저자는 cDNA APP에 박​​사 후이 청 (의학 베일러 대학)을 감사드립니다. 이 작품은 NIH 보조금 R21AG031948 (DB, JMB), F30AG030878 (ESS), R01DK073394 (AFO), 바이오 메디컬 연구에 대한 존 씰리 (Sealy) 브랜드의 기념 기금 (AFO), 그리고 장 C.와 윌리엄 D. 윌리스, 신경 과학 연구 기금의 지원을받는 한 (ESS). JMB는 병진 연구 학술 프로그램의 학자와 텍사스 의료 지점 클로드 E. 페퍼 이전 미국인 독립 센터의 대학의 구성원 (NIH 교부금을 각각 UL1RR029876 및 P30-AG-024832에 의해 지원)입니다.

<html> 1. 재조합 APP 세포 도메인 (AICD)의 표현 <ol><li> 변환 E. 대장균은 벡터 pGEX-4T-1 (GE 헬스 케어)에 복제 인간 AICD (잔류 APP의 649-695, neuronal 이소 형 번호)로 BL21을 변형. 이 벡터는 (GST) 글루타티온-S-transferase의 융합 단백질의 C-말단 잔기로 AICD 표현. 이 벡터는 또한 GST 잔기의 제거를 촉진하기 트롬빈 절단 순서를 인코딩합니다. pGEX-4T-1에 AICD 복제에 대한 자세한 내용은 이전 발행 넷에서 찾을 수 있습니다. </li><li> 하나의 식민지에서 암피실린 (100 μg / ML)와 LB의 국물 10 ML의 예방과 활발한 흔들림으로 37 ° C에서 하루 아침에 품다. </li><li> 다음날 아침, 밤 문화의 5 ML과 함께 한 리터 플라스크에 400 ML의 LB / 암피실린의 예방. </li><li> 활발한 600 나노 미터에서 광학 밀도까지 흔들어 0.6-0.4에 도달과 함께 37 ° C에서 알을 품다. 이 일반적으로 2-2.5 시간이 소요됩니다. </li></ol>이 시점에서 내용 &quot;&gt;는이 SDS-PAGE (그림 1A, B를 참조)에 의해 정화를 수행 할 수있는 작은 샘플을 (~ 10 μl)을 가져하는 것이 바람직 할 수 있습니다. 각 후속 정화 단계는 분석을 위해 제거 작은 나누어지는이 있어야합니다 SDS-PAGE에 의해. <ol start="5"><li> 이소 프로필 - 베타-D-thiogalactopyranoside (IPTG)의 0.4 MM을 추가하여 GST-AICD의 표현을 유도. 활발한 5 시간에 진동과 함께 37 ° C에서 알을 품다. </li><li> 4에 15 분에 6,000 XG에서 세포를 원심 분리기 ° C. 셀 펠렛은 절차의이 시점에서 몇 달 동안 -80 ° C에 저장할 수 있습니다. </li></ol> 2. GST-AICD의 정화 <ol><li> 다음과 같이 50 ML의 용해 버퍼를 준비 : 1 ㎜ dithiothreitol, 1mM ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)), 0.1 % 트리톤 - X100, 1 밀리미터 phenylmethylsulfonyl 플루오르 화 (PMSF), 전체 프로테아제 억제제 칵테일 (로슈 응용 과학), 그리고 인산은 염분 버퍼. 얼음에 진정. </li><li> 에 박테리아 펠렛을 (이전 얼어 붙은 경우) 해동얼음. </li></ol> 이 시점에서, 모든 단계 ° C가 proteolysis를 제한 할 4에서 수행하는 것이 중요합니다. 모든 튜브, 버퍼 및 기타 시약은 사전 차가운해야합니다. 프랑스 언론 용해를위한 유화제를 사용하는 경우,이 역시 사전 차가운해야합니다. <ol start="3"><li> 철저하게 용해 버퍼의 20 ML에있는 박테리아 펠렛을 resuspend. 얼음 10 ML의 피펫과 vortexing과 분쇄의 조합은 펠릿의 전체 resuspension을 보장합니다. </li><li> 4 ° C 30,000에서 PSI에 대한 사전 차가운 유화제를 통해 resuspended 박테리아 세포 (예를 들어, Avestin EmulsiFlex-C3) 또는 프랑스어 압력 셀을 전달합니다. 유화제 두 번째 시간을 lysate를 전달합니다. 미리 차가운 50 ML 튜브에 lysate를 수집합니다. </li></ol> 이 두 악기의 가장 큰 장점은이 샘플의 가열을 최소화 할 것입니다. sonication의 일반적으로 사용되는 기술은 sonication 프로브의 끝에서 상당한 열을 생성하고재조합 단백질의 집계 될 수 있습니다. <ol start="5"><li> 30 분에 15,000 XG에서 lysate를 원심 분리기. 별도의 사전 차가운 50 ML 튜브에 표면에 뜨는을 유지. </li><li> 글루타티온 - 아가로 오스 (시그마 - 알드리치)의 50 % 슬러리 500 μl를 추가합니다. 4 ° C.