우리는 도움이 토론에 대한 기술 지원 및 Gerasimos P. Sykiotis를 들어, 플라이 주식에 대한 크리스틴 머스을 레오 Pallanck 감사합니다. 이 작품은 MCB에 NIH 연수 부여 T32CA009363에 의해 투자되었다

1. 놀람에 의한 부정 Geotaxis의 분석 <ol><li> 원하는 유전자형의 파리를 선택, 그들을 20-30의 동물 동료의 그룹 무작위, 성별로 구분하고 2-3 일마다 새로운 음식 유리 병에 그들을 플립, 시험 비행의 각 집합 (즉, 연령 일치 동료, 하나의 집단 / 유전자형) 일주일에 한 번 이상. </li><li> 부정적인 geotaxis 테스트하기 전에 삼십 분, CO 2와 함께 파리를 마취와 두 개의 빈 음식 유리 병 (재료 표 참조) (실 치수 투명 테이프로 자신의 구멍에 결합하여 만든 사전 - 라벨 투명 플라스틱 튜브에 배치 : 19cm X 2.85 cm). 우리의 분석에서 우리는 일반적으로 25 파리 / 튜브를 사용합니다. 참고. 마취에서 회복 시간이 몇 시간 몇 분에서 변경 될 수 있습니다 (예 : O / N) 및 테스트 특정 유전자형에 최적화되어야한다. </li><li> 수직 계면에 압지 테이프 종이에 서로 다른 높이를 (1 - 20에서 cm) 표시전자, 벤치 수직. </li><li> 종이의 앞에 튜브를 넣 관은 모든 정렬되어야하고 정확한 높이 측정을 할 수 있도록 용지에 가능한 닫아야합니다. </li><li> 대 (피펫 팁 상자 등)에 종이 20-30cm의 거리에서, 관 앞에 디지털 카메라 ( &quot;특수 장비&quot;표 참조) 배치 &quot;영화&quot;옵션을 선택하고 시작 기록;이 시점에서 당신은 또한 연속적인 시험 사이의 시간을 추적하기 위해 타이머를 시작합니다. </li><li> 파리가 몇 초 (예 : 10 초)의 튜브를 눌러 튜브의 바닥에서 수집 할 수 있습니다. 이 단계는 전체 실험을하는 동안 (즉, 같은 기간, 같은 힘, 같은 연산자) 지속적으로 수행해야합니다. </li><li> 10 초 동안 디지털 카메라로 녹화 파리 &#39;운동. </li><li> 한 분 간격으로 단계 1.5-1.7 열네 번 반복합니다. </li><li> 데이터 분석 : <ol type="a"><li> 위에있는 파리의 수를 계산기록 영화의 육안 검사로 10 초 후에 2 센티미터 마크입니다. 참고 : 우리의 분석 조건에서 비행 &#39;부정적인 geotaxis 동작이 깜짝 놀라게 한 후 마지막으로 처음 10 초 이상하지 않은 (즉 파리는 그 놀라운 후 모든 방향으로 10 초를 움직이기 시작). 최소 거리는 2cm가이 시간 창에서 제어 파리 (THGal4 드라이버를 표현 즉, 1 주 이전 파리, 그림 1의 전설 참조) 올랐다. 따라서, 우리는 다양한 연령과 행동을 개시 한 후 유전자형 10 초를의 파리의 등반 활동을 분석하기위한 참고 자료로 2cm 마크를 사용했습니다. 이러한 매개 변수는 (다른 유전 적 배경 또는 실험실 조건 예 때문에) 테스트 파리의 동작의 차이점을 설명하기 위해 조정이 필요할 수 있습니다. 우리의 분석 조건에서, 모든 유전자형이 테스트는 컨트롤 유전자형의 파리 유사 더 수행 또는 알 수 있습니다. </li><li> 열 다섯의 결과의 평균을시험. </li><li> 튜브 (= % 등반 활동)에서 파리의 총 수의 백분율로 표현 평균적으로, 반복 수 (N) 각 유전자형 테스트를 독립적 인 동료의 숫자로 주어진다 </li><li> 시간이 지남에 따라 서로 다른 유전자형 사이의 통계적 유의성을 평가합니다. 이것은, 학생의 t 시험 (두 개의 유전자형을 비교하는 경우) 또는 GraphPad (GraphPad 소프트웨어, Inc.La 졸라 같은 상용 소프트웨어를 사용하여 Bonferroni 사후 검사 (다중 비교를 수행 할 때) 다음 2 방향 ANOVA 분석을 수행 할 수 있습니다 CA, USA). </li></ol></li></ol> 주의 우리는 RT에서와 동일한 조명 조건 하에서, 동일한 시간에 모든 분석을 수행 할 수 있습니다. 12 시간 / 다크 라이트 사이클 환경에서 파리를 유지 파리 &#39;전위의 행동에 circadian 리듬의 효과를 통제하는 것이 좋습니다. 2. 