우리는 크리스토프 Bieniossek, 사이먼 Trowitzsch, 다니엘 피츠 제럴드, 유이치로 타카, 크리스티안 Schaffitzel, 이본 Hunziker, 티모시 리치몬드와 도움과 조언 버거 실험실의 과거와 현재의 회원을 감사드립니다. MultiBac 플랫폼과 개발했습니다 아낌없이 스위스 국립 과학 재단 (SNSF) 직원은 국립 공들인 (ANR)와 센터 국립 공들인 Scientifique (CNRS)와 유럽위원회 (EC) 등의 자금 지원 기관에서 지원하는 프레임 워크 프로그램 (FP) 6과 7. 다국적 액세스에 대한 지원은 EC FP7 프로젝트 P-CUBE (에 의해 제공됩니다 <a href="http://www.p-cube.eu" target="_blank">www.p-cube.eu</a> )와 BioStruct-X ( <a href="http://www.biostruct-x.eu" target="_blank">www.biostruct-x.eu</a> ). 과학의 프랑스 교육부는 특히 투자 회사 디 Avenir에서 프로젝트 FRISBI 통해 EMBL에서 MultiBac 플랫폼을 지원하기 위해 인정 받고 있습니다.

1. Multigene 사 식 구문 생성을위한 텐덤 Recombineering (TR) <ol><li> 공동 식 전략 계획. 기증자와 수락 자에 관심 유전자를 삽입하기위한 설계 방법. 귀하의 복잡한 잠재적 인 생리 서브 모듈은 특정 수락 자 및 기증자에 함께 그룹화해야합니다. 개인 기증자와 수락 플라스미드에서 발현 카세트를 결합 BstXI 쌍 7,8는 실리코에 관련된 모든 구문을 생성하고 실험적인 작업을 진행하기 전에 철저하게 전략을 검증 - 원점 복귀 효소 (HE)으로 구성된 곱셈 모듈을 사용합니다.. 예를 들어, 그 유전자는 HE 또는 다른 제한 사이트 및 정확한 열린 독서 프레임 (ORF를)의 존재를 확인해야한다 포함하지 않는 것으로 확인해야합니다. 단백질 생산 수준뿐만 아니라 EXI의 제거를 향상시키기 위해 곤충 세포 코돈과 mRNA의 이차 구조에 최적화 된 합성 유전자를 주문하는 것을 고려해야HE 관심의 유전자에서 사이트 찌르기. 유연한 또는 노출 된 N-또는 선택의 단백질의 C-말단에 대한 문헌 데이터를 기반으로 정화 태그를 배치하는 것이 좋습니다. 개별 단백질의 상대적 양이 복잡한에 의한 화학 양론 문제 제어해야하는 경우 복잡한 여러 가지 단백질 소단위 생산을 목표로 polyprotein 전략을 적용하는 것이 좋습니다. &quot;방법&quot;문서 (전자 실험실 책을 추천합니다) 4 선발 준비합니다 포함 프로젝트의 모든 예상 실험 단계를 완료 Multigene 사 구문 (들)에 이르기까지. 버거 그룹 홈 페이지 (에서 다운로드 할 수 있습니다 크레-ACEMBLER 소프트웨어를 사용하여 예를 들어, 크레-LoxP 융합 플라스미드의 전자 파일을 생성 <a href="http://www.embl.fr/multibac/%20multiexpression_technologies/cre-acembler" target="_blank">www.embl.fr/multibac/ multiexpression_technologies / CRE-acembler</a> ). </li><li> 선택한 기증자에 관심 유전자를 삽입하고제한 효소와 리가를 사용하거나, 또는 게시 된 프로토콜에 따라 내고 독립적 인 방법을 사용하여 수용체. 5,6,14 당신은 액체 취급 워크 스테이션에 액세스 할 수 있으며 경우 생성되는 구조의 큰 수 (계획 인 경우 조합 방법에 대한 예를 들어) 액체 처리 워크 스테이션을 사용할 수없는 경우 버거 그룹 (그림 2). 14,15가 개발 및 구현 로봇 스크립트를 사용하여 고려 microtitre 플레이트를 사용하여 수동 조작 패션과 같은 HT의 유전자를 삽입 할 수 있습니다. </li><li> 표현 소단위의 화학 양론을 제어 할 필요에 의해 부과 된 제약 조건은 실현 될 수 있습니다. 단백질 복합체의 각 소단위의 화학 양 론적 불균형 발현의 경우들에 의해 간격을 하나의 큰 ORF를 귀하의 복잡한 여러 소단위와 특정 단백질 분해 효소 (예 : 담배 식각 바이러스 NIA 단백질 분해 효소)를 결합하다 할 polyprotein 전략을 적용하는 것을 고려해야pecific 단백질 분해 사이트. 4,8는 고려의 공동 표현은 여러 소단위로 매우 큰 복잡한이 널리 개별 소단위의 분자량에 이르는 경우 단일 식 카세트와 하나 또는 여러 polyproteins합니다. 고려의 공동 발현하는 단백질이 낮은 생산 수율로 특징되는 경우 polyprotein 또는 여러 개의 동일한 표현 카세트와 같은 단백질 코딩 몇 가지 유전자를. 4,13 </li><li> 제한 매핑 (선택적으로 높은 처리량)과 시퀀싱에 의해 복제 된 모든 도너와 억 셉터 구조를 확인합니다. 선택의 Multigene 사 식 구조를 생성하는 크레-LoxP 재조합에 의해 기증자 수락 조합을 융합로 이동합니다. 제한 매핑에 의해 수락 기증자 융합 플라스미드를 정제 검증, 크레-ACEMBLER 또는 참조로 유사한 프로그램에 의해 생성 된 전자 시퀀스를 사용합니다. </li><li> -20 ° C에서 정제 및 검증 기부자, 수락 자 및 기증자 수락 융합을 저장하거나 -80 ° C. 아카이브 PLasmids 나중에 사용을 위해 신중하게 시퀀스 (Microsoft Excel에서 파일 메이커, 등). </li></ol> 2. 복합 Multigene 사에 배큘로 바이러스 생성, 증폭 및 저장 <ol><li> 바이러스 게놈 Tn7 전위에 필요한 기능을 숨겨 DH10 세포로 변환하여 Multigene 사 전송 벡터에게 MultiBac baculoviral 게놈을 통합 할 수 있습니다. Multibac baculoviral 게놈 Tn7 통합 이전 생체 크레 반응에 의해 자신의 LoxP 사이트에서 관심있는 특정 유전자 (YFP 마커, 보호자 등) (Tn7 첨부 파일 사이트에 말초 게놈에 설계)를 미리로드 할 수 있습니다. 13 Tn7 치환 한 후, 관심있는 유전자를 포함하는 복합 배큘로 바이러스와 세포 블루 / 화이트 심사 (β-갈 락토시다 아제의 α-상보성의 손실에 성공 Tn7 전위의 결과에 의해 선택되어 있으므로, 정확한 Tn7 전위와 식민지 선택에 흰색 남아갈치 X-gal을 포함하고있는 고체 배지)와 게놈 알칼리 용해, 에탄올 / 이소프로판올 침전에 의해 준비가되어 있습니다. 5,6 </li><li> 형질 전환 및 초기 바이러스 제작. 