이 작품은 독일 - 이스라엘 프로젝트 협력 (DIP)의 틀 내에서 독일 Forschungsgemeinschaft (DFG)의 이스라엘 과학 재단 (기금 11분의 399), 의해에서 연구 Rappaport 가족 연구소 (일부) 지원이 의료 과학.

1. Inducible 셀 라인의 생성 <ol><li> 하나는 원하는 세포 라인의 준비에 사용 된 모든 세포를 죽이는 약물 G418의 최소 농도를 찾을 필요가 실험하기 전에. 이러한 목적을 위해, 실험 기간 동안 사용하고 G418의 증가 농도 (ML 당 0-1,000 μg)을 추가합니다 매체에 confluency 70%에 여러 개의 중복 된 플레이트에 플레이트 선택한 셀을. 효율적으로 세포를 죽이는 최소한의 G418 농도를 결정하는 매일 셀을 모니터링 할 수 있습니다. 세포 죽음이 3-7일에서 관찰된다. </li><li> 이 shRNA을 표현 플라스미드는 연구에 따라 유전자의 어느 정도 표현으로 줄일 수있는 과도 transfection의 assays에 의해 확인하는 것이 좋습니다 세포 라인의 생성하기 전에. 이것은 효율적으로 transfected 수있는 모든 세포주에서 수행 할 수 있습니다. </li><li> DMEM 매체 (10 % Tet 싸이를 포함하는 8 ML의 10cm 접시 당 6 5x10 주변 세포의 밀도 플레이트 T-렉스-293은 세포줄기 승인 FBS, 2mM L-글루타민, ML 페니실린 100 단위 및 ML 스트렙토 마이신 당 0.1 밀리그램, ML blasticidin 당 5 μg). 37 박 번호판을 길러 ° C, 5 % CO 2. </li><li> 다음 날, transfection하기 전에 8 ML 신선한 매체로 매체를 변경합니다. </li><li> 테트라 사이클린-inducible의 H1 프로모터뿐만 아니라, GFP를 융합하고 제정 PGK업자에 의해 구동 neomycin - 저항 유전자에 의해 구동 pSuperior.neo + GFP 플라스미드 (그림 1) 인코딩 Acf1 또는 SNF2h shRNA 10 μg을 사용하여 셀을 Transfect. NaCl 150 MM 500 μl에 DNA를 추가합니다. μg의 DNA 당 2 μl 150 MM NaCl 500 μl의 다른 나누어지는에 jetPIE 시약을 추가합니다. DNA에 jetPIE 솔루션을 추가하고 vortexing하여 잘 섞는다. 실온에서 15 분에 품다. 부드럽게 70-80% 합류 셀을 포함하는 10cm 플레이트에 DNA 단지를 피펫. 보육에 번호판을 반환합니다. </li><li> 다음 날로 (선택적 매체 DMEM 매체를 매체를 대체) ML G418 당 추가 500 μg을 포함하는 위의 설명. </li><li> 다음 두 주 전지를 모니터링하고 식민지가 나타과 현미경없이 시각화 할 수있을 때까지 모든 3~4일 유사한 새로운 매체 선택 매체를 교체하십시오. </li><li> 식민지의 분리에 앞서, 선택적 매체 24 잘 접시를 준비합니다. </li><li> 눈으로 식민지를 식별하고, 색 마커를 사용하여 플레이트의 하단에 자신의 위치를​​ 표시합니다. 식민지 잘 분리되는 현미경으로 확인합니다. </li><li> 멸균 후드에서 부드럽게 따뜻한 PBS로 씻어 잘 남아있는 모든 액체를 대기음, 접시에서 매체를 대기음. 트립신 / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 판에 하나 식민지로 0.25 %의 3 μl를 추가합니다. 세포 분리하고 24 잘 판에있는 우물 중 하나에 사용자를 추가 할 때까지 반복적으로 트립신을 피펫. 접시에 여러 가지 다른 식민지에 대해이 단계를 반복합니다. </li><li> 37 세포를 성장 ° C, 5 % CO 2 그들은 잘 작성까지. 다음에서 파생 된 세포를 분리세 우물, 별도의 12 잘 플레이트의 각, 그리고 하루 아침에 길러으로 원래 식민지의 각. </li><li> 다음 날 두 번 증류수 (ML 당 1-5 MG)에 준비 재고 솔루션에서 ML doxycycline 당 1 μg을 포함하는 매체와 하나 판에서 매체를 교체하십시오. doxycycline없는 매체가 제어 판에서 매체를 교체하십시오. 37 72 시간에 세포를 배양 ° C, 5 % CO 2. </li><li> 단백질 추출물과 Acf1 또는 SNF2h의 최저의 효율성을 결정하는 서양 얼룩 분석의 준비 각 세포 클론 잘 치료 대우를 하나 하나에서 수확 세포. 로드 제어 역할뿐만 아니라 알파 - Tubulin에 항체와 같은 Acf1 또는 SNF2h에 항체를 사용합니다. 잘 세 번째에있는 세포를 사용하여 doxycycline의 추가는 연구에 따라 단백질의 수준에서 적어도 50 % 감소를 주도하고있는 선택한 셀 클론의 확장을 위해, 치료 떠났다. 자세한 사용 90% FBS, 10 % DMSO에서 이러한 세포의 aliquots을 멈춰 봐. </li></ol><p클래스 = &quot;jove_title&quot;&gt; 2. 최저과 Transfection의 유도 <ol><li> 10cm 플레이트의 선택적 중간에 플레이트 세포. 반 접시에 ML 당 1 μg에 doxycycline을 추가하고 37 품다 ° C, 48-72 시간 (그림 4 참조) 5 % CO 2. </li><li> 48-72 시간 후, 세포의 각 그룹에서 세포를 trypsinize을 계산하고, 동일한 매체에서 6cm 판 당 판 1.5x10 6 셀이나 doxycycline없이. 37 ° C, 5 % CO 2 박에서 세포를 배양. 