저자 덕분에 자신의 귀중한 조언과이 공 배양 화면의 개발 과정에 도움 로베르토 콜터 (하버드 의과 대학). 그녀는 그림 6을 얻는에 대한 지원도 명확성을 위해 원고를 읽어 주셔서 감사합니다 마 힘, 그리고 치아 - 이순신 쳉.

<ol>
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저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

이 프로토콜의 본질적인 한계 중 하나는 미생물 유기체의 cultivability에 의존하고 있다는 점이다. 도 24을 문서화 한 바와 같이, 지구상에서 가장 미생물 생명은 (아직) 날짜 탐구 배양 조건에서 재배 할 수 없습니다. 따라서, 자연 환경에서 발생하는 미생물 종 사이의 상호 작용의 거대한 숫자는이 방법을 사용하여 발견되지 않을 것입니다. 우리의 욕망은 이러한 상호 작용의 존재를 확인, ?...

우리는 박테리아가 분비하는 대사가 이웃 미생물의 생리 및 개발에 영향을 미치는 방법에 대한 이해에 관심이 있습니다. 많은 대사 산물은 다른 미생물에 대한 자신의 생리 활성 효과를 특징으로하고 있습니다. 두 잘 설명 된 예는 다른 미생물의 해외 유전자 발현을 변경하는 다른 미생물의 성장을 억제하는 항생 물질, 및 정족수 인식 분자를 포함한다. 그러나 박테리아는 알려진 bioactivities 1이없는 다른 많은 작은 분자 천연 제품을 생산하고 있습니다. 우리는 박테리아가 진화하고 그들 대부분 세균이 존재하는 내에 복잡한 미생물 군집에서의 미생물 이웃 세포 생리학을 변조 할 수 있기 때문에 이들의 대사 산물을 생산하는 능력을 보존한다는 가설. 바실러스 서브 틸리 세포 유형 우리는 Bacil을 포함하는 화학적 매개 미생물의 상호 작용에 대한 우리의 연구 초점을 맞추고있다LU의 서브 틸리 스. 이뿐만 아니라 때문에 그람 양성 모델 박테리아와 조작에 사용할 수있는 결과 유전 도구와 같은 상태의뿐만 아니라, 때문에 특징 종류의 세포로 분화 할 수있는 능력이다. 예는 셀을 포함한다 :; 강력한 biofilm 형성에 필요한 세포 외 기질을 생산, 환경으로부터 DNA를 취할 능력, 수영 등 2 중, 포자 형성된. 이러한 유형의 세포는 각각 그들 생리 학적 및 / 또는 물리적으로 구별 그들의 유 전적으로 동일한 형제로부터 만드는 특성 전사 귤론을 표현한다. 다양한 성장 조건 하에서, 다중 셀 유형은 B. 단일 콜로니 내에 다양한 모집단 공존 서브 틸리 세포 3. 박테리아의 많은 종은 유사한 셀형 이질성을 나타낼 수 있지만,이 현상은 특히 B.에서 연구되어왔다 서브 틸리 스. UPR 있습니다 특히, 유전자이러한 특정 B. 각에서 egulated 서브 틸리 스의 세포 유형이 확인되었습니다. 관심이 미생물의 표현형의 대부분은 직접 관찰하기 어렵거나 불가능하기 때문에 이러한 상향 조절 유전자를 확인하는 것은 여기에 설명 된 작업을 위해 필수적입니다. 예를 들어, 우리는 시각, 같은 고체 (1.5 %) 한천 플레이트에서 수영과 같은 특성을 감지 할 수는 없지만 B의 모집단 서브 틸리 세포는 그 조건 3에서 편모를 생산하고 있습니다. 또 다른 예는 바이오 필름의 매트릭스 생산이다. 매트릭스 생산 (그것이 거시적으로 주름이 식민지의 결과로) 식민지의 형태로 시각화하지만, 특정 성장 매체에, 오직 성장 4의 배수 일 이후에 할 수 있습니다. 그러나 유전자가 분화하는 동안 상향 조절되는 알고, 우리는 이러한 종류의 세포로 세포 분화를위한 마커 역할을 전사 기자를 구성 할 수 있습니다. 리포터 구조 이러한 형광 transcriptional 기자 세포 형 특정 유전자가 형광성 단백질, 예를 들어, 리포터 유전자의 생산을 구동하기위한 프로모터로 구성. 예를 들면 P의 X 유전자 X의 프로모터 영역을 나타내는 P의 (세포 수영을 위해) 노파-YFP, P 타파-YFP (바이오 필름의 매트릭스를 생산하는 세포) 및 (세포 포자 형성된 경우) P sspB-YFP을 포함한다. 표현형의 기본 규정이 그대로 유지 될 수 있도록이 기자의 구조는 염색체에 중립 궤적에 통합 (그림 1과 아래 참조)된다. 셀이 표현형을 표현 그러나, 지금, 또한 형광 단백질을 표현한다. 이것은 우리가이 생리적 반응을 활성화 미생물을 선별 할 수 있도록, 특정 표현형의 행동의 활성화 쉽게 시각화 판독을 제공합니다. 그러한 리포터는 일반적으로 미생물에 사용되고 있지만, 그것들은 대체로 지문을 확인해 화면에 적용되지 않았다이 방법 전에 미생물 사이의 Y 대사 상호 작용은 5를 설명했다. 셀 타입 별 기자 균주의 설계 및 건설에 중요한 고려 사항이 있습니다. 구조의 다른 유형이 확실히 할 수 있지만 우리는 독점적으로 전사 형광 기자를 활용했다. 우리는 두 가지 이유, 그러나, 우리의 화면에서 세포 유형의 차별화를위한 마커로 번역 융합의 사용을 권장 : 교란 원시 세포 유형 특정 단백질을 떠나 1) 욕구, 2) 인식이 확산, 세포 넓은 형광 (번역 융합과 공통) 세포 내에서 지역화 puncta에보다 감지하기 쉬울 것입니다. 리포터 유전자 선택 판독으로 전사를 사용하기로 결정 한 후, 리포터 유전자 (예 : LacZ를, 형광, 또는 루시 페라 제)를 선택해야합니다. LacZ를는 특별한 필요 최소한의 이점을 갖는다감지하는 장비를 개인별하지만, 환경 미생물 사이에 잘​​못된 반응의 더 높은 가능성이있다. 