티로신 수산화 효소의 면역 형광전체 뇌 마운트의 분석 솔루션 및 버퍼 정착액 솔루션 : 인산 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)는 (PBS) 완충 식염수 버퍼 세척 : PBS의 0.1 %를 트리톤 X-100 0.1 M 트리스 - 염산, 산도 7.5, 0.15 M NaCl을 0.1 % 트리톤 X-100와 0.5 % BSA : 버퍼를 차단 설치 미디어 : Mowiol-DABCO (할로 E, 레인 디, 항체 - 실험실 설명서, 콜드 스프링 하버 연구소 출판부, 콜드 스프링 하버, 뉴욕, 미국, 10:418 (1988에 설명 된 프로토콜) 참조) 순서 <ol><li> 표피 왁스를 제거하기 위해 약 1 분간 70 % 에탄올로 가득 해부 접시에 파리를 넣습니다. </li><li> 전송 얼음처럼 차가운 PBS로 가득 또 다른 해부 접시에 날아간다. </li><li> 뇌를 해부 : <ol type="a"><li> 복부 측면까지 (: 제거 날개와 다리 옵션)와 함께 파리를 놓습니다. </li><li> 몸에서 떨어져 머리를 당겨 : 하나를 사용하는 집게의 집합뇌의 손상을 방지하기 위해 눈 아래 표피에 유지하기 위해 신체 다른 하나 만요 </li><li> 코를 제거합니다. </li><li> 코를 제거한 후 열려있는 왼쪽 슬릿의 반대편에 머리 표피에 보유하고 두뇌가 머리 캡슐에서 제거 될 때까지 반대 방향으로 잡아 당깁니다. </li><li> 뇌에서 모든 표피를 제거합니다. </li><li> 모든 공기 채워진 기관 조직을 제거, 이것은 다음의 부화 단계에서 부동의 두뇌를 방지 할 수 있습니다. </li></ol></li><li> P-200 피펫 팁의 끝 떨어져 몇 mm를 잘라 0.1 % 트리톤 X-100/PBS 용액으로 평형 </li><li> 제조 된 P-200 피펫 팁 사용 4 % PFA / PBS의 0.5 ML로 가득 0.5 ML 에펜 도르프 튜브에 두뇌를 전송하고 절개가 완료 될 때까지 얼음에 보관하십시오. </li><li> 20 분 동안 RT에서 머리를 고정 : 랙 에펜 도르프 튜브를 넣고 nutator에 선반을 배치하여 부드러운 회전을 적용합니다. </li><li> 정착액을 제거P-1000 마이크로 피펫을 사용하여, 0.1 % 트리톤 X-100/PBS 0.5 mL를 반전하여 혼합을 추가하고 1 분 동안 품어 보자, 한번만 세척 단계를 반복합니다. </li><li> 두 번째 세척에서 버퍼를 제거하고, 0.1 % 트리톤 X-100/PBS의 0.5 ML를 추가하고 20 분 동안 RT에서 부화하자,이 단계를 두 번 반복합니다. </li><li> 세척 버퍼를 제거하고 두뇌 RT에서 1 시간 동안 (0.1 M 트리스 - 염산, 산도 7.5, 0.15 M NaCl을 0.1 % 트리톤 X-100와 0.5 % BSA) 차단 버퍼에 품어 보자. </li><li> 4 두 가지 일 ° C, 부드러운 회전 (단계 2.6. 참조), 차단 솔루션 안티 TH 항체의 1:100 희석 ( &quot;특정 시약의 표&quot;참조) 두뇌를 품어. </li><li> 단계 2.7을 세척 반복합니다. 2.8 .. </li><li> 부드러운 회전, 4 ° C에서 이틀 동안, 차 antibodyin 차단 솔루션의 1:200 희석 두뇌 평형. </li><li> 단계 2.7을 세척 반복합니다. 2.8 .. </li><li> 그림 2a에 도시 된 바와 같이 장착 슬라이드를 준비 <ol type="a"><li>체크인 yyyy 2 커버 유리 (24 X 60mm, 아니. 1.5)의 설치 미디어의 X 25 μL 상품 가격이 할인되었습니다. </li><li> 장소에 설치 매체 슬라이드의 중간에 간격을두고 건조하게 두 개의 덮개 유리 (크기 18 X 18mm, 아니. 2). </li></ol> 참고.의 공 초점 현미경의 무대에 샘플 홀더를 확인합니다. 당신은 끝 하나 (매니큐어와 테이프 사용)에 22 X 22mm 1.5 커버 유리를 부착하여 커버 유리에게 25 X 75mm 슬라이드의 같은 크기를 만들 수 있습니다. </li><li> 세척 버퍼를 제거, 설치 미디어의 50 μl를 추가하고 두뇌가 위아래로 pipetting에 의해 그것과 평형 할 수 있습니다. </li><li> 컷 P-200 피펫 팁 (단계 2.4 참조) 두 coverslips를 사이의 공간에서 슬라이드에 두뇌를 전송하고 아무 coverslip에 그들을 커버를 사용. 1.5 (그림 2A 참조; 방향에 슬라이드 두뇌 7 참조). 참고 : 시료는 전방과 포스 모두 시각화 할 수 있도록 두 개의 덮개 유리 사이에 장착되어뇌의 rior 쪽. </li><li> 모든 공기를 제거 한 구석에서 피펫; 설치 미디어 커버 유리 사이의 전체 공간을 채우기 건조하고 매니큐어와 씰 할 수 있습니다. </li><li> 공 촛점 현미경을 사용하여 1.0 μm의 스텝 크기 (Drosophila의 성인 뇌의 도파민 클러스터의 해부학 적 식별을위한 7 참조) Z-축을 따라 광 섹션의 시리즈를 취득 특정 클러스터에있는 도파민 신경 세포의 수를 평가합니다. </li></ol>