계획이 전혀 섹션 2.1에서 플레이트의 각 그룹은 각 지점에 대한 DAPI 분석을위한 두 중복뿐만 아니라 각 샘플의 서양 얼룩 분석 한 플레이트 (그림 4 참조)를 포함한 열두 6cm 판에 대한 세포를 제공는 않습니다. </li><li> 벡터의 4 μg과 함께, 1 빈 플라스미드의 μg 또는 플라스미드 인코딩 E4orf4의 동일한 수량 : 다음 날 plasmids 다음과 같은 조합 6cm 판에서 셀을 transfectAcf1-GFP 또는 SNF2h-GFP를 표현하는 것은 침묵 돌연변이, 또는 해당 빈 벡터와 1 μg 플라스미드 표현 GFP (그림 4) 3 μg의 도입에 의한 세포 클론의 shRNA에 강한 렌더링. transfection 믹스를 준비 위에서 설명한대로 jetPIE 시약 (5 μg의 DNA 당 10 μl)를 사용합니다. 각 샘플의 경우, 세 접시에 transfection 믹스를 준비합니다. </li><li> 상온에서 jetPIE 시약과 DNA의 15 분 부화 후, 부드럽게 세 6cm 판에 각 transfection 믹스에서 DNA 단지의 동등한 양을 피펫 37 ° C, 5 % CO 2 박에 품다. </li></ol> 3. Transfected 셀에서 DAPI 분석 <ol><li> 다음 날, Acf1 또는 SNF2h을 효율적으로 쓰러되었는지와 E4orf4이 서로 다른 샘플에서 동일하게 표현 된 것을 확인하기 위해 서양 얼룩 분석을 위해 샘플 당 하나의 접시에서 단백질을 추출합니다. </li><li> DAPI를위한 플레이트에서 미디어를 대기음검정, PBS로 부드럽게 접시를 씻고 세포를 충당하기 위해 PBS에 준비 4 % paraformaldehyde 1 ML를 추가합니다. 이 화학 물질로 세포의 paraformaldehyde 솔루션 및 치료의 준비는 화학 후드에서 수행되어야한다. 흔들림없이 실내 온도에서 15 분에 품다. </li><li> paraformaldehyde를 대기음 5 분마다 동안 실온에서 흔들, PBS로 세 번 씻어. 적어도 1 시간에 -20 ° C에서 -20 ° C 및 배양으로 유지 80 % 에탄올을 추가합니다. 플레이트는 그들이 에탄올 증발과 건조를 방지하기 위해 잘 봉인 된 동안에는 몇 일 동안 -20 ° C에서 에탄올에서 유지 될 수 있습니다. </li><li> 에탄올을 기음과 PBS로 두 번 세포를 씻어 한 번 PBS-BT (PBS는 0.5 % BSA와 0.05 % 십대 초반-20를 포함)와 함께 5 분마다 동안 실온에서 흔들. </li><li> 실온에서 흔들면서 비 특정 항체 바인딩을 방지하기 위해 20 분에 10 % 염소 혈청을 포함하는 1 ML PBS-BT 버퍼에있는 셀을 차단합니다. 그런 t을 씻어PBS-BT에 두 번 그는 세포, 5 분마다 씻으십시오. </li><li> 실온에서 흔들면서 1 시간에 대해 1 ML PBS-BT에서 주 항체와 세포를 (우리의 경우 E4orf4 특정 항체) 품다. 그런 다음 PBS-BT에 두 번 씻어 한 번 PBS에 0.​​1 % BSA, 5 분마다 세탁을 포함. </li><li> 어둠 속에서 실온에서 흔들면서 40 분에 해당하는 보조 휘황 - 라벨 항체와 DAPI의 ML 최종 농도 당 0.5 μg을 포함하는 PBS-0.1 % BSA의 1 ML에있는 세포를 배양. 그런 다음, 5 분을 위해 PBS로 씻어 흡인하여 잘 건조하고 완전한 건조를 달성 할 밤새에 추가 시간 동안 거꾸로 접시를 유지. 그런 다음 Fluoromount-G 솔루션을 사용하여 셀에 커버 슬라이드를 장착합니다. 4에 접시를 유지 ° C를 어둠 속에서 apoptotic 핵을 계산 할 준비가 될 때까지. </li><li> 편견 방식으로 수행 할 수 있도록 다양한 샘플에 apoptotic 핵을 계산, 새로운 번호로 여러 판을 식별 할 동료에게 물어보십시오. </li><li> U 아래의 세포를 시각화400 배로 확대 (공기) 또는 630X (침지 기름)의 확대에 pright 형광 현미경. 각 샘플로 표현하는 다양한 단백질에 물들와 transfected 세포 인구에서 DAPI의 얼룩으로 시각화 압축 또는 분할 핵의 수를 계산 아르 transfected 세포를 식별합니다. 여러 필드를 모니터링하고 최소한 200 transfected 세포의 총 계산합니다. </li><li> transfected 세포 인구에서 apoptotic 형태로 핵의 비율을 계산합니다. 중복과 실험을 반복, 2 ~ 3 배는 여러 샘플 사이의 변경 사항의 통계적 유의미성을 계산합니다. </li></ol> 4. 대표 결과 유전자 표현의 조건 최저는 성공하는 취득 식민지의 효율성과 관련된 유전자에 따라 변수이다. 우리 손에, 우리는 SNF2h에 대한 Acf1 18 6 아웃에 대한 검사를 12 아웃 7 성공적으로 식민지를 획득하였습니다. 그림 2는 쉬선택한 셀 클론 (그림 2A)뿐만 아니라 하나의 식민지 (그림 2B)의 대표 판을 ows. 그림 3 72 시간에 doxycycline의 유무에서 재배 다양한 클론 세포에서 추출한 단백질로 만든 대표적인 얼룩을 보여줍니다. 얼룩은로드 제어로 제공 SNF2h과 알파 - Tubulin에 항체 물들되었습니다. 클론의 두 (4 번과 5) doxycycline 유도시 SNF2h 수준에서 강력한 감소를 보여 주었다. 그것은 언급되어야 비록 pSuperior.neo 세포 라인 네오 GFP 융합 단백질을 인코딩의 생성에 사용되는 플라스미드 + GFP (그림 1), 안정적인 세포 라인에있는 녹색 형광가 매우 낮은 경우 및 기타 GFP 융합 단백질의 표현 이러한 세포에 transiently 도입 쉽게 배경 녹색 형광 위에 감지 될 수 있습니다. 실험의 개략도는 MEA에 세포 클론에서 수행확인 Acf1 또는 E4orf4 유발 세포 죽음에 SNF2h의 최저의 효과는 그림에 표시됩니다. 