콜라겐 매트릭스 분석은 과거 2-3 년 동안 여러 연구 그룹의 연구에 의해 개발되고 향상되었습니다. dopaminergic 및 striatal explants를 위해 여기에서 설명한 방법은 크게 이러한 연구로부터 혜택을 누릴 수 있습니다. 또한, 저자 striatal explant 문화를 설정하는 그녀의 도움을 Asheeta 프라 사드 감사드립니다. 실험실에서 작품은 인간 국경 과학 프로그램기구 (경력 개발 상)에 의해 추진하는 사업, 보건 연구 및 개발에 네덜란드기구 (ZonMW-VIDI 및 ZonMW-TOP), Europanian 연합 (mdDA-NeuroDev, FP7/2007-2011 , 그랜트 222999) (RJP까지) 및 학술 연구에 대한 네덜란드기구 (TopTalent; .. 너까지).

1. 쥐 꼬리 콜라겐의 작성 <ol><li> 6-10 성인 쥐의 꼬리를 (이것은 사용할 때까지 -20 ° C에 꼬리를 저장할 수 있습니다)를 수집합니다. </li><li> 실온 (RT)에서 하룻밤 사이에 95 % 에탄올에 꼬리를 적시게. </li></ol> 쥐의 꼬리의 절개 (조직 문화 후드에서) : (그들을 사용하지 않을 때 70 %의 에탄올에 도구를 유지하고이 절차 전반에 걸쳐 사용되는 모든 솔루션, 도구 및 유리 제품은 멸균 있는지 확인) <ol start="3"><li> 꼬리에서 힘줄를 수집하려면, 꼬리 끝부분을 잘라. 포셉 한 켤레와 꼬리의 큰 끝을 잡아. , 잡고 구부 및 기타 포셉 가까운 꼬리를 끊어야 할 포셉 또 한 쌍의을 사용합니다. 떨어져 당겨와 힘줄 (그림 1A, B) 뒤에 남아있을 것입니다. </li><li> 멸균 H 2 O에 힘줄를 수집하고 모든 힘줄을 수집 후 멸균 H 2 O를 가진 새로운 petridish으로 이동 </li><li> 2-3 힘줄을 가지고 2 쌍 중을 사용하여 분쇄기에 넣어멸균 H 2 O에있는 새로운 petridish에 ceps 이러한 정맥 (; 그림 1C 힘줄 조직이 반짝 이는 반사이다)로 비 힘줄 조직을 제거합니다. 모든 비 힘줄 조직을 제거 후, ​​각각의 꼬리는 힘줄의 약 100-150 MG를 얻을. </li><li> 멸균 3퍼센트 초산 300 ML에 힘줄을 전송하고 4에 천천히 하룻밤 저어 ° C. </li><li> 멸균 3퍼센트 초산의 추가 200 ML을 추가하고 4에 천천히 하룻밤 저어 ° C. </li><li> 4에 120 분 동안 ~ 2,700 XG에 힘줄이 들어있는 아세트산 용액을 원심 ° C 펠렛 이외의 해산 힘줄이 아닌 힘줄 조직합니다. </li><li> 원심 분리하는 동안 투석 튜브가 준비 : <ul><li> 40cm의 조각 잘라 </li><li> 5 분, 500 μm의 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)에 넣어 익히지 </li><li> 멸균 H 2 O 시원하고 </li></ul></li><li> 투석 튜브의 한쪽 끝에 매듭을 묶게하고 자동 pipett를 사용하여 조직 문화 후드 얼음 속에서 centrifuged 힘줄이 솔루션의 표면에 뜨는 함께 튜브를 채우려면전자과 25 ML의 피펫. 거품을 생산하지 마십시오. 매듭은 튜브의 모든 조각들은 (그림 1D) 얼음 무균 알루미늄 호일에 튜브 및 매장 튜브의 다른 쪽 끝을 가득 때까지. </li><li> 조직 문화 후드에 무균 0.1X MEM, 산도 4.0의 10 나도 준비합니다. 튜브 조각에 시체를 추가하고 10 난 비커에 미리 냉각 0.1X MEM 용액에 이들을 추가합니다. 천천히 교반 ° C ~하면서 4에서 하룻밤 Dialyze. 산도가 낮은 유지하면서 이러한 투석은 초과 산성을 제거합니다. </li><li> 새로운 사전 냉각 10리터 0.1X MEM로 교체 및 4에서 하룻밤 저어 ° C. </li><li> 새로운 사전 냉각 10리터 0.1X MEM으로 대체하여 이전 단계를 반복하고 4에서 하룻밤 저어 ° C. </li><li> 멸균 50 ML 튜브로 나누어지는의 콜라겐 솔루션입니다. 4 ° C.에 상점 aliquots 6-12 개월을 유지, 오직 조직 문화 후드에 콜라겐 주식을 취급하고 있습니다. </li><li> 그것은 정화 콜라겐은 콜라겐 matr에서 최적의 결과를 얻으려면 (0.1x MEM)을 희석해야 여부를 테스트하는 것이 중요하다IX 분석. 따라서 콜라겐 희석 시리즈를 생성 (undiluted 콜라겐, 1시 1분, 1시 2분 및 1시 5분이 희석)와 최적의 콜라겐 희석을 결정하기 위해 아래에 설명된대로 콜라겐 매트릭스 assays를 수행합니다. </li></ol> 2. Dopaminergic Midbrain 7,8의 해부 <ol><li> 어머니의 자궁에서 E14.5 마우스 배아를 해부하고 필요할 때까지 얼음 L15 매체에 보관. </li></ol> 모든 후속 해부 과정은 얼음 L15 매체로 진행됩니다. <ol start="2"><li> 두뇌를 해부. </li><li> 각 telencephalic 소포 (striatal explants 위해 telencephalic vesicles을 사용)의 중간 부분을 따라 절단하여 telencephalon를 제거합니다. </li><li> meningeal 칼집을 제거합니다. </li><li> mesencephalic 굴곡의 단지 주동이의 dorsoventral 몫을합니다. </li><li> mesencephalic 만곡 중 꼬리 다른 dorsoventral 몫을합니다. </li><li> microdissectio을 사용하는 등 부분의 중간선을 따라 rostrocaudal 컷 만들기n은 칼로 기본 복부 midbrain 조직을 폭로합니다. 그것이 dopaminergic 뉴런 (그림 2)가 들어 있으므로 복부 midbrain 조직에 충돌하지 않도록주의하십시오. </li><li> 이 rostrocaudal 인하는 수평과 지느러미 midbrain 조직을 제거하는 복부 중간선에 평행합니다. </li><li> microdissection 나이프를 사용 explants로 남아 복부 midbrain 조직을 나누십시오. </li><li> 사용할 때까지 얼음 5 % FBS를 포함한 L15 매체에 explants을 저장합니다. </li></ol> 3. Striatum의 해부 모든 해부 과정은 얼음 L15 매체로 진행됩니다. <ol><li> midbrain의 해부 동안 해부 telencephalic vesicles을 사용합니다. </li><li> 시상과 집게를 사용하여 striatum 사이에 절단하여 시상을 제거합니다. </li><li> 이러한 후각 망울로 주동이의 구조를 제거 striatum에 mediolateral 상처가 주동이의합니다. striatum에 caudally있는 조직에 대해이 단계를 반복합니다. </li><li> 위치striatum의 코로나보기를 얻을 수 남은 ​​슬라이스 (그림 2). </li><li> striatum는 조직 (더 투명) 약간은 덜 조밀한 부분으로 인식된다. microdissection 나이프를 사용 explants로 striatum과 상처를 해부. 측면과 중간 ganglionic 예하의 이주 뉴런을 포함 중간선에 약간 어두운 조직 주변을 피하십시오. </li><li> 사용할 때까지 얼음 5 % FBS를 포함한 L15 매체에 explants을 저장합니다. </li></ol> 4. 