당사의 프로토콜은 마우스 모델에 최적화되어 있으며 모든 구도자가 쉽게 사용할 수 있는 재료를 사용합니다. 이 기술은 건강, 질병, 또는 유전으로 변경된 마우스 모형에 적용될 수 있습니다. 우리의 프로토콜은 조사자가 질병 또는 유전 변이의 마우스 모형에서 심장 pericyte 생물학에 관하여 어떤 질문에 대답하는 것을 가능하게 할 것입니다.
이 절차는 심장 과구 생물학에 대한 통찰력을 제공하고 우리가 건강과 질병 모두에서 심장 항상성 및 혈역학에 대한 기여를 이해하는 데 도움이됩니다. 마취 된 마우스를 supine 위치에 놓고 앞다리를 테이프로 놓습니다. 조심스럽게 가슴 구멍을 열고 25 게이지 나비 바늘을 사용하여 내림차순 대어를 누를 수 있습니다.
오른쪽 아트리움에서 닉을 만드십시오. 그런 다음, 심장에 밀리리터 당 250단위 이상, 칼슘-마그네슘이 없는 덜베코의 인산염 완충식염식염은 분당 2밀리리터에 가변유 연동 펌프를 함유하고 있습니다. 깨끗한 PBS가 오른쪽 아리아에서 나올 때 관류가 완료됩니다.
대오르타에서 심장을 자르고 얼음차가운 칼슘 마그네슘이 없는 DPBS에 넣습니다. 그런 다음 심장을 15-15센티미터 페트리 접시로 옮킨다. 스프링 가위와 미세 한 점 집게를 사용하여 작은 조각으로 심장을 잘라 내고 조각을 덮을 수있는 충분한 효소 용액을 제공합니다.
이제 조각과 용액을 50밀리리터 원내 튜브로 옮기고 파라핀 플라스틱 필름으로 밀봉합니다. 120 rpm에서 궤도 셰이커에서 섭씨 37도에서 75분 동안 배양합니다. 효소 용액으로 콜라게나아제 소화 후, 100미크론 세포 여과기를 통해 액체를 새로운 50 밀리리터 튜브로 데크닝하여 조각이 건조하지 않도록 충분한 용액을 남깁니다.
미세 한 점 집게를 사용 하 여, 튜브에서 조직을 가지고 현미경 슬라이드에 몇 조각을 배치. 그런 다음, 조직을 분해하기 위해 두 현미경 슬라이드 사이에 조직을 분쇄. 효소가 없는 배양 매체로 슬라이드를 새로운 50밀리리터 원내 튜브로 헹구십시오.
모든 조직 조각이 해리될 때까지 이 단계를 반복하십시오. 긴장된 용액과 접지 조직을 하나의 튜브로 결합합니다. 100 미크로닌 세포 여과기를 통해 새로운 50 밀리리터 원내 튜브로 생성된 서스펜션을 변형시보세요.
원심 분리는 5 분 동안 220 배 g와 섭씨 4도에서 샘플을 원심 분리합니다. 이전 용액을 흡착하고, DPBS 및 소 세럼 알부민을 포함하는 차가운 FACS 염색 버퍼에서 셀 펠릿을 부드럽게 재분리합니다. 셀을 계산하고 셀 카운터를 사용하여 생존 가능성을 확인합니다.
DPBS와 소 혈청 알부민을 포함하는 차가운 FACS 염색 버퍼로 밀리리터 당 백만 세포로 세포를 희석시. 세포는 이제 염색되고 정렬될 준비가 되었습니다. 모든 컨트롤 및 셀 샘플을 위해 5밀리리터 FACS 튜브를 준비하고 라벨을 부착합니다.
알리쿼트 1 밀리리터의 튜브당 세포가 스테인드 샘플, 형광을 뺀 하나의 컨트롤, 동종 타입 일치 컨트롤. 나머지 셀을 정렬에 사용합니다. 모든 컨트롤과 시료는 동시에 준비하고 염색할 수 있습니다.
또한 총 9개의 보상 컨트롤, 2종류의 비스타이드 비드, 마커 패널의 7가지 형광화를 위해 5밀리리터 FACS 튜브를 준비하고 라벨을 부착합니다. 형광 보정 제어를 최적화하려면 짜내기 유리병에서 각 튜브에 1 방울의 보상 구슬을 추가하십시오. 그런 다음, 비드에 항체의 마이크로리터 1개를 추가한다.
마커 패널에서 각 항체에 대해 반복합니다. FMO 컨트롤을 사용하여 스펙트럼 중복으로 인해 배경 얼룩을 최적화합니다. FMO 대조관내의 세포에, 1-100 희석시 마커 패널에서 모든 항체를 추가하지만, 하나의 항체를 배제한다.
총 7개의 대조군을 위해 각 항체에 대해 반복한다. 비특이적 염색에 아이소타입 일치 제어 항체를 사용합니다. 동면 일치 표지 튜브의 세포에, 일대일 100 희석에 등형 일치 제어 항체를 추가합니다.
다음으로 셀을 정렬하도록 준비합니다. 갓 고립된 세포에 1-100 희석에 항체 칵테일을 추가합니다. 또한, 세포 생존성 염료를 일대일 1, 000 희석에 추가합니다.
펄스 소용돌이에 의해 보상 컨트롤을 적극적으로 혼합합니다. 실내 온도에서 방치될 수 있는 셀 생존성 구슬을 제외한 4도에서 30분 동안 배양하여 빛으로부터 보호합니다. FMO 컨트롤, 동종 타입 일치 컨트롤 및 세포가 펄스 소용돌이에 의해 정렬되도록 부드럽게 혼합합니다.