4. doxycycline 치료에 의해 유전자 표현의 최저에 필요한 시간은 수준 감소되어야 단백질의 안정성에 따라 다를 수 있습니다. Acf1 및 SNF2h를 들어, 72 시간 치료는 단백질 수준에서 효율적으로 분해가 필요했다. 그림 5는 E4orf4와 GFP를 표현하고 압축 또는 분할 형태로 DAPI-스테인드 핵의 모양으로 나타나신 세포 죽음을 진행하고 세포의 예를 보여줍니다. 그림 6은 doxycycline 유발 Acf1 최저는으로 이어 것을 보여주는 대표적인 실험의 결과를 보여줍니다 E4orf4 - 자극 세포 사망 (그림 6A)에 향상시킬 수 있습니다. 이 증가 E4orf4 수준 (그림 6B)의 증가에서 발생하지 않았다. 또한, doxycycline 유발 세포에 Acf1의 복원 수준으로 E4orf4 독성의 증가를 감소<html> uninduced 세포 (그림 6)에서 관찰. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/4442/4442fig1.jpg" fo:content-width="5.5in" fo:src="/files/ftp_upload/4442/4442fig1highres.jpg"/> 1 그림. 플라스미드 pSuperior.neo + GFP의지도.지도는 shRNA의 발현과 네오 GFP 융합 단백질의 PGK업자 운전 식을 운전 테트라 사이클린-inducible의 H1업자를 보여줍니다. 지도는 OligoEngine pSuperior 설명서에서 적응되었습니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/4442/4442fig2.jpg" /> 그림 2. 접시의 neomycin 방지 식민지의 식별. 이미지는 식민지 (A)를 포함하고 단일 식민지의 (B) 표시됩니다. 식민지는 neomycin를 포함하는 선택적 매체에 배양하여 14 일 동안 세포를 취득했다. YS &quot;&gt; <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/4442/4442fig3.jpg" /> 그림 3. neomycin의 존재에서 선택한 여러 식민지의 선택 식민지의 최저 효율의 시험. 셀 중복 우물에 도금되었습니다. 각 샘플 잘 하나 doxycycline (+)에 의해 유도 된 하나는 잘 치료 남은 (-). 단백질은 72 시간 게시물 유도를 추출하여 SDS-PAGE에 chromatographed했다. 서양 얼룩은 SNF2h과 알파 - Tubulin (로드 관리 역할)에 대한 항체를 연속 물들과 유도 및 제어 셀에 SNF2h 수준을 보여줍니다되었습니다. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/4442/4442fig4.jpg" /> 4 그림. 전형적인 최저 - DAPI 분석 실험을 계획. 실험의 연속 단계 Acf1 또는 SNF2h의 최저, Acf1 또는 SNF2h 표현을 복원하거나 EMP를 소개 transfection를 달성하기 doxycycline 치료를 포함하여 표시됩니다타이 벡터가와 세포로 E4orf4 또는 해당 빈 벡터를 소개하고, 결과를 분석합니다. Doxycycline - 처리 플레이트는 빨간색으로 표시됩니다 (Dox) 및 제어 플레이트는 파란색으로 표시됩니다. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4442/4442fig4large.jpg" target="_blank">더 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/4442/4442fig5.jpg" /> 그림 5. 그림 4에 설명 된 다양한 트리트먼트를 받았습니다 DAPI 분석하여 E4orf4 유발 세포 죽음을 감지. 세포는 고정와 transfected 세포의 핵을 시각화하는 E4orf4 특정 항체와 DAPI 물들했다. 특정 그림은 샘플이 포함 E4orf4 및 제어 GFP 단백질에서 촬영되었다. (A) GFP. (B) E4orf4. (C) DAPI. (D) 병합 이미지. 흰색 화살표 마르크 GFP 및 apoptotic morphologies과 핵을 포함하는 E4orf4 - transfected 세포. 빨간색 화살표apoptotic 핵으로 계산되지 않습니다 불규칙한 모양과 핵을 표시합니다. 단지 구분이 별표 마크 mitotic의 핵 또는 핵. <img alt="그림 6" src="/files/ftp_upload/4442/4442fig6.jpg" /> 6 그림. Acf1 최저는 E4orf4 유발 세포 죽음을 향상시킵니다. (A) 테트라 사이클린-inducible 프로모터에서 Acf1-shRNA을 표현 T-렉스-293-파생 세포주에서 세포가 doxycycline (+ Dox) 또는 왼쪽 치료 (-Dox)로 유도했다. 3 일 후 세포가 plasmids은 침묵의 도입에 의해 shRNA에 저항력이 렌더링 된 빈 벡터 또는 GFP 태그 표현 플라스미드 Acf1, 함께 E4orf4 (+ E4orf4) 또는 빈 벡터 (-E4orf4)를 표현과 transfected되었습니다 변이. 세포는 이십사시간 E4orf4에 항체가있는 transfection과 스테인드 후에 DAPI로 수정되었습니다. 세포 죽음을 유도는 위에 설명 된 DAPI 분석 및 비율 O에 의해 측정 된압축 또는 분할 핵으로 F transfected 세포가 결정되었습니다. 쓰리와 대표 실험 표시되어 복제 및 오류 막대는 표준 편차를 나타냅니다. (B) 병렬 플레이트의 세포는 서양 얼룩 분석에 수확되었다. 얼룩은 E4orf4, GFP 및 Acf1에 항체 물들되었습니다. 내생 Acf1 및 Acf1-GFP는 두 별도의 패널에 표시됩니다.