멸균 후드에 장소는 6 - 잘 조직 배양 플레이트. 로그 상 SF21 곤충 세포 배양에서 설명 된 배양 배지에 혼합 정제 baculoviral 게놈의 transfection 시약을 추가하여 우물과 형질에있는 세포의 분주 밖으로 씨. 미디어를 제거하여 48-60 시간 후 6 수확 초기 바이러스 ( 높은 품질, 낮은 역가의 바이러스 V 0, 잘 당 일반적으로 3 ML). 추가 2-3 일 에의 한 발송 후 단백질 생산을위한 새로운 미디어 및 테스트 (그리고, YFP 마커가있는 경우, 형광)을 보충합니다. 6,7 </li><li> 바이러스의 증폭, 낮은 MOI 요법. 작은 (100-250 ML) 삼각 플라스크 셰이커 동요에 로그 단계에서 세포의 25-50 ML (ML 당 세포 밀도는 &lt;1X10 6 세포)를 감염 V 0 바이러스를 사용궤도 플랫폼 셰이커 (그림 3). 세포를 카운트하고 세포 (확산 체포) 두배을 중지 할 때까지 매 24 시간을 분할합니다. (셀 당 바이러스 입자의 감염 즉, 수의 다양성) MOI 낮은식이 요법을 따르 세포는 한 번 (MOI &lt;1), 그렇지 않으면 V 0의 작은 볼륨 실험을 반복한다 (적어도) 두 번해야 덧붙였다. 일반적으로, V 0의 3 ㎖를 0.5x10 6 세포 / ㎖의 농도로 SF21 곤충 세포의 25 ML를 감염하는 데 사용됩니다. 이 해로운 것을 방지하는 것이 필수적입니다 이형 유전자의 손실이 발생할 수있는 바이러스에 앰프 및 자동 삭제. 세포 펠렛 및 바이러스를 포함하는 미디어를 제거하여 48-60 시간 후 수확 V 1 바이러스 (25-50 ML). 6, 1X10 6 개의 세포마다 12 또는 24 시간을 제거 펠렛 단백질 생산 및 마커 단백질 (YFP) 신호를 검증.하여 YFP 단백질 생산을위한 새로운 미디어와 시험과 보충 (에 바이러스를 증폭V 2) 더 큰 식 볼륨은 위의 낮은 MOI식이 요법 (세포가 V 1 감염 후 적어도 한 번 두 번해야합니다) 존중 V 1 바이러스 2 L 쉐이크 플라스크에 400 ML의 셀을 감염시켜 목표로하는 경우. 엄격 더 이상 관심의 유전자를 포함하지 않는 결함이 바이러스의 축적을 방지하기 위해 증폭하는 동안 단백질 생산 및 마커 단백질 신호를 테스트 할 수 있습니다. 각각의 증폭에 축적 5-7를 사용하여 세포 펠렛은 관심의 표현 단백질 복합체에 대한 정화 프로토콜을 설정하기위한 단계에서 이미. </li><li> 생산 바이러스의 BIIC 저장. 우리는 강력하게 사용하여 제작 바이러스로 V 2 바이러스를 저장하는 것이 좋습니다 BIIC (B aculovirus - 나는 C ELL 학생을 nsect nfected) 재조합 바이러스의 수정 (관심의 유전자의 예를 들면 손실) 방지하고 높은 표현을 보존하는 방법을 수평의 확산 체포 후 24 시간이 관찰되어 16 펠렛 감염된 세포 -.들이 미디어에 (신진)에 의해 출시 될 직전에이 단계의 세포에 완료 바이러스 입자가 포함되어 있습니다. 액체 질소에 미디어와 세포 펠렛의 동결 분주을 제거하고 무기한 저장합니다. 7,16가 </li></ol> 3. 단백질 생산 및 다운 스트림 처리 <ol><li> 대형 (R) 문화 및 모니터링 YFP를 감염. 생산 실행 (2 L 플라스크에 일반적으로 400 ML)에 대한 더 큰 세포 배양 감염을 V 1, V 2 또는 냉동 BIIC 분주을 사용합니다. 낮은 MOI 요법 (예 :이 감염된 문화가 적어도 한 번 두 배로 감염에 사용되는 바이러스 볼륨을 조정)을 준수하십시오. 플라스크의 수를 곱하여 필요한 경우 감염된 문화 볼륨을 확대합니다. YFP 마커 단백질이 존재하는 경우, 정의 된 간격 1X10 6 개의 세포에서 철수 펠렛 세포를 용해하고 고원이 공업에 도달 할 때까지 YFP 신호의 변화를 모니터링최대 재조합 단백질 생산을 icating. YFP 수준은 형광 신호 (예를 들어 TECAN SPECTRAFluor)을 기록 할 수있는 표준 96 웰 플레이트 리더로 측정 할 수 있습니다. 이 단계에서 수확 세포. -20 ° C (단기) 또는 -80에서 보관 세포 펠렛 ° C (장기). </li><li> 세포 용해 및 분별. 귀하의 단백질 요구 사항 (동결 - 해동, 초음파, 프렌치 프레스, 등)에 맞게 선택의 당신의 마음에 드는 방법으로 세포를 용해. 5-7 분별 세포질과 관심의 단백질의 존재에 대한 핵 및 테스트. 단백질 정제를 단순화하기 위해 결과에 따라 정화 프로토콜을 개발한다. 귀하의 단백질이 핵에있는 경우 높은 KCl을 조건으로 핵 분획에서 단백질을 추출하기 위해 적시 절차를 적용을 고려하십시오. 7,18 </li><li> 단백질 정제 (마이크로 스케일, 대규모). 세포 배양의 종종 작은 볼륨 (10, 25 ml)에 쓰입니다 점에 유의때문에 배큘로 바이러스 / 곤충 세포 시스템 (L 문화와 더 많은 당 단백질의 자주 10-100 MG)에서 외래 단백질의 일반적으로 높거나 매우 높은 생산 수준으로 관심의 단백질의 상당한 금액을 정화 세포 펠렛을 얻기위한 fficient. 마이크로 정화 (다중 웰 플레이트, microtip을 방법, GE 헬스 케어 ÄKTAmicro 시스템 등)와 함께에서 생화학 및 활동 자료와 종종 나노 리터 규모의 높은 처리량 결정에 대해 원하는 단백질과 복합체의 충분한 양 (HTX을 얻을 수있다 ). 작은의 이온 교환 및 크기 배제 크로마토 그래피와 함께, 정화를 촉진하기 복잡하여 단백질의 노출 소단위에 금속 친화력 정화 (Clonetech 다카라 TALON 퀴 아젠 NiNTA 금속 킬레이트 수지)와 올리고-히스티딘 (6-10 잔류) 태그를 사용하는 것이 좋습니다 예를 들어 ÄKTAmicro 또는 유사한 작은 양 정화 기계를 (그림 4 사용 권 </st룽&gt;). 다른 친화력 정화 단계와 올리고-히스티딘 태그 또는 다른 태그와 친화력 정화뿐만 아니라 이온 교환 (IEX) 단계는 (다른 GST, MBP, CBP에서 선택) 할 수 있고 고려되어야한다, 단백질의 생화학 적 특성에 따라 관심과 개별 환경 설정. 정화 효율을 향상시키기 위해 선호도의 태그를 하나 이상의 단위체를 고려하십시오. 당신의 정제 단백질 단지를 집중하고 글리세롤의 유무에 관계없이 동결 등의 스토리지 프로토콜을 설정할 수 있습니다. 당신의 정제 단백질의 배치 별 변화를 평가하기 위해 (활동 분석, 생화학 및 생물 물리학 시험) 표준으로 적용 할 수있는 품질 관리 기준을 개발한다. </li></ol>

