우리는 현미경 분석과 심장 수리 기술자 및 우리의 동물 시설의 관리자를 포함하는 프로젝트를 지원하기위한 Magdi 야콥 연구소 (MYI를) 감사합니다. 이 작품은 영국 심장 재단 (BHF), 프로젝트 보​​조금 PG/10/019에 의해 지원되었다. MPS는 MYI와 BHF에 의해 지원됩니다. TP는 BHF-우수 연구 위원입니다. NR은 NH &amp; MRC 호주 연구원입니다.

모든 동물 실험은 국제 (유럽 의회의 지침 2010/63/EU) 및 국가 (영국 홈 오피스, 법 1986) 규정에 따라 수행되었다. 본 명세서에 기재된 방법은 UK 라이센스 권한 하에서 작업 우리 계획의 일부와 기록의 목적으로 수행되지 않았다. 1. 세포의 준비 이 프로토콜은 설명을 위해 특정 세포주 (인간 배아 신장, HEK293 세포)의 제조를 설명한다. 셀 - 특정 프로토콜은 성장하고 결국 특정 세포 계통에 능성 또는 성체 줄기 세포 분화에 대한 고용해야합니다. <ol><li> DMEM 매체 1 % 피루브산 나트륨, 2 mM의 글루타민, 1 % 항생제 펜 / Strep의 10 % 태아 소 혈청 (FBS)을 함유하는 (고 글루코스, 4500 ㎎ / L)에서 세포를 성장한다. 한 10cm 플레이트는 일반적으로 1:3 분할해야하고 미디어 이틀 신선한 보충. </li><li> tryps와 약간 세포 치료1:1 설명 된 DMEM 배지에서 1X 및 재현 탁한다. </li><li> 혈구 챔버에서 세포를 계산하고 별도의 튜브에 3 × 10 6 세포를 수집합니다. </li><li> 5 분 100g에서 스윙 버킷 로터에서 원심 분리기. </li><li> 뜨는을 취소하고 멸균 인산 완충 배와 세포 펠렛을 씻으십시오. </li><li> immunodepleted 마우스의 좌심실에 주입을위한 10 50분의 6 UL의 농도로 PBS 1X에 재현 탁. </li></ol> 2. 수술 전 상태 <ol><li> 각각의 수술 전, 온도 조절 아이솔레이터의 무균 식품 알약과 물 (표 1 22 ° C)와 immunodepleted 마우스 (NOD.CB17-Prkdscid/JHliHSD)를 유지한다. </li><li> 층류 후드 immunodepleted 마우스의 수술을 수행합니다. 70 % 에탄올로 작업 영역을 청소하고 수술 도구 (집게와 가위를) 압력솥. </li><li> 수술과 회복을위한 가열 패드의 전원을 켭니다. 전기 히터는 중요하다중에 발생하는 체온의 감소 및 사후 수술을 차단. </li><li> 복구 가열 패드에 깨끗하고 멸균 케이지를 놓습니다. </li><li> 아이솔레이터에서 멸균 멸균 봉투에 수술 방에 원래 케이지에 마우스를 수송한다. </li><li> 마우스를 체중 및 체중에 따라 분사 피하 (SC) medetomidine 및 마우스를 마취 0.9 % 멸균 식염수에 희석 케타민 히드로 클로라이드를 함유하는 용액뿐만 아니라 (근육을 이완시키는 medetomidine 1 ㎎ / kg; 케타민 히드로 클로라이드 (75) ㎎ / kg). </li><li> 완전히 마취 할 때 (1 ~ 2 분 이내에 자극 후 더 발가락 핀치 반사)를 케이지에서 마우스를 제거하지 </li><li> 가슴의 왼쪽에있는 제모 크림과 목의 영역을 적용합니다. 시간 (약 2-5 분)의 적당량 후, 물에 젖은 조직과 느슨한 머리를 닦아. </li><li> 앙와위에서 수술 패널에 마우스를 놓습니다. 부터외과 의사의 관점 위치는 수직 꼬리 아래로 헤드 업입니다. </li><li> 뒷다리의 피하에 멸균 생리 식염수 (부 프레 노르 핀)에 희석하여 0.1 ~ 0.2 ㎍ / g에서 진통 용액을 주입하고면 팁 어플리케이터를 사용하여 무균 용액 포비돈 요오드 면도 영역을 커버. </li><li> 목 지역에 현미경 (2.5 배 목표를) 초점을 맞 춥니 다. </li></ol> 3. 외과 조건 <ol><li> 무딘 가위 약간 윤상 연골 아래 약 0.5 cm 길이의 중간 선 복부 피부 절개를 함께. 침샘을 시각화하는 결합 조직에서 피부를 분리합니다. </li><li> 동시에 forcep 자기 가슴 트랙터와 각 부분의 옆으로 당겨 자연 중간 선 부문의 침샘을 분할 및 기관을 노출합니다. </li><li> 후두를 노출하는쪽으로 부드럽게 혀를 잡아 당깁니다. 주의기도에 삽관 튜브를 밀어 넣습니다. 튜브의 끝이 표시 L을 통해 볼 수 있습니다arynx 및 기관. 튜브에 있지만 확실하게 보이지 않는 경우에 중요한, 그것은 식도이다. 그것을 제거하고 튜브 끝의 위치를​​ 변경합니다. </li><li> 환기 시스템에 튜브를 연결합니다. 