Name: in vitro assays to assess blood-brain barrier mesh-like vessel formation and disruption
Uploaded: 2017-06-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 36 s
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레온 타이 (Leon Tai)는 일리노이 대학 시카고 스타트 업 펀드가 자금을 지원합니다.

모든 실험은 시카고 기관 동물 관리 및 사용위원회의 일리노이 대학 (University of Illinois)을 따른다. 1. 일반 준비 참고 : 뇌 미세 혈관 내피 세포주 (hCMEC / D3)는 광범위하게 특성화 된 불멸화 인간 BEC 라인 14 , 15 , 16 , 18 , 19 입니다. 기저 내피 성장 기초 배지에서 콜라겐 유형 I (종아리 피부, 칼슘 2 + 및 Mg 2+를 함유 한 행크의 균형 소금 솔루션 (HBSS) 0.1 % 솔루션의 1:20 희석)로 코팅 조직 배양 플라스크에 hCMEC / D3 세포를 문화 (FBS), 10 % 아스 코르 빈산, 10 % 겐타 마이신 설페이트, 25 % 하이드로 코티 존 및 공급 된 성장 인자 보충제의 총량의 1/4을 포함하는 배양액 (EBM-2) 혈관 내피 세포(VEGF), 표피 성장 인자 (EGF), 인슐린 유사 성장 인자 1 (IGF-1) 및 사람의 염기성 섬유 모세포 성장 인자 (bFGF)와 관련이있다. 참고 : FBS 및 성장 인자가있는 EBM-2 배지를 &quot;EBM-2 complete&quot;라고합니다. FBS와 보충제가없는 EBM-2는 &quot;EBM-2 basal&quot;이라고합니다. 완전한 합류점에서, hCMEC / D3 세포는 ~ 1 x 105cells / cm2이다. <ol><li> 5 분 동안 5 ML 트립신 / EDTA (0.25 %)와 분리 후 칼슘 2 + 및 MG 2 + 없이 3 분 먼저 HBSS와 incubating하여 1시 5 분의 비율로 hCMEC / D3 세포를 통과. EBM - 2 완료 (1시 1 분 중화)를 사용하여 트립신을 중성화하고 4 ° C에서 5 분 동안 290 XG에서 원심 분리하십시오; 상등액을 버린다. 펠렛을 EBM - 2 완료 및 1시 5 분 비율로 다시 접시에 Resuspend. </li><li> 공급 업체의 프로토콜 [ Table of Materials ]에 따라 주요 인간의 혈관 주위 세포 및 성상 교세포를 배양합니다. 문화FBS와 pericyte 성장 보충을 가진 pericyte 기본적인 매체에있는 pericytes. </li><li> 성상 세포 성장 인자를 함유 한 성상 세포에서의 인간 성상 세포 배양. 세포 부착을위한 폴리 -L- 라이신 (PLL) 3 ML로 코팅 조직 배양 플라스크의 pericytes과 astrocytes 모두 문화와 통로 2와 5 사이의 세포를 활용하십시오. </li><li> 7 마리의 마우스를 안락사시키고 포셉으로 뇌간과 소뇌를 제거하십시오. 신중하게 거즈에 두뇌를 굴려하여 meninges를 분리하십시오. 멸균 면도날과 HEPES (뇌 당 5 ML)와 최소 필수 매체 (MEM) 페트리 접시에 남아있는 뇌 조직을 말하다. 참조 된 프로토콜 20 에 따라 2 개월 된 C57BL / 6J 마우스의 기본 마우스 BEC를 분리합니다. </li><li> 15 ML 원뿔 튜브에 다진 뇌 조직을 전송합니다. 4 ° C에서 5 분 동안 290 xg에서 원심 분리하십시오. 뜨는을 제거하고 papain (뇌 당 833.33 μL)과 DNase (뇌 당 41.7 μL)에 조직을 품어용액을 37 ° C 수 욕조에서 1 시간 동안 처리하여 조직을 소화시킨다. </li><li> 19 및 21 게이지 바늘을 통해 균질 물을 순차적으로 분쇄하고 22 % Bovine Serum Albumin (BSA) 용액으로 1 : 1 비율로 혼합하고 4 ℃에서 10 분 동안 1360 xg에서 원심 분리하십시오. </li><li> 4 ML에서 5 분 290 XG에서 1 ML EBM - 2 완료 및 원심 분리기에서 결과 펠렛을 Resuspend ° C. 다시 1 ML EBM - 2에 Resuspend 및 콜라겐 (우물 당 ~ 1 두뇌)로 코팅 6 잘 접시에 세포 (1 ML / 잘) 판. </li><li> 24 시간 후 4 μg / mL 퓨로 마이신 하이드로 클로라이드가 함유 된 EBM-2 완충액으로 배지를 교체하십시오. 2 일 후에 EBM-2로 교체하십시오. 1 차 BEC는 hCMEC / D3 세포와 마찬가지로 배양되고 1 x 105 세포 / cm2에서 완전히 합류한다. </li><li> 분석 전 24 시간 동안 oAβ 100 μM을 준비하십시오. 참고 : oAβ는 A의 질병 관련 형태로 간주됩니다. oAβ의 경우, Dahlgren et al. 21 . </li><li> 튜브 당 140 μL 지하 막에서 살균 PCR 튜브 스트립 (8 튜브)로 4 ° C 및 나누어지는에서 하룻밤 지하 멤브레인 주식 솔루션을 해동. -20 ° C에서 각 스트립 및 저장소를 재 윤활하십시오. 분석 4 시간 전에 96- 웰 플레이트 당 1 개의 스트립을 해동 (24 시간). 응고를 피하려면 피펫 팁을 미리 냉각하십시오. 참고 : 신속한 응고를 피하기 위해 기저막 매트릭스의 모든 취급은 얼음에서 수행해야합니다. 