<ol>
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O., Berger, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ACEMBLing+multigene+expression+constructs+by+recombineering.">ACEMBLing multigene expression constructs by recombineering.</a> Nat. Protocols. , (2009).</li><li>Wasilko, D. J., Lee, S. E., Stutzman-Engwall, K. J., Reitz, B. A., Emmons, T. L., Mathis, K. J., Bienkowski, M. J., Tomasselli, A. 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D., Angst, B., Fitzgerald, D. J., DeLuca, C., Schimmele, K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+mechanism+of+the+chromatin+remodelling+factor+ISW1a.">Structure and mechanism of the chromatin remodelling factor ISW1a.</a> Nature. 472 (7344), 448-453 (2011).</li></ol>

IB는 여기에 설명 된 기술의 일부를 자세히 설명 특허 및 특허 출원에 발명가이다.

그림 2와 3의 비디오 스냅 샷 Multigene 사 표현의 cDNA를에서 로봇을 이용한 세대에서 전체 프로세스를 설명하는 단백질 생산을위한 곤충 세포 배양 감염으로 모든 방법을 구성합니다. 새로운 시약 (플라스미드 및 바이러스) 및 강력한 프로토콜을 표준 운영 절차에 의존하는 파이프 라인을 사용하기 위해 개발되었습니다. 전체 파이프 라인은 그르노블에서 EMBL에서 플랫폼 기술로 구현되?...