조립 콜라겐 매트릭스 Assays 콜라겐의 준비 (얼음의 모든 단계, 피펫 팁에게 냉각 사용)를 <ol><li> 10X MEM 100 μl와 1M 나트륨 중탄산염 40 μl (NaHCO 3)로 희석 콜라겐의 860 μl를 섞어서 얼음에 보관. 이 시점에서 콜라겐가 따뜻해지면 그것은 고체화됩니다. </li><li> 4 잘 Nunc 요리의 우물로 coverslip에 준비된 콜라겐 20 μl의 방울 (직경 약 5 ㎜) 추가그리고 37 CO 2 배양기에 서 해주 ° C ~ 5 % 30 분 (주위 O 2 농도가 충분합니다)에 대한 CO 2. 이 인큐베이션 기간 동안 콜라겐은 아교 질로 만들다 것입니다. </li></ol> 콜라겐 겔에서 설치 프로그램 공동 문화 <ol start="3"><li> 콜라겐은 gelatinized 후 콜라겐으로 dopaminergic 또는 striatal explant를 전송하는 200 μl 팁과 피펫을 사용합니다. </li><li> 바늘을 사용하여 서로 근접 거리에 explants 이동합니다. 한 explant (~ 200-300 μm의) (그림 2)의 약 직경의 거리에서 그들을 따로 보관. </li><li> 초과 매체를 제거하고 explants 위에 준비된 콜라겐 20 μl를 추가합니다. 이것은 종종 explants가 이동하게됩니다. 4.4에서 설명한대로 바늘을 사용하여 explants를 재지정. </li><li> 콜라겐은 37 ° C 5 % CO 2시 30 분 뒤에 RT에서 15 분 동안 응고하자. </li><li> 콜라겐가 설정되면, 전자의 400 μl를 추가할xplant 매체 37시 CO 2 배양기에서 2-3 일동안은 성장 ° C에서 5 % CO 2. </li></ol> 5. Immunohistochemistry과 부량에 의한 분석 Immunohistochemistry <ol><li> explants를 해결하려면 부드럽게 매체 400 μl (이를 4퍼센트로 PFA를 diluting)에 PBS에서 8 % paraformaldehyde 400 μl (PFA)를 추가하고 RT에서 1 시간 동안 서 보자. </li><li> RT에서 PBS의 3 배 15 분 씻으십시오. </li><li> 버퍼를 차단에 품어 (BB, PBS + 1% FBS + 0.1 % 트리톤 X-100) 2 시간. </li><li> 4 ° C.에서 BB의 일차 항체와 하룻밤 품어 dopaminergic axons은 striatal axons 방지 DARPP32 항체 (1:500) 9 및 모든 axons 방지 βIII의 tubulin (1:3000) 7 시각화를위한 안티 - 티로신 hydroxylase 항체 (1:1000) 7을 사용하십시오. </li><li> RT에서 PBS에 5 배 1 시간 씻는다. </li><li> 4에서 하룻밤 BB의 해당 형광단 (1:500)에 복합 이차 항체와 함께 품어° C. 이 단계에서 explants의 노출을 최소화의 빛으로 (예 : 알루미늄 박으로 그들을 포함). </li><li> 4에서 PBS에서 하룻밤 씻으 ° C ~ 다음 날 동안 여러 세차장으로 따라갔다. </li><li> 현미경에 explants를 탑재은 Antifade 시약이 매체를 장착 연장 사용하는 슬라이드. 유리 현미경 슬라이드에 ~ 10 μl의 방울을 추가합니다. coverslip을 가지고 부드럽게 아래로 향하게 explant 측면에 장착 매체의 드롭에 배치하십시오. 아주 부드럽게 장착 매체의 드롭 그것을 낮추는 방법으로 드 coverslip에 따른 공기를 포집하지 마십시오. </li></ol> P / D 비율을 계산하여 부량 <ol start="9"><li> epifluorescence 현미경 (그림 3)를 사용 explants의 디지털 이미지를 습득. </li><li> 이러한 이미지를 사용하여, 근위 사분면 (인접 explant에 가장 가까운 explant의 예 부분)과 말초 사분면 (인접 expla에서 떨어져 멀리 explant의 일부를 생성하는 quadrants으로 각 explant을 나누다NT) (그림 2, 4). </li><li> 근위 및 말초 quadrants의 두 explant에서 신흥 20 긴 neurites의 길이를 측정합니다. </li><li> 각 개별 explant에 대한 P / D 비율을 계산하는 20 긴 neurites의 평균 길이를 사용합니다. 비율 &lt;1 축삭의 반발을 표시하면서 AP / D 비율&gt; 1, 축삭의 명소를 나타냅니다. </li><li> 어떤 경우에는 neurites의 울창한 성장은 개별 neurite 길이의 평가를 방지합니다. 이러한 상황에서는 부량는 explant의 가장자리와 근위 및 말초 quadrants의 축삭 성장의 선도 전면 사이의 거리를 측정하여 수행할 수 있습니다. </li></ol> 6. 대표 이미지 dopaminergic 및 striatal explants의 성공적인 문화 후에는 axons의 큰 숫자 (표시되지 않음) 명시야 현미경을 사용하여 표시하거나 방지 βIII tubulin의 immunocytochemistry 의해 같은 시각입니다. 이러한 axons의 하위 집합이 dopaminergic 또는 S 것입니다<html> 시각을 사용 immunocytochemistry 같은 triatal axons (그림 3). 설명된대로 quadrants로 explants 나누어 및 P / D 비율을 결정함으로써, putative 축삭 매력적이거나 혐오스러운 장면 효과 (그림 3E) 계량하실 수 있습니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3691/3691fig1.jpg" /> 그림 1. 쥐의 꼬리 힘줄의 콜라겐의 준비를 보여주는 사진. 쥐의 꼬리를 갈라 이겠지)는 힘줄을 제공합니다. B) 인대는 밧줄과 같은 번들로서 볼 수 있습니다. C) 인대는 그들의 반짝 이는 흰색 외관에 의해 정맥에서 구별하기 쉽습니다. D) 초산에 힘줄을 해소 후 솔루션은 투석 튜브로 전송됩니다. 녹아 콜라겐 추위를 유지하려면, 튜브는 얼음에 무균 알루미늄 호일에 표시됩니다. 전자 2 &quot;SRC =&quot;/ files/ftp_upload/3691/3691fig2.jpg &quot;/&gt; 그림 2. 절차의 여러 단계를 나타내는 도식. 적절한 뇌 영역 해부와 explants를 생성합니다 버렸어요. 단일 midbrain 및 striatal explant는 콜라겐 매트릭스의 근접 거리에 위치하며 37 ° C.에 48~72시간 동안 성장 남아 있습니다 Axons는 형광 immunohistochemistry에 의해 시각이며 P / D 비율은​​ chemotropic 응답을 수치 계산됩니다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/3691/3691fig3.jpg" /> 그림 3. 콜라겐 매트릭스 문화 축삭의 성장을 보여주는 대표적인 결과. ) Midbrain의 explant는 안티 - 티로신 hydroxylase 항체가 축삭의 가지를 밝히 물들일. 점선은 인접한 explant을 나타냅니다. 보여주는 개별 neurites과 성장 콘 (화살표)의 B) 확대. C) Striatal explant 안티 DARPP32 물들일. D) C의 확대는 개별 neurites을 보여주는. 의 E) 예P / D 비율 부​​량. Explants은 동일 quadrants으로 나뉩니다. 말초 사분에서 멀어 직면하는 동안 근위 구역이 인접한 explant에 직면하고 있습니다. 스케일 바는 100 μm의를 나타냅니다.