분석 당일 10 μL의 기저막이 사용되므로 각 스트립은 하나의 96- 웰 플레이트에 충분합니다. </li><li> 분석 전 24 시간 동안 EBM-2 기저부에서 완전히 융합하는 BEC를 배양하십시오. 참고 : 이론적 근거는 다음과 같습니다. EBM-2 complete는 보충 인자와 FBS가 최적의 세포 성장을 촉진 할 목적으로 포함되어 있습니다. 그러나, 세포 성장을 촉진하는 동일한 분자 경로는 뇌 내피 세포 커버 리지 및 역학에있어서, 존재 및 아울러 모두 중요하다스트레스 원의 nce. 따라서 우리는 혈청과 보충제가 세포 신호 전달 경로의 잔류 활성화의 교란 효과를 줄이기 위해 BEC를 굶어 죽인다. 주목할 것은, 세포는 분석 전에 트립신 처리 된 세포의 중화 동안 FBS에 간단히 노출된다 (5 분). BECs와는 달리, 혈장 기아에 대한 반응으로 이들 세포 유형의 성장 및 상대적 불안정성 (타이 실험실, 미발표 관측)에 대한 상이한 요인의 요구 때문에 혈관 주위 세포 및 성상 교세포는 혈청이 굶어지지 않는다. 참고 : EBM - 2 기초는 단일 및 삼중 문화 meshwork 형성 및 중단 assays에 대한 분석하는 동안 활용됩니다. 이것은 스트레스 요인이나 치료에 의존하는 신호 전달을 막는 데 중요합니다. </li></ol> 2. Meshwork와 같은 형성 및 파괴 Assays <ol><li> 단일 BEC 배양 검사 : 참고 : BEC의 단일 문화에 대한 세 가지 패러다임은 그림 1A에 표시됩니다 </strong&gt;. 각 패러다임은 서로 다른 선박 적용 모델에서 BEC의 반응을 평가하도록 설계되었습니다. 패러다임 1은 망사 형성이다. 이 패러다임은 혈관 신생 및 망막 형성에 대한 스트레스 요인 및 / 또는 치료의 영향을 조사하기 위해 고안되었습니다. BECs, oAβ 및 처리제는 모두 0 시간 시점에서 플레이트에 첨가된다. 패러다임 2는 망사 방해를 방지합니다. 세포를 성장 인자 또는 약물의 존재하에 도금하고 4 시간 동안 배양하여 망사 형 구조를 형성시켰다. 이 경우 스트레스 요인 인 oAβ가 4 시간 후에 첨가됩니다. 이 패러다임은 미리 형성된 망사 형 구조물에 대한 스트레스 요인에 의한 손상을 방지하기위한 치료의 능력을 평가합니다. 패러다임 3은 망사 혼란을 동시에 처리합니다. 세포를 플레이 팅하고 4 시간 동안 망사 형 구조물을 형성하도록 허용한다. 이어서, 처리 및 oAβ를 4 시간 시점에서 동시에 첨가하여, 예비 처리 된 세포 네트워크가 다양한 치료에 반응하는 능력을 평가한다. 모든 패러다임 fo치료 추가시기의 차이를 제외하고는 비슷한 공통 단계를 거칩니다. <ol><li> 분석 당일에, 96- 웰 플레이트의 바닥에 10 μL / 웰의 기저막 매트릭스를 피펫 팅하고 37 ℃에서 1 시간 동안 세팅하도록 허용한다. </li><li> 10 MM 스톡 용액을 생성하기 위해 10 μL DMSO에서 동결 건조 녹색 세포 추적 염료 ( 자료 표 참조)를 일시 중지하고 EBM - 2 기저부에서 10 μM (1 : 1000)로 희석합니다. 완전히 합류 플라스크에서 미디어를 제거하고 녹색 세포 추적 염료 (75cm 2 플라스크 5 ML)를 포함하는 EBM - 2 기초로 바꿉니다. 분석 시작 20 분 전에 BEC에 녹색 세포 추적 염료를 미리 담그십시오. </li><li> 37에서 20-30 분 동안 세포를 품어 ° C, 세포 추적 염료와 매체를 제거하고 단계 1.1에서 설명한대로 세포를 분리하십시오. 10 % FBS를 포함하는 EBM - 2로 매체를 중성화하고 4 ° C에서 5 분 동안 240 XG에서 원심 분리하십시오. 펠렛을 1 ML의 EBM - 2 기저부에 Resuspend. </li><li> EBM - 2 기초 (모든 패러다임에서 0 시간 시점)에서 10,000 세포 / 잘에서 96 - 웰 플레이트에 BECs를 판다. 참고 : 활용되는 패러다임에 따라 치료, 스트레스 요인 또는 차량 컨트롤이 지정된 시점에 추가됩니다. 모든 패러다임에서, 배지는 후속 분석 ( 예 : ELISA 분석)을 위해 수확하고 인산 완충 혈청 (PBS)에서 새로 준비한 4 % 파라 포름 알데히드로 세포를 24 시간 고정합니다. 메쉬 형성에 대한 oAβ의 효과를 결정하기위한 또 다른 접근 방법으로 프로토콜을 수정하여 컨 플루 언트 세포 배양 플라스크에 oAβ를 미리 배양 한 다음 망사 형성 패러다임 (+/- oAβ)을 수행 할 수 있습니다. 참고 : 모든 패러다임에 대한 각 웰의 최종 부피는 70 μL입니다. 모든 치료 (oAβ, EGF 등 )는 1:20 희석, 즉 치료 당 3.5 μL에서 각각의 우물에 첨가됩니다. 패러다임 1의 경우, 세포를 63 μL / w의 세포 현탁 용액에 넣습니다엘. 즉시 oAβ, 원하는 치료법 및 대조군을 각각 3.5 μL / well 씩 첨가하여 총 70 μL를줍니다. 패러다임 2의 경우, 세포 현탁액 63 μL 및 치료 3.5 μL ( 예 : 100 ng / mL EGF)를 0 시간 시점에 추가합니다. 4 시간 배양 한 후, 3.5 μL의 oAβ 스톡을 첨가한다 ( 예 : 100 nM 최종 oAβ 농도, 3.5 μL의 2 μM oAβ 스톡). Paradigm 3의 경우, 세포 현탁액 63 μL를 0 시간 시점에서 첨가하고 4 시간 후 oAβ와 원하는 치료법을 각각 3.5 μL / well 씩 첨가하여 총 70 μL를줍니다. 