에 30 분을 위해 회전 50 ㎜ 트리스 7.8, 0.1 % 트리톤 - X100, 0.5 MM dithiothreitol, 10 MM 감소 글루타티온 : 예제는 회전하는 동안, 신선한 용출 버퍼를합니다. </li></ol> 실온에서 수행되는 프로토콜의 유일한 단계는 용출 단계입니다. 따라서, 용출 버퍼는 실온에서 보관됩니다. 용출 버퍼는 신선한 준비해야합니다. <ol start="7"><li> 조립 (90-130 μm) 필터 (에버그린 과학). 인산염의 3 ML로 열 다섯 번 씻으과 일회용 5 &quot;폴리스티렌 크로마토 그래피 칼럼으로 lysate와 슬러리를 따르다가 염분 버퍼. </li><li> 열의 하단에 캡과 룸 온도 용출 버퍼 500 μl를 추가합니다. 상단을 캡열 및 상온에서 5 분 동안 회전 할 수 있습니다. 차가운 1.5 ML의 microfuge 관에 eluate를 수집합니다. 용출 두 배 (1.5 ML 총 eluate)를 반복합니다. </li><li> 인산의 4리터에서 10,000 분자량의 컷오프 투석 막 (예를 들어, 열 과학 슬라이드-A-Lyzer 투석 카세트)에서 eluate을 Dialyze는 4 ° C.에서 하루 아침에 염분 버퍼 인산염의 추가 4리터에 대한 Dialyze은 4에서 염분 버퍼 ° C 1 시간 다음 날. </li><li> 투석 카세트에서 단백질을 제거하고 GST-AICD의 수율을 결정하는 단백질 정량화 분석을 수행합니다. 문화 400 ML의 전형적인 정화가 10-20 MG / ML의 농도에서 단백질을 정제의&gt; 20 밀리그램의 수율이 높아집니다. -80 200 μl aliquots 및 동결로 나누어지는이 단백질 ° C. </li></ol> 3. 트롬빈의 GST-AICD의 절단 및 AICD의 정화 <ol><li> 해동 200 정화 GST-AICD의 μl 1 U / μl thromb의 20 μl를 추가합니다인치 37 박 품다 ° C. </li></ol> 트롬빈의 품질과 순도는 제조업체들 상당히 다양하고, 오염의 중요한 소스가 될 수 있습니다. 우리는 GE 헬스 케어 (시약의 표 참조) 트롬빈을 사용합니다. 박 부화 후, 융합 단백질의&gt; 95 %는 (그림 1B) 흘리고해야합니다. <ol start="2"><li> 트롬빈과 밤 절단 후 해방 AICD의 일부가 집계를 받았습니다 및 솔루션은 흐린 나타날 수 가능성이 높습니다. 4에 30 분에 20,000 XG에서 원심 분리에 의해 집계 된 자료를 삭제 ° C. 미리 차가운 microfuge 관에 표면에 뜨는을 제거합니다. </li><li> 각각 GST 및 트롬빈을 제거을 50 % 글루타티온 - 아가로 오스 슬러리 50 μl 50% P-aminobenzamidine - 아가로 오스 슬러리의 50 μl를 추가합니다. 상온에서 5 분 동안 회전 품다. </li><li> 침전 아가로 오스 비즈를에 짧게 원심 분리기, 그리고 신선한 튜브로 표면에 뜨는을 제거합니다. t의 압축을 풉니 다그는 글루타티온 - 아가로 오스와 GST 네 개를 더 번. P-aminobenzamidine - 아가로 오스와 단일 추출 트롬빈의 20 U를 제거 할 수있는 것입니다. </li><li> 정화의 AICD의 5 μl에 단백질 quantitation 분석을 수행합니다. 400 ML 문화의 일반적인 수율은 0.2-0.5 MG / ML의 농도에 50-100 μg 있습니다. 높은 수율은 GST-AICD의 큰 볼륨을 cleaving에 의해 가능합니다. </li></ol> 정화 AICD는 생화학 / biophysical 특성화에 대한 새로운 준비를해야합니다. 사용하지 않는 자료는 폐기해야합니다. 이 샘플을 lyophilizing와 버퍼 6 작은 볼륨으로 resuspending하여 AICD을 집중하는 것도 가능합니다. AICD을 검출하는 것은 blotting (예 : 필터 트랩 또는 도트 얼룩 분석 후) 막에 대한 항원 검색이 Pimplikar과 Suryanarayana 12 설명으로 수행해야합니다 필요합니다. 4. 원자 힘 현미경을위한 AICD 집적 (AFM) <ol><li> 희석은 갓 P에 AICD 준비hosphate는 0.1 밀리그램 / 15 μl의 최종 볼륨의 ML의 농도에 염분 버퍼. 이 시점에서, 다양한 화합물 및 / 또는 단백질들은 AICD 집계를 억제 여부를 결정하기 위해 추가 할 수 있습니다. 예를 들어, 우리는 ubiquilin-1의 몰 농도가 검정 4 AICD의 집계를 방지하는 것으로 나타났습니다. </li></ol> 또한 이러한 필터 트랩 assays와 빛의 분산 4와 같은 생화학 실험에 대한 통합 큰 반응 볼륨 할 수 있습니다. 