우리 손에, 락 토양 미생물 사이에 생물 +의 배경 수준 (, 데이터가 표시되지 토양 미생물의 10 %가 X-GAL 판에) 락 + (파란색이었다 &gt;&gt;) 엄청나게 높았다. 우리는 이것을하지 않았지만 그것은 매체에 X-gal을 농도를 적정하면, 이것은 X-GAL 리포터의 사용을 허용하도록 최적화 될 수있다. 루시 페라 탐지 높은 감도를 제공하며, 대부분의 직교 리포터 : 환경 미생물이 본질적으로 발광되는 거의 기회가있다. 그러나, 우리는 대부분의 멀티 웰 플레이트 만 지역화 된 영역을 스캔하도록 설계되었습니다로 어려운, 전체 페트리 접시에 걸쳐 발광 검출을 허용 우리 기관에서 장비를 식별 할 수 있습니다. 또한도 동시에 물리적 인 허용하는 방식으로 발광 식민지를 시각화하는 합병증이있을 수 있습니다유도 생물의 olation. 수탁자를 사용하여이 가능하게 한 수 있지만, 우리는 대신 B에서 작동하는 입증 된 형광 전사 기자를 사용하기로 결정 서브 틸리는, 검출 및 토양 생물 중 하위 위양성 비율의 적절한 감도를 제공하고, 시각화 및 격리 절차를 모두 쉽게 사용할 기기의 사용을 허용. 형광 선택 선택한 특정 형광 물질이 세균의 종류에 따라 달라집니다, 당신이 사용하는 한천 성장 매체, 그리고 특정 형광 필터를 사용하면 사용할 수 있습니다 설정합니다. 우리의 장비로, 우리는 발견 B. 두 서브 틸리 자신과 YFP (노란색 형광 단백질) 필터를 사용했을 때 그들이 우리의 손에 GFP (녹색 형광 단백질)에 그 기자가 우수하고, 전시 적은 형광 배경에 성장 된 한천을 식민지. 형광 단백질의 코돈 사용은자주도 당신의 세균 종에서 일을하거나, 구성 적 프로모터를 사용하여 명시 적으로 테스트하기 위해 문헌에서 알려진 형광을 선택하는 것이 중요하고, 진핵 생물에 최적화. 항상 발전 형광 단백질 변형 많은 수의 소스를 명시 적으로 실험 구에 적합한 형광 단백질을 선택에 대한 지침을 제공하는 일부 7,8의 숫자에서 검토 한 이는 6 현재 사용할 수 있습니다. 발기인 선택 프로모터의 선택은 크게 셀 형식이나 관심의 표현형에 따라 달라집니다. 같은 B. 같은 생물에 대한 서브 틸리 스, 일부 세포 형 특정 리포터 유전자는 문헌에 설립되었습니다. 다른 균주를 들어, 마이크로 어레이 또는 전사 데이터를 검사하는 것은 매우 조건에서 상향 조절되는 유전자에 대한 정보를 제공 할 필요가 어디에 관심 내가 당신의 세포 유형의 적하 목록. 최근의 연구는 B의 전사를 카탈로그 기와의 마이크로 어레이 (10)를 사용하여 104 서로 다른 성장 조건에서 서브 틸리 스. 이 논문은 유전자가 매우 적게 잘 특성화 표현형을위한 귀중한입니다, 다른 조건에서 상향 조절 된에 대한 포괄적 인 정보를 제공합니다. 오히려 그 모든 유전자에 대한 정확한 프로모터 영역을 맵핑하는 것보다, 우리는 일반적으로 단순히 프로모터와 유전자의 상류 순서 200-500 BP를 사용합니다. 정확한 순서의 길이는 게놈 문맥에 따라 달라집니다 필요한 오픈 리딩 프레임을 이웃 상류 코딩 영역을 포함하지 않도록 할 때 짧은 영역이 사용됩니다. 중립 궤적 및 통합 당신의 균주에서 기자 구조는 형광 전사 기자의 피로를 설계 마지막 질문이되어 유지하는 방법. 박테리아에서, 그 유전자는 자주 유지항생제 선택을 사용하여 플라스미드에. 그러나, 환경 미생물을 죽이는없이 공 배양 중에 항생제를 사용하는 것이 가능하지 않을 수있다. 플라스미드가 안정적으로 당신의 종의 박테리아를 유지하는 경우에, 당신의 박테리아가 심사하여 기자를 준비하는 항생제의 존재 플라스미드 매개로 기자를 포함 성장 가능하고 희망의 공 배양 자체 동안 항생제를 제거 할 수 있음을 플라스미드 것 형광 충분히 가능하도록 유지된다. 플라스미드는 쉽게 세균에 손실됩니다, 또는 스트레스 조건에서 손실 된 경우, 이것은 실행 가능한 옵션이되지 않습니다. 많은 경우에, 최적의 솔루션도 전형의 부재하에 리포터의 안정적인 유지 보수를 허용 박테리아 염색체 상으로 리포터 구조체를 통합하는 것이다. 목적 유전자의 정상적인 표현이나 규정을 방해하지 않도록 통합을 위해, 우리는 염색체에 자궁외 사이트에 통합하는 것이 좋습니다 캘리포니아N의 역할을 &quot;중립 궤적.&quot; B.에서 서브 틸리이 통합 사이트가 유전자 것을 - 변이 된 때 - (통합 체는 항생제 선택하지 않고 확인 할 수 있도록) 특정 최소한의 미디어 표현형을 전달, 아직 리치 미디어의 성장과 포자 형성 속도를 변경하지 않고, amyE, 라카와 같은 유전자를 포함, thrC, pyrD, 된 gltA 및 SACA (전분을 이용할 수있는 능력을 반송, β-galactosides, 트레오닌, 우라실, 글루타메이트, 수크로오스, 각각) 11-13. 이러한 유전자의 통합은 B에서 몇 년 동안 안정적으로 사용되었지만 서브 틸리 스 (특히 amyE와 라카에서), 유사한 지식은 많은 다른 박테리아 종의 유전자를 사용하지 못할 수도 있습니다. 파지 부착 사이트의 사용은 중성 염색체 통합 사이트에 대한 훌륭한 대안 : 많은 종의 특정 14-16,뿐만 아니라 TN7 첨부 사이트 (AT &amp; T의 TN7)와 같은 일반적인 통합 사이트가많은 세균 종 (17, 18)에서 확인 및 유전자 삽입을 위해 사용되어. 