200 ㎕의 150 스트로크 / 분에서 스트로크 볼륨을 설정합니다. 테이프로 수술 패널의 환기 튜브를 고정합니다. </li><li> 왼쪽 흉부 지역에 1.5 cm 길이의 피부 절개에 - 무딘 가위와 집게로, 1 머리에 수직 꼬리를합니다. </li><li> 절개를하지 않고 결합 조직 / 근육 층과 메이저와 마이너 가슴 근육으로부터 피부를 풉니 다. </li><li> 다음과 같이 세 번째와 네 번째 늑골 간 개흉술을 수행 <ol><li> 곤란하고 작은 둥근 집게로 긁어서 늑간 근육 층을 관통. </li><li> 늑간 근육 층이 관통되면, 최대한 흉강을 열고 가슴 트랙터를 배치합니다. 그 위에있는 귓바퀴 (아트리움)과 좌심실 (LV)의 상단과 중간 부분은지금 눈에 보이는. </li></ol></li><li> 세포와 정밀 주사기를 준비합니다. 주사기 각 주사 10 UL의 볼륨의 양을 제공 할 수 있어야한다. 주사기의 끝 부분에 30 G 바늘을 캐스팅합니다. </li><li> 노출에게 바늘의 오픈 팁을 포함하여 단 1 밀리미터를 떠나, 바늘 테이프 (introcan-W 20 G에서) 작은 플라스틱 캐 뉼러를 사용하여 고정하십시오. 이것은 전체 좌심실 벽을 관통하고 좌심실 공동 내로 세포를 주입부터 바늘을 방지 할 것이다. </li><li> (각 주사 주입 106 세포의 총 10 UL를 제공 할 것입니다) 5 배 목표의 도움으로,이 배율 좌심실에서 시각화하고 5 개의 다른 위치에서 왼쪽 심실 벽에 세포를 주입. 주입이 성공하면 흰색 영역 및 셀 주요 역세의 부재 (사출에 성공하지 않은 경우, 동물은 기능 분석에서 제외된다) 표시 할 것이다. </li><li> 트랙터를 제거합니다. 흉부 B 벽을 닫습니다Y는 6-0 실크 봉합사의 두 바늘에 두 개의 분리 된 갈비를 둘러싸. </li><li> 가슴 근육과 PBS 1X에 젖어면 끝이 피부를 보습하고 조심스럽게 집게로 원래의 위치로 근육을 넣어. </li><li> 6-0 실크 봉합사의 3 ~ 4 바늘로 피부를 닫습니다. 피부를 닫습니다 2-3 바늘 목 절개를 봉합. </li><li> 마취 효과를 되돌릴 atipamezole (1 ㎎ / ㎏ 최종 농도)를 주입한다. </li><li> 마우스가 자율적으로 호흡을 시작하자마자, 기관에서 튜브를 꺼내 그 오른쪽에 마우스를 넣어. 마우스를 몇 분 안에 복구 할 것으로 예상된다. </li><li> 마우스를 켜고 도보 시간 동안 따뜻한 복구 케이지 (폐쇄 필터링 최고 작은 IVC 케이지)에 배치하기 시작합니다. </li><li> 제어 가열 상자 (37 ℃)에서 밤새 동물을 둡니다. </li><li> 수술 후 처음 2 일간 복구를 지원하기 위해 물과 펠렛 음식과 요리를 입력합니다. </li></ol> 다음과 같이 세포와 10 제어 주입하지 마음을 주사 열 마음은 조직 학적으로 분석하고 있습니다 : <ol><li> 일주 주입 (그림 1, 3) 후 이식 세포의 분석을 수행합니다. <ol><li> 이소 플루 란의 과다 복용에 의한 안락사 후, 조직을 해결하기 위해 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA) 20 ㎖와 마음을 perfuse. (70~100%) 에탄올의 비율을 증가하고 파라핀 블록에 삽입 고정 된 조직을 탈수. </li><li> 제 형태 학적 분석을 위해 헤 마톡 실린 및 에오신 5 μm의 얼룩에서 마이크로톰 파라핀의 마음입니다. </li><li> 메이슨의 트리 크롬 염색을 사용하여 결합 조직을 시각화. </li><li> 슬라이드 스캐너 현미경 (도 1A, 2A, 3A, 3B 및 3C)에서 이미지를 분석하여 디지털 슬라이드 스캐너 현미경 (Figu을 사용하여 단축 뷰의 전체 심장을 시각화입술 1B 및 1C). </li></ol></li><li> 위의 분석은, 자일 렌의 심장 조직을 deparaffinize 후, 에탄올의 비율을 감소하는 표본을 잠수 (100 %의 물)과 주사 전자 현미경 (SEM)을위한 과정은 다음과 같이하여 재수 : <ol><li> 1 시간 동안 0.1 M 인산 버퍼에 1 % 탄닌산으로 탈 파라핀 블록을 품어. </li><li> (25~100%) 에탄올의 비율을 증가하는 표본을 탈수. </li><li> HMDS (헥사 메틸 디 실라 잔)을 건조 샘플. </li><li> 애치슨은 다그 및 금 팔라듐 코팅을 가진 스텁에 시편을 장착합니다. </li><li> 분석 스캐닝 전자 현미경 (그림 2B)에서보기 샘플. </li></ol></li></ol>