생물학적 활성은 단백질과 세포 기능을 촉진하기 위해 콘서트에서 역할을 다른 생체 분자의 어셈블리에 의해 제어됩니다. 주목할만한 예는 메신저 RNA에 DNA에 들어있는 유전 정보를 표기 기계 있습니다. 인간, 100 개 이상의 단백질이다 RNA 중합 효소 II와 같은 TFIID, TFIIH 등과 같은 일반적인 전사 인자. 9 다른 예제를 포함하여 10 더 소단위 대형 multiprotein의 단지를 형성 유전자를 속기 정의와 규제 과정에서 함께 온 리보솜, 단백질 합성, 또는 진핵 생물의 핵 봉투를 통해 생체 분자를 왕복을 담당하는 핵 기공 복합체를 촉매 많은 단백질과 RNA 분자로 구성. 셀에 기본적으로 모두 다 성분계 시스템의 상세한 건축 및 생화학 해부 그들의 기능을 이해하는 것이 중요합니다. 원핵 세포와 eukar의 구조 규명yotic 리보솜은, 예를 들어, 이러한 고분자 기계 셀에 자신의 지정된 기능을 수행하는 방법에 전례없는 통찰력을 항복 특징 이벤트를 창설. 10,11 리보솜은 최대 세포 질량의 30 %가 리보솜으로 구성되어 있다는 사실로 인해 배양 세포에서 내인성 물질을 정화하여 자세한 연구를위한 충분한 질과 양에서 얻을 수 있습니다. RNA 중합 효소 II는 다른 중요한 단지의 압도적 인 다수가있는 그러나 존재 이미 효모 문화의 적은 크기의 순서로 풍부한, 많은 천 리터 전사의 중심이 필수적인 복합의 세부 원자 뷰를 얻기 위해 처리해야했습니다. 12 따라서 원시 세포, 그리고 훨씬 낮은 금액 네이티브 소스 재료에서 적절하게 정제 할 수 없습니다. 자세한 구조와 기능 분석에 액세스 같은 단지를 렌더링하려면 재조합 테를 사용하여 이종의 생산을 필요로chniques. 재조합 단백질 생산은 생명 과학 연구에 큰 영향을 미쳤다. 대부분의 단백질은 재조합 생산, 그들의 구조와 기능은 높은 해상도 해부 하였다. 구조 유전체학 프로그램은 높은 처리량 (HT) 모드에서 전체 생물의 유전자 제품의 레퍼토리를 해결하기 위해 많은 생물의 게놈의 해명의 장점을 가지고있다. 단백질 구조의 수천 따라서 결정되었습니다. 지금까지, 재조합 단백질 생산을위한 가장 다산 사용되는 시스템은 E.되었습니다 대장균, 많은 발현 시스템이 호스트 외래 생산 년 동안 개발하고 세련되었다. E.에서 단백질 생산을 가능하게하는 기능의 과다를 숨겨 플라스미드 대장균 상업 제공자의 전체 카탈로그를 작성하십시오. 하지만, E. 대장균은 많은 진핵 생물의 단백질을 생산하는 것이 적합하지 않은 특정 제한 사항이 있습니다 및 P의많은 소단위와 관절 단백질 복합체. 따라서, 진핵 호스트 단백질 생산은 증가 최근 몇 년 동안 선택의 방법이되었다. 진핵 생물의 단백질을 생산하기 위해 특별히 잘 적응 시스템은 실험실에서 재배 곤충 세포 배양을 감염 외래 유전자를 운반하는 재조합 배큘로 바이러스에 의존 배큘로 바이러스 발현 벡터 시스템 (BEVS)입니다. MultiBac 시스템은 특히 많은 소단위 (그림 1) 진핵 세포 단백질 단지의 생산에 맞게 조정되어 더 최근에 개발 된 BEVS입니다. MultiBac는 2004 년에 처음 도입되었다. 13는 도입 이후, MultiBac 지속적으로 세련되어 있고, 취급을 간단하게 목적 단백질의 품질을 개선하고 일반적으로 효율적인 표준 운영 절차 (SOP에)를 설계하여 비 전문가 사용자에게 시스템에 액세스 할 수 있도록하는 스트림 - 늘어서있다. 4 MultiBac는 AC에 전 세계적으로 많은 실험실에서 구현되었습니다ademia 산업. 그르노블에서 EMBL에서 다국적 액세스 프로그램은 그들의 연구를 발전이 생산 시스템을 사용하고자 과학자 MultiBac 플랫폼에서 전문적인 교육을 제공하기 위해 유럽위원회에 의해 장소에 넣어했다. 그들은 EMBL 그르노블에서 MultiBac 시설에 운영에 있기 때문에 지금까지 접근되지 않은 많은 단백질 복합체의 구조와 기능 MultiBac으로 제작 샘플을 사용하여 해명했다. 4 다음에서 MultiBac 생산의 필수적인 단계는 프로토콜에 요약되어있다.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bluo-Gal</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>15519-028 (1 g)</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tetracycline</td>
 <td>Euromedex</td>
 <td>UT2965-B (25 g)</td>
 <td>1,000X at 10 mg/ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Kanamycine</td>
 <td>Euromedex</td>
 <td>EU0420 (25 g)</td>
 <td>1,000X at 50 mg/ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Gentamycine</td>
 <td>SIGMA</td>
 <td>G3632 (5 g)</td>
 <td>1,000X at 10 mg/ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>IPTG</td>
 <td>Euromedex</td>
 <td>EU0008-B (5 g)</td>
 <td>1,000X at 1M</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cre-recombinase</td>
 <td>New England BioLabs</td>
 <td>M0298</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>X-Treme GENE HP transfection reagent</td>
 <td>Roche</td>
 <td>06 366 236 001</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hyclone SFM4 Insect</td>
 <td>Thermo Scientific</td>
 <td>SH 30913.02</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>6-well plate Falcon</td>
 <td>Dominique Dutscher</td>
 <td>353046</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2 ml pipette Falcon</td>
 <td>Dominique Dutscher</td>
 <td>357507</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5 ml pipette Falcon</td>
 <td>Dominique Dutscher</td>
 <td>357543</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10 ml pipette Falcon</td>
 <td>Dominique Dutscher</td>
 <td>357551</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>25 ml pipette Falcon</td>
 <td>Dominique Dutscher</td>
 <td>357535</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>50 ml pipette Falcon</td>
 <td>Dominique Dutscher</td>
 <td>357550</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>50 ml tube Falcon</td>
 <td>Dominique Dutscher</td>
 <td>352070</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>15 ml tube Falcon</td>
 <td>Dominique Dutscher</td>
 <td>352096</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1.8 ml cryotube Nunc</td>
 <td>Dominique Dutscher</td>
 <td>55005</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>100 ml shaker flasks Pyrex</td>
 <td>Dominique Dutscher</td>
 <td>211917</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>250 ml shaker flasks Pyrex</td>
 <td>Dominique Dutscher</td>
 <td>211918</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>500 ml shaker flasks Pyrex</td>
 <td>Dominique Dutscher</td>
 <td>211919</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2 L shaker flasks Pyrex</td>
 <td>Dominique Dutscher</td>
 <td>211921</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Certomat Orbital Shaker + plateau</td>
 <td>Sartorius</td>
 <td>4445110, 4445233</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Liquid nitrogen tank dewar 35 L</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>M76801</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Biological Safety Cabinet Faster</td>
 <td>Sodipro</td>
 <td>FASV20000606</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Optical Microscope</td>
 <td>Zeiss</td>
 <td>451207</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sf21 Insect cells</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hi5 Insect cells</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>B855-02</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tecan freedom EVO running Evoware plus</td>
 <td>TECAN</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10 &mu;l conductive tips (black),</td>
 <td>TECAN</td>
 <td>10 612 516</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>200 &mu;l conductive tips (black)</td>
 <td>TECAN</td>
 <td>10 612 510</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>disposable trough for reagents, 100 ml</td>
 <td>TECAN</td>
 <td>10 613 049</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>twin.tec PCR plate 96, skirted</td>
 <td>Eppendorf</td>
 <td>0030 128.648</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>96 well V bottom, non sterile</td>
 <td>BD falcon</td>
 <td>353263</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>96 deepwell plate color natural, PP)</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>M3752M</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PS microplate, 96 well flat bottom</td>
 <td>Greiner</td>
 <td>655101</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>96 deepwell plate</td>
 <td>Thermo scientific</td>
 <td>AB-0932</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>24 well blocks RB</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>19583</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DpnI restriction enzyme</td>
 <td>NEB</td>
 <td>R0176L</td>
 <td>20 U/uL</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NEBuffer 4 10X</td>
 <td>NEB</td>
 <td>B7004S</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2X phusion mastermix HF</td>
 <td>Finnzyme</td>
 <td>ref F-531L</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2X phusion mastermix GC</td>
 <td>Finnzyme</td>
 <td>ref F-532L</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DGLB 1.5X</td>
 <td>homemade</td>
 <td></td>
 <td>7.5% glycerol, 0.031% Bromophenol blue, 0.031% Xylen cyanol FF</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>High DNA Mass Ladder for e-gel</td>
 <td>Life Technologies</td>
 <td>10496-016</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Low DNA Mass Ladder for e-gel</td>
 <td>Life Technologies</td>
 <td>10068-013</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>E-gel 48 1% agarose GP</td>
 <td>Life Technologies</td>
 <td>G8008-01</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nucleo Spin- robot-96 plasmid kit</td>
 <td>Macherey Nagel</td>
 <td>740 708.24</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PCR clean-up kit, Nucleospin Robot-96 Extract</td>
 <td>Macherey Nagel</td>
 <td>740 707.2</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Gotaq green master mix</td>
 <td>Promega</td>
 <td>M7113</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>T4 DNA polymerase, LIC-qualified</td>
 <td>Novagen</td>
 <td>70099-3</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DTT 100 mM</td>
 <td>homemade</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Urea 2 M</td>
 <td>homemade</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EDTA 500 mM pH 8.0</td>
 <td>Homemade</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>LB broth (Miller) 500 g</td>
 <td>Athena ES</td>
 <td>103</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