환경 미생물 우리는 우리의 공동 배양 화면에 대한 환경 미생물의 직접 소스로 흙을 사용합니다. 토양 미생물의 높은 다양성을 포함하고, 이러한 생물의 대부분은 천연 제품의 풍부한 원천입니다. (토양 세균의 사전 분리없이) 우리의 형광 전사 기자의 변형과 접시에 직접 배치 토양의 액체 현탁액을 사용함으로써, 우리는 매우 실험적인 접근 방식을 단순화합니다. 토양 어느 수확​​ 후 즉시 이용 될 수도 있고, 미래의 사용을 위해 -80 ° C에 냉동. 즉시 사용이 잘 동결 살아남지 못할 것이다 것을 포함하여 미생물의 다양성이 잠재적으로 성장 할 수있는 장점을 가지고 있습니다. 그것은 사용되어야 스크린 판의 수를 증가, 이들 샘플로부터 경작 토양 미생물의 농도를 알 수없는 단점이있다. 델ayed 사용 콜로니 최적화 수가 각 화면 접시에 성장 될 수 있도록, 각각의 토양의 소스 CFU / ㎖가 미리 결정될 수있는 이점을 갖는다. 그러나, 토양 생물이 동결 생존 할 수 있어야합니다. 큰 계통 발생 학적 다양성이 우리의 행렬 유도 화면에서 확인 된 히트에서 관찰되었다 (토양 소스 즉) 검사되는 유도 풀을 다양 화하면 동일한 토양에 대한 깊이있는 심사보다 새로운 종간의 상호 작용을 식별에 더 효과가 나타나는 것을 추가 토양 소스는 오히려 더 철저하게 같은 토양 소스 (EA 생크와 R. 콜터, 하버드 의과 대학, 게시되지 않은 결과를) 심사보다 조사 하였다. 개요 우리가 여기에서 설명하는 방법은 기술적 요구 사항의 관점에서 간단합니다. 그것은 포함한다 : 1) B에 형광 전사 기자 구축 서브 틸리 나관심의 다른 박테리아 종, 2),이 기자가 활성화되지 않은되는 조건을 식별 3) (우리의 경우 토양에 있지만, 다른 소스 대신에 사용될 수있다)이 기자의 변형 및 상영하는 생물의 분취 량을 준비 4)이 혼합 고체 미디어, 5) 식별 및 추정이 생물을 유도 분리, 6)이 생물이 실제로 보조 화면이 표현형을 활성화 않는 것이 확인에 대한 미생물의 두 세트. 일단 확인이 생물과 그 대사 산물은 세균 생리학과 미생물의 상호 작용을 연구하기 위해, 박테리아의 행동을 조절하고, 잠재적 인 미래의 치료 화합물 등의 새로운 발판 역할을하는 화학 도구와 우리를 제공합니다.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any spectrophotomer capable of measuing OD600 absorbance values.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria broth, Lennox</td>
			<td>VWR</td>
			<td>80017-484</td>
			<td>Alternative media sources may be necessary.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beads, 3 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>26396-508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel loading tips, round</td>
			<td>VWR</td>
			<td>29442-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass rods</td>
			<td>VWR</td>
			<td>59060-069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence dissecting stereoscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>N/A</td>
			<td>The author used a Zeiss Stemi SV6 dissection stereoscope with an EXFO X-cite 120 fluorescent light source, a long-pass YFP filter cube, an achromat 0.63X objective, 10X eyepieces, and an Axio HRC HR digital camera. Most screening was done with the focusing mount at 2.0-3.2X. Any dissecting stereoscope with fluorescence capabilities is fine, provided you have the correct filters for the FP you are using. It is best if there is a shutter that allows you to easily switch between brightfield and fluorescense, as well as a stage that allows illumination from above and below. If you want to capture images, an attached camera is also necessary.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using coculture to detect chemically mediated interspecies interactions

