이 작품은 EMBO 장기 교제 (ABW)에 의해 지원되었다, 국립 과학 재단 (National Science Foundation) 국제 박사 학위 취득 후 연구 활동 (ABW), 막스 플랑크 먼 (ABW, DS, JS, ACO), 파고-BB의 교제 (AO), 및 (ACO DS) 유럽 공동체 일곱 번째 프레임 워크 프로그램 STG-207634에서 유럽 연구위원회. 우리는 원고에 도움이 코멘트 라비 데 사이 감사합니다. 우리는 또한 제브라 피쉬 Fibronectin1 조각, 관리 및 우리의 물고기 라인과 영상 지원을위한 MPI-CBG 광학 현미경 시설의 유지 보수를 위해 MPI-CBG 물고기 시설 직원의 생산을위한 MPI-CBG 단백질 발현 시설 감사의 말씀을 전합니다.

1. 해부하기 전에 <ol><li> 해부 전날, 유전자 변형 대립 유전자의 이형 제브라 피쉬 쌍의 incross에서 배아를 얻을 수 있습니다. <ol><li> 28 ℃로 메틸렌 블루없이 E3 매체에 배아를 인상 방패 단계 (6 시간 포스트 수정)까지. </li><li> 20 O CO / N.에 메틸렌 블루없이 E3 매체 이식란 그들은 tailbud 단계에 도달하면 20 ℃로, 배아는 시간 당 1 체절을 형성 할 것이다. 20 O C에서 17 ~ 20 시간의 O / N 후, 배아는 해부 프로토콜의 시작 부분에 다음 아침을 무대 5 ~ 8 체절에 있어야합니다. </li></ol></li><li> 도구와 해부에 필요한 시약을 조립합니다. <ol><li> 배아 조직의 전송을위한 화재 광택 유리 피펫 </li><li> 배아 chorions의 제거를위한 미세 집게의 쌍 </li><li> 해부 용 실 가드 코팅 된 35-mm 요리 - 35mm 접시에 실 가드 폴리머를 붓고 37 ℃에서 O / N을 치료 사용하여 잘 해부를 확인경화 폴리머의 작은 양을 제거하는 니들 팁. 요리 청소 이후에 다시 사용할 수 있습니다. </li><li> PSM 조직 조작 깎아 평평 텅스텐 와이어 도구 </li><li> 문화 PSM의 원하는 조각을 절단 마이크로 메스 </li><li> 트립신 배양을위한 35-mm 플라스틱 접시 </li><li> 10 % 소 태아 혈청을 함유 L15 매체 </li><li> 0.25 % 트립신 / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 솔루션 </li><li> 분산에 대한 Sigmacoted 젤 로딩 팁 </li><li> 메틸렌 블루없이 E3 매체를 포함하는 플라스틱 배양 접시. </li></ol></li><li> Fibronectin1 기판 (PBS에서 10 ㎍ / mL)로 유리 바닥 이미징 접시를 커버. 해부 동안 코트에 벤치에 접시를 남겨주세요. </li><li> 식별 할 수있는 적절한 형광 필터 및 정렬 긍정적 인 형질 전환 배아 (5 ~ 8 체절 단계)과 입체경을 사용합니다. <ol><li> 형광 채널에서 YFP 식에 대한 presomitic 중배엽 (PSM) (그림 1A)를 검사하여 유전자 변형 배아를 식별합니다. 형광 소자민련은 tailbud의 마지막 형성 체절에서 지역에서 볼 수. 밝은 신호 배아를 선택; 자식의 25 %는 유전자의 두 사본을 들고 동형 접합 배아해야한다. 필요한 확인 된 배아의 수는 실험에 따라 달라집니다. 하나 해부 tailbud 조각은 평균 1,000 세포를 얻을 것입니다. 일반적으로 몇 가지 추가 양의 배아는 경우 오류가 해부하는 동안 만들어 유용하다. </li><li> 신호에서, 특히 노른자 셀에, 어떤 형광도를 구분하는 위치 기준으로 전송 된 빛을 사용합니다. </li><li> 메틸렌 블루없이 E3 매체를 포함하는 별도의 플라스틱 페트리 접시에 긍정적 인 배아를 전송합니다. </li></ol></li></ol> 2. PSM 해부 및 분산 <ol><li> 해부 배아를 준비합니다. <ol><li> 해부 현미경, 미세 집게를 사용하여 조심스럽게 E3 매체의 각 배아에서 융모막을 제거합니다. 배아를 손상 시키거나 노른자 셀을 방해하지 않도록주의하십시오. </lI&gt; <li> 기입 혈청 L15 매체와 요리를 해부 실 가드 코팅. 집게 또는 다른 평면 도구를 사용하여, 실 가드의 표면에서 공기 방울을 제거합니다. </li><li> 해부 접시에 화재 광택 유리 피펫을 사용하여 dechorionated 배아를 전송합니다. </li><li> 와이어 도구를 사용하여 해부 접시의 한쪽이 배아를 이동. </li></ol></li><li> 하나의 배아에서 PSM을 해부하다. <ol><li> 동양 아니라 해부 접시 (그림 1B) 내에서 실 가드 층에서 만든 작은에서의 측면에 하나의 배아. </li><li> 배아와 노른자 셀을 통해 마이크로 메스, 조각을 사용하면 단지 후뇌와 (빨간색 점선 그림 1B) 태아의 복부 극을 통해 전방. </li><li> 접시의 측면에 멀리 이동, 우물에서 배아의 앞쪽 부분을 제거하고 PSM 등의 후방 부에서 떨어져 남은 노른자 세포 과립을 긁어 와이어 도구를 사용합니다. </li><li>노른자가 긁어되면, 평평하고 멀리 실험에서 가리키는 앞쪽 끝이 PSM 및 실험 (그림 1C)을 향하는 후방 방향. </li><li> 외배엽의 얇은 층이 키워드 뽑아되지 않으면 멀리 PSM 조직의 위로부터 박리 와이어 도구를 사용한다. </li><li> 마이크로 메스를 사용하여 멀리 조직 (빨간 점선 그림 1C)의 나머지 tailbud, 척색의 끝을지나 PSM의 가장 뒤 끝을 잘라. 참고 : PSM에서 조직의 다른 부분, 예를 들어 전방 PSM에 가까운 마지막 체절 형성에, 또한 실험 질문에 따라, 문화에 가지고 갈 수있다. </li><li> 멀리 해부 영역에서 요리의 한 구석에 tailbud 조각을 이동합니다. 