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	<li>van den Heuvel, D. M., Pasterkamp, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+connected+in+the+dopamine+system.">Getting connected in the dopamine system.</a> Prog. Neurobiol. 85, 75-93 (2008).</li><li>Lobo, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+profiling+of+striatonigral+and+striatopallidal+medium+spiny+neurons+past,+present,+and+future.">Molecular profiling of striatonigral and striatopallidal medium spiny neurons past, present, and future.</a> Int. Rev. Neurobiol. 89, 1-35 (2009).</li><li>Dickson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+axon+guidance.">Molecular mechanisms of axon guidance.</a> Science. 298, 1959-1964 (2002).</li><li>Chilton, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecules+mechanisms+of+axon+guidance.">Molecules mechanisms of axon guidance.</a> Dev. Biol. 292, 13-24 (2006).</li><li>Lumsden, A. G., Davies, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotropic+effect+of+specific+target+epithelium+in+the+developing+mammalian+nervous+system.">Chemotropic effect of specific target epithelium in the developing mammalian nervous system.</a> Nature. 323, 538-539 (1986).</li><li>Tessier-Lavigne, M., Placzek, M., Lumsden, A. G., Dodd, J., Jessel, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotropic+guidance+of+developing+axons+in+the+mammalian+central+nervous+system.">Chemotropic guidance of developing axons in the mammalian central nervous system.</a> Nature. 336, 775-778 (1988).</li><li>Kolk, S. M., Gunput, R. A., Tran, T. S., van den Heuvel, D. M., Prasad, A. A., Hellemons, A. J., Adolfs, Y., Ginty, D. D., Kolodkin, A. L., Burbach, J. P., Smidt, M. P., Pasterkamp, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semaphorin+3F+is+a+bifunctional+guidance+cue+for+dopaminergic+axons+and+controls+their+fasciculation,+channeling,+rostral+growth,+and+intracortical+targeting.">Semaphorin 3F is a bifunctional guidance cue for dopaminergic axons and controls their fasciculation, channeling, rostral growth, and intracortical targeting.</a> J. Neurosci. 29, 12542-12557 (2009).</li><li>Fenstermaker, A. G., Prasad, A. A., Bechara, A., Adolfs, Y., Tissir, F., Goffinet, A., Zou, Y., Pasterkamp, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt/planar+cell+polarity+signaling+controls+the+anterior-posterior+organization+of+monoaminergic+axons+in+the+brainstem.">Wnt/planar cell polarity signaling controls the anterior-posterior organization of monoaminergic axons in the brainstem.</a> J. Neurosci. 30, 16053-16064 (2010).</li><li>Arlotta, P., Molyneaux, B. J., Jabaudon, D., Yoshida, Y., Macklis, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ctip2+controls+the+differentiation+of+medium+spiny+neurons+and+the+establishment+of+the+cellular+architecture+of+the+striatum.">Ctip2 controls the differentiation of medium spiny neurons and the establishment of the cellular architecture of the striatum.</a> J. Neurosci. 28, 622-632 (2008).</li><li>De Wit, J., Toonen, R. F., Verhage, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix-dependent+local+retention+of+secretory+vesicle+cargo+in+cortical+neurons.">Matrix-dependent local retention of secretory vesicle cargo in cortical neurons.</a> J. Neurosci. 29, 23-37 (2009).</li><li>G&#228;hwiler, B. H., Capogna, M., Debanne, D., McKinney, R. A., Thompson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+slice+cultures:+a+technique+has+come+of+age.">Organotypic slice cultures: a technique has come of age.</a> Trends Neurosci. 20, 471-477 (1997).</li></ol>