자연 속에서, 박테리아는 거의 독립적으로 존재하지 않으며 대신 대사 산물을 분비하여 지역 환경을 변경 다른 미생물의 다양한 배열에 의해 둘러싸여 있습니다. 이러한 대사 물질은 미생물 이웃의 생리 및 분화를 조절하는 잠재력을 가지고 스타일 복잡한 미생물 군집의 유지 가능성에 중요한 요소들이다. 우리는 화학적으로 매개 된 미생물의 상호 작용을 식별하는 형광 기반의 공동 배양 화면을 개발했다. 화면이 고체 미디어 환경 미생물과 형광 전사 기자의 변형을 결합하고 식민지가 공동 배양에서 성장 할 수 있도록 포함한다. 그것은 관심의 특정 표현형 표현하면 선택된 균주는 형광 있도록 형광 전사 기자 설계 (즉 바이오 필름 ​​형성, 포자 형성, 독성 인자 생산, 등.) 검사는 성장 조건에서 수행 갔지이 표현형 다시 표현 (따라서 기자의 변형은 일반적으로 비 형광입니다)되지 않습니다. 환경 미생물이 표현형을 활성화 대사 산물을 분비 할 때, 한천을 통해 확산 및 형광 기자의 구조를 활성화합니다. 이 유도 - 대사 산물을 생산하는 미생물 탐지 할 수 : 그들은 형광 식민지에 가장 인접 비 형광 식민지입니다. 따라서,이 화면은 기자의 변형에서 특정 생리적 반응을 활성화 확산 대사 산물을 생산 환경 미생물의 식별을 할 수 있습니다. 이 책은 방법에 대해 설명합니다 :) 적절한 공 배양 검사 조건을 선택, b)는 기자와 검사에 대한 환경 미생물을 준비, C) 공동 배양 화면을 수행, D) 추정은 생물을 유도 분리, 전자) 보조 화면에 자신의 활동을 확인합니다. 우리는 바실러스 서브 틸리 스 (Bacillus subtilis)에있는 바이오 필름의 매트릭스 생산을 활성화 토양 생물에 대한 화면이 방법을 개발 </EM&gt;하지만, 우리는 또한 다른 유전자 다루기 쉬운 박테리아에이 방법을 적용하기위한 고려 사항에 대해 설명합니다.