저자가 공개하는 게 없다.

이 논문에서, 우리는 쥐의 심장 세포의 심근 내 주입을 수행하는 방법을 보여 주었다. 이 방법의 증거로, 우리는 HEK293 세포를 사용했습니다. 그것은 HEK293 세포가 어떤 세포 치료 연구에 사용하지 않으며, 따라서이 논문의 연구 결과는 치료 접근에 직접 번역에 적합하지 않은 것을 강조하는 것이 중요하다. 그러나, HEK293 세포는 세포 수축되지 않는 다른 종류의 세포에 transdifferentiate하지 않는다는 ?...

다양한 세포 배달 프로토콜은 인간의 환자에서이 실험 절차의 효율성, 효과와 안전성을 번역하는 것을 목표로 심혈관 질환의 생쥐와 쥐 모델에서 테스트되었습니다. 쥐의 심장 antegrade 3 역행 4 관동맥 세포 주입으로도 사용할 수있는 반면, 작은 설치류의 마음에, 심근 내 세포 전달은 세포 전달 1,2의 가장 실현 가능한 방법입니다. 두 가지 방법 모두 한계와 장점이 있습니다. 관상 동맥 내 경로를 통해 세포 전달은 글로벌 휴대 보급 3 증진에 직접 근육 주사를 통해 이론적 인 장점을 가지고 있지만, 그것은 또한 관상 동맥 색전증 3,5를 일으킬 위험이 있습니다. 심근 내 배달의 제한은 기계적 손상, 급성 염증, 심근 손상 6,7과 연결되어 있습니다. 인간, 심장 수리를 위해 세포 내막 또는 외과 심 외막을 통해 심근 내 주입에 의해 제공됩니다접근 또는 관상 동맥 내 동맥 경로 (8)에 의해. transvascular 경로로 주입은 급성 심근 경색 및 재관류 심근 환자에 적합하지만, 전체 폐색 또는 영향 지역 (9)의 혈관 내 가난한 흐름의 경우에는 할 수없는 경우가 있습니다. transendocardial 또는 transepicardial 주사 심실 벽에 직접 주사는 환자의 건강 상태에 따라 기술적으로 가능하다. 실제로, transepicardial 주입 열린 가슴 수술이 필요하고, transendocardial 위해 가능한 허혈성 또는 상처 심근 9의 사이트를 차별화하는 데 필요한 각각의 환자에 대한 전기 생리학 맵핑에 접근하지만,이 기술은 10, 11 안전한 것으로 나타났습니다. 중요한 사실은, 세포 치료 연구에 이식 될 수있는 가장 좋은 셀의 선택은 조사 중에있다. 단기 분석 (4 주) 보여 주었다 cardiospheres로 정의 심장 줄기 세포의 주입 <s업&gt; 12 골수 13 쪽 인구 세포 흉터의 크기와 세포 사멸을 감소시킴으로써 심근 경색의 쥐 14 쥐 15 모델에서 심장 기능 회복을 유도. 면역이없는 쥐의 심근 경색 모델에서 cardiospheres의 동종 이식은 심장 재생을 촉진, 안전한 것으로 판명, 내생 수리 메커니즘 (15)의 자극을 통해 심장 기능을 개선했다. 마음에 Lin-/c-kit + 성인 전구 세포는 시험 관내 및 생체 내에서 자기 갱신, 클론 원성 및 다 능성 것으로 표시하고, 허혈성 쥐의 심장에 주입했을 때이 부상 심근 벽 (16)의 많은 부분을 재구성하고 있었다되었다 도전과 중간 크기의 관상 동맥 (17)을 형성 할 수있는 능력. 이 유망한 데이터 상에 연료를 공급 I과 인간의 임상 2 :자가 및 동종 중간 엽 줄기 세포 (MSC) (18)의 주입은, 19 cardiospheres, 또는 C-키트 긍정적 인 심장 줄기 세포 (CSC) 허혈성 인간의 마음에있는 20 각 장기 연구에서 심장 기능에 유익한 효과를 보여 주었다. 그럼에도 불구하고, 넓은 장기 후속 및 향적 메타 분석 줄기 세포 요법이 아니라 예측할 수없는 결과 (21)의 범위 외에서는, 일부 환자에 상당한 이점을 제공한다는 것을 보여 주었다. 이들 제한은 각 각 질환에 대한 세포 전달의 특정 프로토콜의 설계를 필요로 할 가능성이있다. 마우스와 쥐 모델에서 장기 연구는 세포 주입이 더 심장 기능 (12 개월)이 개선되지 않은 것으로 나타났다. 실제로, 인간 배아 줄기 세포 유래 심근 (hESC의-CM)의 이식은 주로 섬유 성 조직 (22, 23)의 층에 의해 숙주 심근로부터 단리 하였다. 비슷한 결과는 경색 마우스 (24)의 마음으로 골격 근육 아세포의 심근 내 이식 후 관찰되었다. Furthermo다시 경색 심장에 기능을 유지하기 위해 동종 중간 엽 줄기 세포의 장기 기능이 분화 25 일 이후 면역 상태로 면역 적격의 전환에 의해 제한되어 있습니다. 고려 위에서 설명한 도전과 전망을 고려, 우리는 쥐의 심근 내 주입하여 세포를 전달하는 방법을 여기에 보여줍니다. 우리는 심근 수축 특성이없는 세포가 숙주 심근 접속하고 얇은 섬유 성 장벽 응집 덩어리를 형성하지 않는 것을 관찰한다. 일부 경우에 이러한 결과는 바람직 할 수도 있지만, 다음의 분석은 세포의 생착뿐만 아니라 기능적으로 연결된 심근 구조를 생성하기 위해 변조 될 수있는 방법을 이해하는 것이 유용 할 수있다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="560">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:103px;">Isolator</td>
			<td style="width:115px;">Pfi systems</td>
			<td style="width:88px;">-</td>
			<td style="width:255px;">Quotation needed</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:103px;">Heating Pad</td>
			<td style="width:115px;">Vet Tech Solutions</td>
			<td style="width:88px;">HE006</td>
			<td style="width:255px;">For small animals</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:103px;">medetomidine</td>
			<td style="width:115px;">National veterinary Service</td>
			<td style="width:88px;">-</td>