우리는 성공은 1 μM의 낮은 농도로 희석 AICD 400 μl로 크게 반응 혼합물에 필터 트랩 assays을 수행 있었다. <ol start="2"><li> 48 시간에 Eppendorf Thermomixer 800 rpm으로 흔들어와 43 ° C에서 샘플을 잠복기에 의해 열 집계를 유도. 이 온도는 모델 보호자 기판 구연산의 synthase 4,13의 열 집계를 검토 보호자 assays에 따라 선정되었습니다. </li></ol><p class="jove_content"&gt; 열 집합은 분자간 집계 형성에 결과가 아닌 기본 구조 (풍부한 일반적으로 베타 시트입니다)에 네이티브에서 단백질의 구조 전환을 유도 할 수있는 일반적으로 사용되는 방법입니다. 열 집합은 부적절한 분자간 상호 작용 (및 따라서 열 집계를 병신의 예방)을 형성 소수성 세그먼트를 보호 분자 보호자의 기능을 검사하는 데 사용됩니다. <ol start="3"><li> 갓 흘리고 운모에 탈 이온수와 장소 2 μl에 20 배 샘플을 희석. 밤새 dessicator에서 샘플을 말린다. 그것은 경험적으로 이미지를위한 최적의 희석을 확인할 필요가있을 것이고, 따라서 10 일부터 이르기까지 여러 dilutions - 100 배에는 신중한 것입니다. </li><li> 모드 14 도청에 AFM 운영을 사용하여 집계 AICD를 표시합니다. 사용 cantilevers은 2 nm의 공칭 팁 반경 골드 코팅 마이크로 날카로운 질화물 레버 (MSNL, Bruker)입니다. 일반적인 도청 진폭 두어ING 영상은 cantilevers (30-50 kHz에서)의 공명 주파수에서 10-20 nm의 수 있습니다. </li></ol> 우리는 서로 다른 단백질을 합산의 이미지 품질 및 대비는 가해진 힘과 실험 기간에 의존 것으로 나타났습니다. 팁이 샘플 섭동을 최소화하기 위해, 우리는 95 % 이상 세트 포인트 비율을 유지하고 5-10 분 각 샘플의 검사를 제한하여 상대적으로 낮은 적용 힘을 유지하고있다. 이미지 처리가 WSxM 소프트웨어 (Nanotec)로 수행되었습니다. 표준 영상 처리는 비행기 빼기와 납작로 구성. 우리 실험실 사용 &quot;집에서 내장&quot;상업 스캐닝 프로브 현미경 제어 시스템 (Nanotec)에 인터페이스 AFM 15.주세요 5. 대표 결과 표현과 GST-AICD의 상대적 농축은 그림 1A에 표시됩니다. 용해 후, 융합 단백질의 대부분은 수용성 분수에 존재하며, 따라서 inclusi에서 추출몸에 필요하지 않습니다. 글루타티온 아가로 오스 칼럼에서 용출 자료&gt; 95 % 순수입니다. 그림 1에 표시된 준비에 열로부터 용출 단백질의 농도는 14.5 밀리그램 / ML이었고, 수율은 22 밀리그램 (400 ML의 시작 문화에서)이었다. 트롬빈 20 U과 밤이 준비 200 μl의 절단은 융합 단백질 (그림 1B)의 거의 100 % 절단하게되었습니다. ( &quot;흘리고&quot;레인, 그림 1b 참조) Coomassie 푸른 얼룩에 의해 감지 될하지로 사용 트롬빈의 양만큼 낮습니다. 트롬빈과 GST의 제거하지만이 0.35 밀리그램 / ML의 농도에 AICD의 70 μg의 사립의 수율과&gt; 90% 순수이었고, 재료의 일부 손실되었습니다. 그림 1C는 AICD의 집합에 대한 플로우 차트를 보여줍니다 및 이후 분석. AFM으로 이미징 AICD 집계는 일반적으로 회전 타원체 / 비정질이며, 크기 범위 50-100 나노 미터 (그림 1D, F)에서. 집계자료 자야 ubiquilin-1의 몰 금액이 집계 반응 (그림 1E) 4에 추가 될 때 감지되지 않습니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/4204/4204fig1.jpg" /> 1 그림. 정화 및 AICD의 집합이 있습니다. 샘플 A) Coomassie 푸른 얼룩 정화 과정의 각 단계에서 수집. uninduced 및 유도 샘플의 경우, 총 세균의 20 μl은 젤에서 실행되었습니다. 표면에 뜨는 분수를 들어, lysate의 5 μl가 (20 ML의 총 볼륨에서) 젤에서 실행되었습니다. 펠렛 분수를 들어, 펠릿이 용해 버퍼의 20 ML에 resuspended되었고,이 자료의 5​​ μl은 4시 30 분에 물 목욕 sonicator에 sonicated되었습니다 ° C 전에 젤에로드합니다. flowthrough를 들어, 5 μl은 젤에서 실행되었습니다. 젤에로드 eluate의 양이 표시됩니다. uncleaved 흘리고 GST-AICD (2 μl)와 1, 5 및 m의 B) Coomassie 푸른 스테인드 젤U; 리터 정화가 AICD. AICD 정화, 집계 및 분석 C) 흐름도. 의 D, E) 대표 AFM 이미지 열 분자 보호자 ubiquilin-1의 부재 (D)와 존재 (E)에 AICD 집계됩니다. AICD 집계의 크기 분포 F) 히스토그램.