the multibac protein complex production platform at the embl

프로테오믹스 연구는 전례없는 정밀도 진핵 세포 프로테옴의 인상적인 복잡성을 밝혔다. 지금 세포에있는 단백질은 주로 고립 된 개체로하지 존재하지만, 대부분의 경우 모든 생명 기능을위한 셀의 조립 라인을 형성, 인간 10 명 이상, 많은 다른 단백질과 관련있는 생물학적 활성을 발휘하는 일반적으로 인정 개념이다. 1 이 multiprotein의 어셈블리의 기능과 구조의 2 지식은 자세한 분석을 위해 우수한 품질과 충분한 양에서의 공급이 필요합니다. 세포에서 많은 단백질 단지의 소수는 진핵 세포에서 특히 네이티브 소스에서 해당 추출을 금지하고, 재조합 생산을 필요로한다. 배큘로 바이러스 발현 벡터 시스템 (BEVS)는 진핵 생물의 단백질을 생산하는 데 특히 유용한 것으로 입증되었습니다,의 활동은 종종 번역 후 처리에 의존하는 다른 일반적으로 사용되는 발현 시스템은 종종 할 수있는지원하지 3. BEVS 관심의 유전자가 차례로 선택의 단백질을 생산하는 곤충 세포 배양을 감염 삽입 된 재조합 배큘로 바이러스를 사용합니다. MultiBac 특히 많은 소단위를 포함하는 진핵 세포 단백질 단지의 생산을위한 맞춤형 된 BEVS이다. 4 효율적인 단백질 생산과 단지를위한 중요한 전제 조건 이상적으로 구현 될 수있는 식 실험에 관련된 모든 단계에 대한 강력한 프로토콜입니다 표준 작업 절차 (SOP)와 비교 쉽게 전문가가 아닌 사용자도 따랐다. 유럽​​ 분자 생물학 연구소 (EMBL)에서 MultiBac 플랫폼은 단백질의 소규모 분석 외래 단백질 생산 특성에 최적화 된 설계 baculoviral 게놈에 유전자의 삽입부터 시작 multiprotein의 복잡한 발현 실험에 관련된 모든 단계에 대한 SOP를 사용 생산 시편. 5-8 플랫폼EMBL 그르노블에서 오픈 액세스 모드로 설치되어 학계 및 단백질의 복잡한 연구 프로젝트를 가속화하는 업계의 많은 과학자를 지원하고 있습니다.

MultiBac 시스템에 의해 달성 이종 단백질의 강력한 공동 발현은 그림 1D (서스펜션 세포 배양 감염 후 48 시간 촬영 프로브)에 표시됩니다. 과다 발현 단백질 밴드는 전체 세포 추출물 (SNP) 및 삭제 해물 (SN)에 명확하게 식별 할 수 있습니다. 생산 된 단백질 재료의 품질과 수량은 종종 그림 1E에서와 같이 같은 유사 분열 체크 포인트 복잡한 MCC 등의 단백질 복합체의 구조 결정...