이 부피는 치료법에 따라 조정될 수 있습니다. 예를 들어, 단 한 번의 치료가 필요한 경우 세포 현탁액을 66.5 μL (10,000 세포 / 웰을 유지)로 조절할 수 있으며 치료 용량은 3.5 μL로 유지 될 수 있습니다. </li></ol></li><li> 삼중 배양 분석 : 참고 : BEC의 단일 배양 검사뿐만 아니라,( 예 : oAβ)에 대한 예비 형성된 네트워크 내의 BECs, 혈관 주위 세포 및 성상 세포의 반응을 결정하기 위해 triple culture assay 패러다임 ( 그림 1B )을 개발했다. BEC는 0 시간에서 원하는 치료가있는 상태에서 도금됩니다. 4 시간 후, 혈장 주위 세포를 부드럽게 플레이트에 첨가 하였다. 7 시간에, 성상 교세포를 플레이트에 첨가 한 다음, 11 시간에 스트레스 인자를 첨가 하였다. 세포를 24 시간 시점까지 배양한다. 참고 : 3 배 배양 검사의 경우 모든 세포가 동시에 융합되도록 타이밍을 고려하는 것이 중요합니다. 인간의 성상 세포 및 혈관 주위 세포는 분석 1 주 전에 배양해야하며, hCMEC / D3 세포는 분석 일 4 ~ 5 일 전에 도금 또는 계대해야합니다. 또한, 표현형 표류를 피하기 위해 낮은 통과 (2-5) 기본 세포를 사용하는 것이 중요합니다. <ol><li> 분석을 시작하기 전에 hCMEC / D3 세포에 녹색 세포 추적 염료 작동 솔루션을 20 분 추가합니다. 10시 hCMEC / D3 세포를 플레이트, EBM-2 기초 (0 시간 시점)에서 000 세포 / 웰. 사용 된 부피는 세포 현탁액 45 μL와 치료 3.5 μL입니다 ( 즉, 최종 EGF 농도 50 ng / mL, 100 ng / mL 또는 20 배 이상 농축 된 스톡에서 1,000 ng / mL). </li><li> 37 ° C에서 3.5 시간 보육 다음, 인간의 기본 혈관 주위 세포에 파란색 셀 추적 염료 작동 솔루션 (EBM - 2 기저부에 10 μM 세포 추적기 파란색)을 추가합니다. 4 시간 시점 (세포 추적 염료와 함께 ~ 30 분 보육)에서 6 μL / 잘 볼륨 hCMEC / D3을 포함하는 플레이트에 2,000 pericytes / 잘 추가합니다. </li><li> 추가 2.5 시간 부화 (0 시간 시점에서 총 6.5 시간) 후, 인간의 기본 astrocytes에 오렌지 세포 추적 염료 작동 솔루션 (EBM - 2 기저부에 10 μm의 세포 추적기 오렌지)를 추가합니다. 7 시간 시점에서, 부드럽게 12 μL 볼륨에 접시에 10,000 astrocytes를 추가합니다. 따라서, 내피 세포에 대한 전체 세포 비율 : pericytes : astrocytes 내가s 5 : 1 : 5. 또한이 지점까지 도달 한 양은 66.5 μL입니다. </li><li> 4 시간 후 (0 시간 시점에서 총 11 시간) oAβ (100μM 스톡 3.5μL)를 첨가한다. </li><li> PBS에서 갓 준비한 4 % paraformaldehyde에서 13 시간 후 세포를 고정합니다. 주의 : 파라 포름 알데히드를 취급하는 동안 보호 복, 장갑 및 안경을 착용하십시오. </li></ol></li></ol> 3. 정량화 <ol><li> 해부 현미경을 사용하여 50 % 최대 전력에서 2 초 노출 시간과 1.6X 배율에서 96 - 웰 플레이트의 전체 우물의 형광 이미지를 캡처합니다. 참고 : 동등한 현미경을 사용할 수 있습니다. 그러나 포괄적 인 분석을 위해 전체 우물을 포획하는 것이 중요합니다. </li><li> 정량 분석을 위해 ImageJ 혈관 신생 분석기 플러그인 22 를 사용하여 이미지를 처리하여 분기 수, 메시 수 및 총 셀 길이를 계량합니다 (이 판독 값은 소프트웨re). 이 단계의 상세한 시각적 프로토콜은 그림 2에 나와 있습니다. <ol><li> 소프트웨어 아이콘을 클릭하여 피지 ImageJ를 엽니 다. </li><li> 툴바의 끝에있는 두 개의 빨간색 화살표를 클릭하고 &quot;Angiogenesis Analyzer&quot;를 클릭하십시오. </li><li> 이미지 파일이있는 폴더를 선택하고 &quot;열기&quot;를 클릭하십시오. </li><li> &quot;분석 설정&quot;상자가 나타나면 &quot;확인&quot;을 클릭하십시오. </li><li> 처리 할 이미지 수를 나타내는 &quot;이미지 처리 중&quot;상자가 나타나면 &quot;확인&quot;을 클릭하십시오. </li><li> 예상 처리 시간을 나타내는 &quot;일괄 진행 창&quot;상자가 나타납니다. 이 시간 동안 프로그램은 분기 수, 메쉬 수 및 전체 셀 길이를 포함한 출력을 계량합니다. 참고 : 모든 이미지가 정량화되면 결과 파일이 원본 이미지 폴더에 스프레드 시트 문서로 나타납니다. </li><li> 고르다스프레드 시트 파일에는 결과가 포함되어 있으며 그룹간에 분기, 메쉬 및 총 셀 길이의 수를 비교합니다. 참고 : Triple culture assay에서 ImageJ는 pericyte / astrocyte 적용 범위와 수를 분석하기 위해 추가로 활용됩니다. 맹인 실험자가 임계 값을 설정하고 판독 값을 생성하는 데 사용되는 &quot;입자 분석&quot;기능을 사용합니다. 고정 세포 및 튜브와 같은 구조는 또한 Aβ 17 또는 다른 마커에 대해 면역 염색 될 수 있습니다. </li></ol></li></ol>