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관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

이 프로토콜에서 우리는, 구조 biophysical 및 생화학 분석을위한 매우 순수 AICD를위한 절차를 설명합니다. 이 절차는 복잡한 크로마토 그래피 장비를 필요로하기 때문에 대부분의 실험실에 액세스 할 수 없습니다. 다른 그룹은 생화학 / 구조 분석을위한 GST-AICD 17-19 포함한 AICD 5-7,16을 정화하고 있습니다. 이전 프로토콜 단점은 가난한 AICD 16 용해도, 이상적인 순도 17 ?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 </td></tr><tr><td> pGEX-4T-1 </td><td> GE 헬스 케어 </td><td> 28-9545-49 </td><td></td></tr><tr><td> 트롬빈 </td><td> GE 헬스 케어 </td><td> 27-0846-01 </td><td></td></tr><tr><td> 암피실린 </td><td> 피셔 과학 </td><td> BP1760 </td><td></td></tr><tr><td> 브래드 포드 단백질 분석 시약 </td><td> 바이오 RAD </td><td> 500-0002 </td><td></td></tr><tr><td> Coomassie 블루 </td><td> 바이오 RAD </td><td> 161-0786 </td><td></td></tr><tr><td> IPTG (이소 프로필 - 베타-D thiogalactopyranoside) </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> I6758 </td><td></td></tr><tr><td> 글루타티온 - 아가로 오스 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> G4510 </td><td></td></tr><tR&gt; <td> P-aminobenzamidine - 아가로 오스 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> A7155 </td><td></td></tr><tr><td> 전체 프로테아제 억제제 칵테일 </td><td> 로슈 </td><td> 11836170001 </td><td></td></tr><tr><td> 슬라이드-A-Lyzer 투석 카세트 </td><td> 열 과학 </td><td> 66,380 </td><td></td></tr><tr><td> 크로마토 그래피 칼럼 </td><td> 상록 과학 </td><td> 208-3367-050 </td><td></td></tr><tr><td> 유화제 </td><td> Avestin, Inc의 </td><td> EmulsiFlex-C3 </td><td> 추천 </td></tr><tr><td> Eppendorf Thermomixer </td><td> Eppendorf </td><td> 022670107 </td><td></td></tr><tr><td> 운모 디스크 </td><td> 테드 펠라 </td><td> 50-12 </td><td></td></tr><tr><td> AFM의 cantilevers </td><td> Bruker </td><td> MSNL-10 </td><td></td></tr><tr><td> WSxM 소프트웨어 </td><td> Nanotec </td><td> N / A </td><td> 금EE 다운로드 </td></tr></tbody></table>

purification and aggregation of the amyloid precursor protein intracellular domain

아밀로이드 전구체 단백질 (APP)이 알츠하이머 병 (AD)의 pathogenesis과 관련된 유형 I의 transmembrane 단백질입니다. APP는 대형 세포 도메인과 APP 세포 도메인 (AICD)이라고한다 짧은 cytosolic 도메인이 특징입니다. 분비 경로를 통해 성숙하는 동안, APP는 α, β, 그리고 γ-secretases 일이라고한다 프로테아제에 의해 흘리고 할 수 있습니다. β와 γ-secretases와 APP 연속 proteolytic 절단은 작은 proteolytic의 펩타이드, 칭했다 Aβ, amyloidogenic하고 치매 액자의 핵심 구성의 생산에 연결됩니다. AICD은 secretase 처리 후도 막에서 해방이며, Fe65와 Tip60와의 상호 작용을 통해 여러 대상 유전자 2,3의 전사 조절에 참여하는 핵으로 이동시키다 수 있습니다. AICD 관련된 단백질 단백질 상호 작용은 트래픽 관리, 처리, 홀로 APP와 C-termin의 세포 기능에 영향을 미칠 수 있습니다알 조각. 우리는 최근 AICD는 AD-연루 분자 보호자 ubiquilin-14에 의해 억제되어 체외에서 집계,이 처리 할 수있는 것으로 나타났습니다. Fe65 7 구속 할 때 다음 결과에 의거하여 AICD는 소수성 도메인을 노출하고 본질적으로 체외 5,6에 섞여 있으며, 그러나 그것은 안정적인 보조 구조를 얻습니다. 우리는 ubiquilin-1 체외에서, 4 그대로 셀의 집계를 방지 AICD의 부적절한 상호 및 분자 상호 작용을 방지 것을 제안했습니다. 대부분의 연구는 AD의 pathogenesis에 APP의 역할에 초점을하지만,이 과정에서 AICD의 역할은 확실하지 않습니다. AICD의 표현은 경로에게 9 신호 변조하는 apoptosis 8 유도하고, 10 신호 칼슘을 조절하는 표시되었습니다. 유전자 변형 마우스 모델에서 AICD와 Fe65 이상의 표현은 병리학 11처럼 알츠하이머을 유도하고, 최근 AICD는 브라에서 발견되었습니다적절한 항원 검색 기술 12를 사용할 때 서쪽이 blotting에 의해 lysates 인치 AICD의, 구조 생화학 및 biophysical 연구를 촉진하기 위해, 우리는 매우 순수 AICD 단백질의 recombinantly 많은 양을 생산 할 수있는 절차를 개발했습니다. 우리는 더 원자 힘 현미경에 의한 AICD 및 분석의 체외 열 집계에를 유도하는 방법을 설명합니다. 설명 방법, 생화학 biophysical 및 구조 AICD의 특성화 및 AICD 집계에 분자 보호자의 효과에 유용합니다.

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Purification and Aggregation of the Amyloid Precursor Protein Intracellular Domain

APP 세포 도메인 (AICD)의 대규모 정화하기위한 방법이 설명되어 있습니다. 우리는 또한 유도하는 방법을 설명합니다<em&gt; 체외에서</em원자 힘 현미경으로&gt; AICD 집합 및 시각화. 설명 방법은 생화학 / 구조 AICD의 특성 및 집계에 대한 분자 보호자의 효과에 유용합니다.