해부 필드에서 이물질 및 원치 않는 배아 조직을 취소 선 도구를 사용합니다. </li><li> 다음 배아와 반복합니다. </li></ol></li><li> 여러 전자 풀의 tailbud 조각mbryos, 실험을 위해 요구 될 것이다 얼마나 많은 셀에 따라. 평균적으로, tailbud 조직의 한 조각은 1,000 세포를 얻을 수 있습니다. </li><li> 트립신-EDTA의 작은 볼륨 빈 35 mm 플라스틱 접시를 채우십시오. </li><li> 화재 광택 유리 피펫을 사용하여, 트립신 / EDTA를 포함하는 접시에 요리를 해부에서 tailbud 조각을 전송합니다. 실온에서 20 분 동안 트립신 / EDTA에 tailbud 조각을 품어. </li><li> 조직이 트립신 배양되는 동안, 바닥이 유리로 된 영상 접시에서 Fibronectin1 솔루션을 제거합니다. <ol><li> 를 MilliQ 물 유리에서 3 번 솔루션을 씻으십시오. 각 세척을 제거하고 접시가 완전히 건조하기 위해 흡입을 사용합니다. </li></ol></li><li> 이미징 매체에 tailbud 조각을 분산. <ol><li> 영상 접시에 혈청 L15 매체 100 μl를 피펫. </li><li> 코팅 젤 팁을 사용하여 가능한 한 작은 볼륨에서 트립신 / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)에서 tailbud 조각을 제거합니다. </li><li> 매질에 tailbud 조각 피펫영상 요리. 따로 따로 휴식 및 매체에 세포를 일시 중단 위아래로 여러 번 조각을 피펫. 공기 방울을 도입하지 않도록주의하십시오. 현미경으로 세포 덩어리를 확인하고 필요에 따라 더 분산. </li><li> 현탁액의 분산 된 세포가 실온에서 20 분 동안 Fibronectin1 코팅 유리에 정착 할 수 있습니다. </li></ol></li><li> 촬상을 시작하기 전에 세포 혈청 추가적인 L15 매체의 작은 양을 추가. 침전 된 세포를 방해하지 않도록주의하십시오. </li><li> 실험 질문을 감안할 때, 문화에 보완 또는 약물 치료를 추가합니다. </li></ol> 분산 된 PSM 세포의 3. 영상 <ol><li> 시간 경과 영상 현미경에 온도 챔버에서 영상 요리를 설정합니다. 실험 원하는 온도에 워너 챔버를 설정합니다. 요리 이미지 수집을 시작하기 전에 적어도 30 분 동안 평형을 허용합니다. 필요한 경우 외부 온도 프로브를 비교 검토 온도는 접시에 배치. 참고 : 인해온도와 somitogenesis 속도 21 안정적인 온도 제어의 관계는 하나의 PSM 세포주기의 정확한 측정을 위해 필수적입니다. </li><li> 노출 시간 및 이득이 소음에 좋은 신호를 확인하기 위해 채도하지 않고 강도의 큰 동적 범위를 제공하는 것을 확인하기 위해 형광 채널에서의 테스트 이미지를 취득. 이 프로토콜을 사용하여 우리의 선에서 생성 된 분산 세포에서 얻은 전형적인 형광 이미지 (85)의 EM 게인에서 작동 EMCCD 카메라로 전송 된 광 이미지를 400 밀리, 40 밀리 초를 필요로합니다.에서 또한, 프리 앰프 이득 및 판독 속도 카메라는 노이즈에 신호를 극대화하는 것이 필수적이다. </li><li> 전송 된 광 채널을 사용하여, 시간 경과 수집을위한 세포의 필드를 선택합니다. </li><li> 시간의 원하는 기간 동안 시간 경과 수집 프로토콜을 실행합니다. <ol><li> 하나의 전송 빛과 필드 당 하나의 형광 이미지를 획득. 참고 : 인수 소유주 사이의 간격을 설정세포의 확장 된 이미지 또는 유도 독성에 사진을 표백하지 않고 시간적 역학을 캡처합니다 unds. 이 프로토콜은 2 분 간격을 사용합니다. </li></ol></li><li> 세포가없는 소프트웨어 또는 하드웨어 오류 등을 초점에 남아 있는지 확인하기 위해 녹화 중 가끔 시간 경과 셋업을 확인 </li></ol> 획득 시간 경과 영화 4. 이미지 처리 <ol><li> 오픈 동영상 이미지 처리 소프트웨어에서 취득한 필드 파일. 참고 : 피지는이 프로토콜의 모든 처리를 위해 사용되었다. <ol><li> 분할 이미​​지의 2 스택을 생성하는 하나의 필드에서 빛과 형광 프레임을 전송. </li></ol></li><li> 전송 된 광 채널에서 단일 셀을 추적 할 수 있습니다. <ol><li> 투과광 채널에서의 첫 번째 프레임에서 선택된 셀의 주위에 원형 ROI (관심 영역) 배치. . NOTE :. 1 기록의 끝에 건강한 남은 세포,이 필드의 외측으로 이동하지 않고,도 3은 다른 세륨과 접촉하지 않는다.LLS는 추적됩니다. </li><li> 투자 수익 (ROI)에게 ROI 관리에 대한 모든 몇 프레임을 저장합니다. 마지막 프레임까지 셀을 추적 할 수 있습니다. </li></ol></li><li> 형광 채널에 저장된 개의 ROI를 이용하여 강도를 측정한다. <ol><li> 형광 스택을 선택하고 저장된의 ROI로, 시간이 지남에 따라 추적 된 셀의 세기를 측정하도록 지정 동그라미 인터폴 플러그 및 매크로를 사용한다. </li><li> 매크로의 출력 추적을 확인합니다. 추적이 질적으로 형광 시간 경과의 기능을 캡처하면, Excel 워크 시트에 값을 보냅니다. </li><li> 셀에 대한 투자 수익 (ROI) 목록을 저장합니다. </li></ol></li><li> 전송 채널에서 추적하고 현장에서 다른 세포에 형광 채널에서 측정을 반복합니다. </li><li> 실험에서 추가 필드의 모든 단계를 반복합니다. </li></ol>