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	<li>Brummelkamp, T. R., Bernards, R., Agami, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+system+for+stable+expression+of+short+interfering+RNAs+in+mammalian+cells.">A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells.</a> Science (New York, N.Y). 296, 550-553 (2002).</li><li>Brummelkamp, T. R., Bernards, R., Agami, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+suppression+of+tumorigenicity+by+virus-mediated+RNA+interference.">Stable suppression of tumorigenicity by virus-mediated RNA interference.</a> Cancer. 2, 243-247 (2002).</li><li>Czauderna, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+shRNA+expression+for+application+in+a+prostate+cancer+mouse+model.">Inducible shRNA expression for application in a prostate cancer mouse model.</a> Nucleic acids research. 31, e127 (2003).</li><li>Matsukura, S., Jones, P. A., Takai, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+conditional+vectors+for+hairpin+siRNA+knockdowns.">Establishment of conditional vectors for hairpin siRNA knockdowns.</a> Nucleic acids research. 31, e77 (2003).</li><li>Wiznerowicz, M., Trono, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+suppression+of+cellular+genes:+lentivirus+vector-mediated+drug-inducible+RNA+interference.">Conditional suppression of cellular genes: lentivirus vector-mediated drug-inducible RNA interference.</a> Journal of. 77, 8957-8961 (2003).</li><li>Brestovitsky, A., Sharf, R., Mittelman, K., Kleinberger, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+adenovirus+E4orf4+protein+targets+PP2A+to+the+ACF+chromatin-remodeling+factor+and+induces+cell+death+through+regulation+of+SNF2h-containing+complexes.">The adenovirus E4orf4 protein targets PP2A to the ACF chromatin-remodeling factor and induces cell death through regulation of SNF2h-containing complexes.</a> Nucleic acids research. 39, 6414-6427 (2011).</li><li>Livne, A., Shtrichman, R., Kleinberger, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase+activation+by+adenovirus+E4orf4+protein+is+cell+line-specific+and+is+mediated+by+the+death+receptor+pathway.">Caspase activation by adenovirus E4orf4 protein is cell line-specific and is mediated by the death receptor pathway.</a> J. Virol. 75, 789-798 (2001).</li><li>Shtrichman, R., Kleinberger, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus+type+5+E4+open+reading+frame+4+protein+induces+apoptosis+in+transformed+cells.">Adenovirus type 5 E4 open reading frame 4 protein induces apoptosis in transformed cells.</a> J. Virol. 72, 2975-2982 (1998).</li><li>Shtrichman, R., Sharf, R., Kleinberger, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus+E4orf4+protein+interacts+with+both+Ba+and+B'+subunits+of+protein+phosphatase+2A,+but+E4orf4-induced+apoptosis+is+mediated+only+by+the+interaction+with+Ba.">Adenovirus E4orf4 protein interacts with both Ba and B' subunits of protein phosphatase 2A, but E4orf4-induced apoptosis is mediated only by the interaction with Ba.</a> Oncogene. 19, 3757-3765 (2000).</li><li>Galluzzi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+assays+for+monitoring+cell+death+in+higher+eukaryotes.">Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring cell death in higher eukaryotes.</a> Cell death and differentiation. 16, 1093-1107 (2009).</li><li>Lavoie, J. N., Nguyen, M., Marcellus, R. C., Branton, P. E., Shore, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E4orf4,+a+novel+adenovirus+death+factor+that+induces+p53-independent+apoptosis+by+a+pathway+that+is+not+inhibited+by+zVAD-fmk.">E4orf4, a novel adenovirus death factor that induces p53-independent apoptosis by a pathway that is not inhibited by zVAD-fmk.</a> J. Cell Biol. 140, 637-645 (1998).</li><li>Li, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+adenovirus+E4orf4+protein+induces+growth+arrest+and+mitotic+catastrophe+in+H1299+human+lung+carcinoma+cells.">The adenovirus E4orf4 protein induces growth arrest and mitotic catastrophe in H1299 human lung carcinoma cells.</a> Oncogene. 28, 390-400 (2009).</li><li>Lavoie, J. N., Champagne, C., Gingras, M. -. C., Robert, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus+E4+open+reading+frame+4-induced+apoptosis+involves+dysregulation+of+Src+family+kinases.">Adenovirus E4 open reading frame 4-induced apoptosis involves dysregulation of Src family kinases.</a> J. Cell Biol. 150, 1037-1055 (2000).</li></ol>