이 화면은 B.의 생리를 변경 화합물을 분비하는 토양 미생물을 확인하는 데 사용 하였다 서브 틸리 스. 여기에 기재된 결과는 B.의 행렬 생성 세포 유형에 집중 이 박테리아의 강력한 biofilm 형성에 필요한 단백질과 엑소 폴리 사카 라이드를 생산 서브 틸리 스,. 우리는 우리의 형광 기자의 구조 (P 타파-YFP)의 타파 - sipW - TASA 오페론의 프로모터를 선정했다. ?...

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Using Coculture to Detect Chemically Mediated Interspecies Interactions

박테리아는 그들의 이웃들 미생물의 생리학에 영향을 미칠 가능성이 분비되는 화합물을 생성. 여기에서 우리는 고체 미디어의 바실러스 서브 틸리 스 (Bacillus subtilis)의 형광 전사 기자 균주와 토양 미생물을 혼합하여 화학적으로 매개 종간의 상호 작용을 검출 할 수있는 공 배양 화면을 설명합니다.

화학적 매개 종간의 상호 작용을 검출하는 공 배양을 사용하여

In nature, bacteria rarely exist in isolation; they are instead surrounded by a diverse array of other microorganisms that alter the local environment by ...

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Research

JoVE Journal

Biology

13.5K 조회수.  University of North Carolina at Chapel Hill.  박테리아는 그들의 이웃들 미생물의 생리학에 영향을 미칠 가능성이 분비되는 화합물을 생성. 여기에서 우리는 고체 미디어의 바실러스 서브 틸리 스 (Bacillus subtilis)의 형광 전사 기자 균주와 토양 미생물을 혼합하여 화학적으로 매개 종간의 상호 작용을 검출 할 수있는 공 배양 화면을 설명합니다. 

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Microfluidic Co-culture of Epithelial Cells and Bacteria for Investigating Soluble Signal-mediated Interactions

The human gastrointestinal (GI) tract is a unique environment in which intestinal epithelial cells and non-pathogenic (commensal) bacteria coexist. It has been proposed that the microenvironment that the pathogen encounters in the commensal layer is important in determining the extent of colonization. Current culture methods for investigating pathogen colonization are not well suited for investigating this hypothesis as they do not enable co-culture of bacteria and epithelial cells in a manner that mimics the GI tract microenvironment. Here we describe a microfluidic co-culture model that enables independent culture of eukaryotic cells and bacteria, and testing the effect of the commensal microenvironment on pathogen colonization. The co-culture model is demonstrated by developing a commensal Escherichia coli biofilm among HeLa cells, followed by introduction of enterohemorrhagic E. coli (EHEC) into the commensal island, in a sequence that mimics the sequence of events in GI tract infection.

This protocol describes a microfluidic co-culture model for simultaneous and localized culture of epithelial cells and bacteria. This model can be used for investigating the role of different soluble molecular signals on pathogenesis as well as screen the effectiveness of putative probiotic bacterial strains.

Microfluidic 가용성식이 중재 신호의 상호 작용을 조사하는 상피 세포 박테리아의 공동 문화

The human gastrointestinal (GI) tract is a unique environment in which intestinal epithelial cells and non-pathogenic (commensal) bacteria coexist. It has ...