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S., Sassone-Corsi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+acts+directly+on+organs+and+cells+in+culture+to+set+the+vertebrate+circadian+clock.">Light acts directly on organs and cells in culture to set the vertebrate circadian clock.</a> Nature. 404, 87-91 (2000).</li><li>Soroldoni, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Doppler+effect+in+embryonic+pattern+formation.">A Doppler effect in embryonic pattern formation.</a> Science. 345, 222-225 (1126).</li></ol>

저자 포스트 : ABW 개발 및 분산, 문화, 이미징 및 세포 추적 프로토콜을 정제. DS는 트랜스 제닉 라인을 생성하고이 프로토콜에서 사용되는 저속 형광 현미경의 디자인을 감독. AO는 해리 초기의 원리 증명 실험을 개척와 문화 이미지 PSM 세포. JS는 시간 경과 영화에서 형광 강도를 측정하는 데 사용되는 피지의 원 보간 플러그인 도구를 썼다. ABW와 ACO는 원고를 썼다.

배아 발달의 과정을 통해 일어나는 세포 과정을 연구하기 위해, 생물 학자들은 일반적으로 전체 배아의 맥락에서 접근 방식을 사용합니다. 그러나, 완벽하게 하나의 세포가 발달 시간 내에 작동하는 방식을 이해하기 위해, 검사 및 격리에 각각의 세포를 교란 할 수있는 방법은 매우 유용합니다. 형질 전환 제브라 피쉬 배아를 사용하여 분산 된 PSM 세포 배양을 생성하여 우리는 이제 직접 정량적 인 방법으로 분할 시계 유전 진동의 세포 자율적 인 특성을 연구 할 수있는 도구가 있습니다. 그것은 다양한 조건 하에서 세포 수백 트립 형광 리포터에서 진동의 역학을 측정 할 수있다. 문화에서 하나의 세포의 관찰 기간은 그대로 배아에서 somitogenesis 기간보다 더 길다. 우리는 문화에 그대로 PSM 이식편도 그쪽을 제안, 그대로 배아 (데이터가 표시되지 않음)보다 느리게 진동을 나타내는 것을 관찰T 고립 된 세포에서 관찰 된 이상 기간이 분산 손상 단순히 때문이 아니다. 가변주기와 진폭은 우리 단세포 시계열의 대부분에서 관찰된다. 이 변화의 원인은 알 수 있지만, 분할 시계의 속도 결정 회로에 대한 중요한 정보를 공개해야한다. 이 방법으로 우리는 전체 태아 검사에 도전하는 유전자 세포 수준에서 분할의 구성 요소 및 주소 문제를 공부할 수 있습니다. 예를 들어, 우리의 문화에 배아에서 발견 알려진 신호 전달 분자의 제어뿐만 아니라, 우리는 강력하고 재현 분석에서 하나의 PSM 휴대 발진기에 미치는 영향을 조사 할 수 있습니다. 우리의 PSM 문화 시스템은 이러한 진동을 억제하는 요인이 무엇인지, 혼​​자, 인자, 또는 조합이 세포의 진동을 촉진 무엇의 엄격한 평가에 문을 열고, 같은 분자 사이의 상호 작용을 테스트 할 수 있습니다. 손에 이러한 도구를 사용, 우리가 목표로전체 배아에서 시험 될 수 예측을 생성하기 위해 하나의 셀에서 출판 조직 수준의 데이터뿐만 아니라, 이용 실적에 기초 somitogenesis의 기존 모델을 평가한다. 우리의 상식으로,이 단일 세포에서 형광의 급성 시간 경과 기록에 대한 최초의 제브라 피쉬의 기본 세포 배양 프로토콜입니다; 이 프로토콜의 추가 개발 및 개선을 할 수 의심의 여지가있다. 다른 프로토콜들은 종종 기자 형질 장기 촬상 27-29 사용될 수 안정된 세포주를 생성하기 위해 제브라 피쉬 배아를 사용한다. 안정적인 라인 등의 일주기 시계로 개발 타이밍에 연결되지 않은 프로세스를 이미징 유용하지만 세포가 진동, 전구 상태에 아직도있는 동안, 배아 분할의 문제는 즉시 영상을 필요로한다. 세포는 진동을 중지하면, 그들은 조직에서, 체절에​​ 통합 될 때 분화 된 세포의 운명을 가정합니다. 그것은 PO이다오른쪽 인자 또는 관내에 존재하는 요인과 우리가 크게 장기 관찰, 여러 개의 연속 교란, 또는 높은 처리량 검사를 가능하게 진동 남아있을 PSM 같은 제브라 피쉬의 세포 배양 라인을 생성 할 수 있음을 ssible. 우리는 시간 경과 이미징에 분산 된 세포의 차 문화를 준비하는이 방법은 안정 제브라 피쉬의 세포 라인을 사용하여 가까이하지 않는 개발 기간 내에 발생하는 세포 과정의 연구에 적합합니다 기대합니다. 해부를 통해 또는 FACS를 통해 하나의 해당 유전자 변형 기자 라인에서 뚜렷한 발달 단계에서 서로 다른 세포 유형의 분리는 배아 분리 한 후, 시작 세포를 제공 할 수 있습니다. 세포 배아 기원에 의해 안내 배양 조건, 몇몇 최적화가 요구 될 수있다. 형질 전환 제브라 피쉬의 빠르게 성장하는 컬렉션이 유연하고 민감한 프로토콜을 결합하여라인, 우리는 고전적인 유전 학적 방법을 보완 체외 발달 생물학의 접근을 용이하게하는 것을 희망한다.