우리는 공개 할게 없다.

콜라겐 매트릭스 분석은 여기 설명 (예 : 참고 문헌 5-8 참조) 축삭 유도 분자와의 연결 시스템의 다양한 조사를 위해 지난 수십 년간의 여러 연구소에서 사용하고 향상되었습니다. 이러한 연구는이 분석은 효과와 다른 (중급) 대상 조직을 통해 분비 축삭 유도 분자 규제를 공부를위한 강력한 도구입니다 것으로 나타났습니다. 그러나, 그것은 콜라겐 매트릭스가 세포외 환경 (E...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> 소태아 세럼 </td><td> BioWhittaker </td><td> 14-801F </td><td></td></tr><tr><td> 글루타민 (200mM) </td><td> PAA </td><td> M11-004 </td><td></td></tr><tr><td> Hepes </td><td> VWR 인터내셔널 </td><td> 441476L </td><td></td></tr><tr><td> β-메르 캅 토 에탄올 </td><td> 머크 </td><td> 444,203 </td><td></td></tr><tr><td> 최소 필수 미디어 (MEM) </td><td> Gibco </td><td> 61100-087 </td><td></td></tr><tr><td> Neurobasal </td><td> Gibco </td><td> 21103-049 </td><td></td></tr><tr><td> B27 </td><td> Gibco </td><td> 17504-044 </td><td></td></tr><tr><td> Leibovitz의 L-15 중간 </td><td> Gibco </td><td&gt; 11415-049 </td><td></td></tr><tr><td> 페니실린 - 스트렙토 마이신 </td><td> Gibco </td><td> 15070-063 </td><td></td></tr><tr><td> 골드 Antifade 시약을 연장 </td><td> Invitrogen </td><td> P36930 </td><td></td></tr><tr><td> 투석 튜브 </td><td> 스펙트럼 연구소 </td><td> 132,660 </td><td></td></tr><tr><td> 래빗 안티 티로신 Hydroxylase </td><td> 펠 - Freez </td><td> P40101-0 </td><td></td></tr><tr><td> 래빗 안티 Darpp32 (H-62) </td><td> 산타 - 크루즈 </td><td> SC-11365 </td><td></td></tr><tr><td> 마우스 방지 βIII의 tubulin </td><td> 시그마 </td><td> T8660 </td><td></td></tr><tr><td> 알렉사 형석은 이차 항체를 분류 </td><td> Invitrogen </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

dissection and culture of mouse dopaminergic and striatal explants in three-dimensional collagen matrix assays