아밀로이드 전구체 단백질 세포 내 도메인의 정화 및 집계

Amyloid precursor protein (APP) is a type I transmembrane protein associated with the pathogenesis of Alzheimer's disease (AD). APP is characterized by a ...

purification-aggregation-amyloid-precursor-protein-intracellular

Research

JoVE Journal

Medicine

11.7K 조회수.  University of Texas Medical Branch. APP 세포 도메인 (AICD)의 대규모 정화하기위한 방법이 설명되어 있습니다. 우리는 또한 유도하는 방법을 설명합니다 체외에서 AICD 집합 및 시각화. 설명 방법은 생화학 / 구조 AICD의 특성 및 집계에 대한 분자 보호자의 효과에 유용합니다.

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Performing and Processing FNA of Anterior Fat Pad for Amyloid

Historically, heart, liver, and kidney biopsies were performed to demonstrate amyloid deposits in amyloidosis. Since the clinical presentation of this disease is so variable and non-specific, the associated risks of these biopsies are too great for the diagnostic yield. Other sites that have a lower biopsy risk, such as skin or gingival, are also relatively invasive and expensive. In addition, these biopsies may not always have sufficient amyloid deposits to establish a diagnosis. Fat pad aspiration has demonstrated good clinical correlation with low cost and minimal morbidity. However, there are no standardized protocols for performing this procedure or processing the aspirated specimen, which leads to variable and nonreproducible results. The most frequently utilized modality for detecting amyloid in tissue is an apple-green birefringence on Congo red stained sections using a polarizing microscope. This technique requires cell block preparation of aspirated material. Unfortunately, patients presenting in early stage of amyloidosis have minimal amounts of amyloid which greatly reduces the sensitivity of Congo red stained cell block sections of fat pad aspirates. Therefore, ultrastructural evaluation of fat pad aspirates by electron microscopy should be utilized, given its increased sensitivity for amyloid detection. This article demonstrates a simple and reproducible procedure for performing anterior fat pad aspiration for the detection of amyloid utilizing both Congo red staining of cell block sections and electron microscopy for ultrastructural identification.

Fat pad aspiration is a preferred, minimally invasive, and low cost approach as compared to other methods to detect amyloid for diagnosis of systemic amyloidosis. This video article demonstrates a procedural outline for performing fat pad aspiration with appropriate processing of the specimen for the optimal diagnostic outcome.

아밀로이드에 대한 앞쪽에 지방 패드의 FNA 공연 및 처리

Historically, heart, liver, and kidney biopsies were performed to demonstrate amyloid deposits in amyloidosis.  Since the clinical presentation of this ...

연구

의학

Biomarkers in an Animal Model for Revealing Neural, Hematologic, and Behavioral Correlates of PTSD

Identification of biomarkers representing the evolution of the pathophysiology of Post Traumatic Stress Disorder (PTSD) is vitally important, not only for objective diagnosis but also for the evaluation of therapeutic efficacy and resilience to trauma. Ongoing research is directed at identifying molecular biomarkers for PTSD, including traumatic stress induced proteins, transcriptomes, genomic variances and genetic modulators, using biologic samples from subjects' blood, saliva, urine, and postmortem brain tissues. However, the correlation of these biomarker molecules in peripheral or postmortem samples to altered brain functions associated with psychiatric symptoms in PTSD remains unresolved. Here, we present an animal model of PTSD in which both peripheral blood and central brain biomarkers, as well as behavioral phenotype, can be collected and measured, thus providing the needed correlation of the central biomarkers of PTSD, which are mechanistic and pathognomonic but cannot be collected from people, with the peripheral biomarkers and behavioral phenotypes, which can.
Our animal model of PTSD employs restraint and tail shocks repeated for three continuous days - the inescapable tail-shock model (ITS) in rats. This ITS model mimics the pathophysiology of PTSD 17, 7, 4, 10. We and others have verified that the ITS model induces behavioral and neurobiological alterations similar to those found in PTSD subjects 17, 7, 10, 9. Specifically, these stressed rats exhibit (1) a delayed and exaggerated startle response appearing several days after stressor cessation, which given the compressed time scale of the rat's life compared to a humans, corresponds to the one to three months delay of symptoms in PTSD patients (DSM-IV-TR PTSD Criterian D/E 13), (2) enhanced plasma corticosterone (CORT) for several days, indicating compromise of the hypothalamopituitary axis (HPA), and (3) retarded body weight gain after stressor cessation, indicating dysfunction of metabolic regulation.
The experimental paradigms employed for this model are: (1) a learned helplessness paradigm in the rat assayed by measurement of acoustic startle response (ASR) and a charting of body mass; (2) microdissection of the rat brain into regions and nuclei; (3) enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for blood levels of CORT; (4) a gene expression microarray plus related bioinformatics tools 18. This microarray, dubbed rMNChip, focuses on mitochondrial and mitochondria-related nuclear genes in the rat so as to specifically address the neuronal bioenergetics hypothesized to be involved in PTSD.

We describe a rat model of post traumatic stress disorder (PTSD) that reveals the persistent alterations in neuroendocrine function and the delayed long-term, exaggerated fear response, characteristic of PTSD patients. The animal model and methods described here are useful for correlating biomarkers in brain nuclei, which are mechanistic but cannot be measured in patients, with biomarkers in peripheral white blood cells, which can.