척추 동물의 몸 축, 또는 somitogenesis 따라 세그먼트의주기적인 형성, 배아의 공간과 시간 발진기의 증거입니다. somitogenesis을 제어 애용기구는 개념적 이제 세포 내 환상 유전자 2 ​​세트의 리듬 표현에 의해 구동되는 것으로 생각 셀룰러 발진기 이루어진 &quot;시계&quot;, 형성 떨어져 틱 상기 &quot;시계 및 파면&quot;모델 1에 의해 설명된다 의 somites presomitic 중배엽 (PSM)에서. 배아 발달로, PSM의 성숙 &quot;파면&quot;는 둔화 있고 그것을 통과 세포 발진기를 체포, 후방을 향해 되돌아가는 조직과 협력하여 이동합니다. 함께,이 시공간 동적 시스템 분할 시계라고합니다. 분할 시계 범위에서 현지 커플 링 번째로 하나의 세포에있는 유전자 발진기에서 조직의 세 증가 수준을 공부하는 현재의 접근 방식에서 세포 그리고 마지막으로 집단 PSM 조직 4 위치 정보의 글로벌 규제 사이에 발생합니다. 이전 연구는 제브라 피쉬의 셀 자치 분할 발진기는 전사 억제 5-7을 통해 음의 피드백 루프를 형성하기 위해 생각됩니다 factorfamily 그녀 / HES 전사에서 유전자와 단백질 제품으로 구성하는 것이 좋습니다. 델타 / 노치 신호 전달 경로가 이웃하는 셀 사이의 진동을 동기화하고 인구의 8-10 집단 기간을 조절한다. tailbud에서 생산 FGF 신호 전달 분자는 제브라 피쉬의 PSM에 걸쳐 그라데이션을 구축하기 위해 나타나고, 이에 따라 전방 (11)에 진동 세포를 둔화 및 체포에 기여하는 가정합니다. 지금까지 somitogenesis에서 이러한 분자의 각각의 기능적인 역할은 유전자 변이, 모르 폴리 노 주입, 열 충격을 통해 표현하고 길항제 약물 세차장에 의해 조사 된시계의 구성 요소와 세포 5,7,10,12 사이의 신호의 tment. 이러한 섭동을 사용하여 분할 시계 기능은 조직 수준의 체절 결함의 설명과 HER1, her7, 델타 같은주기 유전자의 발현에 균일 한 진동의 손실에서 유추 된 C. 그러나, 거의 모든 데이터는 고정 된 배아에서하고 정확하게 분할 클록의 역동적 함수에 내재 된 변경을 캡처하지 못한다. 최근 여러 배아 시간 경과 영상은 변경된 발진기 기간이 첫 번째 돌연변이를 밝혀 왔지만, 이러한 관찰은 또한 조직 수준 7,13에서 만들어졌다. 따라서, somitogenesis 동안 가정 세포 자치 발진기의 동작은 관찰되지 않았습니다. 본질적으로, 프로세스가 진동 시스템에 의해 구동되기 때문 somitogenesis의 정적 스냅 샷은 불완전한 그림을 제공합니다. 마우스와 병아리 세포의 이전 작업은 보여 주었다 성적 수준단백질의 상승 및 하강하지만, 약 2 시간의 진동마다 30 ~ 45 분을 샘플링은 반드시 수집 된 데이터와 14, 15을 그릴 수있는, 따라서 결론을 제한합니다. 다른 생물 발진기의 연구는, 특히, 일주기 시계는 실시간 형광 및 발광 생물 기자 (16, 17)를 사용하여 모니터링 멀리 유전자 및 단백질 발현의 단계적 측정에서 이동했습니다. 이러한 도구는 하나의 셀 (18)의 시계 속성을 보여 필수적입니다. HES1주기 유전자의 발광 생물 기자 개발 간단히 하나의 마우스 PSM 셀 (19)을 특징으로하고있다. 평균주기 및 차이는 진동이 시험관 내에서 여러 사이클 지속되었음을 보여 세포의 소수에 대해 계산 하였다. 그러나, 이들 연구는 정량적으로 세포가 저절로 시작하거나 종료 진동 할 수 있는지 여부, 오실레이터 주파수 및 진폭의 안정성과 견고성을 해결하지 않았다방법 및 세포는 그들의 위상 관계를 유지한다. 또한, 세포 자치 시계의 배아에있는 신호 분자의 효과를 직접 테스트 된 것은 아닙니다. 따라서, 단일 세포 발진기의 이러한 근본적인 특성은 전혀 알려지지 남아있다. 우리는 최근에 HER1 식 (30)의 금성 (YFP) 형광 기자를 구동하기 위해 BAC의 recombineering (20)를 이용하여 형질 전환 어류 라인을 개발했습니다. 이러한 라인은 매립 및 시간적 역학 HER1의 공간적 패턴을 다시 요약되는 본래 염색체 유전자좌의 규제 신호를 악용. 이 획기적인 생체 현상 제브라 피쉬 배아에서 유전자 발현의 실시간 모니터링을 허용한다. 기본적인 세포 자율 진동의 특성과 방법 등의 표현이 시간이 지남에 따라 규제를 연구하기 위해, 우리는 최근 체외에서 PSM 세포에서 분리하여 기록 할 수있는 신뢰할 수있는 방법을 개발했다. 이 프로토COL은 우리가 하나의 셀에 제브라 피쉬 분할 시계의 진동 특성을 할 수있는 분산 된 세포 배양을 생성하기 위해 유전자 변형 기자 라인을 활용 한 방법을 설명합니다. 우리는 따라서 뛰어난 정적 또는 조직 수준 분석 접근 없었던 분야의 문제뿐만 아니라 직접 신호 분자와 억제제와 단일 세포 수준에서 세그멘테이션 시계를 조작을 해결할 수있다.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Epifluorescence microscope</td>
 <td>Olympus</td>
 <td>Model: SZX16</td>
 <td ></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Epifluorescence microscope</td>
 <td>X-cite Illumination</td>
 <td>Series: 120Q</td>
 <td ></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dissection microscope</td>
 <td>Olympus</td>
 <td>Model: SZX12</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fine forceps no. 55</td>
 <td>Fine Science Tools</td>
 <td>11295-51</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glass transfer pipettes</td>
 <td>Assistent</td>
 <td>567/2</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>35 mm plastic petri dishes</td>
 <td>Greiner</td>
 <td>627102</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>60 mm plastic petri dishes</td>
 <td>Greiner</td>
 <td>628102</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sylgard polymer</td>
 <td>SASCO</td>
 <td>266727</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Manipulation tools</td>
 <td>Made in-house</td>
 <td></td>
 <td>For description of manipulation tools Ref. 22</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Microsurgical knife</td>
 <td>World Precision Instruments</td>
 <td>500249</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>L15 medium</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>57322</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Penicillin/streptomyocin</td>
 <td>PAA</td>
 <td>P11-010</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fetal bovine serum</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>257322</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>0.05% trypsin / 0.02% EDTA</td>
 <td>PAA </td>
 <td>L11-004</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Gel loading tips</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>253188</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sigmacote</td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>254589</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Micropipette set</td>
 <td>Gilson International</td>
 <td>F167300</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Zebrafish Fibronectin1 70 kD fragment</td>
 <td>MPI-CBG protein facility</td>
 <td></td>
 <td>Generated in-house from construct based on previously published work Ref. 23-25</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glass bottom imaging dishes</td>
 <td>Mattek (single well)</td>
 <td>P35G-1.5-14-C</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glass bottom imaging dishes</td>
 <td>Greiner (CellView -multi-well)</td>
 <td>262502</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>E3 medium without methylene blue</td>
 <td>Made in-house</td>
 <td></td>
 <td>From The Zebrafish Book, 5th Ed. Ref. 26 </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Plastic transfer pipettes</td>
 <td>Ratiolab</td>
 <td>260011</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Warner heating/cooling chamber</td>
 <td>Warner Instruments</td>
 <td>TC-324B/344B</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EM-CCD camera</td>
 <td>Andor</td>
 <td>Model: iXOn 888</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Wide-field fluorescence microscope with Venus filter set</td>
 <td>Zeiss</td>
 <td>Model: Axiovert 200M</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Wide-field fluorescence microscope with Venus filter set</td>
 <td></td>
 <td>NeoFluor 40x, NA 0.75</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Wide-field fluorescence microscope with Venus filter set</td>
 <td>Lumencor Light Engine</td>
 <td>Model: Spectra X</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Wide-field fluorescence microscope with Venus filter set</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Wide-field fluorescence microscope with Venus filter set</td>
 <td>BrightLine HC 575/15</td>
 <td>F39-575</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

generation of dispersed presomitic mesoderm cell cultures for imaging of the zebrafish segmentation clock in single cells

분할은 척추 동물의주기 순차적 형태 발생 과정이다. 몸의 축을 따라 somites라는 조직의 블록이 리듬 형성은 배아를 패터닝 유전 발진기의 증거입니다. 제브라 피쉬에서, 세포 내 시계 구동 조각은 음의 피드백 루프로 구성 그녀 / 신은 전사 인자 가족의 구성원으로 구성되어 있습니다. 우리는 최근 presomitic 중배엽 (PSM)의 진동의 시공간적 패턴을 요점을 되풀이주기 유전자 HER1에 대한 형질 전환 형광 기자 라인을 생성했다. 이러한 라인을 사용하여, 우리는 하나의 절연 PSM 세포 내에 분할 클록 진동의 실시간 분석을 허용 시험 관내 배양 시스템을 개발 하였다. 유전자 변형 배아에서 PSM 조직을 제거하고 유리 바닥 요리에 영역을 진동 세포를 분산함으로써, 우리는 형광 신호의 시간 경과 이미징에 적합한 문화를 생성각각의 시계 세포. 이 방법은 세포 자치와 조직 수준의 속성을 구분하고 해부 할 수 있도록 전례없는 단일 셀 해상도로 분할 시계의 직접 조작에 대한 실험과 개념적 프레임 워크를 제공합니다.