<ol>
	<li>Bayersdorfer, F., Voigt, A., Schneuwly, J., Botella, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine-dependent+neurodegeneration+in+Drosophila+models+of+familial+and+sporadic+Parkinson's+disease.">Dopamine-dependent neurodegeneration in Drosophila models of familial and sporadic Parkinson's disease.</a> Neurobiol. Dis. 40, 113-119 (2010).</li><li>Feany, M. B., Bender, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Drosophila+model+of+Parkinson's+disease.">A Drosophila model of Parkinson's disease.</a> Nature. 404, 394-398 (2000).</li><li>Friggi-Grelin, F., Coulom, H., Meller, M., Gomez, D., Hirsh, J., Birman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+expression+in+Drosophila+dopaminergic+cells+using+regulatory+sequences+from+tyrosine+hydroxylase.">Targeted gene expression in Drosophila dopaminergic cells using regulatory sequences from tyrosine hydroxylase.</a> J. Neurobiol. 54, 618-627 (2003).</li><li>Gargano, J. W., Martin, I., Bandari, P., Grotewiel, M. 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Drug Targets. 9, 504-523 (2010).</li><li>Lundell, M., Hirsh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+and+spacial+development+of+serotonin+and+dopamine+neurons+in+the+Drosophila+CNS.">Temporal and spacial development of serotonin and dopamine neurons in the Drosophila CNS.</a> Dev. Biol. 165, 385-396 (1994).</li><li>Mao, Z., Davis, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eight+different+types+of+dopaminergic+neurons+innervate+the+Drosophila+mushroom+body+neuropil:+anatomical+and+physiological+heterogeneity.">Eight different types of dopaminergic neurons innervate the Drosophila mushroom body neuropil: anatomical and physiological heterogeneity.</a> Front Neural Circuits. 3, 5 (2009).</li><li>Mizuno, H., Fujikake, N., Wada, K., Nagai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha-Synuclein+Transgenic+Drosophila+As+a+Model+of+Parkinson's+Disease+and+Related+Synucleinopathies.">Alpha-Synuclein Transgenic Drosophila As a Model of Parkinson's Disease and Related Synucleinopathies.</a> Parkinsons Dis. 2011, 212706 (2011).</li><li>Neckameyer, W. 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M., Hirth, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dopaminergic+system+in+the+aging+brain+of+Drosophila.">The dopaminergic system in the aging brain of Drosophila.</a> Front Neurosci. 4, 205 (2010).</li><li>Whitworth, A. J., Wes, P. D., Pallanck, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+models+pioneer+a+new+approach+to+drug+discovery+for+Parkinson's+disease.">Drosophila models pioneer a new approach to drug discovery for Parkinson's disease.</a> Drug Discov. Today. 11, 119-126 (2006).</li><li>Wu, J. S., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+dissecting+Drosophila+melanogaster+brains+for+live+imaging+or+immunostaining.">A protocol for dissecting Drosophila melanogaster brains for live imaging or immunostaining.</a> Nat. Protoc. 1, 2110-2115 (2006).</li><li>Barone, M. C., Sykiotis, G. P., Bohmann, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+activation+of+Nrf2+signaling+is+sufficient+to+ameliorate+neurodegenerative+phenotypes+in+a+Drosophila+model+of+Parkinson's+disease.">Genetic activation of Nrf2 signaling is sufficient to ameliorate neurodegenerative phenotypes in a Drosophila model of Parkinson's disease.</a> Dis. Model Mech. 4 (5), 701-707 (2011).</li></ol>

우리는 우리가 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

분석은 서로 다른 질병에 연결된 유전 배경 (5 위)뿐 아니라 노화 DA 신경 세포의 유지에 경로 또는 작은 화합물 신호, 특정 유전자의 역할을 연구하는 유용한 방법을 제공합니다 여기에 설명. 초파리의 놀람에 의한 부정 geotaxis 동작은 광범위하게, 특히 PD 연결된 돌연변이의 존재에있는 다른 유전 적 배경에서 DA 뉴런의 기능에 대한 읽기 아웃 기능으로 사용되?...