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	<li>Abbott, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-brain+barrier+structure+and+function+and+the+challenges+for+CNS+drug+delivery.">Blood-brain barrier structure and function and the challenges for CNS drug delivery.</a> J Inherit Metab Dis. 36 (3), 437-449 (2013).</li><li>Engelhardt, B., Liebner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+insights+into+the+development+and+maintenance+of+the+blood-brain+barrier.">Novel insights into the development and maintenance of the blood-brain barrier.</a> Cell Tissue Res. 355 (3), 687-699 (2014).</li><li>Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+the+blood-brain+barrier.">Structure and function of the blood-brain barrier.</a> Neurobiol Dis. 37 (1), 13-25 (2010).</li><li>Zlokovic, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurovascular+pathways+to+neurodegeneration+in+Alzheimer's+disease+and+other+disorders.">Neurovascular pathways to neurodegeneration in Alzheimer's disease and other disorders.</a> Nat Rev Neurosci. 12 (12), 723-738 (2011).</li><li>Pardridge, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+delivery+of+protein+and+gene+medicines+through+the+blood-brain+barrier.">Targeted delivery of protein and gene medicines through the blood-brain barrier.</a> Clin Pharmacol Ther. 97 (4), 347-361 (2014).</li><li>Tai, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+APOE+in+cerebrovascular+dysfunction.">The role of APOE in cerebrovascular dysfunction.</a> Acta Neuropathol. 131 (5), 709-723 (2016).</li><li>Biron, K. E., Dickstein, D. L., Gopaul, R., Jefferies, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+triggers+extensive+cerebral+angiogenesis+causing+blood+brain+barrier+permeability+and+hypervascularity+in+Alzheimer's+disease.">Amyloid triggers extensive cerebral angiogenesis causing blood brain barrier permeability and hypervascularity in Alzheimer's disease.</a> PLoS One. 6 (8), e23789 (2011).</li><li>Cameron, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alzheimer's-related+peptide+amyloid-beta+plays+a+conserved+role+in+angiogenesis.">Alzheimer's-related peptide amyloid-beta plays a conserved role in angiogenesis.</a> PLoS One. 7 (7), e39598 (2012).</li><li>Boscolo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta+amyloid+angiogenic+activity+in+vitro+and+in+vivo.">Beta amyloid angiogenic activity in vitro and in vivo.</a> Int J Mol Med. 19 (4), 581-587 (2007).</li><li>Paris, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+angiogenesis+in+a+transgenic+mouse+model+of+cerebral+amyloidosis.">Impaired angiogenesis in a transgenic mouse model of cerebral amyloidosis.</a> Neurosci Lett. 366 (1), 80-85 (2004).</li><li>Kitaguchi, H., Ihara, M., Saiki, H., Takahashi, R., Tomimoto, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capillary+beds+are+decreased+in+Alzheimer's+disease,+but+not+in+Binswanger's+disease.">Capillary beds are decreased in Alzheimer's disease, but not in Binswanger's disease.</a> Neurosci Lett. 417 (2), 128-131 (2007).</li><li>Jantaratnotai, N., Ryu, J. K., Schwab, C., McGeer, P. L., McLarnon, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Vascular+Perturbations+in+an+Abeta-Injected+Animal+Model+and+in+AD+Brain.">Comparison of Vascular Perturbations in an Abeta-Injected Animal Model and in AD Brain.</a> Int J Alzheimers Dis. 2011, 918280 (2011).</li><li>Donnini, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abeta+peptides+accelerate+the+senescence+of+endothelial+cells+in+vitro+and+in+vivo,+impairing+angiogenesis.">Abeta peptides accelerate the senescence of endothelial cells in vitro and in vivo, impairing angiogenesis.</a> FASEB J. 24 (7), 2385-2395 (2010).</li><li>Tai, L. M., Holloway, K. A., Male, D. K., Loughlin, A. J., Romero, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid-beta-induced+occludin+down-regulation+and+increased+permeability+in+human+brain+endothelial+cells+is+mediated+by+MAPK+activation.">Amyloid-beta-induced occludin down-regulation and increased permeability in human brain endothelial cells is mediated by MAPK activation.</a> J Cell Mol Med. 14 (5), 1101-1112 (2010).</li><li>Tai, L. M., Loughlin, A. J., Male, D. K., Romero, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P-glycoprotein+and+breast+cancer+resistance+protein+restrict+apical-to-basolateral+permeability+of+human+brain+endothelium+to+amyloid-beta.">P-glycoprotein and breast cancer resistance protein restrict apical-to-basolateral permeability of human brain endothelium to amyloid-beta.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 29 (6), 1079-1083 (2009).</li><li>Tai, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarized+P-glycoprotein+expression+by+the+immortalised+human+brain+endothelial+cell+line,+hCMEC/D3,+restricts+apical-to-basolateral+permeability+to+rhodamine+123.">Polarized P-glycoprotein expression by the immortalised human brain endothelial cell line, hCMEC/D3, restricts apical-to-basolateral permeability to rhodamine 123.</a> Brain Res. 1292, 14-24 (2009).</li><li>Koster, K. P., Thomas, R., Morris, A. W., Tai, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+growth+factor+prevents+oligomeric+amyloid-beta+induced+angiogenesis+deficits+in+vitro.">Epidermal growth factor prevents oligomeric amyloid-beta induced angiogenesis deficits in vitro.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 36 (11), 1865-1871 (2016).</li><li>Weksler, B., Romero, I. A., Couraud, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hCMEC/D3+cell+line+as+a+model+of+the+human+blood+brain+barrier.">The hCMEC/D3 cell line as a model of the human blood brain barrier.</a> Fluids Barriers CNS. 10 (1), 16 (2013).</li><li>Weksler, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-brain+barrier-specific+properties+of+a+human+adult+brain+endothelial+cell+line.">Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line.</a> FASEB J. 19 (13), 1872-1874 (2005).</li><li>Welser-Alves, J. V., Boroujerdi, A., Milner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+primary+mouse+brain+endothelial+cells.">Isolation and culture of primary mouse brain endothelial cells.</a> Methods Mol Biol. 1135, 345-356 (2014).</li><li>Dahlgren, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligomeric+and+fibrillar+species+of+amyloid-beta+peptides+differentially+affect+neuronal+viability.">Oligomeric and fibrillar species of amyloid-beta peptides differentially affect neuronal viability.</a> J Biol Chem. 277 (35), 32046-32053 (2002).</li><li>Carpentier, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis+Analyzer.">Angiogenesis Analyzer.</a> ImageJ News. , (2012).</li><li>Thomas, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+growth+factor+prevents+APOE4+and+amyloid-beta-induced+cognitive+and+cerebrovascular+deficits+in+female+mice.">Epidermal growth factor prevents APOE4 and amyloid-beta-induced cognitive and cerebrovascular deficits in female mice.</a> Acta Neuropathol Commun. 4 (1), 111 (2016).</li><li>Tai, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+APOE+in+cerebrovascular+dysfunction.">The role of APOE in cerebrovascular dysfunction.</a> Acta Neuropathol. 131 (5), 709-723 (2016).</li><li>Ambrose, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroangiogenesis:+a+vascular+basis+for+Alzheimer's+disease+and+cognitive+decline+during+aging.">Neuroangiogenesis: a vascular basis for Alzheimer's disease and cognitive decline during aging.</a> J Alzheimers Dis. 32 (3), 773-788 (2012).</li><li>Ambrose, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+therapeutic+approach+for+senile+dementias:+neuroangiogenesis.">A therapeutic approach for senile dementias: neuroangiogenesis.</a> J Alzheimers Dis. 43 (1), 1-17 (2015).</li><li>Ambrose, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Capillaries+in+the+Lesser+Ailments+of+Old+Age+and+in+Alzheimer's+Disease+and+Vascular+Dementia:+The+Potential+of+Pro-Therapeutic+Angiogenesis.">The Role of Capillaries in the Lesser Ailments of Old Age and in Alzheimer's Disease and Vascular Dementia: The Potential of Pro-Therapeutic Angiogenesis.</a> J Alzheimers Dis. 54 (1), 31-43 (2016).</li></ol>