이 프로토콜은 형광 신호의 시간 경과 영상 (그림 2)을 위해 실행 가능한, 분산, 하나의 PSM 세포의 문화를 생산하고 있습니다. 우리의 유전자는 그 사이클 생산 및 분해 시간 반 정도의 배아에서 내인성 유전자와 단백질과 유사한 역학 발생하는 기자를 생성합니다. 그것의 빠른 회전율로, 하나의 세포에서 YFP 신호는 표백을 최소화하기 위해 신속하게 감지하고 각각의 진동주기의 기능을 캡처하는 높은 시간 해상도를해야합니다. 또한, 신호의 상대적 어스레 제공, 문화 및 인수 조건은 신중하게 민감하고 강력한 결과를 보장하기 위해 조정되었다. . 유리 바닥 문화 요리 코팅에 사용되는 1 ECM 기판 : 우리는 이미징을위한 최적의 PSM 세포 배양을 생성에 중요한 것은 다음과 같은 요소를 발견했습니다. 2. 해부 및 영상 매체에 혈청의 추가. 상대 HETE 후 촬영 확인 된 배아에서 PSM의 3. 해부누구의 자손 잠재적으로 유전자의 두 사본을 가지고 rozygous 쌍. 형광 신호의 효율적인 캡쳐를 보장하기 위해 높은 NA 대물 렌즈를 사용하여 최적의 배율 범위 내의 4. 이미지 수집. 5. 배경 잡음에 기여할 수있는 강도 변동을 최소화하기 위해 고체 광원과 조명. 6. 고감도 EM-CCD 카메라와 신호 검출 신호 판독을 극대화 할 수 있습니다. 차선의 문화는 기록을 통해 둥근과 건강을 유지하지 않는 세포를 포함합니다. 우리는 우리의 ECM 기판, 제브라 피쉬 fibronectin1의 조각이 폴리 라이신 또는 라미닌과 같은 다른 일반적으로 사용되는 기판에 비해, 미분화 PSM 같은 상태로 세포를 유지한다는 가설을 세웠다. 우리가 다른 기판은 테스트 셀 기록의 과정을 통해 유리와 형광 발진 신호의 손실에 평탄화시킨다. 우리는 또한 발견 해부 동안 혈청 배지에 첨가, 분산,녹화뿐만 아니라 분리에 사용되는 트립신을 해소하는 것이 중요했다, 또한 성능이 향상된 세포 생존 가능성이 배경 위에 형광 강도를 증가. 하나의 세포에서 최적의 신호 캡처를 보장하기 위해 우리는 높은 NA와 특히 형광 이미징 (혈구 계획 NeoFluor 시리즈)를 위해 디자인 된 40 배 목표를 사용했습니다. 우리는 또한 고체 광원 잡음이 이미지에 기여 배경 변동을 최소화하는 것이 중요합니다 기존의 수은 램프,보다 안정적인 조명을 한 것으로 나타났습니다. 이러한 수정은 강력한 결과를 보장하는 것이 중요합니다. 이 프로토콜을 이용하여 우리가 예상 관련 분야에서 다수의 셀을 기록하는 동안 어느 시점에서 형광성되는 배양. 우리는 형광 세포는 일반적으로 녹음하는 동안 때로는 매우 운동성이 둥근 남아있는 것을 발견. 형광 세포를 포함하여 몇 가지 세포는, 촬영시 세포 사멸 될 수 있습니다. 이 세포는 어떤에서 제외됩니다(분석). 우리는 또한 다른 세포와 접촉 세포를 제외하거나 시야 밖에서 이동합니다. 투과광 채널에서 건강한 세포의 수를 계수함으로써 측정 평균적으로, 우리는 10 시간의 기록에 의한 단부 필드 당 세포 수의 12 % 감소를 참조. 이 손실은 세포의 죽음과 필드 밖으로 이동 한 세포가 모두 포함됩니다. 이러한주의 사항을 감안할 때 우리는 평균적으로 일반적으로 트랙 5 형광 실행 가능하고 그대로 표시 필드 당 세포 및이 조건에 6 필드를 기록 할 수 있습니다. 예를 들어, 4 조건 실험은 총 24 개 분야는 일반적으로 조건 당 30 추적 세포를 취득해야합니다. 10 % 소 태아 혈청을 함유 L15 배지로 표준 촬상 조건 하에서, 우리는 PSM 세포 (4 실험적 반복 실험에서 N = 101 세포) 3 ± 1 피크 (2의 평균 및 표준 편차와 함께, 2 및 7 피크 사이 생산할 수있는 것을 발견 -3 회). 중간 피크 개수뿐만 아니라, 25 % 백분위,이 피크와 75 %의 백분위 I이다3 피크에요. 우리 반자동 추적 및 분석을 사용하여, 우리는 신속도 2c에 도시 된 대표적인 셀 추적과 함께, PSM 개별 셀에 대한 시간 트레이스 위에 형광 강도를 생성 할 수있다. 이러한 것의 트레이스는 그런 주파수, 진폭,주기 수, 및 피크의 타이밍으로서 진동 PSM 세포의 성질의 정량적 측정을 위해 사용될 수있다. <img alt="그림 1" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50307/50307fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50307/50307fig1.jpg" /> ~ 5 체절 단계에서 YFP의 형광을 발현하는 형질 전환 제브라 피쉬 배아의 자신의 해부의 형질 전환 배아 및 회로도 그림 1. 확인. (A) 측면보기. 이미지가 전송 빛과 형광 채널의 오버레이입니다. 화살표는 L 향해 PSM 걸쳐 tailbud의 끝에서 시작하는 신호의 부분을 나타낸다<html> AST 체절을 형성했다. 삽입은 개발 및 생체 내 행동에 대한 자세한 내용은 Soroldoni 등. 30을 참조하십시오. 첫 해부하는 동안 절단하기 전에 배아의 측면보기의 (B) 도식. 빨간 점선 라인은 첫 번째 컷을 나타냅니다 (리포터 유전자의 개략도를 보여줍니다 다만 tailbud 노른자 과립과의 전후방 축을 따라 중심의 표피 층의 제거 다음 평평 PSM의. (C) 개략도 뒤에 노른자 셀. 빨간 점선 라인은 팁을 제거하는 두 번째 컷을 표시하지만, 후뇌에 걸쳐 만든 분산과 문화에 대한 tailbud의. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50307/50307fig1highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 07fig2.jpg &quot;/&gt; 그림 2. 분산 PSM 문화에서 하나의 세포에서 대표 이미지와 흔적. (A) 몽타주의 6 시간 시간 경과 기록에서 하나의 PSM 셀의 빛 이미지를 전송. 셀이 기록의 과정에 걸쳐 둥근 건강한 유지됩니다. (B) 하나의 PSM 세포에서 형광 이미지의 몽타주 대응. 셀의 강도 피크 기록의 과정을 통해 번호가 매겨집니다.이 셀에 배치 된 투자 수익 (ROI)에서 측정 한 시간에 (C) 평균 강도. 값은 피지로 작성 원 보간 플러그인 및 사용자 지정 매크로를 사용하여 2 분마다 하나의 프레임 속도로 영화의 모든 프레임에서 가져옵니다. 강도의 피크가 다시 추적을 통해 번호가 매겨집니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50307/50307fig2highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Generation of Dispersed Presomitic Mesoderm Cell Cultures for Imaging of the Zebrafish Segmentation Clock in Single Cells