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

특정 유전자 표현의 최저는 규제 경로로 단백질의 기여의 조사에 중요한 접근 방식이다. 필수 유전자의 표현의 제정 최저 부정적인 세포 증식에​​ 영향을 미치는 때문에, 그들의 연구는 과도 siRNAs의 도입이나 안정적인 조건 최저 시스템의 응용 프로그램 중 하나를 필요로 할 수 있습니다. 여기에 설명 된 shRNAs의 약물 유발 표현을 수용 할 수있는 안정적인 세포 라인의 생성, 많은 세포 라인에 ?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 (선택 사항) </td></tr><tr><td> 높은 포도당 DMEM </td><td> Gibco </td><td> 41,965 </td><td></td></tr><tr><td> Tet 시스템 승인 FBS </td><td> Clontech </td><td> 631106 </td><td></td></tr><tr><td> L-글루타민 </td><td> Gibco </td><td> 25,030 </td><td></td></tr><tr><td> 펜 패 혈성 </td><td> Gibco </td><td> 15,140 </td><td></td></tr><tr><td> 0.25 % 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) </td><td> Gibco </td><td> 25,200 </td><td></td></tr><tr><td> T-렉스-293 세포 </td><td> Invitrogen </td><td> R710-07 </td><td></td></tr><tr><td> G418 </td><td> 시그마 </td><td> A1720 </td><td></td></tr><tr><td> blasticidin </td><td> Invit로겐 </td><td> R210-01 </td><td></td></tr><tr><td> 플라스미드 pSuperior.neo + GFP </td><td> OligoEngine </td><td> VEC-PBS-0007/0008 </td><td></td></tr><tr><td> jetPIE </td><td> Polyplus transfection </td><td> 101-40 </td><td></td></tr><tr><td> doxycycline </td><td> 시그마 </td><td> D9891 </td><td></td></tr><tr><td> paraformaldehyde </td><td> 전자 현미경 과학 </td><td> 15,710 </td><td></td></tr><tr><td> 4 &#39;, 6 diamidino-2-phenylindole (DAPI) </td><td> 시그마 </td><td> D9542 </td><td></td></tr><tr><td> Fluoromount-G </td><td> SouthernBiotech </td><td> 0100-01 </td><td></td></tr></tbody></table>

preparation of cell-lines for conditional knockdown of gene expression and measurement of the knockdown effects on e4orf4-induced cell death

포유류의 세포에서 유전자 발현의 기능 불 활성화는 다양한 경로의 1,2의 관심 단백질의 기여에 관한 연구하는데 매우 중요합니다. 제정 최저 시간이 3-5 오랜 기간 동안 세포 용납되지 않은 경우 그러나, 유전자 표현의 조건 최저는 경우에 필요합니다. 여기 ACF 염색질 리모델링 요소의 subunits의 조건 최저를 허용 세포 라인의 준비를위한 프로토콜을 설명합니다. 이러한 세포 라인은 아데노 바이러스 E4orf4 단백질 6 셀 죽음의 유도에 ACF의 노력의 결정을 용이하게합니다. ACF 염색질 리모델링 인자의 Acf1 및 SNF2h subunits에 대한 짧은 머리 핀의 자형 RNAs를 인코딩 순서는 또한 neomycin 내성 유전자에 대한 유전자를 포함하는 플라스미드의 doxycycline-inducible업자 옆에 복제되었습니다. Neomycin 방지 세포 클론은 G418과 절연의 존재에 선정되었다. 그 결과 세포 라인에 의해 유도 된doxycycline 치료는 한 번 Acf1 또는 SNF2h 표현 수준이 감소되었다 세포는 플라스미드 인코딩 E4orf4하거나 빈 벡터와 transfected했다. shRNA 구조의 특정 효과를 확인하려면 Acf1 또는 SNF2h 단백질 수준은 침묵 변이의 도입에 의해 shRNA에 저항력이 렌더링 된 플라스미드 표현 Acf1 또는 SNF2h과 cotransfection에 의해 WT 수준으로 복원되었습니다. 다양한 샘플에서 세포 죽음을 유도하는 E4orf4의 능력은 transfected 세포 인구의 apoptotic morphologies과 핵의 모양의 빈도가 7-9 측정 된에 DAPI 분석에 의해 산출 된 것입니다. 제정 최저 셀은 치명적 될 때 여기에 설명 된 프로토콜은 경우에 자신의 단백질 파트너가 세포 죽음을 유도하는 여러 단백질의 기능 공헌 결정에 활용 될 수있다.

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Preparation of Cell-lines for Conditional Knockdown of Gene Expression and Measurement of the Knockdown Effects on E4orf4-Induced Cell Death

E4orf4 유도 세포 죽음에 ACF 염색질 리모델링 요소의 기여가 측정되었다. 프로토콜은 doxycycline 치료는 ACF subunits Acf1과 SNF2h의 조건 최저를 유도하는 세포 클론의 선택이 포함되어 있으며, inducible 세포 라인에 E4orf4 유발 세포 죽음을 측정 할 수있는 DAPI 분석을 사용합니다.