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기술 된 방법은 뇌 혈관 커버리지를 둘러싼 몇 가지 근본적인 생물학적 문제를 해결하기 위해 활용 될 수있다. 구체적으로, 그들은 수용체 및 신호 전달 경로가 혈관 신생, 암 조직에서의 혈관 확장 및 뇌와 관련된 말초 내피 세포에서 역할을하는지 확인할 수있다. 예를 들면, 혈관 신생 성장 인자 수용체, 산화 질소, 마이 토겐 활성화 단백질 키나아제 신호 전달 및 칼슘 신호 전달 25,26,27이 있습니...

<html> 대뇌 모세 혈관의 혈액 뇌 장벽 (BBB)은 혈액 대 뇌 접촉의 가장 큰 경계면이며 중추 신경계 (CNS) 1 , 2 의 항상성에 중심 역할을합니다. BBB의 동적 인 과정은 혈액에서 원하지 않는 분자의 섭취를 막고, CNS에서 폐기물을 제거하고, 필수 영양소와 신호 분자를 CNS에 공급하고, 신경 염증 1 , 2 , 3 , 4 , 5를 조절 합니다. BBB 손상은 노화 및 알쯔하이머 병 (AD), 다발성 경화증 및 뇌졸중 1 , 2 , 3 , 4 , 5 ,ass = &quot;xref&quot;&gt; 6. 따라서 BBB 기능 장애는 치료 목표를 포함 해 신경 퇴행성 장애에 핵심적인 역할을 할 수 있습니다. 혈관 커버리지를 유지하는 것은 BBB의 항상성 기능에 중요합니다. 그러나, 생체 내 및 시험 관내 자료가 신경 퇴행성 장애에 관련된 과정이 AD에서 특히 BBB 적용 범위를 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13으로 증가시키는 지에 대해 충돌합니다. 따라서 BBB 범위의 역학을 평가하고보다 포괄적으로 이해하기 위해 관련 세포 유형을 사용 하는 시험 관내 모델의 개발에 대한 강력한 근거가 있습니다. 대뇌 모세 혈관은 성상 세포, 혈관 주위 세포 및 뇌 내피 세포 (BEC) 3 입니다. 일반적으로 BBB 기능을 평가하기위한 세포 배양 기술은 스트레스 원 14 , 15 , 16 모두를 첨가 한 후 필터 삽입물에서 키운 세포에서 수행 된 투과성 분석 또는 주요 BEC 단백질의 수준 평가입니다. 중요한 것은이 검사는 뇌 혈관 검사에 초점을 두지 않는다는 것입니다. 여기에서 우리의 이전 방법 17 은 불멸화 된 인간 BEC의 단일 배양, 일차 마우스 BEC의 단일 배양 및 인간화 된 삼중 배양을 사용하여 BEC 적용 범위 및 망사 형 구조를 평가하기 위해 상세화된다모델 (BECs, astrocytes 및 pericytes) BBB. 목표는 BEC 적용 범위에서 AD 진행에 중요한 공헌자로 간주되는 oAβ의 해로운 영향을 입증하는 것이 었습니다. 표피 성장 인자 (EGF)의 보호 효과는 치료 선별 도구로서의 기술의 잠재력을 강조합니다. 이 기술은 1) 혈관 신생 및 혈관 범위에 대한 특정 경로의 역할을 묘사하는 것, 2) 혈관 신생 및 혈관 형성에 질병 및 노화 관련 요인의 영향을 평가하는 것, 3) 약리학 적 특성을 확인하는 것 목표.

<table><tbody><tr><td>hCMEC/D3 cells</td><td>Milipore</td><td>SCC066</td><td></td></tr><tr><td>EBM-2 basal media</td><td>Lonza</td><td>CC-3156</td><td></td></tr><tr><td>Collagen Type 1</td><td>ThermoFisher</td><td>A1064401</td><td></td></tr><tr><td>HBSS, calcium, magnesium, no phenol red</td><td>ThermoFisher</td><td>14025092</td><td></td></tr><tr><td>HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red</td><td>ThermoFisher</td><td>14175095</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.25%)</td><td>ThermoFisher</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>Final concentrations of the SingleQuot growth factor supplements for EBM2 media</td><td>Lonza</td><td>CC-4147</td><td></td></tr><tr><td>5% FBS</td><td>Lonza</td><td>CC-4147</td><td></td></tr><tr><td>10% Ascorbic acid</td><td>Lonza</td><td>CC-4147</td><td></td></tr><tr><td>10% Gentamycin sulphate</td><td>Lonza</td><td>CC-4147</td><td></td></tr><tr><td>25% Hydrocortisone</td><td>Lonza</td><td>CC-4147</td><td></td></tr><tr><td>1/4 volume of the supplied growth factors: fibroblast growth factor, epidermal growth factor, insulin-like growth factor, vascular endothelial growth factor</td><td>Lonza</td><td>CC-4147</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin hydrochloride</td><td>VWR</td><td>80503-312</td><td></td></tr><tr><td>MEM-HEPES</td><td>Thermo Scientific</td><td>12360-038</td><td></td></tr><tr><td>Papain cell dissociation system (papain and DNase1)</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LK003150</td><td></td></tr><tr><td>Human pericytes</td><td>Sciencell</td><td>1200</td><td></td></tr><tr><td>Pericyte basal media</td><td>Sciencell</td><td>1201</td><td></td></tr><tr><td>Pericyte growth supplement</td><td>Sciencell</td><td>1252</td><td></td></tr><tr><td>Human Astrocytes</td><td>Sciencell</td><td>1800</td><td></td></tr><tr><td>Astrocyte media</td><td>Sciencell</td><td>1801</td><td></td></tr><tr><td>Astrocyte growth supplement</td><td>Sciencell</td><td>1852</td><td></td></tr><tr><td>Basement membrane (Matrigel Growth Factor Reduced)</td><td>Corning</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>Angiogenesis m-plates (96-well)</td><td>ibidi</td><td>89646</td><td></td></tr><tr><td>Human Epidermal growth factor</td><td>Shenendoah Biotechnology</td><td>100-26</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker green</td><td>ThermoFisher</td><td>C7025</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker orange</td><td>ThermoFisher</td><td>C34551</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker blue</td><td>ThermoFisher</td><td>C2110</td><td></td></tr><tr><td>Poly-l-lysine</td><td>Sciencell</td><td>0403</td><td></td></tr><tr><td>10% Neutral Buffered Formalin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT5012-60ML</td><td></td></tr><tr><td>C57BL mice</td><td>Jackson Laboratory</td><td>na</td><td></td></tr><tr><td>PCR tube strips</td><td>GeneMate</td><td>T-3014-2</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss stereo discover v.8 dissecting microscope</td><td>Zeiss</td><td>na</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro assays to assess blood-brain barrier mesh-like vessel formation and disruption