Somitogenesis는 리듬 발달 과정입니다 공간적 패턴 척추 동물의 태아의 몸 축. 이전에, 우리는이 과정을 드라이브주기 유전자를 관찰하는 형광 기자를 사용하여 형질 전환 제브라 피쉬 라인을 개발했다. 여기, 우리의 문화는 체외에서 시간이 지남에 따라이 라인 및 이미지 자신의 진동을 세포를 분산.

단일 세포의 Zebrafish의 분할 시계의 이미징을위한 분산 Presomitic 중배엽 세포 배양의 생성

Segmentation is a  periodic and sequential morphogenetic process in vertebrates. This rhythmic  formation of blocks of tissue called somites along the ...

generation-dispersed-presomitic-mesoderm-cell-cultures-for-imaging

Research

JoVE Journal

Biology

13.6K 조회수.  Max Planck Institute of Molecular Cell Biology and Genetics.  Somitogenesis는 리듬 발달 과정입니다 공간적 패턴 척추 동물의 태아의 몸 축. 이전에, 우리는이 과정을 드라이브주기 유전자를 관찰하는 형광 기자를 사용하여 형질 전환 제브라 피쉬 라인을 개발했다. 여기, 우리의 문화는 체외에서 시간이 지남에 따라이 라인 및 이미지 자신의 진동을 세포를 분산. 

비디오: Generation of Dispersed Presomitic Mesoderm Cell Cultures for Imaging of the Zebrafish Segmentation Clock in Single Cells

Single Cell Fate Mapping in Zebrafish

The ability to differentially label single cells has important implications in developmental biology. For instance, determining how hematopoietic, lymphatic, and blood vessel lineages arise in developing embryos requires fate mapping and lineage tracing of undifferentiated precursor cells. Recently, photoactivatable proteins which include: Eos1, 2, PAmCherry3, Kaede4-7, pKindling8, and KikGR9, 10 have received wide interest as cell tracing probes. The fluorescence spectrum of these photosensitive proteins can be easily converted with UV excitation, allowing a population of cells to be distinguished from adjacent ones. However, the photoefficiency of the activated protein may limit long-term cell tracking11. As an alternative to photoactivatable proteins, caged fluorescein-dextran has been widely used in embryo model systems7, 12-14. Traditionally, to uncage fluorescein-dextran, UV excitation from a fluorescence lamp house or a single photon UV laser has been used; however, such sources limit the spatial resolution of photoactivation. Here we report a protocol to fate map, lineage trace, and detect single labeled cells. Single cells in embryos injected with caged fluorescein-dextran are photoactivated with near-infrared laser pulses produced from a titanium sapphire femtosecond laser. This laser is customary in all two-photon confocal microscopes such as the LSM 510 META NLO microscope used in this paper. Since biological tissue is transparent to near-infrared irradiation15, the laser pulses can be focused deep within the embryo without uncaging cells above or below the selected focal plane. Therefore, non-linear two-photon absorption is induced only at the geometric focus to uncage fluorescein-dextran in a single cell. To detect the cell containing uncaged fluorescein-dextran, we describe a simple immunohistochemistry protocol16 to rapidly visualize the activated cell. The activation and detection protocol presented in this paper is versatile and can be applied to any model system. 
Note: The reagents used in this protocol can be found in the table appended at the end of the article.

A method is described to photoactivate single cells containing a caged fluorescent protein using two-photon absorption from a Ti:Sapphire femtosecond laser oscillator. To fate map the photoactivated cell, immunohistochemistry is used. This technique can be applied to any cell type.

Zebrafish의 단세포 운명 매핑

The ability to differentially label single cells has important implications in developmental biology. For instance, determining how hematopoietic, ...

연구

생물학

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal neurons. In contrast, the adult zebrafish retina possesses the robust ability to spontaneously regenerate any neuronal class that is lost in a variety of different retinal damage models, including retinal puncture, chemical ablation, concentrated high temperature, and intense light treatment 1-8. Our lab extensively characterized regeneration of photoreceptors following constant intense light treatment and inner retinal neurons after intravitreal ouabain injection 2, 5, 9. In all cases, resident M&uuml;ller glia re-enter the cell cycle to produce neuronal progenitors, which continue to proliferate and migrate to the proper retinal layer, where they differentiate into the deficient neurons. 
	We characterized five different stages during regeneration of the light-damaged retina that were highlighted by specific cellular responses. We identified several differentially expressed genes at each stage of retinal regeneration by mRNA microarray analysis 10. Many of these genes are also critical for ocular development. To test the role of each candidate gene/protein during retinal regeneration, we needed to develop a method to conditionally limit the expression of a candidate protein only at times during regeneration of the adult retina. 
	Morpholino oligos are widely used to study loss of function of specific proteins during the development of zebrafish, Xenopus, chick, mouse, and tumors in human xenografts 11-14. These modified oligos basepair with complementary RNA sequence to either block the splicing or translation of the target RNA. Morpholinos are stable in the cell and can eliminate or "knockdown" protein expression for three to five days 12. 
	Here, we describe a method to efficiently knockdown target protein expression in the adult zebrafish retina. This method employs lissamine-tagged antisense morpholinos that are injected into the vitreous of the adult zebrafish eye. Using electrode forceps, the morpholino is then electroporated into all the cell types of the dorsal and central retina. Lissamine provides the charge on the morpholino for electroporation and can be visualized to assess the presence of the morpholino in the retinal cells. 
	Conditional knockdown in the retina can be used to examine the role of specific proteins at different times during regeneration. Additionally, this approach can be used to study the role of specific proteins in the undamaged retina, in such processes as visual transduction and visual processing in second order neurons.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

A method to conditionally knockdown a target protein&#x2019;s expression in the adult zebrafish retina is described, which involves intravitreally injecting antisense morpholinos and electroporating them into the retina. The resulting protein is knocked down for several days, which allows testing the protein&#x2019;s role in the regenerating or intact retina.