연구

생물학

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

Schwann cells are one of the commonly used cells in repair strategies following spinal cord injuries. Schwann cells are capable of supporting axonal regeneration and sprouting by secreting growth factors 1,2 and providing growth promoting adhesion molecules 3 and extracellular matrix molecules 4. In addition they myelinate the demyelinated axons at the site of injury 5.
However following transplantation, Schwann cells do not migrate from the site of implant and do not intermingle with the host astrocytes 6,7. This results in formation of a sharp boundary between the Schwann cells and astrocytes, creating an obstacle for growing axons trying to exit the graft back into the host tissue proximally and distally. Astrocytes in contact with Schwann cells also undergo hypertrophy and up-regulate the inhibitory molecules 8-13.
In vitro assays have been used to model Schwann cell-astrocyte interactions and have been important in understanding the mechanism underlying the cellular behaviour.
These in vitro assays include boundary assay, where a co-culture is made using two different cells with each cell type occupying different territories with only a small gap separating the two cell fronts. As the cells divide and migrate, the two cellular fronts get closer to each other and finally collide. This allows the behaviour of the two cellular populations to be analyzed at the boundary. Another variation of the same technique is to mix the two cellular populations in culture and over time the two cell types segregate with Schwann cells clumped together as islands in between astrocytes together creating multiple Schwann-astrocyte boundaries.
The second assay used in studying the interaction of two cell types is the migration assay where cellular movement can be tracked on the surface of the other cell type monolayer 14,15. This assay is commonly known as inverted coverslip assay. Schwann cells are cultured on small glass fragments and they are inverted face down onto the surface of astrocyte monolayers and migration is assessed from the edge of coverslip.
Both assays have been instrumental in studying the underlying mechanisms involved in the cellular exclusion and boundary formation. Some of the molecules identified using these techniques include N-Cadherins 15, Chondroitin Sulphate proteoglycans(CSPGs) 16,17, FGF/Heparin 18, Eph/Ephrins19.
This article intends to describe boundary assay and migration assay in stepwise fashion and elucidate the possible technical problems that might occur.

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

This article intends to describe in stepwise fashion the commonly used in vitro assays used in studying Schwann cell-asrtocyte interactions.

사용 Schwann - astrocyte 상호 작용 분석 체외에서 Assays

Schwann cells are one of the commonly used cells in repair strategies following spinal cord injuries. Schwann cells are capable of supporting axonal ...

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

Proteomics research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that proteins in cells mostly exist not as isolated entities but exert their biological activity in association with many other proteins, in humans ten or more, forming assembly lines in the cell for most if not all vital functions.1,2 Knowledge of the function and architecture of these multiprotein assemblies requires their provision in superior quality and sufficient quantity for detailed analysis. The paucity of many protein complexes in cells, in particular in eukaryotes, prohibits their extraction from native sources, and necessitates recombinant production. The baculovirus expression vector system (BEVS) has proven to be particularly useful for producing eukaryotic proteins, the activity of which often relies on post-translational processing that other commonly used expression systems often cannot support.3 BEVS use a recombinant baculovirus into which the gene of interest was inserted to infect insect cell cultures which in turn produce the protein of choice. MultiBac is a BEVS that has been particularly tailored for the production of eukaryotic protein complexes that contain many subunits.4 A vital prerequisite for efficient production of proteins and their complexes are robust protocols for all steps involved in an expression experiment that ideally can be implemented as standard operating procedures (SOPs) and followed also by non-specialist users with comparative ease. The MultiBac platform at the European Molecular Biology Laboratory (EMBL) uses SOPs for all steps involved in a multiprotein complex expression experiment, starting from insertion of the genes into an engineered baculoviral genome optimized for heterologous protein production properties to small-scale analysis of the protein specimens produced.5-8 The platform is installed in an open-access mode at EMBL Grenoble and has supported many scientists from academia and industry to accelerate protein complex research projects.

Protein complexes catalyze key cellular functions. Detailed functional and structural characterization of many essential complexes requires recombinant production. MultiBac is a baculovirus/insect cell system particularly tailored for expressing eukaryotic proteins and their complexes. MultiBac was implemented as an open-access platform, and standard operating procedures developed to maximize its utility.

EMBL에서 MultiBac 단백질 복잡한 생산 플랫폼

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

Rapid Synthesis and Screening of Chemically Activated Transcription Factors with GFP-based Reporters

Synthetic biology aims to rationally design and build synthetic circuits with desired quantitative properties, as well as provide tools to interrogate the structure of native control circuits. In both cases, the ability to program gene expression in a rapid and tunable fashion, with no off-target effects, can be useful. We have constructed yeast strains containing the ACT1 promoter upstream of a URA3 cassette followed by the ligand-binding domain of the human estrogen receptor and VP16. By transforming this strain with a linear PCR product containing a DNA binding domain and selecting against the presence of URA3, a constitutively expressed artificial transcription factor (ATF) can be generated by homologous recombination. ATFs engineered in this fashion can activate a unique target gene in the presence of inducer, thereby eliminating both the off-target activation and nonphysiological growth conditions found with commonly used conditional gene expression systems. A simple method for the rapid construction of GFP reporter plasmids that respond specifically to a native or artificial transcription factor of interest is also provided.

This protocol describes an experimental procedure for the rapid construction of artificial transcription factors (ATFs) with cognate GFP reporters&#160;and quantification of the ATFs ability to stimulate GFP expression via flow cytometry.