Blood-brain barrier (BBB) ​​범위는 중추 신경계 (CNS)의 항상성에 중요한 역할을합니다. BBB는 성상 세포, 혈관 주위 세포 및 뇌 내피 세포 (BECs)에 의해 동적으로 유지됩니다. 여기, 우리는 불멸의 인간 BEC의 단일 문화, 기본 마우스 BEC의 단일 문화, BBB의 인간화 트리플 문화 모델 (BECs, astrocytes 및 pericytes)를 사용하여 BBB 범위를 평가하는 방법을 자세히 설명합니다. 질병 상태에 대한 분석법의 적용 가능성을 강조하기 위해 우리는 BBB 적용 범위에서 알츠하이머 병 (AD) 진행에 중요한 기여를하는 oligomeric amyloid-β (oAβ)의 효과에 대해 설명합니다. 또한 우리는이 기술의 약물 스크리닝 가능성을 조명하기 위해 표피 성장 인자 (EGF)를 이용합니다. 우리의 결과는 단일 및 삼중 배양 BECs은 기초 조건 하에서 meshwork와 같은 구조를 형성하고, oAβ는이 세포 망 조직 형성을 방해하고 예비 형성된 메쉬 구조를 퇴화시키고,EGF는 이러한 혼란을 차단합니다. 따라서 기술 된 기술은 BBB 적용 범위를 조절하는 근본적이고 질병 관련 프로세스를 해부하는 데 중요합니다.

단일 문화에서는 hCMEC / D3 세포 ( 그림 3A )와 기본 마우스 BEC ( 그림 3B ) 모두 우물 전체에 망사 모양의 구조를 형성합니다. 구조는 상호 연결된 노드들의 망목을 특징으로합니다 ( 그림 3 ). 설명 된 모든 패러다임 ( 그림 1 )에서, meshwork와 같은 구조는 24 시간 후 대조군에서 유사하여 ?...

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In Vitro Assays to Assess Blood-brain Barrier Mesh-like Vessel Formation and Disruption

혈액 뇌 장벽의 범위를 유지하는 것은 중추 신경계의 항상성을 유지하기위한 열쇠입니다. 이 프로토콜은 혈액 - 뇌 장벽 범위를 조정하는 근본적인 병적 과정을 묘사하는 체외 기술을 설명합니다.

혈액 뇌 장벽 메쉬와 유사한 혈관 형성 및 분열을 평가하기위한 In vitro 시험 법

Blood-brain barrier (BBB) coverage plays a central role in the homeostasis of the central nervous system (CNS). The BBB is dynamically maintained by ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

In Vitro Assays to Assess Blood-brain Barrier Mesh-like Vessel Formation and Disruption

8.4K 조회수.  University of Illinois at Chicago.  혈액 뇌 장벽의 범위를 유지하는 것은 중추 신경계의 항상성을 유지하기위한 열쇠입니다. 이 프로토콜은 혈액 - 뇌 장벽 범위를 조정하는 근본적인 병적 과정을 묘사하는 체외 기술을 설명합니다. 

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Predicting In Vivo Payloads Delivery using a Blood-brain Tumor-barrier in a Dish

Highly selective by nature, the blood-brain barrier (BBB) is essential for the brain homeostasis in physiological conditions. However, in the context of brain tumors, the molecular selectivity of BBB also shields the neoplastic cells by blocking the delivery of peripherally administered chemotherapies. The development of novel drugs (including nanoparticles) targeting malignant brain tumors ideally requires the use of preclinical animal models to study the drug&#8217;s transcytosis and antitumor efficacy. In order to comply with the 3R principle (refine, reduce, and replace) to reduce the number of laboratory animals in experimental setup and perform the high-throughput screening of a large library of antitumor agents, we developed a reproducible in vitro human and murine mimic of the blood-brain tumor-barrier (BBTB) using three-layered cultures of endothelial cells, astrocytes, and patient-derived glioblastoma spheres. For higher scalability and reproducibility, commercial cell lines or immortalized cells have been used in tailored conditions to allow the formation of a barrier resembling the actual BBB. Here we describe a protocol to obtain a BBTB mimic by culturing endothelial cells in contact with astrocytes at specific cell densities on inserts. This BBTB mimic can be used, for instance, for the quantification and confocal imaging of the nanoparticle passage through the endothelial and astrocytic barriers, in addition to the evaluation of the tumor cell targeting within the same assay. Moreover, we show that the obtained data can be used to predict the behavior of nanoparticles in preclinical animal models. In a broader perspective, this in vitro model could be adapted to other neurodegenerative diseases for the determination of the passage of new therapeutic molecules through the BBB and/or be supplemented with brain organoids to directly evaluate the efficacy of drugs.

Drug targeting to central nervous system tumors is a major challenge. Here we describe a protocol to produce an in vitro mimic of the blood-brain tumor-barrier using murine and/or human cells and discuss their relevance for the predictability of central nervous system tumor targeting in vivo.

예측의 Vivo 페이로드 배달 접시에 혈액 종양-배리어를 사용 하 여

Highly selective by nature, the blood-brain barrier (BBB) is essential for the brain homeostasis in physiological conditions. However, in the context of ...

연구

암 연구학

Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has been implied in the etiology of many brain pathologies, creating a need for development of human in vitro BBB models to assist in clinically-relevant research. Among the numerous BBB models thus far described, a static (without flow), contact BBB model, where astrocytes and brain endothelial cells (BECs) are cocultured on the opposite sides of a porous membrane, emerged as a simplified yet authentic system to simulate the BBB with high throughput screening capacity. Nevertheless the generation of such model presents few technical challenges. Here, we describe a protocol for preparation of a contact human BBB model utilizing a novel combination of primary human BECs and immortalized human astrocytes. Specifically, we detail an innovative method for cell-seeding on inverted inserts as well as specify insert staining techniques and exemplify how we use our model for BBB-related research.

Establishment of human models of the blood-brain barrier (BBB) can benefit research into brain conditions associated with BBB failure. We describe here an improved technique for preparation of a contact BBB model, which permits coculturing of human astrocytes and brain endothelial cells on the opposite sides of a porous membrane.

방법 혈액 - 뇌 장벽의 인간 세포 기반의 연락 모델의 준비를 위해 개선

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has ...