여기에 설명 된 분석의 특이성은 도파민 뉴런 3의 특정 표현을 달성하기 위해 티로신 수산화 효소 유전자의 조절 서열을 이용 GAL4 플라이 라인의 사용에 의존하고 있습니다. 티로신 수산화 효소는 도파민 합성의 첫 번째 및 속도 제한 단계를 촉매. 생체 내에서 DA의 뉴런 (예 6을 참조)을 식별 할 수있는 좋은 후보 TH하는 도파민의과 성인 플라이 뇌 중복의 TH 면역 반응. 또한, THGal4의 발현 패턴 도파 탈 카르복시 화 효소 유전자의 조절 서열을 포함하고 DA 뉴런에서뿐만 아니라 유전자 발현을 드라이브 같은 DdcGal4 다른 GAL4 라인보다 더 구체적이고, 또한 3 glial 세포의 serotoninergic 뉴런 집합에 . Feany 및 벤더 (2000)은 최초의 PD 링크 된 인간 α-synuclein의 유전자의 팬의 연결을 표현 역의 진보적 인 손실을 가속 관찰초파리 rtle에 의한 부정 geotaxis 동작. 우리는 expressionof α-synuclein의 유전자 10를 구동하는 DA-신경 세포의 특정 THGal4 줄을 사용하여 유사한 결과를 관찰하고이에 NRF2 통로의 신경 역할을 연구하기 위해이 기능을 읽기 중 사용한 PD 14 초파리 모델. 여기에 설명 된 특정 분석은 2와 3에서 적응됩니다. 초파리 뇌 (예 : 11 7 참조) 공 촛점 현미경에 의해 뇌 전체 마운트에 시각화 할 수있는 적어도 5 개의 다른 클러스터에 배치 100 개 이상의 DA 뉴런 (PPL1, PPL2, PAL, PPM1 / 2, PPM3)가 포함되어 있습니다. 그러나 연령에 따라 신경 변성이 PD 연결된 유전자가 변이 된 곳에 파리에서 관찰 / 인간의 질병을 모델로 과발현이며 나이 9, 11과 초파리 뇌의 감소에있는 DA의 뉴런의 수 있는지 여부를 아직 논란이있다5. DA 신경 세포에서 인간의 α-synuclein의 발현은 영향을 가지고 있으며, 따라서, PD를위한 모델로 사용하고있다. 여기에서 우리는 DA의 뉴런은 세포 마커로 TH를 사용하여 마운트 전체 뇌의 계산에 대한 분석을 설명합니다. 이 분석은 13, 10에서 적응하고있다.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name </td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-tyrosine hydroxylase antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB152</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey TRITC-labeled anti rabbit IgG antibody</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>711-026-152</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mowiol</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>475904</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DABCO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2522</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene vials</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89092-734</td>
			<td>28.5 x 95 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital camera</td>
			<td>Canon</td>
			<td>PowerShot A3100IS (model)</td>
			<td>12.1 Megapixels 4X Optical Zoom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips no. 1.5</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48366 205 48393 252</td>
			<td>Sizes: 18 x 18 mm, 24 x 60 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips no. 2</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48368-040</td>
			<td>Size: 18 x 18 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection dishes</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>70543-01</td>
			<td>Size: 30 mm O.D.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumostar No. 5 tweezers</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72705-01</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>Stemi 2000 (model)</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>SP2 or SP5 (model)</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Materials Table.

assessing neurodegenerative phenotypes in drosophila dopaminergic neurons by climbing assays and whole brain immunostaining

초파리는 신경계 노화와 병적 인 퇴행성 과정을 연구하는 중요한 모델 생물이다. 실험 시스템으로 파리의 장점은 유전 온순함, 짧은 수명과 관찰하고 정량적으로 복잡한 행동을 분석 할 수 있습니다. 초파리 뇌의 특정 신경 세포 집단에서 질병에 연결된 유전자의 발현 등 파킨슨 병과 알츠하이머 5 인간 neurodegenerative 질병을 모델링하는 데 사용할 수 있습니다. 도파민 (DA) 신경 세포는 노화 인간의 두뇌에서 가장 취약한 신경 인구 중입니다. 파킨슨 병에 (PD), 가장 일반적인 퇴행성 운동 장애, DA 뉴런의 가속 손실 전위 함수의 진보와 돌이킬 수없는 쇠퇴에 이르게한다. 나이와 환경 독소에 노출뿐만 아니라, DA 뉴런의 손실은 코드의 특정 돌연변이에 의해 악화됩니다여러 유전자 또는 프로모터 영역. 같은 PD-연관된 대립 유전자의 식별은 생체 내에서 DA 뉴런의 신경 퇴행을 연구하는 모델로 초파리의 사용에 대한 실험적 기초를 제공합니다. 예를 들어, 초파리 DA 뉴런 recapitulates 인간의 질병의 일부 기능, DA의 뉴런의 예를 들어 진보적 인 손실 감소 전위 기능이있는 PD 링크 된 인간 α-synuclein의 유전자의 발현. 따라서,이 모델이 성공적으로 PD 8 잠재적 인 치료 목표를 식별하는 데 사용되었습니다. 전체 성인 뇌의 놀람에 의한 부정 geotaxis 응답 및 티로신 수산화 면역 염색에 따라 등반 분석이 DA 뉴런의 수를 모니터링하는 마운트 : 여기에 우리가 일반적으로 초파리의 DA 뉴런의 나이에 따라 신경 변성을 연구하는 데 사용 된 두 가지 분석을 설명 다른 나이에. 두 경우 모두, UAS t의 생체 내 발현DA의 뉴런에 특별히 ransgenes은 티로신 수산화 효소 (TH) 프로모터 GAL4 드라이버 3 호선, 10을 사용하여 얻을 수 있습니다.