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The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

단백질 단지 키 세포 기능을 촉진. 많은 필수 단지의 자세한 기능 및 구조 특성은 재조합 생산을 필요로합니다. MultiBac 특히 진핵 세포 단백질과 복합체를 표현하기위한 맞춤형 배큘로 바이러스 / 곤충 세포 시스템입니다. MultiBac는 오픈 액세스 플랫폼, 자사의 유틸리티를 극대화하기 위해 개발 된 표준 운영 절차로 구현되었다.

EMBL에서 MultiBac 단백질 복잡한 생산 플랫폼

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

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Research

JoVE Journal

Biology

15.8K 조회수.  EMBL Grenoble Outstation and Unit of Virus Host Cell Interactions (UVHCI) UMR5322. 단백질 단지 키 세포 기능을 촉진. 많은 필수 단지의 자세한 기능 및 구조 특성은 재조합 생산을 필요로합니다. MultiBac 특히 진핵 세포 단백질과 복합체를 표현하기위한 맞춤형 배큘로 바이러스 / 곤충 세포 시스템입니다. MultiBac는 오픈 액세스 플랫폼, 자사의 유틸리티를 극대화하기 위해 개발 된 표준 운영 절차로 구현되었다.

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Gross Dissection of the Stomach of the Lobster, Homarus Americanus

The stomach of the American lobster (Homarus americanus) is located in the cephalothorax, between the rostrum and the cervical groove. The anterior end of the stomach is defined by the mouth opening and the posterior end by the bottom of the pylorus. Along the dorsal side of the stomach lies the stomatogastric nervous system (STNS). This nervous system, which contains rhythmic networks that underlie feeding behavior, is an established model system for studying rhythm generating networks and neuromodulation 1,2. While it is possible to study this system in vivo 3, the STNS continues to produce its rhythmic activity when isolated in vitro. In order to study this system in vitro the stomach must be removed from the animal. This video article describes how the stomach can be dissected from the American lobster. In an accompanying video article4 we demonstrate how the STNS can be isolated from the stomach.

Gross Dissection of the Stomach of the Lobster, Homarus Americanus

We describe the gross dissection of the stomach of the American lobster (Homarus americanus).

랍스터의 뱃속의 총 해부, Homarus Americanus</em

The stomach of the American lobster (Homarus americanus) is located in the cephalothorax, between the rostrum and the cervical groove. The anterior end of ...

연구

생물학

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

유기 용매 및 초산없이 쿠매시 G - 250로 젤의 단백질 염색법

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based fractionation. The system is comprised of single-use, 8-sample capacity cartridges and a benchtop GELFREE Fractionation Instrument. During separation, a constant voltage is applied between the anode and cathode reservoirs, and each protein mixture is electrophoretically driven from a loading chamber into a specially designed gel column gel. Proteins are concentrated into a tight band in a stacking gel, and separated based on their respective electrophoretic mobilities in a resolving gel. As proteins elute from the column, they are trapped and concentrated in liquid phase in the collection chamber, free of the gel. The instrument is then paused at specific time intervals, and fractions are collected using a pipette. This process is repeated until all desired fractions have been collected. If fewer than 8 samples are run on a cartridge, any unused chambers can be used in subsequent separations.
This novel technology facilitates the quick and simple separation of up to 8 complex protein mixtures simultaneously, and offers several advantages when compared to previously available fractionation methods. This system is capable of fractionating up to 1mg of total protein per channel, for a total of 8mg per cartridge. Intact proteins over a broad mass range are separated on the basis of molecular weight, retaining important physiochemical properties of the analyte. The liquid phase entrapment provides for high recovery while eliminating the need for band or spot cutting, making the fractionation process highly reproducible1.

The accompanying video describes the use of the GELFREE 8100 Fractionation System, which partitions complex protein samples on the basis of molecular weight and recovers the fractions in liquid phase. The video describes how the technology works, how it is used, and provides resultant data, with polyacrylamide gel electrophoresis analysis of fractionated bovine liver homogenate.

액상 복구와 분자량 기반 분류에 대한 GELFREE 8100 분획화 시스템을 사용하여

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Production of Tissue Microarrays, Immunohistochemistry Staining and Digitalization Within the Human Protein Atlas

The tissue microarray (TMA) technology provides the means for high-throughput analysis of multiple tissues and cells. The technique is used within the Human Protein Atlas project for global analysis of protein expression patterns in normal human tissues, cancer and cell lines. Here we present the assembly of 1 mm cores, retrieved from microscopically selected representative tissues, into a single recipient TMA block. The number and size of cores in a TMA block can be varied from approximately forty 2 mm cores to hundreds of 0.6 mm cores. The advantage of using TMA technology is that large amount of data can rapidly be obtained using a single immunostaining protocol to avoid experimental variability. Importantly, only limited amount of scarce tissue is needed, which allows for the analysis of large patient cohorts 1 2. Approximately 250 consecutive sections (4 &mu;m thick) can be cut from a TMA block and used for immunohistochemical staining to determine specific protein expression patterns for 250 different antibodies. In the Human Protein Atlas project, antibodies are generated towards all human proteins and used to acquire corresponding protein profiles in both normal human tissues from 144 individuals and cancer tissues from 216 different patients, representing the 20 most common forms of human cancer. Immunohistochemically stained TMA sections on glass slides are scanned to create high-resolution images from which pathologists can interpret and annotate the outcome of immunohistochemistry. Images together with corresponding pathology-based annotation data are made publically available for the research community through the Human Protein Atlas portal (<a href="http://www.proteinatlas.org" target="_blank">www.proteinatlas.org</a>) (Figure 1) 3 4. The Human Protein Atlas provides a map showing the distribution and relative abundance of proteins in the human body. The current version contains over 11 million images with protein expression data for 12.238 unique proteins, corresponding to more than 61% of all proteins encoded by the human genome.