PTSD의, 신경 Hematologic, 그리고 행동 상관 관계를 누설하는 행위에 대해서는 동물 모델에서 생체

Identification of biomarkers representing the evolution of the pathophysiology of Post Traumatic Stress Disorder (PTSD) is vitally important, not only for ...

Subretinal Transplantation of MACS Purified Photoreceptor Precursor Cells into the Adult Mouse Retina

Vision impairment and blindness due to the loss of the light-sensing cells of the retina, i.e. photoreceptors, represents the main reason for disability in industrialized countries. Replacement of degenerated photoreceptors by cell transplantation represents a possible treatment option in future clinical applications. Indeed, recent preclinical studies demonstrated that immature photoreceptors, isolated from the neonatal mouse retina at postnatal day 4, have the potential to integrate into the adult mouse retina following subretinal transplantation. Donor cells generated a mature photoreceptor morphology including inner and outer segments, a round cell body located at the outer nuclear layer, and synaptic terminals in close proximity to endogenous bipolar cells. Indeed, recent reports demonstrated that donor photoreceptors functionally integrate into the neural circuitry of host mice. For a future clinical application of such cell replacement approach, purified suspensions of the cells of choice have to be generated and placed at the correct position for proper integration into the eye. For the enrichment of photoreceptor precursors, sorting should be based on specific cell surface antigens to avoid genetic reporter modification of donor cells. Here we show magnetic-associated cell sorting (MACS) - enrichment of transplantable rod photoreceptor precursors isolated from the neonatal retina of photoreceptor-specific reporter mice based on the cell surface marker CD73. Incubation with anti-CD73 antibodies followed by micro-bead conjugated secondary antibodies allowed the enrichment of rod photoreceptor precursors by MACS to approximately 90%. In comparison to flow cytometry, MACS has the advantage that it can be easier applied to GMP standards and that high amounts of cells can be sorted in relative short time periods. Injection of enriched cell suspensions into the subretinal space of adult wild-type mice resulted in a 3-fold higher integration rate compared to unsorted cell suspensions.

Cell transplantation represents a strategy for the treatment of retinal degeneration characterized by photoreceptor loss. Here we describe a method for enrichment of transplantable photoreceptors and their subretinal grafting into adult mice.

성인 마우스 망막으로 MACS 정제 광수용체 전구체 세포의 감하 이식

Vision impairment and blindness due to the loss of the light-sensing cells of the retina, i.e. photoreceptors, represents the main reason for disability ...

Synergetic Use of Neural Precursor Cells and Self-assembling Peptides in Experimental Cervical Spinal Cord Injury

Spinal cord injuries (SCI) cause serious neurological impairment and psychological, economic, and social consequences for patients and their families. Clinically, more than 50% of SCI affect the cervical spine1. As a consequence of the primary injury, a cascade of secondary mechanisms including inflammation, apoptosis, and demyelination occur finally leading to tissue scarring and development of intramedullary cavities2,3. Both represent physical and chemical barriers to cell transplantation, integration, and regeneration. Therefore, shaping the inhibitory environment and bridging cavities to create a supportive milieu for cell transplantation and regeneration is a promising therapeutic target4. Here, a contusion/compression model of cervical SCI using an aneurysm clip is described. This model is more clinically relevant than other experimental models, since complete transection or ruptures of the cord are rare. Also in comparison to the weight drop model, which in particular damage the dorsum columns, circumferential compression of the spinal cord appears advantageous. Clip closing force and duration can be adjusted to achieve different injury severity. A ring spring facilitates precise calibration and constancy of clip force. Under physiological conditions, synthetic self-assembling peptides (SAP) self-assemble into nanofibers and thus, are appealing for application in SCI5. They can be injected directly into the lesion minimizing damage to the cord. SAPs are biocompatible structures erecting scaffolds to bridge intramedullary cavities and thus, equip the damaged cord for regenerative treatments. K2(QL)6K2 (QL6) is a novel SAP introduced by Dong et al.6 In comparison to other peptides, QL6 self-assembles into &#946;-sheets at neutral pH6.14 days after SCI, after the acute stage, SAPs are injected into the center of the lesion and neural precursor cells (NPC) are injected into adjacent dorsal columns. In order to support cell survival, transplantation is combined with continuous subdural administration of growth factors by osmotic micro pumps for 7 days.

Treating cervical spinal cord injury with both self-assembling peptides (SAP) and neural precursor cells (NPC), together with growth factors, is a promising approach to promote regeneration and recovery. A contusion/compression aneurysm clip rat model of cervical SCI and combined treatment involving SAP injection and NPC transplantation is established.

실험 경추 척수 손상의 신경 전구체 세포 및 자기 조립 펩티드의 시너지 사용

Spinal cord injuries (SCI) cause serious neurological impairment and psychological, economic, and social consequences for patients and their families. ...

Assessment of Spontaneous Alternation, Novel Object Recognition and Limb Clasping in Transgenic Mouse Models of Amyloid-&#946; and Tau Neuropathology

Here we describe a staged, behavioral testing approach that can be used to screen for compounds that exhibit in vivo efficacy on cognitive and functional motor behaviors in transgenic mouse models of &#946;-amyloidosis and tauopathy. The paradigm includes tests for spontaneous alternation in a Y-maze, novel object recognition, and limb clasping. These tests were selected because they: 1) interrogate function of cognitive or motor domains and the correlate neural circuitry relevant to the human disease state, 2) have clearly defined endpoints, 3) have easily implementable quality control checks, 4) can be run in a moderate throughput format, and 5) require little intervention by the investigator. These methods are designed for investigators looking to screen compounds for activity in short-term and working memory tasks, or functional motor behaviors associated with Alzheimer's disease mouse models. The methods described here use behavioral tests that engage a number of different brain regions including hippocampus and various cortical areas. Investigators that desire cognitive tests that specifically assess cognition mediated by a single brain region could use these techniques to supplement other behavioral tests.