우리는 분석이 PD (14)의 초파리 모델에서의 응력 보호 NRF2 통로의 역할을 연구하기 위해 여기에 설명 된 사용했습니다. 이 모델은 TH GAL4 드라이버 2, 10를 사용하여 DA 뉴런에서 인간의 α-synuclein의 유전자의 발현에 의존합니다. 그림 1은 TH GAL4 드라이버의 통제하에 서로 다른 형질 전환 유전자를 표현하는 남성 파리의 놀람에 의한 부정 geotaxis...

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Assessing Neurodegenerative Phenotypes in Drosophila Dopaminergic Neurons by Climbing Assays and Whole Brain Immunostaining

여기에 우리가있는 도파민 (DA) 신경 세포의 연령에 따라 신경 변성을 연구하기 위해 설립 된 두 가지 분석을 설명<em&gt; 초파리</em&gt; 등산 / DA 뉴런의 변성 및 전체 뇌 마운트의 DA 뉴런을 식별하고 계산하는 데 사용되는 티로신 수산화 효소 면역 염색의 기능 효과를 연구 할 수 있도록 놀라게 의한 부정 geotaxis 분석.

에 신약 표현형을 평가<em&gt; 초파리</em&gt; 등산 분석 실험에 의한 도파민 뉴런과 뇌 전체의 면역 염색

Drosophila melanogaster is a valuable model organism to study aging and pathological degenerative processes in the nervous system. The advantages of the ...

assessing-neurodegenerative-phenotypes-drosophila-dopaminergic

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Assessing Neurodegenerative Phenotypes in Drosophila Dopaminergic Neurons by Climbing Assays and Whole Brain Immunostaining

19.0K 조회수.  University of Rochester Medical Center. 여기에 우리가있는 도파민 (DA) 신경 세포의 연령에 따라 신경 변성을 연구하기 위해 설립 된 두 가지 분석을 설명 초파리 등산 / DA 뉴런의 변성 및 전체 뇌 마운트의 DA 뉴런을 식별하고 계산하는 데 사용되는 티로신 수산화 효소 면역 염색의 기능 효과를 연구 할 수 있도록 놀라게 의한 부정 geotaxis 분석.

비디오: Assessing Neurodegenerative Phenotypes in Drosophila Dopaminergic Neurons by Climbing Assays and Whole Brain Immunostaining

Dissection and Culture of Mouse Dopaminergic and Striatal Explants in Three-Dimensional Collagen Matrix Assays

Midbrain dopamine (mdDA) neurons project via the medial forebrain bundle towards several areas in the telencephalon, including the striatum1. Reciprocally, medium spiny neurons in the striatum that give rise to the striatonigral (direct) pathway innervate the substantia nigra2. The development of these axon tracts is dependent upon the combinatorial actions of a plethora of axon growth and guidance cues including molecules that are released by neurites or by (intermediate) target regions3,4. These soluble factors can be studied in vitro by culturing mdDA and/or striatal explants in a collagen matrix which provides a three-dimensional substrate for the axons mimicking the extracellular environment. In addition, the collagen matrix allows for the formation of relatively stable gradients of proteins released by other explants or cells placed in the vicinity (e.g. see references 5 and 6). Here we describe methods for the purification of rat tail collagen, microdissection of dopaminergic and striatal explants, their culture in collagen gels and subsequent immunohistochemical and quantitative analysis. First, the brains of E14.5 mouse embryos are isolated and dopaminergic and striatal explants are microdissected. These explants are then (co)cultured in collagen gels on coverslips for 48 to 72 hours in vitro. Subsequently, axonal projections are visualized using neuronal markers (e.g. tyrosine hydroxylase, DARPP32, or &beta;III tubulin) and axon growth and attractive or repulsive axon responses are quantified. This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of mesostriatal and striatonigral axon growth and guidance during development. Using this assay, it is also possible to assess other (intermediate) targets for dopaminergic and striatal axons or to test specific molecular cues.

Explants from the midbrain dopamine system and striatum are used in a collagen matrix assay for the in vitro analysis of mesostriatal and striatonigral pathway development. In this assay axonal outgrowth and guidance can be manipulated and quantified. It can also be modified for assessing other regions or molecular cues.