Tissue microarrays allows for an efficient method to gain concurrent information from a multitude of tissues. Representative parts of tissues are assembled into a single paraffin block. Sections from the block are used for immunohistochemistry and analysis of protein expression patterns. Digital scanning generates corresponding images for distribution of data.

인간 단백질 아틀라스 이내 조직 Microarrays, Immunohistochemistry의 염색법과 디지털 제작

The  tissue microarray (TMA) technology provides the means for high-throughput  analysis of multiple tissues and cells. The technique is used within the ...

A Convenient and General Expression Platform for the Production of Secreted Proteins from Human Cells

Recombinant protein expression in bacteria, typically E. coli, has been the most successful strategy for milligram quantity expression of proteins. However, prokaryotic hosts are often not as appropriate for expression of human, viral or eukaryotic proteins due to toxicity of the foreign macromolecule, differences in the protein folding machinery, or due to the lack of particular co- or post-translational modifications in bacteria. Expression systems based on yeast (P. pastoris or S. cerevisiae) 1,2, baculovirus-infected insect (S. frugiperda or T. ni) cells 3, and cell-free in vitro translation systems 2,4 have been successfully used to produce mammalian proteins. Intuitively, the best match is to use a mammalian host to ensure the production of recombinant proteins that contain the proper post-translational modifications. A number of mammalian cell lines (Human Embryonic Kidney (HEK) 293, CV-1 cells in Origin carrying the SV40 larget T-antigen (COS), Chinese Hamster Ovary (CHO), and others) have been successfully utilized to overexpress milligram quantities of a number of human proteins 5-9. However, the advantages of using mammalian cells are often countered by higher costs, requirement of specialized laboratory equipment, lower protein yields, and lengthy times to develop stable expression cell lines. Increasing yield and producing proteins faster, while keeping costs low, are major factors for many academic and commercial laboratories.
Here, we describe a time- and cost-efficient, two-part procedure for the expression of secreted human proteins from adherent HEK 293T cells. This system is capable of producing microgram to milligram quantities of functional protein for structural, biophysical and biochemical studies. The first part, multiple constructs of the gene of interest are produced in parallel and transiently transfected into adherent HEK 293T cells in small scale. The detection and analysis of recombinant protein secreted into the cell culture medium is performed by western blot analysis using commercially available antibodies directed against a vector-encoded protein purification tag. Subsequently, suitable constructs for large-scale protein production are transiently transfected using polyethyleneimine (PEI) in 10-layer cell factories. Proteins secreted into litre-volumes of conditioned medium are concentrated into manageable amounts using tangential flow filtration, followed by purification by anti-HA affinity chromatography. The utility of this platform is proven by its ability to express milligram quantities of cytokines, cytokine receptors, cell surface receptors, intrinsic restriction factors, and viral glycoproteins. This method was also successfully used in the structural determination of the trimeric ebolavirus glycoprotein 5,10.
In conclusion, this platform offers ease of use, speed and scalability while maximizing protein quality and functionality. Moreover, no additional equipment, other than a standard humidified CO2 incubator, is required. This procedure may be rapidly expanded to systems of greater complexity, such as co-expression of protein complexes, antigens and antibodies, production of virus-like particles for vaccines, or production of adenoviruses or lentiviruses for transduction of difficult cell lines.

In the post-human genomics era, the availability of recombinant proteins in native conformations is crucial to structural, functional and therapeutic research and development. Here, we describe a test- and large-scale protein expression system in human embryonic kidney 293T cells that can be used to produce a variety of recombinant proteins.

인간의 세포에서 분비 단백질의 생산을위한 편리하고 일반적인 표현 플랫폼

Recombinant protein expression in bacteria, typically E. coli, has been the most successful strategy for milligram quantity expression of proteins. ...

The Logic, Experimental Steps, and Potential of Heterologous Natural Product Biosynthesis Featuring the Complex Antibiotic Erythromycin A Produced Through E. coli

The heterologous production of complex natural products is an approach designed to address current limitations and future possibilities. It is particularly useful for those compounds which possess therapeutic value but cannot be sufficiently produced or would benefit from an improved form of production. The experimental procedures involved can be subdivided into three components: 1) genetic transfer; 2) heterologous reconstitution; and 3) product analysis. Each experimental component is under continual optimization to meet the challenges and anticipate the opportunities associated with this emerging approach.
Heterologous biosynthesis begins with the identification of a genetic sequence responsible for a valuable natural product. Transferring this sequence to a heterologous host is complicated by the biosynthetic pathway complexity responsible for product formation. The antibiotic erythromycin A is a good example. Twenty genes (totaling &gt;50 kb) are required for eventual biosynthesis. In addition, three of these genes encode megasynthases, multi-domain enzymes each ~300 kDa in size. This genetic material must be designed and transferred to E. coli for reconstituted biosynthesis. The use of PCR isolation, operon construction, multi-cystronic plasmids, and electro-transformation will be described in transferring the erythromycin A genetic cluster to E. coli.
Once transferred, the E. coli cell must support eventual biosynthesis. This process is also challenging given the substantial differences between E. coli and most original hosts responsible for complex natural product formation. The cell must provide necessary substrates to support biosynthesis and coordinately express the transferred genetic cluster to produce active enzymes. In the case of erythromycin A, the E. coli cell had to be engineered to provide the two precursors (propionyl-CoA and (2S)-methylmalonyl-CoA) required for biosynthesis. In addition, gene sequence modifications, plasmid copy number, chaperonin co-expression, post-translational enzymatic modification, and process temperature were also required to allow final erythromycin A formation.
Finally, successful production must be assessed. For the erythromycin A case, we will present two methods. The first is liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) to confirm and quantify production. The bioactivity of erythromycin A will also be confirmed through use of a bioassay in which the antibiotic activity is tested against Bacillus subtilis. The assessment assays establish erythromycin A biosynthesis from E. coli and set the stage for future engineering efforts to improve or diversify production and for the production of new complex natural compounds using this approach.