E4orf4 - 유도 세포 사망에 최저 효과의 유전자 발현 및 측정의 조건부 최저위한 셀 라인의 작성

Functional inactivation of gene expression in mammalian cells is crucial for the study of the contribution of a protein of interest to various ...

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Research

JoVE Journal

Biology

10.9K 조회수.  Technion - Israel Institute of Technology. E4orf4 유도 세포 죽음에 ACF 염색질 리모델링 요소의 기여가 측정되었다. 프로토콜은 doxycycline 치료는 ACF subunits Acf1과 SNF2h의 조건 최저를 유도하는 세포 클론의 선택이 포함되어 있으며, inducible 세포 라인에 E4orf4 유발 세포 죽음을 측정 할 수있는 DAPI 분석을 사용합니다.

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The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

Electroporation에 대한 Murine 골수에서 조혈 세포 차 문화의 준비

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

연구

생물학

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell electroporation system and Gene Pulser electroporation buffer (Bio-Rad) were specifically developed to easily transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells. We will demonstrate how to perform a simple experiment to quickly identify the best electroporation conditions. We will demonstrate how to run several samples through a range of electroporation conditions so that an experiment can be conducted at the same time as optimization is performed. We will also show how optimal conditions identified using 96-well electroporation plates can be used with standard electroporation cuvettes, facilitating the switch from electroporation plates to electroporation cuvettes while maintaining the same electroporation efficiency. In the video, we will also discuss some of the key factors that can lead to the success or failure of electroporation experiments.

This procedure shows how to use the Gene Pulser MXcell electroporation system to rapidly and easily identify the best electroporation conditions for mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or other primary cells. Considerations for troubleshooting are also discussed in the associated video.

고효율 기본 셀을 Transfect하는 진 Pulser Electroporation MXcell의 시스템을 사용하여

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only to study the effects of downregulating single genes, but also to interrogate signaling pathways and other complex interaction networks.  These pathway analyses require both the use of relevant cellular models and methods that cause less perturbation to the cellular physiology.  Electroporation is increasingly being used as an effective way to introduce siRNA and other nucleic acids into difficult to transfect cell lines and primary cells without altering the signaling pathway under investigation. There are multiple critical steps to a successful siRNA experiment, and there are ways to simplify the work while improving the data quality at several experimental stages.  To help you get started with your siRNA mediated gene knockdown project, we will demonstrate how to perform a pathway study complete from collecting and counting the cells prior to electroporation through post transfection real-time PCR gene expression analysis.  The following study investigates the role of the transcriptional activator STAT6 in IL-4 dependent gene expression of CCL17 in a Burkitt lymphoma cell line (Namalwa).  The techniques demonstrated are useful for a wide range of siRNA-based experiments on both adherent and suspension cells.  We will also show how to streamline cell counting with the TC10 automated cell counter, how to electroporate multiple samples simultaneously using the MXcell electroporation system, and how to simultaneously assess RNA quality and quantity with the Experion automated electrophoresis system.

This procedure describes a quick and easy workflow to introduce siRNA into difficult to transfect cell lines and follow gene expression by real-time PCR. Use of an automated cell counter, multi-well electroporation plate, and automated electrophoresis station provide quick and reliable results without the need for expensive robotic handling.

유전자 발현 연구를 단순화하는 자동 셀 카운터를 사용하여 : Namalwa 셀에서 IL - 4 종속 유전자 발현의 siRNA의 최저

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of muscle specification, formation and function in model systems has provided valuable insight into muscle physiology. Therefore, identifying and characterizing molecular mechanisms that underlie muscle damage is critical. The structure of adult Drosophila multi-fiber muscles resemble vertebrate striated muscles 1 and the genetic tractability of Drosophila has made it a great system to analyze dystrophic muscle morphology and characterize the processes affecting muscular function in ageing adult flies 2. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. These preparations allow for the tissue to be stained with classical histological stains and labeled with protein detecting dyes, and specifically cryosections are ideal for immunohistochemical detection of proteins in intact muscles. This allows for analysis of muscle tissue structure, identification of morphological defects, and detection of the expression pattern for muscle/neuron-specific proteins in Drosophila adult muscles. These techniques can also be slightly modified for sectioning of other body parts.

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identification of mechanisms underlying muscle damage is crucial. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. This allows analysis of muscle morphology and localization of protein and other muscle cell components.