생체공학

Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier (BBB): A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport

The blood brain barrier (BBB) specifically regulates molecular and cellular flux between the blood and the nervous tissue. Our aim was to develop and characterize a highly reproducible rat syngeneic in vitro model of the BBB using co-cultures of primary rat brain endothelial cells (RBEC) and astrocytes to study receptors involved in transcytosis across the endothelial cell monolayer. Astrocytes were isolated by mechanical dissection following trypsin digestion and were frozen for later co-culture. RBEC were isolated from 5-week-old rat cortices. The brains were cleaned of meninges and white matter, and mechanically dissociated following enzymatic digestion. Thereafter, the tissue homogenate was centrifuged in bovine serum albumin to separate vessel fragments from nervous tissue. The vessel fragments underwent a second enzymatic digestion to free endothelial cells from their extracellular matrix. The remaining contaminating cells such as pericytes were further eliminated by plating the microvessel fragments in puromycin-containing medium. They were then passaged onto filters for co-culture with astrocytes grown on the bottom of the wells. RBEC expressed high levels of tight junction (TJ) proteins such as occludin, claudin-5 and ZO-1 with a typical localization at the cell borders. The transendothelial electrical resistance (TEER) of brain endothelial monolayers, indicating the tightness of TJs reached 300 ohm&#183;cm2 on average. The endothelial permeability coefficients (Pe) for lucifer yellow (LY) was highly reproducible with an average of 0.26 &#177;&#160;0.11 x 10-3 cm/min. Brain endothelial cells organized in monolayers expressed the efflux transporter P-glycoprotein (P-gp), showed a polarized transport of rhodamine 123, a ligand for P-gp, and showed specific transport of transferrin-Cy3 and DiILDL across the endothelial cell monolayer. In conclusion, we provide a protocol for setting up an in vitro BBB model that is highly reproducible due to the quality assurance methods, and that is suitable for research on BBB transporters and receptors.

Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier BBB: A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport

The aim of the present study was to validate the reproducibility of an in vitro BBB model involving a rat syngeneic co-culture of endothelial cells and astrocytes. The endothelial cell monolayer presented high TEER and low LY permeability. Expression of specific TJ proteins, functional responses to inflammation and functionality of transporters and receptors were assessed.

설정 - 업<em&gt; 체외</em쥐 뇌 혈관 벽의&gt; 모델 (BBB)​​ : BBB 불 침투성 및 수용체 매개 운송에 초점

The blood brain barrier (BBB) specifically regulates molecular and cellular flux between the blood and the nervous tissue. Our aim was to develop and ...

의학

An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction

Breakdown of the blood-brain barrier (BBB) is a critical step in the development of autoimmune diseases such as multiple sclerosis (MS) and its animal model experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). This process is characterized by the transmigration of activated T cells across brain endothelial cells (ECs), the main constituents of the BBB. However, the consequences on brain EC function upon interaction with such T cells are largely unknown. Here we describe an assay that allows for the evaluation of primary mouse brain microvascular EC (MBMEC) function and barrier integrity during the interaction with T cells over time. The assay makes use of impedance cell spectroscopy, a powerful tool for studying EC monolayer integrity and permeability, by measuring changes in transendothelial electrical resistance (TEER) and cell layer capacitance (Ccl). In direct contact with ECs, stimulated but not na&#239;ve T cells are capable of inducing EC monolayer dysfunction, as visualized by a decrease in TEER and an increase in Ccl. The assay records changes in EC monolayer integrity in a continuous and automated fashion. It is sensitive enough to distinguish between different strengths of stimuli and levels of T cell activation and it enables the investigation of the consequences of a targeted modulation of T cell-EC interaction using a wide range of substances such as antibodies, pharmacological reagents and cytokines. The technique can also be used as a quality control for EC integrity in in vitro T-cell transmigration assays. These applications make it a versatile tool for studying BBB properties under physiological and pathophysiological conditions.

An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction

Here, we describe an in vitro murine model of the blood-brain barrier that makes use of impedance cell spectroscopy, with a focus on the consequences on endothelial cell integrity and permeability upon interaction with activated T cells.

<em&gt; 체외</em&gt; 임피던스 분광학을 사용하여 혈액 - 뇌 장벽 모델 : T 세포 - 내피 세포 상호 작용에 초점

Breakdown of the blood-brain barrier (BBB) is a critical step in the development of autoimmune diseases such as multiple sclerosis (MS) and its animal ...

면역학 및 감염병학

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte extravasation might result in pathophysiological changes in the CNS. Thus, investigation of lymphocyte migration into the CNS is important to understand inflammatory CNS diseases and to develop new therapy approaches. Here we present an in vitro model of the human blood-brain barrier to study lymphocyte extravasation. Human brain microvascular endothelial cells (HBMEC) are confluently grown on a porous polyethylene terephthalate transwell insert to mimic the endothelium of the blood-brain barrier. Barrier function is validated by zonula occludens immunohistochemistry, transendothelial electrical resistance (TEER) measurements as well as analysis of evans blue permeation. This model allows investigation of the diapedesis of rare lymphocyte subsets such as CD56brightCD16dim/- NK cells. Furthermore, the effects of other cells, cytokines and chemokines, disease-related alterations, and distinct treatment regimens on the migratory capacity of lymphocytes can be studied. Finally, the impact of inflammatory stimuli as well as different treatment regimens on the endothelial barrier can be analyzed.

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Here, we describe a human blood-brain barrier model enabling to investigate lymphocyte transmigration into the central nervous system in vitro.

를 사용하여 림프구 혈관 외로 유출 분석<em&gt; 체외</em&gt; 인간의 혈액 - 뇌 장벽의 모델

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

Blood-brain barrier (BBB) is a specialized barrier that protects the brain microenvironment from toxins and pathogens in the circulation and maintains brain homeostasis. The principal sites of the barrier are endothelial cells of the brain capillaries whose barrier function results from tight intercellular junctions and efflux transporters expressed on the plasma membrane. This function is regulated by pericytes and astrocytes that together form the neurovascular unit (NVU). Several neurological diseases such as stroke, Alzheimer&#39;s disease (AD), brain tumors are associated with an impaired BBB function. Assessment of the BBB permeability is therefore crucial in evaluating the severity of the neurological disease and the success of the treatment strategies employed.
We present here a simple yet robust permeability assay that have been successfully applied to several mouse models both, genetic and experimental. The method is highly quantitative and objective in comparison to the tracer fluorescence analysis by microscopy that is commonly applied. In this method, mice are injected intraperitoneally with a mix of aqueous inert fluorescent tracers followed by anesthetizing the mice. Cardiac perfusion of the animals is performed prior to harvesting brain, kidneys or other organs. Organs are homogenized and centrifuged followed by fluorescence measurement from the supernatant. Blood drawn from the cardiac puncture just before perfusion serves for normalization purpose to the vascular compartment. The tissue fluorescence is normalized to the wet weight and serum fluorescence to obtain a quantitative tracer permeability index. For additional confirmation, the contralateral hemi-brain preserved for immunohistochemistry can be utilized for tracer fluorescence visualization purposes.