			<td style="width:255px;">Veterinary prescription is necessary</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:103px;">ketamine hydrochloride</td>
			<td style="width:115px;">National veterinary Service</td>
			<td style="width:88px;">-</td>
			<td style="width:255px;">Veterinary prescription is necessary</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:103px;">atipamezole</td>
			<td style="width:115px;">National veterinary Service</td>
			<td style="width:88px;">-</td>
			<td style="width:255px;">Veterinary prescription is necessary</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:103px;">Hair removal cream</td>
			<td style="width:115px;">Commercial shops</td>
			<td style="width:88px;">-</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:103px;">buprenorphine</td>
			<td style="width:115px;">NVS</td>
			<td style="width:88px;">-</td>
			<td style="width:255px;">Veterinary prescription is necessary</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:103px;">Leica MZFLIII microscope</td>
			<td style="width:115px;">Leica</td>
			<td style="width:88px;">Model S6E</td>
			<td style="width:255px;">With swing arm stand TS0</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:103px;">Hamamatsu Nanozoomer digital slide scanner</td>
			<td style="width:115px;">Hamamatsu</td>
			<td style="width:88px;">RS series</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:103px;">Scanning Electron Microscope</td>
			<td style="width:115px;">Jeol</td>
			<td style="width:88px;">JSM-6610</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:103px;">Blunt scissors</td>
			<td style="width:115px;">FST</td>
			<td style="width:88px;">14084-09</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:103px;">Minivent</td>
			<td style="width:115px;">Harvard apparatus</td>
			<td style="width:88px;">73-0043</td>
			<td style="width:255px;">Including small Y adapter (73-0027) and intubation cannula (73-2844)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:103px;">Forceps</td>
			<td style="width:115px;">FST</td>
			<td style="width:88px;">11052-10</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:103px;">Retraction system</td>
			<td style="width:115px;">FST</td>
			<td style="width:88px;">18200-20</td>
			<td style="width:255px;">Kit for animals up to 200grams</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:103px;">30G 12mm; &#189; inch</td>
			<td style="width:115px;">BBraun</td>
			<td style="width:88px;">A210</td>
			<td style="width:255px;">Fine yellow</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:103px;">microliter syringe</td>
			<td style="width:115px;">ESSLAB</td>
			<td style="width:88px;">81201</td>
			<td style="width:255px;">Also include a Hamilton repeating dispenser PB 600-1 Catalogue number 83700</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:103px;">6-0 silk suture</td>
			<td style="width:115px;">Ethicon</td>
			<td style="width:88px;">W1614T</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intramyocardial cell delivery: observations in murine hearts