빠른 합성 및 GFP 기반 기자들과 화학적으로 활성화 된 전사 인자의 상영

Synthetic biology aims to rationally design and build synthetic circuits with desired quantitative properties, as well as provide tools to interrogate the ...

Determination of Protein-ligand Interactions Using Differential Scanning Fluorimetry

A wide range of methods are currently available for determining the dissociation constant between a protein and interacting small molecules. However, most of these require access to specialist equipment, and often require a degree of expertise to effectively establish reliable experiments and analyze data. Differential scanning fluorimetry (DSF) is being increasingly used as a robust method for initial screening of proteins for interacting small molecules, either for identifying physiological partners or for hit discovery. This technique has the advantage that it requires only a PCR machine suitable for quantitative PCR, and so suitable instrumentation is available in most institutions; an excellent range of protocols are already available; and there are strong precedents in the literature for multiple uses of the method. Past work has proposed several means of calculating dissociation constants from DSF data, but these are mathematically demanding. Here, we demonstrate a method for estimating dissociation constants from a moderate amount of DSF experimental data. These data can typically be collected and analyzed within a single day. We demonstrate how different models can be used to fit data collected from simple binding events, and where cooperative binding or independent binding sites are present. Finally, we present an example of data analysis in a case where standard models do not apply. These methods are illustrated with data collected on commercially available control proteins, and two proteins from our research program. Overall, our method provides a straightforward way for researchers to rapidly gain further insight into protein-ligand interactions using DSF.

Differential scanning fluorimetry is a widely used method for screening libraries of small molecules for interactions with proteins. Here, we present a straightforward method to extend these analyses to provide an estimate of the dissociation constant between a small molecule and its protein partner.

시차 주사 Fluorimetry를 사용하여 단백질 - 리간드 상호 작용의 결정

A wide range of methods are currently available for determining the dissociation constant between a protein and interacting small molecules. However, most ...

Probing High-density Functional Protein Microarrays to Detect Protein-protein Interactions

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an affinity purified yeast kinase fusion protein containing a V5-epitope tag for read-out. Purified kinase is obtained through culture of a yeast strain optimized for high copy protein production harboring a plasmid containing a Kinase-V5 fusion construct under a GAL inducible promoter. The yeast is grown in restrictive media with a neutral carbon source for 6 hr followed by induction with 2% galactose. Next, the culture is harvested and kinase is purified using standard affinity chromatographic techniques to obtain a highly purified protein kinase for use in the assay. The purified kinase is diluted with kinase buffer to an appropriate range for the assay and the protein microarrays are blocked prior to hybridization with the protein microarray. After the hybridization, the arrays are probed with monoclonal V5 antibody to identify proteins bound by the kinase-V5 protein. Finally, the arrays are scanned using a standard microarray scanner, and data is extracted for downstream informatics analysis1,2 to determine a high confidence set of protein interactions for downstream validation in vivo.

Using protein microarrays containing nearly the entire S. cerevisiae proteome is probed for rapid unbiased interrogation of thousands of protein-protein interactions in parallel. This method can be utilized for protein-small molecule, posttranslational modification, and other assays in high-throughput.

고밀도 기능성 단백질 마이크로 어레이를 프로빙하는 단백질 - 단백질 상호 작용을 검출하기

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an ...

Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions

Correct folding and assembly of proteins and protein complexes are essential for cellular function. Cells employ quality control pathways that correct, sequester or eliminate damaged proteins to maintain a healthy proteome, thus ensuring cellular proteostasis and preventing further protein damage. Because of redundant functions within the proteostasis network, screening for detectable phenotypes using knockdown or mutations in chaperone-encoding genes in the multicellular organism Caenorhabditis elegans results in the detection of minor or no phenotypes in most cases. We have developed a targeted screening strategy to identify chaperones required for a specific function and thus bridge the gap between phenotype and function. Specifically, we monitor novel chaperone interactions using RNAi synthetic interaction screens, knocking-down chaperone expression, one chaperone at a time, in animals carrying a mutation in a chaperone-encoding gene or over-expressing a chaperone of interest. By disrupting two chaperones that individually present no gross phenotype, we can identify chaperones that aggravate or expose a specific phenotype when both perturbed. We demonstrate that this approach can identify specific sets of chaperones that function together to modulate the folding of a protein or protein complexes associated with a given phenotype.

Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions

To study chaperone-chaperone and chaperone-substrate interactions, we perform synthetic interaction screens in Caenorhabditis elegans using RNA interference in combination with mild mutations or over-expression of chaperones and monitor tissue-specific protein dysfunction at the organismal level.