마우스 Dopaminergic 및 3 차원 콜라겐 매트릭스 Assays의 Striatal Explants의 해부와 문화

Midbrain dopamine (mdDA) neurons project via the medial forebrain bundle towards several areas in the telencephalon, including the striatum1. ...

연구

신경과학

Detection of Protein Palmitoylation in Cultured Hippocampal Neurons by Immunoprecipitation and Acyl-Biotin Exchange (ABE)

Palmitoylation is a post-translational lipid modification involving the attachment of a 16-carbon saturated fatty acid, palmitate, to cysteine residues of substrate proteins through a labile thioester bond [reviewed in1]. Palmitoylation of a substrate protein increases its hydrophobicity, and typically facilitates its trafficking toward cellular membranes. Recent studies have shown palmitoylation to be one of the most common lipid modifications in neurons1, 2, suggesting that palmitate turnover is an important mechanism by which these cells regulate the targeting and trafficking of proteins. The identification and detection of palmitoylated substrates can therefore better our understanding of protein trafficking in neurons.
Detection of protein palmitoylation in the past has been technically hindered due to the lack of a consensus sequence among substrate proteins, and the reliance on metabolic labeling of palmitoyl-proteins with 3H-palmitate, a time-consuming biochemical assay with low sensitivity. Development of the Acyl-Biotin Exchange (ABE) assay enables more rapid and high sensitivity detection of palmitoylated proteins2-4, and is optimal for measuring the dynamic turnover of palmitate on neuronal proteins. The ABE assay is comprised of three biochemical steps (Figure 1): 1) irreversible blockade of unmodified cysteine thiol groups using N-ethylmaliemide (NEM), 2) specific cleavage and unmasking of the palmitoylated cysteine's thiol group by hydroxylamine (HAM), and 3) selective labeling of the palmitoylated cysteine using a thiol-reactive biotinylation reagent, biotin-BMCC. Purification of the thiol-biotinylated proteins following the ABE steps has differed, depending on the overall goal of the experiment.
Here, we describe a method to purify a palmitoylated protein of interest in primary hippocampal neurons by an initial immunoprecipitation (IP) step using an antibody directed against the protein, followed by the ABE assay and western blotting to directly measure palmitoylation levels of that protein, which is termed the IP-ABE assay. Low-density cultures of embryonic rat hippocampal neurons have been widely used to study the localization, function, and trafficking of neuronal proteins, making them ideally suited for studying neuronal protein palmitoylation using the IP-ABE assay. The IP-ABE assay mainly requires standard IP and western blotting reagents, and is only limited by the availability of antibodies against the target substrate. This assay can easily be adapted for the purification and detection of transfected palmitoylated proteins in heterologous cell cultures, primary neuronal cultures derived from various brain tissues of both mouse and rat, and even primary brain tissue itself.

Detection of Protein Palmitoylation in Cultured Hippocampal Neurons by Immunoprecipitation and Acyl-Biotin Exchange ABE

The reversible addition of palmitate to proteins is an important regulator of intracellular protein trafficking. This is of particular interest in neurons where many synaptic proteins are palmitoylated. We utilize a simple biochemical method to detect palmitoylated proteins in cultured neurons, which can be adapted for multiple cell types and tissues.

Immunoprecipitation 및 아실-비오틴 거래소 (아베)에 의한 양식 Hippocampal 뉴런의 단백질 Palmitoylation의 감지

Palmitoylation is a post-translational lipid  modification involving the attachment of a 16-carbon saturated fatty acid,  palmitate, to cysteine residues ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this information to the brain. As such, determining how olfactory information is transferred to the brain, modifying both perception and behavior, merits investigation. Interestingly, there is emerging evidence that cellular transduction and transcriptional factors are involved in the diversification of olfactory receptor neuron. Here we provide a robust whole mount immunological labeling method to assay in vivo olfactory receptor neuron organization. Using this method, we identified all olfactory receptor neurons with anti-ELAV antibody, a known pan-neural marker and Or49a-mCD8::GFP, an olfactory receptor neuron specifically expressed in Nba neuron using anti-GFP antibody.

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Herein we describe the process of whole mount immunostaining of Drosophila antennae, which enables us to better understand the molecular mechanisms involved in the diversification of olfactory receptor neurons (ORN)s.

에있는 후각 수용체 뉴런의 전체 마운트 Immunolabeling<em&gt; 초파리</em&gt; 안테나

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

Primary Culture of Mouse Dopaminergic Neurons

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions such as motor control, motivation, and working memory. Nigrostriatal dopaminergic neurons selectively degenerate in Parkinson&#39;s disease (PD). This progressive neuronal loss is unequivocally associated with the motors symptoms of the pathology (bradykinesia, resting tremor, and muscular rigidity). The main agent responsible of dopaminergic neuron degeneration is still unknown. However, these neurons appear to be extremely vulnerable in diverse conditions. Primary cultures constitute one of the most relevant models to investigate properties and characteristics of dopaminergic neurons. These cultures can be submitted to various stress agents that mimic PD pathology and to neuroprotective compounds in order to stop or slow down neuronal degeneration. The numerous transgenic mouse models of PD that have been generated during the last decade further increased the interest of researchers for dopaminergic neuron cultures. Here, the video protocol focuses on the delicate dissection of embryonic mouse brains. Precise excision of ventral mesencephalon is crucial to obtain neuronal cultures sufficiently rich in dopaminergic cells to allow subsequent studies. This protocol can be realized with embryonic transgenic mice and is suitable for immunofluorescence staining, quantitative PCR, second messenger quantification, or neuronal death/survival assessment.