Assessment of Spontaneous Alternation, Novel Object Recognition and Limb Clasping in Transgenic Mouse Models of Amyloid-&amp;#946; and Tau Neuropathology

Described here is a staged, behavioral screening approach that can be used to screen for compounds that exhibit in vivo efficacy on cognitive and functional motor behaviors in transgenic mouse models of &#946;-amyloidosis and tauopathy. These methods are optimized to screen compounds for activity in short-term and working memory tasks.

아밀로이드 -β 및 타우 신경 병증의 유전자 변형 마우스 모델에서 자발적 교대, 새로운 대상 인식 및 사지 걸림의 평가

Here we describe a staged, behavioral testing approach that can be used to screen for compounds that exhibit in vivo efficacy on cognitive and functional ...

Turbidimetry on Human Washed Platelets: The Effect of the Pannexin1-inhibitor Brilliant Blue FCF on Collagen-induced Aggregation

Turbidimetry is a laboratory technique that is applied to measure the aggregation of platelets suspended in either plasma (platelet-rich plasma, PRP) or in buffer (washed platelets), by the use of one or a combination of agonists. The use of washed platelets separated from their plasma environment and in the absence of anticoagulants allows for studying intrinsic platelet properties. Among the large panel of agonists, arachidonic acid (AA), adenosine di-phosphate (ADP), thrombin and collagen are the most frequently used. The aggregation response is quantified by measuring the relative optical density (OD) over time of platelet suspension under continuous stirring. Platelets in homogeneous suspension limit the passage of light after the addition of an agonist, platelet shape change occurs producing a small transitory increase in OD. Following this initial activation step, platelet clots form gradually, allowing the passage of light through the suspension as a result of decreased OD. The aggregation process is ultimately expressed as a percentage, compared to the OD of platelet-poor plasma or buffer. Rigorous calibration is thus essential at the beginning of each experiment. As a general rule: calibration to 0% is set by measuring the OD of a non-stimulated platelet suspension while measuring the OD of the suspension medium containing no platelets represents a value of 100%. Platelet aggregation is generally visualized as a real-time aggregation curve. Turbidimetry is one of the most commonly used laboratory techniques for the investigation of platelet function and is considered as the historical gold standard and used for the development of new pharmaceutical agents aimed at inhibiting platelet aggregation. Here, we describe detailed protocols for 1) preparation of human washed platelets and 2) turbidimetric analysis of collagen-induced aggregation of human washed platelets pretreated with the food dye Brilliant Blue FCF that was recently identified as an inhibitor of Pannexin1 (Panx1) channels.

We describe a straightforward method for the isolation of washed platelets from human blood followed by agonist-induced platelet aggregation measurements by turbidimetry. As an example we apply this method for studying the aggregation response of human platelets to collagen after a pre-incubation with the Pannexin1 channel inhibitor Brilliant Blue FCF.

콜라겐 - 유도 된 응집에 Pannexin1 억제제의 효과 브릴리언트 블루 FCF : 탁도는 인간 혈소판에 씻어

Turbidimetry is a laboratory technique that is applied to measure the aggregation of platelets suspended in either plasma (platelet-rich plasma, PRP) or ...

Assessment of Sarcoplasmic Reticulum Calcium Reserve and Intracellular Diastolic Calcium Removal in Isolated Ventricular Cardiomyocytes

Intracellular calcium recycling plays a critical role in regulation of systolic and diastolic function in cardiomyocytes. Cardiac sarcoplasmic reticulum (SR) serves as a Ca2+ reservoir for contraction, which reuptakes intracellular Ca2+ during relaxation. The SR Ca2+ reserve available for beats is determinate for cardiac contractibility, and the removal of intracellular Ca2+ is critical for cardiac diastolic function. Under some pathophysiological conditions, such as diabetes and heart failure, impaired calcium clearance and SR Ca2+ store in cardiomyocytes may be involved in the progress of cardiac dysfunction. Here, we describe a protocol to evaluate SRCa2+ reserve and diastolic Ca2+ removal. Briefly, a single cardiomyocyte was enzymatically isolated, and the intracellular Ca2+ fluorescence indicated by Fura-2 was recorded by a calcium imaging system. To employ caffeine for inducing total SR Ca2+ release, we preset an automatic perfusion switch program by interlinking the stimulation system and the perfusion system. Then, the mono-exponential curve fitting was used for analyzing decay time constants of calcium transients and caffeine-induced calcium pulses. Accordingly, the contribution of the SR Ca2+-ATPase (SERCA) and Na+-Ca2+ exchanger (NCX) to diastolic calcium removal was evaluated.

Intracellular calcium recycling plays a critical role in regulation of systolic and diastolic function in cardiomyocytes. Here, we describe a protocol to evaluate sarcoplasmic reticulum Ca2+ reserve and diastolic calcium removal function in cardiomyocytes by a calcium imaging system.

격리 된 심 실 Cardiomyocytes에 Sarcoplasmic 그물 칼슘 예비 및 세포내 확장기 칼슘 제거의 평가

Intracellular calcium recycling plays a critical role in regulation of systolic and diastolic function in cardiomyocytes. Cardiac sarcoplasmic reticulum ...