striatum 한 포함한 telencephalon 여러 분야에 대한 중간 forebrain 번들 통해 Midbrain의 도파민 (mdDA) 뉴런 프로젝트. 서로, striatonigral (직접) 경로를 야기할 striatum에서 매체 가시 뉴런은 substantia nigra 2 신경을 분포시키다. 이러한 축삭의 책자의 개발은 축삭의 성장과 neurites하거나 (중급) 대상 지역 3,4에 의해 출시되는 분자를 포함하여지도 단서의 과다의 조합 동작에 의존적일 수 밖에 없습니다. 이러한 수용성 요소는 세포외 환경을 흉내낸 axons에 대한 입체적인 기판을 제공하는 콜라겐 매트릭스의 culturing의 mdDA 및 / 또는 striatal explants하여 체외에서 공부하실 수 있습니다. 또한, 콜라겐 매트릭스 주변 (예 : 참고 문헌 5와 6 참조)에 배치 기타 explants이나 세포가 발표한 단백질의 상대적으로 안정적인 그라디언트의 형성을 허용합니다. 여기 pur를위한 방법을 설명콜라겐 젤류 및 후속 immunohistochemical 및 정량 분석​​에 쥐의 꼬리 콜라겐, dopaminergic 및 striatal explants의 microdissection, 그들의 문화 ification. 첫째, E14.5 마우스 배아의 두뇌는 고립된 dopaminergic이며 striatal explants는 microdissected됩니다. 이러한 explants 그 후 (CO) 체외에서 48~72시간 동안 coverslips에 콜라겐 젤에 배양해 있습니다. 그 후, axonal 전망이의 연결을 표시 (예, 티로신 hydroxylase, DARPP32 또는 βIII의 tubulin)과 축삭의 성장과 매력적이거나 혐오스러운 장면 축삭 댓글의 계량하고 사용하여 시각입니다. 이것의 연결 준비는 개발하는 동안 mesostriatal 및 striatonigral 축삭의 성장과지도의 세포와 분자 메커니즘의 체외 연구에 대한 유용한 도구입니다. 이러한 분석을 사용, 그건 dopaminergic 및 striatal axons 기타 (중급) 목표를 평가하기 위해 또는 특정 분자 단서를 테스트할 수도 있습니다.

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Dissection and Culture of Mouse Dopaminergic and Striatal Explants in Three-Dimensional Collagen Matrix Assays

midbrain의 도파민 시스템과 striatum에서 Explants가를위한 콜라겐 매트릭스 분석에 사용됩니다<em&gt; 체외에서</emmesostriatal 및 striatonigral 경로 개발&gt; 분석. 본 분석에서는 axonal 파생물 및지도는 조작과 계량 수 있습니다. 그것은 또한 다른 지역이나 분자 단서를 평가에 대해 수정할 수 있습니다.

마우스 Dopaminergic 및 3 차원 콜라겐 매트릭스 Assays의 Striatal Explants의 해부와 문화

Midbrain dopamine (mdDA) neurons project via the medial forebrain bundle towards several areas in the telencephalon, including the striatum1. ...

dissection-culture-mouse-dopaminergic-striatal-explants-three

Research

JoVE Journal

Neuroscience

25.6K 조회수.  University Medical Center Utrecht. midbrain의 도파민 시스템과 striatum에서 Explants가를위한 콜라겐 매트릭스 분석에 사용됩니다 체외에서 분석. 본 분석에서는 axonal 파생물 및지도는 조작과 계량 수 있습니다. 그것은 또한 다른 지역이나 분자 단서를 평가에 대해 수정할 수 있습니다.

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Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies of these neurons are located in the dorsal spinal cord and their axons follow stereotyped trajectories during embryonic development. Commissural axons initially project ventrally towards the floorplate. After crossing the midline, these axons turn anteriorly and project towards the brain. Each of these steps is regulated by the action of several guidance cues. Cultures highly enriched in commissural neurons are ideally suited for many experiments addressing the mechanisms of axon pathfinding, including turning assays, immunochemistry and biochemistry. Here, we describe a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. First, the spinal cord is isolated and dorsal strips are dissected out. The dorsal tissue is then dissociated into a cell suspension by trypsinization and mechanical disruption. Neurons are plated onto poly-L-lysine-coated glass coverslips or tissue-culture dishes. After 30 hours in vitro, most neurons have extended an axon. The purity of the culture (Yam et al. 2009), typically over 90%, can be assessed by immunolabeling with the commissural neuron markers DCC, LH2 and TAG1 (Helms and Johnson, 1998). This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of commissural axon growth and guidance during spinal cord development.

This video demonstrates a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. Dissociated commissural neurons are useful to study the cellular and molecular mechanisms of axon growth and guidance.

배아 척수에서 뉴런의 Commissural 해부와 문화

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

연구

신경과학

Dissection and Culture of Chick Statoacoustic Ganglion and Spinal Cord Explants in Collagen Gels for Neurite Outgrowth Assays