빛으로부터 보호된 섭씨 4도에서 30분 동안 배양하십시오. 각 보상 제어, FMO 제어 및 등류 형 제어에 FACS 염색 버퍼 3 밀리리터를 추가합니다. 4°C에서 5분간 300배 g의 원심분리합니다.
용액을 흡기하고 각 펠릿을 FACS 염색 버퍼400 마이크로리터로 재보선합니다. 보정 컨트롤, FMO 컨트롤 및 등류형 컨트롤을 사용할 준비가 되었습니다. 염색 후, 4섭씨에서 5분간 300배 g에서 원심분리로 FACS 염색 버퍼로 세포를 씻으시다.
용액을 흡인시키고, FACS 염색 버퍼에서 셀 펠릿을 밀리리터당 0.5백만 개의 세포로 재보선한다. 35미크론 필터 상판이 있는 새로운 FACS 튜브를 사용하여 염색된 세포 샘플을 뚜껑과 중력 여과에 피펫하여 단일 셀 서스펜션을 얻습니다. 얼음을 유지합니다.
셀 선별기를 사용하여 세포를 정화합니다. 셀 선별기에서 스테인드되지 않은 셀을 실행하여 전압을 설정하고 배경 신호를 수정합니다. 각 단일 색상 보정 비드 샘플을 한 번에 하나씩 실행하여 각 채널의 전압을 조정하고 양수 신호에 대한 게이트를 조정합니다.
데이터를 수집합니다. 보정 매트릭스를 계산하여 스펙트럼 중복을 계산하는 소프트웨어를 사용합니다. 모든 전압이 준비되고 설정됩니다.
각 등유형 컨트롤을 한 번에 하나씩 실행합니다. 이 데이터는 특정바인딩에 대한 게이트를 조정하는 데 사용할 수 있습니다. 각 FMO 샘플을 한 번에 하나씩 실행합니다.
각 채널의 전압을 조정하여 멀티컬러 패널로 인해 스펙트럼 출혈을 보정합니다. 셀 선별기에서 스테인드 셀 샘플을 실행합니다. 15 밀리리터 원추형 수집 튜브에서 10 밀리리터 효소가 없는 배양 배지에서 세포를 수집합니다.
다음 게이팅 전략을 사용합니다. 첫째, 단일 셀의 게이트입니다. 그런 다음 라이브 셀의 게이트입니다.
다음으로, CD45 음성 셀의 게이트입니다. CD34 및 CD31 음수 셀의 게이트입니다. 그런 다음 NG2 양성 셀의 게이트입니다.
그리고 마지막으로, CD146 및 CD140b 양성 셀에 대한 게이트. pericytes를 배양하기 위하여는, 코팅된 24웰 접시에 효소 없는 배양 배지에서 갓 얻은 세포를 종자. 세포 인큐베이터에서 세포를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%, 산소 95%로 배양합니다.
전체 심장의 효소 소화 및 해리 후 세포의 FACS 정화 전에 세포는 심장으로부터 많은 다른 세포 유형을 포함하는 조잡한 혼합물입니다. FACS 정화 및 배양 후 세포는 균일합니다. 그(것)들은 단 하나 핵, 아주 평평하고, 전형적인 pericyte 매명 모성을 가지고 있습니다.
FACS를 사용하여 세포는 균질화로 정제됩니다. 첫째, 파편과 이중은 전방 및 측면 산란 분포를 기반으로 문이 꺼졌습니다. 그런 다음, 죽은 세포는 살아있는 세포보다는 더 크고 강렬한 신호를 생성하는 염료를 가진 그들의 아민 반응 때문에 밖으로 문포되었습니다.
살아있는 세포의, 조혈 세포는 CD45 양성인 것에 의해 밖으로 문개했다. 조혈 및 내피 세포를 추가로 제거하기 위해 CD34 양성 및 CD31 양성 세포가 문지워졌습니다. 마지막으로, NG2 양성 및 CD140b/CD146 양성 세포는 전형적인 백혈구 마커의 발현을 가진 경피세포에 대해 선택되었다.
인간의 뇌 pericytes와 비교했을 때, 세포는 유사한 형태를 가졌습니다. 마우스와 인간 처럼 매끄러운 근육 세포에 비해, 세포는 복체 마커에 대한 면역 세포 화학에 의해 통과 7에서 세포의 상이한 형태 피놀리 피오티픽 특성이 형태학 또는 마커 발현에 관찰된 변화를 보여주지 않았다. 유사하게, 7번 통로에서 의 혈중 세포측정에 의한 분석은 인구가 균질한 채로 남아 있음을 확인시켜 주었다.
셀 생존능력은 좋은 수율을 얻는 데 매우 중요합니다. 조달 하는 동안 조직을 차가운 유지, 세포 염색 하는 동안 세포를 차가운 유지. 또한 효소 솔루션이 매번 신선하게 준비되었는지 확인하십시오.
올바른 세포의 분리를 보장하기 위해 배양 후, 유동 세포 측정 및 면역 형광 염색으로 특성화. 이 세포는 기능성 장벽 연구를 위한 내피 세포를 이용한 동배 실험뿐만 아니라 생물학적 및 생리적 기능 및 특성을 연구하기 위한 해석에 사용될 수 있다. 심장 회백은 혈관 무결성 및 안정성에 근본적인 역할을하며, 그 기능 장애는 글로벌 심장 기능에 결과적입니다.
우리의 기술로, 연구원은 심장 pericytes의 치료 잠재력을 탐구할 수 있습니다.