이전 연구는 세포 배달 사이토 카인 및 심장 조직 재 시술 및 세포의 생존을 증가 요인의 방출에 의해 심장 기능의 개량을 촉진 것으로 나타났다. 또, 상기 관찰은 심장 줄기 세포, 간엽 줄기 세포와 같은 특정 cardiospheres 줄기 세포, 심근 세포, 평활근 세포 및 내피 세포로 분화하여 주변 심근 내에 통합 할 수있는 능력을 가질 것으로 나타났다. 여기, 우리는 확실하게 immunodepleted 마우스의 왼쪽 심실 벽에 noncontractile 세포를 제공 할 수있는 대상 및 방법을 제시한다. 이 미세 수술 절차의 현저한 단계는 마취 및 진통제 주입, 기관 내 삽관, 가슴을 열고 멸균 30 게이지 바늘과 정밀 마이크로 리터 주사기로 세포의 마음과 배달을 노출 절개를 포함한다. 심장 수확, embeddi 구성된 조직 처리NG, 절편 조직 학적 염색은 심근 내 세포 주입 작은 심 외막 지역의 피해뿐만 아니라, 심실 벽을 생산 것을 보여 주었다. Noncontractile 세포는 면역 생쥐의 심근 벽으로 유지하고, 심장 압력 및 기계적 부하로부터 보호 할 가능성이 섬유 성 조직의 층에 의해 포위되었다.