의 파라핀 - 임베디드 및 냉동 섹션 Drosophila 성인 근육

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

활성 T.의 체외의 Reconstitution에서 castaneum의 Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells (HSCs) differentiate into oligopotent progenitors, committed precursors and mature red blood cells 1. This process is regulated for a large part at the level of gene expression, whereby specific transcription factors activate lineage-specific genes while concomitantly repressing genes that are specific to other cell types 2. Studies on transcription factors regulating erythropoiesis are often performed using human and murine cell lines that represent, to some extent, erythroid cells at given stages of differentiation 3-5. However transformed cell lines can only partially mimic erythroid cells and most importantly they do not allow one to comprehensibly study the dynamic changes that occur as cells progress through many stages towards their final erythroid fate. Therefore, a current challenge remains the development of a protocol to obtain relatively homogenous populations of primary HSCs and erythroid cells at various stages of differentiation in quantities that are sufficient to perform genomics and proteomics experiments.
Here we describe an ex vivo cell culture protocol to induce erythroid differentiation from human hematopoietic stem/progenitor cells that have been isolated from either cord blood, bone marrow, or adult peripheral blood mobilized with G-CSF (leukapheresis). This culture system, initially developed by the Douay laboratory 6, uses cytokines and co-culture on mesenchymal cells to mimic the bone marrow microenvironment. Using this ex vivo differentiation protocol, we observe a strong amplification of erythroid progenitors, an induction of differentiation exclusively towards the erythroid lineage and a complete maturation to the stage of enucleated red blood cells. Thus, this system provides an opportunity to study the molecular mechanism of transcriptional regulation as hematopoietic stem cells progress along the erythroid lineage. 
Studying erythropoiesis at the transcriptional level also requires the ability to over-express or knockdown specific factors in primary erythroid cells. For this purpose, we use a lentivirus-mediated gene delivery system that allows for the efficient infection of both dividing and non-dividing cells 7. Here we show that we are able to efficiently knockdown the transcription factor TAL1 in primary human erythroid cells. In addition, GFP expression demonstrates an efficiency of lentiviral infection close to 90%. Thus, our protocol provides a highly useful system for characterization of the regulatory network of transcription factors that control erythropoiesis.

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

An ex vivo protocol to generate mature human red blood cells from hematopoietic stem/progenitors is described. Additionally we describe an efficient lentiviral-delivery method to knockdown the transcription factor TAL1 in primary erythroid cells. The efficiency of lentivirus mediated gene delivery is demonstrated using GFP expressing viruses.

Lentiviral - 중재 최저 동안 예 VIVO</em인간 조혈 줄기 세포의> 적혈구 조혈

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells ...

RNAi Mediated Gene Knockdown and Transgenesis by Microinjection in the Necromenic Nematode Pristionchus pacificus

Although it is increasingly affordable for emerging model organisms to obtain completely sequenced genomes, further in-depth gene function and expression analyses by RNA interference and stable transgenesis remain limited in many species due to the particular anatomy and molecular cellular biology of the organism. For example, outside of the crown group Caenorhabditis that includes Caenorhabditis elegans3, stably transmitted transgenic lines in non-Caenorhabditis species have not been reported in this specious phylum (Nematoda), with the exception of Strongyloides stercoralis4 and Pristionchus pacificus5. To facilitate the expanding role of P. pacificus in the study of development, evolution, and behavior6-7, we describe here the current methods to use microinjection for making transgenic animals and gene knock down by RNAi. Like the gonads of C. elegans and most other nematodes, the gonads of P. pacificus is syncitial and capable of incorporating DNA and RNA into the oocytes when delivered by direct microinjection. Unlike C. elegans however, stable transgene inheritance and somatic expression in P. pacificus requires the addition of self genomic DNA digested with endonucleases complementary to the ends of target transgenes and coinjection markers5. The addition of carrier genomic DNA is similar to the requirement for transgene expression in Strongyloides stercoralis4 and in the germ cells of C. elegans. However, it is not clear if the specific requirement for the animals' own genomic DNA is because P. pacificus soma is very efficient at silencing non-complex multi-copy genes or that extrachromosomal arrays in P. pacificus require genomic sequences for proper kinetochore assembly during mitosis. The ventral migration of the two-armed (didelphic) gonads in hermaphrodites further complicates the ability to inject both gonads in individual worms8. We also demonstrate the use of microinjection to knockdown a dominant mutant (roller,tu92) by injecting double-stranded RNA (dsRNA) into the gonads to obtain non-rolling F1 progeny. Unlike C. elegans, but like most other nematodes, P. pacificus PS312 is not receptive to systemic RNAi via feeding and soaking and therefore dsRNA must be administered by microinjection into the syncitial gonads. In this current study, we hope to describe the microinjection process needed to transform a Ppa-egl-4 promoter::GFP fusion reporter and knockdown a dominant roller prl-1 (tu92) mutant in a visually informative protocol.

RNAi Mediated Gene Knockdown and Transgenesis by Microinjection in the Necromenic Nematode Pristionchus pacificus

In model organisms, transgenesis can manipulate gene functions while RNAi can knockdown specific mRNA transcripts 1-2. This protocol aims to illustrate the techniques needed to introduce stably transmitted DNA and transient double stranded RNA into the necromenic nematode Pristionchus pacificus for studies in evolutionary, developmental, and behavioral biology.

RNAi는 Necromenic 선충류의 Microinjection에 의해 유전자 최저 및 Transgenesis을 중재 Pristionchus pacificus</em

Although it is increasingly affordable for emerging model organisms to obtain completely sequenced genomes, further in-depth gene function and expression ...

Generation of Stable Human Cell Lines with Tetracycline-inducible (Tet-on) shRNA or cDNA Expression