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

Here we present a mouse brain vascular permeability assay using intraperitoneal injection of fluorescent tracers followed by perfusion that is applicable to animal models of blood-brain barrier dysfunction. One hemi-brain is used for assessing permeability quantitatively and the other for tracer visualization/immunostaining. The procedure takes 5 - 6 h for 10 mice.

Vivo에서 혈액-뇌 장벽 침투성 분석 결과 사용 하 여 마우스에 붙일 추적기 표시

Blood-brain barrier (BBB) is a specialized barrier that protects the brain microenvironment from toxins and pathogens in the circulation and maintains ...

신경과학

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

The aim of this protocol presents an optimized procedure for the purification and cultivation of pBECs and to establish in vitro blood-brain barrier (BBB) models based on pBECs in mono-culture (MC), MC with astrocyte-conditioned medium (ACM), and non-contact co-culture (NCC) with astrocytes of porcine or rat origin. pBECs were isolated and cultured from fragments of capillaries from the brain cortices of domestic pigs 5-6 months old. These fragments were purified by careful removal of meninges, isolation and homogenization of grey matter, filtration, enzymatic digestion, and centrifugation. To further eliminate contaminating cells, the capillary fragments were cultured with puromycin-containing medium. When 60-95% confluent, pBECs growing from the capillary fragments were passaged to permeable membrane filter inserts and established in the models. To increase barrier tightness and BBB characteristic phenotype of pBECs, the cells were treated with the following differentiation factors: membrane permeant 8-CPT-cAMP (here abbreviated cAMP), hydrocortisone, and a phosphodiesterase inhibitor, RO-20-1724 (RO). The procedure was carried out over a period of 9-11 days, and when establishing the NCC model, the astrocytes were cultured 2-8 weeks in advance. Adherence to the described procedures in the protocol has allowed the establishment of endothelial layers with highly restricted paracellular permeability, with the NCC model showing an average transendothelial electrical resistance (TEER) of 1249 &#177; 80 &#937; cm2, and paracellular permeability (Papp) for Lucifer Yellow of 0.90 10-6 &#177; 0.13 10-6 cm sec-1 (mean &#177; SEM, n=55). Further evaluation of this pBEC phenotype showed good expression of the tight junctional proteins claudin 5, ZO-1, occludin and adherens junction protein p120 catenin. The model presented can be used for a range of studies of the BBB in health and disease and, with the highly restrictive paracellular permeability, this model is suitable for studies of transport and intracellular trafficking.

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

The aim of the protocol is to present an optimized procedure for the establishment of an in vitro blood-brain barrier (BBB) model based on primary porcine brain endothelial cells (pBECs). The model shows high reproducibility, high tightness, and is suitable for studies of transport and intracellular trafficking in drug discovery.

생체 외에서 혈액-뇌 장벽 돼지 뇌 내 피 세포를 기반으로 하는 모델의 설립에 대 한 방법 개선

The aim of this protocol presents an optimized procedure for the purification and cultivation of pBECs and to establish in vitro blood-brain barrier (BBB) ...

인간 만능 줄기세포에서 파생된 3D 혈액-뇌 장벽 모델

Reconstruction of the Blood-Brain Barrier In Vitro to Model and Therapeutically Target Neurological Disease

The blood-brain barrier (BBB) is a key physiological component of the central nervous system (CNS), maintaining nutrients, clearing waste, and protecting the brain from pathogens. The inherent barrier properties of the BBB pose a challenge for therapeutic drug delivery into the CNS to treat neurological diseases. Impaired BBB function has been related to neurological disease. Cerebral amyloid angiopathy (CAA), the deposition of amyloid in the cerebral vasculature leading to a compromised BBB, is a co-morbidity in most cases of Alzheimer&#39;s disease (AD), suggesting that BBB dysfunction or breakdown may be involved in neurodegeneration. Due to limited access to human BBB tissue, the mechanisms that contribute to proper BBB function and BBB degeneration remain unknown. To address these limitations, we have developed a human pluripotent stem cell-derived BBB (iBBB) by incorporating endothelial cells, pericytes, and astrocytes in a 3D matrix. The iBBB self-assembles to recapitulate the anatomy and cellular interactions present in the BBB. Seeding iBBBs with amyloid captures key aspects of CAA. Additionally, the iBBB offers a flexible platform to modulate genetic and environmental factors implicated in cerebrovascular disease and neurodegeneration, to investigate how genetics and lifestyle affect disease risk. Finally, the iBBB can be used for drug screening and medicinal chemistry studies to optimize therapeutic&#160;delivery to the CNS. In this protocol, we describe the differentiation of the three types of cells (endothelial cells, pericytes, and astrocytes) arising from human pluripotent stem cells, how to assemble the differentiated cells into the iBBB, and how to model CAA in vitro using exogenous amyloid. This model overcomes the challenge of studying live human brain tissue with a system that has both biological fidelity and experimental flexibility, and enables the interrogation of the human BBB and its role in neurodegeneration.

저자 스포트라이트: 체외 혈액-뇌 장벽 모델을 사용하여 알츠하이머병을 조사하기 위한 맞춤형 접근 방식 

The blood-brain barrier (BBB) has a crucial role in sustaining a stable and healthy brain environment. BBB dysfunction is associated with many neurological diseases. We have developed a 3D, stem-cell-derived model of the BBB to investigate cerebrovascular pathology, BBB integrity, and how the BBB is altered by genetics and disease.

신경 질환을 모델링하고 치료적으로 표적화하기 위한 체외 혈액-뇌 장벽 재건

The blood-brain barrier (BBB) is a key physiological component of the central nervous system (CNS), maintaining nutrients, clearing waste, and protecting ...

혈액 뇌 장벽 메쉬와 유사한 혈관 형성 및 분열을 평가하기위한 In vitro 시험 법

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를 사용하여 림프구 혈관 외로 유출 분석

Vivo에서 혈액-뇌 장벽 침투성 분석 결과 사용 하 여 마우스에 붙일 추적기 표시

생체 외에서 혈액-뇌 장벽 돼지 뇌 내 피 세포를 기반으로 하는 모델의 설립에 대 한 방법 개선

신경 질환을 모델링하고 치료적으로 표적화하기 위한 체외 혈액-뇌 장벽 재건

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