The Logic, Experimental Steps, and Potential of Heterologous Natural Product Biosynthesis Featuring the Complex Antibiotic Erythromycin A Produced Through E. coli

The heterologous biosynthesis of erythromycin A through E. coli includes the following experimental steps: 1) genetic transfer; 2) heterologous reconstitution; and 3) product analysis. Each step will be explained in the context of the motivation, potential, and challenges in producing therapeutic natural products using E. coli as a surrogate host.

을 통해 생산 단지 항생제 에리스로 마이신을 자랑하는 논리, 실험 단계, 그리고 Heterologous 자연 제품 생합성의 잠재적<em&gt; E. 대장균</em

The heterologous production of complex natural products is an approach designed to address current limitations and future possibilities.  It is ...

Protein Isolation from the Developing Embryonic Mouse Heart Valve Region

Western blot analysis is a commonly employed technique for detecting and quantifying protein levels. However, for small tissue samples, this analysis method may not be sufficiently sensitive to detect a protein of interest. To overcome these difficulties, we examined protocols for obtaining protein from adult human cardiac valves and modified these protocols for the developing early embryonic mouse counterparts. In brief, the mouse embryonic aortic valve regions, including the aortic valve and surrounding aortic wall, are collected in the minimal possible volume of a Tris-based lysis buffer with protease inhibitors. If required based on the breeding strategy, embryos are genotyped prior to pooling four embryonic aortic valve regions for homogenization. After homogenization, an SDS-based sample buffer is used to denature the sample for running on an SDS-PAGE gel and subsequent western blot analysis. Although the protein concentration remains too low to quantify using spectrophotometric protein quantification assays and have sample remaining for subsequent analyses, this technique can be used to successfully detect and semi-quantify phosphorylated proteins via western blot from pooled samples of four embryonic day 13.5 mouse aortic valve regions, each of which yields approximately 1 &#956;g of protein. This technique will be of benefit for studying cell signaling pathway activation and protein expression levels during early embryonic mouse valve development.

The analysis of protein expression in young embryonic mouse valves has been hampered by the limited tissue available. This manuscript provides a protocol for preparing protein from developing embryonic mouse valve regions for western blot analysis.

개발 배아 마우스 심장 밸브 지역에서 단백질 분리

Western blot analysis is a commonly employed technique for detecting and quantifying protein levels. However, for small tissue samples, this analysis ...

Quantitative Immunofluorescence Assay to Measure the Variation in Protein Levels at Centrosomes

Centrosomes are small but important organelles that serve as the poles of mitotic spindle to maintain genomic integrity or assemble primary cilia to facilitate sensory functions in cells. The level of a protein may be regulated differently at centrosomes than at other .cellular locations, and the variation in the centrosomal level of several proteins at different points of the cell cycle appears to be crucial for the proper regulation of centriole assembly. We developed a quantitative fluorescence microscopy assay that measures relative changes in the level of a protein at centrosomes in fixed cells from different samples, such as at different phases of the cell cycle or after treatment with various reagents. The principle of this assay lies in measuring the background corrected fluorescent intensity corresponding to a protein at a small region, and normalize that measurement against the same for another protein that does not vary under the chosen experimental condition. Utilizing this assay in combination with BrdU pulse and chase strategy to study unperturbed cell cycles, we have quantitatively validated our recent observation that the centrosomal pool of VDAC3 is regulated at centrosomes during the cell cycle, likely by proteasome-mediated degradation specifically at centrosomes.

Here, a novel quantitative fluorescence assay is developed to measure changes in the level of a protein specifically at centrosomes by normalizing that protein&#8217;s fluorescence intensity to that of an appropriate internal standard.

정량 면역 형광 분석은 중심체에서 단백질 수준의 변화를 측정하기 위해

Centrosomes are small but important organelles that serve as the poles of mitotic spindle to maintain genomic integrity or assemble primary cilia to ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

막 단백질의 녹색 형광 단백질 기반의 표현 상영에<em&gt; 대장균</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

CUBIC Protocol Visualizes Protein Expression at Single Cell Resolution in Whole Mount Skin Preparations

The skin is essential for our survival. The outer epidermal layer consists of the interfollicular epidermis, which is a stratified squamous epithelium covering most of our body, and epidermal appendages such as the hair follicles and sweat glands. The epidermis undergoes regeneration throughout life and in response to injury. This is enabled by K14-expressing basal epidermal stem/progenitor cell populations that are tightly regulated by multiple regulatory mechanisms active within the epidermis and between epidermis and dermis. This article describes a simple method to clarify full thickness mouse skin biopsies, and visualize K14 protein expression patterns, Ki67 labeled proliferating cells, Nile Red labeled sebocytes, and DAPI nuclear labeling at single cell resolution in 3D. This method enables accurate assessment and quantification of skin anatomy and pathology, and of abnormal epidermal phenotypes in genetically modified mouse lines. The CUBIC protocol is the best method available to date to investigate molecular and cellular interactions in full thickness skin biopsies at single cell resolution.

This report describes a CUBIC protocol to clarify full thickness mouse skin biopsies, and visualize protein expression patterns, proliferating cells, and sebocytes at the single cell resolution in 3D. This method enables accurate assessment of skin anatomy and pathology, and of abnormal epidermal phenotypes in genetically modified mouse lines.

CUBIC 프로토콜 전체 마운트 피부 준비 단일 셀 해상도에서 단백질 발현을 시각화합니다

The skin is essential for our survival. The outer epidermal layer consists of the interfollicular epidermis, which is a stratified squamous epithelium ...