Morpholinos의 생체내의 Electroporation에서 성인 Zebrafish의 망막에

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration of adult tissues, such as the heart1, retina2, spinal cord3, optic nerve4, sensory hair cells5, and fins6.
The zebrafish fin is a relatively simple appendage that is easily manipulated to study multiple stages in epimorphic regeneration. Classically, fin regeneration was characterized by three distinct stages: wound healing, blastema formation, and fin outgrowth. After amputating part of the fin, the surrounding epithelium proliferates and migrates over the wound. At 33 &deg;C, this process occurs within six hours post-amputation (hpa, Figure 1B)6,7. Next, underlying cells from different lineages (ex. bone, blood, glia, fibroblast) re-enter the cell cycle to form a proliferative blastema, while the overlying epidermis continues to proliferate (Figure 1D)8. Outgrowth occurs as cells proximal to the blastema re-differentiate into their respective lineages to form new tissue (Figure 1E)8. Depending on the level of the amputation, full regeneration is completed in a week to a month.
The expression of a large number of gene families, including wnt, hox, fgf, msx, retinoic acid, shh, notch, bmp, and activin-betaA genes, is up-regulated during specific stages of fin regeneration9-16. However, the roles of these genes and their encoded proteins during regeneration have been difficult to assess, unless a specific inhibitor for the protein exists13, a temperature-sensitive mutant exists or a transgenic animal (either overexpressing the wild-type protein or a dominant-negative protein) was generated7,12. We developed a reverse genetic technique to quickly and easily test the function of any gene during fin regeneration.
Morpholino oligonucleotides are widely used to study loss of specific proteins during zebrafish, Xenopus, chick, and mouse development17-19. Morpholinos basepair with a complementary RNA sequence to either block pre-mRNA splicing or mRNA translation. We describe a method to efficiently introduce fluorescein-tagged antisense morpholinos into regenerating zebrafish fins to knockdown expression of the target protein. The morpholino is micro-injected into each blastema of the regenerating zebrafish tail fin and electroporated into the surrounding cells. Fluorescein provides the charge to electroporate the morpholino and to visualize the morpholino in the fin tissue.
This protocol permits conditional protein knockdown to examine the role of specific proteins during regenerative fin outgrowth. In the Discussion, we describe how this approach can be adapted to study the role of specific proteins during wound healing or blastema formation, as well as a potential marker of cell migration during blastema formation.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

We describe a method to conditionally knockdown the expression of a target protein during adult zebrafish fin regeneration. This technique involves micro-injecting and electroporating antisense oligonucleotide morpholinos into fin tissue, which allows testing the protein&#x2019;s role in various stages of fin regeneration, including wound healing, blastema formation, and regenerative outgrowth.

생성중 성인 Zebrafish 테일 핀으로 Morpholinos의 생체내 Electroporation에

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also produce a source of patient-matched cells for regenerative therapies. iPSCs may be generated using multiple protocols and derived from multiple cell sources. Once generated, iPSCs are tested using a variety of assays including immunostaining for pluripotency markers, generation of three germ layers in embryoid bodies and teratomas, comparisons of gene expression with embryonic stem cells (ESCs) and production of chimeric mice with or without germline contribution2. Importantly, iPSC lines that pass these tests still vary in their capacity to produce different differentiated cell types2. This has made it difficult to establish which iPSC derivation protocols, donor cell sources or selection methods are most useful for different applications.
The most stringent test of whether a stem cell line has sufficient developmental potential to generate all tissues required for survival of an organism (termed full pluripotency) is tetraploid embryo complementation (TEC)3-5. Technically, TEC involves electrofusion of two-cell embryos to generate tetraploid (4n) one-cell embryos that can be cultured in vitro to the blastocyst stage6. Diploid (2n) pluripotent stem cells (e.g. ESCs or iPSCs) are then injected into the blastocoel cavity of the tetraploid blastocyst and transferred to a recipient female for gestation (see Figure 1). The tetraploid component of the complemented embryo contributes almost exclusively to the extraembryonic tissues (placenta, yolk sac), whereas the diploid cells constitute the embryo proper, resulting in a fetus derived entirely from the injected stem cell line.
Recently, we reported the derivation of iPSC lines that reproducibly generate adult mice via TEC1. These iPSC lines give rise to viable pups with efficiencies of 5-13%, which is comparable to ESCs3,4,7 and higher than that reported for most other iPSC lines8-12. These reports show that direct reprogramming can produce fully pluripotent iPSCs that match ESCs in their developmental potential and efficiency of generating pups in TEC tests. At present, it is not clear what distinguishes between fully pluripotent iPSCs and less potent lines13-15. Nor is it clear which reprogramming methods will produce these lines with the highest efficiency. Here we describe one method that produces fully pluripotent iPSCs and "all- iPSC" mice, which may be helpful for investigators wishing to compare the pluripotency of iPSC lines or establish the equivalence of different reprogramming methods.

Generating induced pluripotent stem cell (iPSC) lines produces lines of differing developmental potential even when they pass standard tests for pluripotency. Here we describe a protocol to produce mice derived entirely from iPSCs, which defines the iPSC lines as possessing full pluripotency1.

유도 만능의 줄기 세포에서 파생 마우스의 생성

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Monitoring Cell-autonomous Circadian Clock Rhythms of Gene Expression Using Luciferase Bioluminescence Reporters