The sensory organs of the chicken inner ear are innervated by the peripheral processes of statoacoustic ganglion (SAG) neurons. Sensory organ innervation depends on a combination of axon guidance cues1 and survival factors2 located along the trajectory of growing axons and/or within their sensory organ targets. For example, functional interference with a classic axon guidance signaling pathway, semaphorin-neuropilin, generated misrouting of otic axons3. Also, several growth factors expressed in the sensory targets of the inner ear, including Neurotrophin-3 (NT-3) and Brain Derived Neurotrophic Factor (BDNF), have been manipulated in transgenic animals, again leading to misrouting of SAG axons4. These same molecules promote both survival and neurite outgrowth of chick SAG neurons in vitro5,6.
Here, we describe and demonstrate the in vitro method we are currently using to test the responsiveness of chick SAG neurites to soluble proteins, including known morphogens such as the Wnts, as well as growth factors that are important for promoting SAG neurite outgrowth and neuron survival. Using this model system, we hope to draw conclusions about the effects that secreted ligands can exert on SAG neuron survival and neurite outgrowth. 
SAG explants are dissected on embryonic day 4 (E4) and cultured in three-dimensional collagen gels under serum-free conditions for 24 hours. First, neurite responsiveness is tested by culturing explants with protein-supplemented medium. Then, to ask whether point sources of secreted ligands can have directional effects on neurite outgrowth, explants are co-cultured with protein-coated beads and assayed for the ability of the bead to locally promote or inhibit outgrowth. We also include a demonstration of the dissection (modified protocol7) and culture of E6 spinal cord explants. We routinely use spinal cord explants to confirm bioactivity of the proteins and protein-soaked beads, and to verify species cross-reactivity with chick tissue, under the same culture conditions as SAG explants. These in vitro assays are convenient for quickly screening for molecules that exert trophic (survival) or tropic (directional) effects on SAG neurons, especially before performing studies in vivo. Moreover, this method permits the testing of individual molecules under serum-free conditions, with high neuron survival8.

We demonstrate how to dissect and culture chick E4 statoacoustic ganglion and E6 spinal cord explants. Explants are cultured under serum-free conditions in 3D collagen gels for 24 hours. Neurite responsiveness is tested with growth factor-supplemented medium and with protein-coated beads.

Neurite 가지의 Assays에 대한 해부와 칙 Statoacoustic 신경절과 콜라겐 젤에서 척수의 Explants의 문화

The sensory organs of the chicken inner ear are innervated by the peripheral processes of statoacoustic ganglion (SAG) neurons. Sensory organ innervation ...

A Functional Motor Unit in the Culture Dish: Co-culture of Spinal Cord Explants and Muscle Cells

Human primary muscle cells cultured aneurally in monolayer rarely contract spontaneously because, in the absence of a nerve component, cell differentiation is limited and motor neuron stimulation is missing1. These limitations hamper the in vitro study of many neuromuscular diseases in cultured muscle cells. Importantly, the experimental constraints of monolayered, cultured muscle cells can be overcome by functional innervation of myofibers with spinal cord explants in co-cultures.
Here, we show the different steps required to achieve an efficient, proper innervation of human primary muscle cells, leading to complete differentiation and fiber contraction according to the method developed by Askanas2. To do so, muscle cells are co-cultured with spinal cord explants of rat embryos at ED 13.5, with the dorsal root ganglia still attached to the spinal cord slices. After a few days, the muscle fibers start to contract and eventually become cross-striated through innervation by functional neurites projecting from the spinal cord explants that connecting to the muscle cells. This structure can be maintained for many months, simply by regular exchange of the culture medium.
The applications of this invaluable tool are numerous, as it represents a functional model for multidisciplinary analyses of human muscle development and innervation. In fact, a complete de novo neuromuscular junction installation occurs in a culture dish, allowing an easy measurement of many parameters at each step, in a fundamental and physiological context.
Just to cite a few examples, genomic and/or proteomic studies can be performed directly on the co-cultures. Furthermore, pre- and post-synaptic effects can be specifically and separately assessed at the neuromuscular junction, because both components come from different species, rat and human, respectively. The nerve-muscle co-culture can also be performed with human muscle cells isolated from patients suffering from muscle or neuromuscular diseases3, and thus can be used as a screening tool for candidate drugs. Finally, no special equipment but a regular BSL2 facility is needed to reproduce a functional motor unit in a culture dish. This method thus is valuable for both the muscle as well as the neuromuscular research communities for physiological and mechanistic studies of neuromuscular function, in a normal and disease context.

Cultured muscle cells are an inadequate model to recapitulate innervated muscle in vivo. A functional motor unit can be reproduced in vitro by innervation of differentiated human primary muscle cells using rat embryo spinal cord explants. This article describes how co-cultures of spinal cord explants and muscle cells are established.

문화 접시에있는 기능성 모터 단위 : 척수의 Explants와 근육 세포의 공동 문화

Human primary muscle cells cultured  aneurally in monolayer rarely contract spontaneously because, in the absence of  a nerve component, cell ...

Assessing Neurodegenerative Phenotypes in Drosophila Dopaminergic Neurons by Climbing Assays and Whole Brain Immunostaining

Drosophila melanogaster is a valuable model organism to study aging and pathological degenerative processes in the nervous system. The advantages of the fly as an experimental system include its genetic tractability, short life span and the possibility to observe and quantitatively analyze complex behaviors. The expression of disease-linked genes in specific neuronal populations of the Drosophila brain, can be used to model human neurodegenerative diseases such as Parkinson's and Alzheimer's 5.
Dopaminergic (DA) neurons are among the most vulnerable neuronal populations in the aging human brain. In Parkinson's disease (PD), the most common neurodegenerative movement disorder, the accelerated loss of DA neurons leads to a progressive and irreversible decline in locomotor function. In addition to age and exposure to environmental toxins, loss of DA neurons is exacerbated by specific mutations in the coding or promoter regions of several genes. The identification of such PD-associated alleles provides the experimental basis for the use of Drosophila as a model to study neurodegeneration of DA neurons in vivo. For example, the expression of the PD-linked human &alpha;-synuclein gene in Drosophila DA neurons recapitulates some features of the human disease, e.g. progressive loss of DA neurons and declining locomotor function 2. Accordingly, this model has been successfully used to identify potential therapeutic targets in PD 8.
Here we describe two assays that have commonly been used to study age-dependent neurodegeneration of DA neurons in Drosophila: a climbing assay based on the startle-induced negative geotaxis response and tyrosine hydroxylase immunostaining of whole adult brain mounts to monitor the number of DA neurons at different ages. In both cases, in vivo expression of UAS transgenes specifically in DA neurons can be achieved by using a tyrosine hydroxylase (TH) promoter-Gal4 driver line 3, 10.