In Vivo Imaging of Cx3cr1gfp/gfp Reporter Mice with Spectral-domain Optical Coherence Tomography and Scanning Laser Ophthalmoscopy

Spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT) and scanning laser ophthalmoscopy (SLO) are extensively used in experimental ophthalmology. In the present protocol, mice expressing green fluorescent protein (gfp) under the promoter of Cx3cr1 (BALB/c-Cx3cr1gfp/gfp) were used to image microglia cells in vivo in the retina. Microglia are resident macrophages of the retina and have been implicated in several retinal diseases1,2,3,4,5,6. This protocol provides a detailed approach for generation of retinal B-scans, with SD-OCT, and imaging of microglia cell distribution in Cx3cr1gfp/gfp mice with SLO in vivo, using an ophthalmic imaging platform system. The protocol can be used in several reporter mouse lines. However, there are some limitations to the protocol presented here. First, both SLO and SD-OCT, when used in the high-resolution mode, collect data with high axial resolution but the lateral resolution is lower (3.5 &#181;m and 6 &#181;m, respectively). Moreover, the focus and saturation level in SLO is highly dependent on parameter selection and correct alignment of the eye. Additionally, using devices designed for human patients in mice is challenging due to the higher total optical power of the mouse eye compared to the human eye; this can lead to lateral magnification inaccuracies7, which are also dependent on the magnification by the mouse lens among others. However, despite that the axial scan position is dependent upon lateral magnification, the axial SD-OCT measurements are accurate8.

In Vivo Imaging of Cx3cr1gfp/gfp Reporter Mice with Spectral-domain Optical Coherence Tomography and Scanning Laser Ophthalmoscopy

This protocol describes how high-resolution imaging techniques such as spectral domain optical coherence tomography and scanning laser ophthalmoscopy can be utilized in small rodents, using an ophthalmic imaging platform system, to obtain information on retinal thickness and microglial cell distribution, respectively.

Vivo에서 스펙트럼-도메인 광학 일관성 단층 촬영 스캐닝 레이저 Ophthalmoscopy와 Cx3cr1gfp/gfp 기자 쥐의 이미징

Spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT) and scanning laser ophthalmoscopy (SLO) are extensively used in experimental ophthalmology. In the ...

Isolation and Purification of Murine Cardiac Pericytes

Pericytes, perivascular cells of microvessels and capillaries, are known to play a part in angiogenesis, vessel stabilization, and endothelial barrier integrity. However, their tissue-specific functions in the heart are not well understood. Moreover, there is currently no protocol utilizing readily accessible materials to isolate and purify pericytes of cardiac origin. Our protocol focuses on using the widely used mammalian model, the mouse, as our source of cells. Using the enzymatic digestion and mechanical dissociation of heart tissue, we obtained a crude cell mixture that was further purified by fluorescence activating cell sorting (FACS) by a plethora of markers. Because there is no single unequivocal marker for pericytes, we gated for cells that were CD31-CD34-CD45-CD140b+NG2+CD146+. Following purification, these primary cells were cultured and passaged multiple times without any changes in morphology and marker expression. With the ability to regularly obtain primary murine cardiac pericytes using our protocol, we hope to further understand the role of pericytes in cardiovascular physiology and their therapeutic potential.

We have optimized a protocol to isolate and purify murine cardiac pericytes for basic research and investigation of their biology and therapeutic potential.

뮤린 심장 pericytes의 격리 및 정화

Pericytes, perivascular cells of microvessels and capillaries, are known to play a part in angiogenesis, vessel stabilization, and endothelial barrier ...

인간 ADSC에서 세포외 소포체의 초원심분리기 기반 분리(Ultracentrifuge-Based Isolation of Extracellular Vesicles from Human ADSCs)

Purification and Characterization of Extracellular Vesicles from Human Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells

Human adipose-derived mesenchymal stem cells (ADSCs) can promote the regeneration and reconstruction of various tissues and organs. Recent research suggests that their regenerative function may be attributed to cell-cell contact and cell paracrine effects. The paracrine effect is an important way for cells to interact and transfer information over short distances, in which extracellular vesicles (EVs) play a functional role as carriers. There is significant potential for ADSC EVs in regenerative medicine. Multiple studies have reported on the effectiveness of these methods. Various methods for extracting and isolating EVs are currently described based on principles such as centrifugation, precipitation, molecular size, affinity, and microfluidics. Ultracentrifugation is regarded as the gold standard for isolating EVs. Nevertheless, a meticulous protocol to highlight precautions during ultracentrifugation is still absent. This study presents the methodology and crucial steps involved in ADSC culture, supernatant collection, and EV ultracentrifugation. However, even though ultracentrifugation is cost-effective and requires no further treatment, there are still some inevitable drawbacks, such as a low recovery rate and EV aggregation.

저자 스포트라이트: 인간 ADSC에서 세포외 소포체의 추출 및 정제 표준화 및 개선

This protocol describes all procedures, from culturing human adipose-derived mesenchymal stem cells (ADSCs) and collecting supernatant to extracting extracellular vesicles (EVs) using ultracentrifugation.

Human Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells의 세포외 소포체의 정제 및 특성 분석

Human adipose-derived mesenchymal stem cells (ADSCs) can promote the regeneration and reconstruction of various tissues and organs. Recent research ...