A major approach in the field of mammalian cell biology is the manipulation of the expression of genes of interest in selected cell lines, with the aim to reveal one or several of the gene's function(s) using transient/stable overexpression or knockdown of the gene of interest. Unfortunately, for various cell biological investigations this approach is unsuitable when manipulations of gene expression result in cell growth/proliferation defects or unwanted cell differentiation. Therefore, researchers have adapted the Tetracycline repressor protein (TetR), taken from the E. coli tetracycline resistance operon1, to generate very efficient and tight regulatory systems to express cDNAs in mammalian cells2,3. In short, TetR has been modified to either (1) block initiation of transcription by binding to the Tet-operator (TO) in the promoter region upon addition of tetracycline (termed Tet-off system) or (2) bind to the TO in the absence of tetracycline (termed Tet-on system) (Figure 1). Given the inconvenience that the Tet-off system requires the continuous presence of tetracycline (which has a half-life of about 24 hr in tissue cell culture medium) the Tet-on system has been more extensively optimized, resulting in the development of very tight and efficient vector systems for cDNA expression as used here.
Shortly after establishment of RNA interference (RNAi) for gene knockdown in mammalian cells4, vectors expressing short-hairpin RNAs (shRNAs) were described that function very similar to siRNAs5-11. However, these shRNA-mediated knockdown approaches have the same limitation as conventional knockout strategies, since stable depletion is not feasible when gene targets are essential for cellular survival. To overcome this limitation, van de Wetering et al.12 modified the shRNA expression vector pSUPER5 by inserting a TO in the promoter region, which enabled them to generate stable cell lines with tetracycline-inducible depletion of their target genes of interest.
Here, we describe a method to efficiently generate stable human Tet-on cell lines that reliably drive either inducible overexpression or depletion of the gene of interest. Using this method, we have successfully generated Tet-on cell lines which significantly facilitated the analysis of the MST/hMOB/NDR cascade in centrosome13,14 and apoptosis signaling15,16. In this report, we describe our vectors of choice, in addition to describing the two consecutive manipulation steps that are necessary to efficiently generate human Tet-on cell lines (Figure 2). Moreover, besides outlining a protocol for the generation of human Tet-on cell lines, we will discuss critical aspects regarding the technical procedures and the characterization of Tet-on cells.

Generation of Stable Human Cell Lines with Tetracycline-inducible Tet-on shRNA or cDNA Expression

A rapid and simple way to generate human cell lines with inducible and reversible cDNA overexpression or shRNA-mediated knock-down of the gene of interest. This method enables researchers to reliably and highly reproducibly manipulate cell lines that are difficult to alter by transient transfection methods or conventional knockdown/knockout strategies.

테트라싸이클린-inducible (Tet-에서) shRNA 또는 cDNA 표현과 안정적인 인간 세포 라인의 생성

A major approach in  the field of mammalian cell biology is the manipulation of the expression of  genes of interest in selected cell lines, with the aim ...

Large-scale Gene Knockdown in C. elegans Using dsRNA Feeding Libraries to Generate Robust Loss-of-function Phenotypes

RNA interference by feeding worms bacteria expressing dsRNAs has been a useful tool to assess gene function in C. elegans. While this strategy works well when a small number of genes are targeted for knockdown, large scale feeding screens show variable knockdown efficiencies, which limits their utility. We have deconstructed previously published RNAi knockdown protocols and found that the primary source of the reduced knockdown can be attributed to the loss of dsRNA-encoding plasmids from the bacteria fed to the animals. Based on these observations, we have developed a dsRNA feeding protocol that greatly reduces or eliminates plasmid loss to achieve efficient, high throughput knockdown. We demonstrate that this protocol will produce robust, reproducible knock down of C. elegans genes in multiple tissue types, including neurons, and will permit efficient knockdown in large scale screens. This protocol uses a commercially available dsRNA feeding library and describes all steps needed to duplicate the library and perform dsRNA screens. The protocol does not require the use of any sophisticated equipment, and can therefore be performed by any C. elegans lab.

Large-scale Gene Knockdown in C. elegans Using dsRNA Feeding Libraries to Generate Robust Loss-of-function Phenotypes

While dsRNA feeding in C. elegans is a powerful tool to assess gene function, current protocols for large scale feeding screens result in variable knockdown efficiencies. We describe an improved protocol for performing large scale RNAi feeding screens that results in highly efficacious and reproducible knockdown of gene expression.

대규모 유전자 넉다운에<em&gt; C. 엘레</em&gt; 강력한 기능 상실 표현형을 생성하는 dsRNA를 먹이는 라이브러리 사용

RNA interference by feeding worms bacteria expressing dsRNAs has been a useful tool to assess gene function in C. elegans. While this strategy works well ...

In Vivo SiRNA Transfection and Gene Knockdown in Spinal Cord via Rapid Noninvasive Lumbar Intrathecal Injections in Mice

This report describes a step-by-step guide to the technique of acute intrathecal needle injections in a noninvasive manner, i.e. independent of catheter implantation. The technical limitation of this surgical technique lies in the finesse of the hands. The injection is rapid, especially for a trained experimenter, and since tissue disruption with this technique is minimal, repeated injections are possible; moreover immune reaction to foreign tools (e.g. catheter) does not occur, thereby giving a better and more specific read out of spinal cord modulation. Since the application of the substance is largely limited to the target region of the spinal cord, drugs do not need to be applied in large dosages, and more importantly unwanted effects on other tissue, as observed with a systemic delivery, could be circumvented1,2. Moreover, we combine this technique with in vivo transfection of nucleic acid with the help of polyethylenimine (PEI) reagent3, which provides tremendous versatility for studying spinal functions via delivery of pharmacological agents as well as gene, RNA, and protein modulators.

In Vivo SiRNA Transfection and Gene Knockdown in Spinal Cord via Rapid Noninvasive Lumbar Intrathecal Injections in Mice

This report describes a simple and rapid technique of intrathecal needle puncture for a localized transfection of siRNA in the lumbar spinal cord in mouse under short lasting light anesthesia.

마우스의 빠른 비 침습 요추 경 막내 주사를 통해 생체 siRNA의 형질과 척수에있는 유전자 넉다운에

This report describes a step-by-step guide to the technique of acute intrathecal needle injections in a noninvasive manner, i.e. independent of catheter ...