Assessing Neurodegenerative Phenotypes in Drosophila Dopaminergic Neurons by Climbing Assays and Whole Brain Immunostaining

Here we describe two assays that have been established to study age-dependent neurodegeneration of dopaminergic (DA) neurons in Drosophila: the climbing/startle-induced negative geotaxis assay which allows to study the functional effects of DA neurons degeneration and the tyrosine hydroxylase immunostaining which is used to identify and count DA neurons in whole brain mounts.

에 신약 표현형을 평가<em&gt; 초파리</em&gt; 등산 분석 실험에 의한 도파민 뉴런과 뇌 전체의 면역 염색

Drosophila melanogaster is a valuable model organism to study aging and pathological degenerative processes in the nervous system. The advantages of the ...

Isolation and Quantification of Botulinum Neurotoxin From Complex Matrices Using the BoTest Matrix Assays

Accurate detection and quantification of botulinum neurotoxin (BoNT) in complex matrices is required for pharmaceutical, environmental, and food sample testing. Rapid BoNT testing of foodstuffs is needed during outbreak forensics, patient diagnosis, and food safety testing while accurate potency testing is required for BoNT-based drug product manufacturing and patient safety. The widely used mouse bioassay for BoNT testing is highly sensitive but lacks the precision and throughput needed for rapid and routine BoNT testing. Furthermore, the bioassay&#39;s use of animals has resulted in calls by drug product regulatory authorities and animal-rights proponents in the US and abroad to replace the mouse bioassay for BoNT testing. Several in vitro replacement assays have been developed that work well with purified BoNT in simple buffers, but most have not been shown to be applicable to testing in highly complex matrices. Here, a protocol for the detection of BoNT in complex matrices using the BoTest Matrix assays is presented. The assay consists of three parts: The first part involves preparation of the samples for testing, the second part is an immunoprecipitation step using anti-BoNT antibody-coated paramagnetic beads to purify BoNT from the matrix, and the third part quantifies the isolated BoNT&#39;s proteolytic activity using a fluorogenic reporter. The protocol is written for high throughput testing in 96-well plates using both liquid and solid matrices and requires about 2 hr of manual preparation with total assay times of 4-26 hr depending on the sample type, toxin load, and desired sensitivity. Data are presented for BoNT/A testing with phosphate-buffered saline, a drug product, culture supernatant, 2% milk, and fresh tomatoes and includes discussion of critical parameters for assay success.

The BoTest Matrix botulinum neurotoxin (BoNT) detection assays rapidly purify and quantify BoNT from a range of sample matrices.&#160;Here, we present a protocol for the detection and quantification of BoNT from both solid and liquid matrices and demonstrate the assay with BOTOX, tomatoes, and milk.

BoTest 매트릭스 분석 실험을 사용하여 복잡한 매트릭스에서 분리 및 보툴리눔 신경 독소의 정량화

Accurate detection and quantification of botulinum neurotoxin (BoNT) in complex matrices is required for pharmaceutical, environmental, and food sample ...

Primary Culture of Mouse Dopaminergic Neurons

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions such as motor control, motivation, and working memory. Nigrostriatal dopaminergic neurons selectively degenerate in Parkinson&#39;s disease (PD). This progressive neuronal loss is unequivocally associated with the motors symptoms of the pathology (bradykinesia, resting tremor, and muscular rigidity). The main agent responsible of dopaminergic neuron degeneration is still unknown. However, these neurons appear to be extremely vulnerable in diverse conditions. Primary cultures constitute one of the most relevant models to investigate properties and characteristics of dopaminergic neurons. These cultures can be submitted to various stress agents that mimic PD pathology and to neuroprotective compounds in order to stop or slow down neuronal degeneration. The numerous transgenic mouse models of PD that have been generated during the last decade further increased the interest of researchers for dopaminergic neuron cultures. Here, the video protocol focuses on the delicate dissection of embryonic mouse brains. Precise excision of ventral mesencephalon is crucial to obtain neuronal cultures sufficiently rich in dopaminergic cells to allow subsequent studies. This protocol can be realized with embryonic transgenic mice and is suitable for immunofluorescence staining, quantitative PCR, second messenger quantification, or neuronal death/survival assessment.

Dopaminergic neurons play a vital regulatory role in the brain. Their loss is associated with Parkinson's disease. In this video, we show how to generate primary cultures of central dopaminergic neurons from embryonic mouse mesencephalon. Such cultures are useful to study the extreme vulnerability of these neurons to various stresses.

마우스 도파민 뉴런의 차 문화

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions ...

Long-term Time Lapse Imaging of Mouse Cochlear Explants

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building the highly ordered, complex structure of the mammalian cochlea proceeds for around ten days. In order to study changes in gene expression over this period and their response to pharmaceutical or genetic manipulation, long-term imaging is necessary. Previously, live imaging has typically been limited by the viability of explanted tissue in a humidified chamber atop a standard microscope. Difficulty in maintaining optimal conditions for culture growth with regard to humidity and temperature has placed limits on the length of imaging experiments. A microscope integrated into a modified tissue culture incubator provides an excellent environment for long term-live imaging. In this method we demonstrate how to establish embryonic mouse cochlear explants and how to use an incubator microscope to conduct time lapse imaging using both bright field and fluorescent microscopy to examine the behavior of a typical embryonic day (E) 13 cochlear explant and Sox2, a marker of the prosensory cells of the cochlea, over 5 days.