Dopaminergic neurons play a vital regulatory role in the brain. Their loss is associated with Parkinson's disease. In this video, we show how to generate primary cultures of central dopaminergic neurons from embryonic mouse mesencephalon. Such cultures are useful to study the extreme vulnerability of these neurons to various stresses.

마우스 도파민 뉴런의 차 문화

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions ...

Olfactory Assays for Mouse Models of Neurodegenerative Disease

In many neurodegenerative diseases and particularly in Parkinson&#8217;s disease, deficits in olfaction are reported to occur early in the disease process and may be a useful behavioral marker for early detection. Earlier detection in neurodegenerative disease is a major goal in the field because this is when neuroprotective therapies have the best potential to be effective. Therefore, in preclinical studies testing novel neuroprotective strategies in rodent models of neurodegenerative disease, olfactory assessment could be highly useful in determining therapeutic potential of compounds and translation to the clinic. In the present study we describe a battery of olfactory assays that are useful in measuring olfactory function in mice. The tests presented in this study were chosen because they measure olfaction abilities in mice related to food odors, social odors, and non-social odors. These tests have proven useful in characterizing novel genetic mouse models of Parkinson&#8217;s disease as well as in testing potential disease-modifying therapies.

Impairment in olfactory function is a common feature in many neurodegenerative disorders including Parkinson, Alzheimer, and Huntington diseases. In the present article, we describe a set of tests for assessing olfaction discrimination and detection in mice that can be used to measure olfactory abilities in mouse models of neurodegenerative diseases.

신경 퇴행성 질환의 마우스 모델에 대한 후각 분석 실험

In many neurodegenerative diseases and particularly in Parkinson&#8217;s disease, deficits in olfaction are reported to occur early in the disease process ...

Isolation, Culture and Long-Term Maintenance of Primary Mesencephalic Dopaminergic Neurons From Embryonic Rodent Brains

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes involved in physiological functions and vulnerability and death of these neurons is imparative to understanding the underlying causes and unraveling the cure for this common neurodegenerative disorder. Primary cultures of mesDA neurons provide a tool for investigation of the molecular, biochemical and electrophysiological properties, in order to understand the development, long-term survival and degeneration of these neurons during the course of disease. Here we present a detailed method for the isolation, culturing and maintenance of midbrain dopaminergic neurons from E12.5 mouse (or E14.5 rat) embryos. Optimized cell culture conditions in this protocol result in presence of axonal and dendritic projections, synaptic connections and other neuronal morphological properties, which make the cultures suitable for study of the physiological, cell biological and molecular characteristics of this neuronal population.

The causes of degeneration of midbrain dopaminergic neurons during Parkinson&#8217;s disease are not fully understood. Cellular culture systems provide an essential tool for study of the neurophysiological properties of these neurons. Here we present an optimized protocol, which can be utilized for in vitro modeling of neurodegeneration.

배아 쥐의 뇌에서 차 중뇌 도파민 신경 세포의 분리, 문화 및 장기 유지 보수

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes ...

Quantitative Analysis of Climbing Defects in a Drosophila Model of Neurodegenerative Disorders

Locomotive defects resulting from neurodegenerative disorders can be a late onset symptom of disease, following years of subclinical degeneration, and thus current therapeutic treatment strategies are not curative. Through the use of whole exome sequencing, an increasing number of genes have been identified to play a role in human locomotion. Despite identifying these genes, it is not known how these genes are crucial to normal locomotive functioning. Therefore, a reliable assay, which utilizes model organisms to elucidate the role of these genes in order to identify novel targets of therapeutic interest, is needed more than ever. We have designed a sensitized version of the negative geotaxis assay that allows for the detection of milder defects earlier and has the ability to evaluate these defects over time. The assay is performed in a glass graduated cylinder, which is sealed with a wax barrier film. By increasing the threshold distance to be climbed to 17.5 cm and increasing the experiment duration to 2 min&#160;we have observed a greater sensitivity in detecting mild mobility dysfunctions. The assay is cost effective and does not require extensive training to obtain highly reproducible results. This makes it an excellent technique for screening candidate drugs in Drosophila mutants with locomotion defects.

We present an optimized inexpensive and reliable negative geotaxis assay in Drosophila melanogaster as a model for neurodegenerative disorders. Being more sensitive to mild locomotor defects, this assay will help screen for potential genetic interactions and drug targets.