In mammals, many aspects of behavior and physiology such as sleep-wake cycles and liver metabolism are regulated by endogenous circadian clocks (reviewed1,2). The circadian time-keeping system is a hierarchical multi-oscillator network, with the central clock located in the suprachiasmatic nucleus (SCN) synchronizing and coordinating extra-SCN and peripheral clocks elsewhere1,2. Individual cells are the functional units for generation and maintenance of circadian rhythms3,4, and these oscillators of different tissue types in the organism share a remarkably similar biochemical negative feedback mechanism. However, due to interactions at the neuronal network level in the SCN and through rhythmic, systemic cues at the organismal level, circadian rhythms at the organismal level are not necessarily cell-autonomous5-7. Compared to traditional studies of locomotor activity in vivo and SCN explants ex vivo, cell-based in vitro assays allow for discovery of cell-autonomous circadian defects5,8. Strategically, cell-based models are more experimentally tractable for phenotypic characterization and rapid discovery of basic clock mechanisms5,8-13.
Because circadian rhythms are dynamic, longitudinal measurements with high temporal resolution are needed to assess clock function. In recent years, real-time bioluminescence recording using firefly luciferase as a reporter has become a common technique for studying circadian rhythms in mammals14,15, as it allows for examination of the persistence and dynamics of molecular rhythms. To monitor cell-autonomous circadian rhythms of gene expression, luciferase reporters can be introduced into cells via transient transfection13,16,17 or stable transduction5,10,18,19. Here we describe a stable transduction protocol using lentivirus-mediated gene delivery. The lentiviral vector system is superior to traditional methods such as transient transfection and germline transmission because of its efficiency and versatility: it permits efficient delivery and stable integration into the host genome of both dividing and non-dividing cells20. Once a reporter cell line is established, the dynamics of clock function can be examined through bioluminescence recording. We first describe the generation of P(Per2)-dLuc reporter lines, and then present data from this and other circadian reporters. In these assays, 3T3 mouse fibroblasts and U2OS human osteosarcoma cells are used as cellular models. We also discuss various ways of using these clock models in circadian studies. Methods described here can be applied to a great variety of cell types to study the cellular and molecular basis of circadian clocks, and may prove useful in tackling problems in other biological systems.

Circadian clocks function within individual cells, i.e., they are cell-autonomous. Here, we describe methods for generating cell-autonomous clock models using non-invasive, luciferase-based real-time bioluminescence technology. Reporter cells provide tractable, functional model systems for studying circadian biology.

루시 페라 제 Bioluminescence 기자를 사용하여 유전자 발현의 셀 자치 Circadian 시계 리듬을 모니터링

In mammals, many aspects of behavior and physiology such as sleep-wake cycles and liver metabolism are regulated by endogenous circadian clocks ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

사멸 세포 간극의 이미지를하는 동안 라이브<em&gt; 초파리</em&gt; 배아

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs include modeling pathogenesis of human genetic diseases, autologous cell therapy after gene correction, and personalized drug screening by providing a source of patient-specific and symptom relevant cells. However, there are several hurdles to overcome, such as eliminating the remaining reprogramming factor transgene expression after human iPSCs production. More importantly, residual transgene expression in undifferentiated human iPSCs could hamper proper differentiations and misguide the interpretation of disease-relevant in vitro phenotypes. With this reason, integration-free and/or transgene-free human iPSCs have been developed using several methods, such as adenovirus, the piggyBac system, minicircle vector, episomal vectors, direct protein delivery and synthesized mRNA. However, efficiency of reprogramming using integration-free methods is quite low in most cases.
Here, we present a method to isolate human iPSCs by using Sendai-virus (RNA virus) based reprogramming system. This reprogramming method shows consistent results and high efficiency in cost-effective manner.

Here, we present our established method to reprogram human somatic cells into transgene-free human iPSCs with Sendai virus, which shows consistent outcome and enhanced efficiency.

센다이 바이러스와 인간의 체세포의 효율적인 생성 인간 유도 만능 줄기 세포

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid decline in renal function and development of the clinical syndrome known as acute kidney injury (AKI). Pharmacological agents used to treat medical circumstances ranging from bacterial infection to cancer, when administered individually or in combination with other drugs, can initiate AKI. Zebrafish are a useful animal model to study the chemical effects on renal function in vivo, as they form an embryonic kidney comprised of nephron functional units that are conserved with higher vertebrates, including humans. Further, zebrafish can be utilized to perform genetic and chemical screens, which provide opportunities to elucidate the cellular and molecular facets of AKI and develop therapeutic strategies such as the identification of nephroprotective molecules. Here, we demonstrate how microinjection into the zebrafish embryo can be utilized as a paradigm for nephrotoxin studies.

Renal injuries incurred from nephrotoxins, which include drugs ranging from antibiotics to chemotherapeutics, can result in complex disorders whose pathogenesis remains incompletely understood. This protocol demonstrates how zebrafish can be used for disease modeling of these conditions, which can be applied to the identification of renoprotective measures.

Zebrafish의에서 콩팥 세포 독소 미세 주입은 급성 신장 손상을 모델링하기

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

Analysis of Beta-cell Function Using Single-cell Resolution Calcium Imaging in Zebrafish Islets

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to hyperglycemia and severe, life-threatening consequences. Understanding how the beta-cells operate under physiological conditions and what genetic and environmental factors might cause their dysfunction could lead to better treatment options for diabetic patients. The ability to measure calcium levels in beta-cells serves as an important indicator of beta-cell function, as the influx of calcium ions triggers insulin release. Here we describe a protocol for monitoring the glucose-stimulated calcium influx in zebrafish beta-cells by using GCaMP6s, a genetically encoded sensor of calcium. The method allows monitoring the intracellular calcium dynamics with single-cell resolution in ex vivo mounted islets. The glucose-responsiveness of beta-cells within the same islet can be captured simultaneously under different glucose concentrations, which suggests the presence of functional heterogeneity among zebrafish beta-cells. Furthermore, the technique provides high temporal and spatial resolution, which reveals the oscillatory nature of the calcium influx upon glucose stimulation. Our approach opens the doors to use the zebrafish as a model to investigate the contribution of genetic and environmental factors to beta-cell function and dysfunction.

Beta-cell functionality is important for blood-glucose homeostasis, which is evaluated at single-cell resolution using a genetically encoded reporter for calcium influx.

Zebrafish 독도에서 단일 셀 해상도 칼슘 이미징 사용 하 여 베타 세포 기능 분석

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to ...

Probing mRNA Kinetics in Space and Time in Escherichia coli using Two-Color Single-Molecule Fluorescence In Situ Hybridization

Single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) allows for counting the absolute number of mRNAs in individual cells. Here, we describe an application of smFISH to measure the rates of transcription and mRNA degradation in Escherichia coli. As smFISH is based on fixed cells, we perform smFISH at multiple time points during a time-course experiment, i.e., when cells are undergoing synchronized changes upon induction or repression of gene expression. At each time point, sub-regions of an mRNA are spectrally distinguished to probe transcription elongation and premature termination. The outcome of this protocol also allows for analyzing intracellular localization of mRNAs and heterogeneity in mRNA copy numbers among cells. Using this protocol many samples (~50) can be processed within 8 h, like the amount of time needed for just a few samples. We discuss how to apply this protocol to study the transcription and degradation kinetics of different mRNAs in bacterial cells.

Probing mRNA Kinetics in Space and Time in Escherichia coli using Two-Color Single-Molecule Fluorescence In Situ Hybridization

This protocol describes an application of single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) to measure the in vivo kinetics of mRNA synthesis and degradation.

시투 혼성화에서 2색 단일 분자 형광을 사용하여 에샤리치아 대장균의 공간과 시간에서 mRNA 운동학을 프로빙

Single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) allows for counting the absolute number of mRNAs in individual cells. Here, we describe an ...