Live imaging of the embryonic mammalian cochlea is challenging because the developmental processes at hand operate on a temporal gradient over ten days. Here we present a method for culturing and then imaging embryonic cochlear explant tissue taken from a fluorescent reporter mouse over five days.

마우스 인공 와우의 Explants의 장기 시간 경과 영상

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building ...

Protocol for Three-dimensional Confocal Morphometric Analysis of Astrocytes

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify their functional and structural properties, a condition called reactive astrogliosis. Here, a protocol for assessment of the morphological properties of astrocytes is presented. This protocol includes quantification of 12 different parameters i.e. the surface area and volume of the tissue covered by an astrocyte (astrocyte territory), the entire astrocyte including branches, cell body, and nucleus, as well as total length and number of branches, the intensity of fluorescence immunoreactivity of antibodies used for astrocyte detection, and astrocyte density (number/1,000 &#181;m2). For this purpose three-dimensional (3D) confocal microscopic images were created, and 3D image analysis software such as Volocity 6.3 was used for measurements. Rat brain tissue exposed to amyloid beta1-40 (A&#946;1-40) with or without a therapeutic&#160;intervention was used to present the method. This protocol can also be used for 3D morphometric analysis of other cells from either in vivo or in vitro conditions.

Astrocytes in the CNS change their functional and structural properties in response to harmful stimuli. This report presents a protocol for assessment of three-dimensional astrocyte morphology in diseased conditions or after therapeutic interventions.

성상의 3 차원 공 촛점 형태 학적 분석을위한 프로토콜

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify ...

Fiber Connections of the Supplementary Motor Area Revisited: Methodology of Fiber Dissection, DTI, and Three Dimensional Documentation

The purpose of this study is to show the methodology for the examination of the white matter connections of the supplementary motor area (SMA) complex (pre-SMA and SMA proper) using a combination of fiber dissection techniques on cadaveric specimens and magnetic resonance (MR) tractography. The protocol will also describe the procedure for a white matter dissection of a human brain, diffusion tensor tractography imaging, and three-dimensional documentation. The fiber dissections on human brains and the 3D documentation were performed at the University of Minnesota, Microsurgery and Neuroanatomy Laboratory, Department of Neurosurgery. Five postmortem human brain specimens and two whole heads were prepared in accordance with Klingler's method. Brain hemispheres were dissected step by step from lateral to medial and medial to lateral under an operating microscope, and 3D images were captured at every stage. All dissection results were supported by diffusion tensor imaging. Investigations on the connections in line with Meynert's fiber tract classification, including association fibers (short, superior longitudinal fasciculus I and frontal aslant tracts), projection fibers (corticospinal, claustrocortical, cingulum, and frontostriatal tracts), and commissural fibers (callosal fibers) were also conducted.

The purpose of this study is to show each step of the fiber dissection technique on human cadaveric brains, the 3D documentation of these dissections, and the diffusion tensor imaging of the anatomically dissected fiber pathways.

재조합 모터 영역의 광섬유 연결 : 광섬유 해부, DTI 및 3 차원 문서화 방법론

The purpose of this study is to show the methodology for the examination of the white matter connections of the supplementary motor area (SMA) complex ...

Stereotaxic Surgery for Genetic Manipulation in Striatal Cells of Neonatal Mouse Brains

Many genes are expressed in embryonic brains, and some of them are continuously expressed in the brain after birth. For such persistently expressed genes, they may function to regulate the developmental process and/or physiological function in neonatal brains. To investigate neurobiological functions of specific genes in the brain, it is essential to inactivate genes in the brain. Here, we describe a simple stereotaxic method to inactivate gene expression in the striatum of transgenic mice at neonatal time windows. AAV-eGFP-Cre viruses were microinjected into the striatum of Ai14 reporter gene mice at postnatal day (P) 2 by stereotaxic brain surgery. The tdTomato reporter gene expression was detected in P14 striatum, suggesting a successful Cre-loxP mediated DNA recombination in AAV-transduced striatal cells. We further validated this technique by microinjecting AAV-eGFP-Cre viruses into P2Foxp2fl/fl mice. Double labeling of GFP and Foxp2 showed that GFP-positive cells lacked Foxp2 immunoreactivity in P9 striatum, suggesting the loss of Foxp2 protein in AAV-eGFP-Cre transduced striatal cells. Taken together, these results demonstrate an effective genetic deletion by stereotaxically microinjected AAV-eGFP-Cre viruses in specific neuronal populations in the neonatal brains of floxed transgenic mice. In conclusion, our stereotaxic technique provides an easy and simple platform for genetic manipulation in neonatal mouse brains. The technique can not only be used to delete genes in specific regions of neonatal brains, but it also can be used to inject pharmacological drugs, neuronal tracers, genetically modified optogenetics and chemogenetics proteins, neuronal activity indicators and other reagents into the striatum of neonatal mouse brains.

We describe a protocol of stereotaxic surgery with a homemade head-fixed device for microinjecting reagents into the striatum of neonatal mouse brains. This technique allows genetic manipulation in neuronal cells of specific regions of neonatal mouse brains.

신생아 마우스 두뇌의 Striatal 세포에서 유전자 조작에 대 한 stereotaxic 수술

Many genes are expressed in embryonic brains, and some of them are continuously expressed in the brain after birth. For such persistently expressed genes, ...