퇴행성 신경 질환의 초파리 모델에서 등반 결함의 정량 분석

Locomotive defects resulting from neurodegenerative disorders can be a late onset symptom of disease, following years of subclinical degeneration, and ...

Assessing Primary Neurogenesis in Xenopus Embryos Using Immunostaining

Primary neurogenesis is a dynamic and complex process during embryonic development that sets up the initial layout of the central nervous system. During this process, a portion of neural stem cells undergo differentiation and give rise to the first populations of differentiated primary neurons within the nascent central nervous system. Several vertebrate model organisms have been used to explore the mechanisms of neural cell fate specification, patterning, and differentiation. Among these is the African clawed frog, Xenopus, which provides a powerful system for investigating the molecular and cellular mechanisms responsible for primary neurogenesis due to its rapid and accessible development and ease of embryological and molecular manipulations. Here, we present a convenient and rapid method to observe the different populations of neuronal cells within Xenopus central nervous system. Using antibody staining and immunofluorescence on sections of Xenopus embryos, we are able to observe the locations of neural stem cells and differentiated primary neurons during primary neurogenesis.

Assessing Primary Neurogenesis in Xenopus Embryos Using Immunostaining

This article presents a convenient and rapid method for visualizing different neuronal cell populations in the central nervous system of Xenopus embryos using immunofluorescent staining on sections.

에서 차 신경 발생 평가<em&gt; Xenopus의</em&gt; 배아 사용하여 면역 염색

Primary neurogenesis is a dynamic and complex process during embryonic development that sets up the initial layout of the central nervous system. During ...

Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light

The nervous system has the remarkable ability to adapt and respond to various stimuli. This neural adjustment is largely achieved through plasticity at the synaptic level. The Active Zone (AZ) is the region at the presynaptic membrane that mediates neurotransmitter release and is composed of a dense collection of scaffold proteins. AZs of Drosophila melanogaster (Drosophila) photoreceptors undergo molecular remodeling after prolonged exposure to natural ambient light. Thus the level of neuronal activity can rearrange the molecular composition of the AZ and contribute to the regulation of the functional output.
Starting from the light exposure set-up preparation to the immunohistochemistry, this protocol details how to quantify the number, the spatial distribution, and the delocalization level of synaptic molecules at AZs in Drosophila photoreceptors. Using image analysis software, clusters of the GFP-fused AZ component Bruchpilot were identified for each R8 photoreceptor (R8) axon terminal. Detected Bruchpilot spots were automatically assigned to individual R8 axons. To calculate the distribution of spot frequency along the axon, we implemented a customized software plugin. Each axon&#39;s start-point and end-point were manually defined and the position of each Bruchpilot spot was projected onto the connecting line between start and end-point. Besides the number of Bruchpilot clusters, we also quantified the delocalization level of Bruchpilot-GFP within the clusters. These measurements reflect in detail the spatially resolved synaptic dynamics in a single neuron under different environmental conditions to stimuli.

Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light

Here we show how to quantify the number and spatial distribution of synaptic active zones in Drosophila melanogaster&#160;photoreceptors, highlighted with a genetically encoded molecular marker, and their modulation after prolonged exposure to light.

의 시냅틱 변조 분석<em&gt; 노랑 초파리</em&gt; 장시간 빛에 노출 후 광수

The nervous system has the remarkable ability to adapt and respond to various stimuli. This neural adjustment is largely achieved through plasticity at ...

Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors

Whole-cell voltage clamp recordings from Drosophila melanogaster photoreceptors have revolutionized the field of invertebrate visual transduction, enabling the use of D. melanogaster molecular genetics to study inositol-lipid signaling and Transient Receptor Potential (TRP) channels at the single-molecule level. A handful of labs have mastered this powerful technique, which enables the analysis of the physiological responses to light under highly controlled conditions. This technique allows control over the intracellular and extracellular media; the membrane voltage; and the fast application of pharmacological compounds, such as a variety of ionic or pH indicators, to the intra- and extracellular media. With an exceptionally high signal-to-noise ratio, this method enables the measurement of dark spontaneous and light-induced unitary currents (i.e.&#160;spontaneous and quantum bumps) and macroscopic Light-induced Currents (LIC) from single D. melanogaster photoreceptors. This protocol outlines, in great detail, all the key steps necessary to perform this technique, which includes both electrophysiological and optical recordings. The fly retina dissection procedure for the attainment of intact and viable ex vivo isolated ommatidia in the bath chamber is described. The equipment needed to perform whole-cell and fluorescence imaging measurements are also detailed. Finally, the pitfalls in using this delicate preparation during extended experiments are explained.

Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors

Whole-cell recordings from Drosophila melanogaster photoreceptors enable the measurement of spontaneous dark bumps, quantum bumps, macroscopic responses to light, and current-voltage relationships under various conditions. In combination with D. melanogaster genetic manipulation tools, this method enables the study of the ubiquitous inositol-lipid signaling pathway and its target, the TRP channel.