조직별 샤페론 상호 작용을 위해 검사하기 위해 Caenorhabditis elegans를 사용

Correct folding and assembly of proteins and protein complexes are essential for cellular function. Cells employ quality control pathways that correct, ...

Graphene Enclosure of Chemically Fixed Mammalian Cells for Liquid-Phase Electron Microscopy

A protocol is described for investigating the human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) in the intact plasma membrane of breast cancer cells using scanning transmission electron microscopy (STEM). Cells of the mammalian breast cancer cell line SKBR3 were grown on silicon microchips with silicon nitride (SiN) windows. Cells were chemically fixed, and HER2 proteins were labeled with quantum dot nanoparticles (QDs), using a two-step biotin-streptavidin binding protocol. The cells were coated with multilayer graphene to maintain a hydrated state, and to protect them from electron beam damage during STEM. To examine the stability of the samples under electron beam irradiation, a dose series experiment was performed. Graphene-coated and non-coated samples were compared. Beam induced damage, in the form of bright artifacts, appeared for some non-coated samples at increased electron dose D, while no artifacts appeared on coated samples.

Presented here is a protocol for labeling membrane proteins in mammalian cells and coating the sample with graphene for liquid-phase scanning transmission electron microscopy. The stability of the samples against the damage caused by radiation can also studied with this protocol.

액체 상 전자 현미경 검사를 위한 화학적으로 고정된 포유류 세포의 그래핀 인클로저

A protocol is described for investigating the human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) in the intact plasma membrane of breast cancer cells using ...

Culture Methods to Study Apical-Specific Interactions using Intestinal Organoid Models

The lining of the gut epithelium is made up of a simple layer of specialized epithelial cells that expose their apical side to the lumen and respond to external cues. Recent optimization of in vitro culture conditions allows for the re-creation of the intestinal stem cell niche and the development of advanced 3-dimensional (3D) culture systems that recapitulate the cell composition and the organization of the epithelium. Intestinal organoids embedded in an extracellular matrix (ECM) can be maintained for long-term and self-organize to generate a well-defined, polarized epithelium that encompasses an internal lumen and an external exposed basal side. This restrictive nature of the intestinal organoids presents challenges in accessing the apical surface of the epithelium in vitro and limits the investigation of biological mechanisms such as nutrient uptake and host-microbiota/host-pathogen interactions. Here, we describe two methods that facilitate access to the apical side of the organoid epithelium and support the differentiation of specific intestinal cell types. First, we show how ECM removal induces an inversion of the epithelial cell polarity and allows for the generation of apical-out 3D organoids. Second, we describe how to generate 2-dimensional (2D) monolayers from single cell suspensions derived from intestinal organoids, comprised of&#160;mature and differentiated cell types. These techniques provide novel tools to study apical-specific interactions of the epithelium with external cues in vitro and promote the use of organoids as a platform to facilitate precision medicine.

Here we present two protocols that allow the modeling of intestinal apical-specific interactions. Organoid-derived intestinal monolayers and Air-Liquid Interface (ALI) cultures facilitate the generation of well-differentiated epithelia accessible from both luminal and basolateral sides, whereas polarity-inverted intestinal organoids expose their apical side and are amenable to high throughput assays.

장 관성 오르가노이드 모델을 사용하여 정법별 상호 작용을 연구하는 문화 방법

The lining of the gut epithelium is made up of a simple layer of specialized epithelial cells that expose their apical side to the lumen and respond to ...

Bioinformatics Resources for the Study of Glycan-Mediated Protein Interactions

The Glyco@Expasy initiative was launched as a collection of interdependent databases and tools spanning several aspects of knowledge in glycobiology. In particular, it aims at highlighting interactions between glycoproteins (such as cell surface receptors) and carbohydrate-binding proteins mediated by glycans. Here, major resources of the collection are introduced through two illustrative examples centered on the N-glycome of the human Prostate Specific Antigen (PSA) and the O-glycome of human serum proteins. Through different database queries and with the help of visualization tools, this article shows how to explore and compare content in a continuum to gather and correlate otherwise scattered pieces of information. Collected data are destined to feed more elaborate scenarios of glycan function. Glycoinformatics introduced here is, therefore, proposed as a means to either strengthen, shape, or refute assumptions on the specificity of a protein glycome in a given context.

This protocol illustrates how to explore, compare, and interpret human protein glycomes with online resources.

글리칸 매개 단백질 상호작용 연구를 위한 생물정보학 자료

The Glyco@Expasy initiative was launched as a collection of interdependent databases and tools spanning several aspects of knowledge in glycobiology. In ...