method for 3D ex vivo culture of surgically-excised patient-derived fibrovascular tissue (FT), which will serve as a relevant model of human PDR pathophysiology. The FTs are dissected into explants and embedded in fibrin matrix for ex vivo culture and 3D characterization. Whole-mount immunofluorescence of the native FTs and end-point cultures allows thorough investigation of tissue composition and multicellular processes, highlighting the importance of 3D tissue-level characterization for uncovering relevant features of PDR pathophysiology. This model will allow the simultaneous assessment of molecular mechanisms, cellular/tissue processes and treatment responses in the complex context of dynamic biochemical and physical interactions within the PDR tissue architecture and microenvironment. Since this model recapitulates PDR pathophysiology, it will also be amenable for testing or developing new treatments.

Here, we present a protocol to study the pathophysiology of proliferative diabetic retinopathy by using patient-derived, surgically-excised, fibrovascular tissues for three-dimensional native tissue characterization and ex vivo culture. This ex vivo culture model is also amenable for testing or developing new treatments.

증식 성 당뇨 망막 증에 Fibrovascular 합병증에 대 한 전 비보 조직 문화 모델

Diabetic retinopathy (DR) is the most common microvascular complication of diabetes and one of the leading causes of blindness in working-age adults. No ...