우리는 긴 심근 (그림 1A)에 비해 조약돌 모양 (그림 1) 서로 다른 형태로 심장 세포에서 구별 HEK293 세포를 주입. HEK293 세포 때문에 그들의 증가 핵 콘텐츠 (그림 1A)의 가능성이 심근 (핑크 색상)에 비해 헤 마톡 실린 염색 (파란색)에 더 민감했다. 또한 호스트 조직으로부터 주입 된 세포를 구별하기 위해, HEK293 세포를 주사 전에 DAPI 2시간으로 표시했다. 도...

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Intramyocardial Cell Delivery: Observations in Murine Hearts

고혈압이나 심근 경색 등의 심혈관 질환의 생쥐 모델에서 심근 내 세포 전달은 널리 재생 연구에서 서로 다른 종류의 세포 치료 가능성을 테스트하는 데 사용됩니다. 그러므로, 상세한 설명이 수술의 명확한 시각화가 작은 설치류의 혈관 세포 치료 분석의 한계와 이점을 정의하는 것을 도울 것이다.

심근 내 휴대 납품 : 쥐과 마음의 관찰

Previous studies showed that cell delivery promotes cardiac function amelioration by release of cytokines and factors that increase cardiac tissue ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

13.4K 조회수.  Imperial College London.  고혈압이나 심근 경색 등의 심혈관 질환의 생쥐 모델에서 심근 내 세포 전달은 널리 재생 연구에서 서로 다른 종류의 세포 치료 가능성을 테스트하는 데 사용됩니다. 그러므로, 상세한 설명이 수술의 명확한 시각화가 작은 설치류의 혈관 세포 치료 분석의 한계와 이점을 정의하는 것을 도울 것이다. 

비디오: Intramyocardial Cell Delivery: Observations in Murine Hearts

Coronary Artery Ligation and Intramyocardial Injection in a Murine Model of Infarction

Mouse models are a valuable tool for studying acute injury and chronic remodeling of the myocardium in vivo. With the advent of genetic modifications to the whole organism or the myocardium and an array of biological and/or synthetic materials, there is great potential for any combination of these to assuage the extent of acute ischemic injury and impede the onset of heart failure pursuant to myocardial remodeling. 
Here we present the methods and materials used to reliably perform this microsurgery and the modifications involved for temporary (with reperfusion) or permanent coronary artery occlusion studies as well as intramyocardial injections. The effects on the heart that can be seen during the procedure and at the termination of the experiment in addition to histological evaluation will verify efficacy. 
Briefly, surgical preparation involves anesthetizing the mice, removing the fur on the chest, and then disinfecting the surgical area. Intratracheal intubation is achieved by transesophageal illumination using a fiber optic light. The tubing is then connected to a ventilator. An incision made on the chest exposes the pectoral muscles which will be cut to view the ribs. For ischemia/reperfusion studies, a 1 cm piece of PE tubing placed over the heart is used to tie the ligature to so that occlusion/reperfusion can be customized. For intramyocardial injections, a Hamilton syringe with sterile 30gauge beveled needle is used. When the myocardial manipulations are complete, the rib cage, the pectoral muscles, and the skin are closed sequentially. Line block analgesia is effected by 0.25% marcaine in sterile saline which is applied to muscle layer prior to closure of the skin. The mice are given a subcutaneous injection of saline and placed in a warming chamber until they are sternally recumbent. They are then returned to the vivarium and housed under standard conditions until the time of tissue collection. At the time of sacrifice, the mice are anesthetized, the heart is arrested in diastole with KCl or BDM, rinsed with saline, and immersed in fixative. Subsequently, routine procedures for processing, embedding, sectioning, and histological staining are performed. 
Nonsurgical intubation of a mouse and the microsurgical manipulations described make this a technically challenging model to learn and achieve reproducibility. These procedures, combined with the difficulty in performing consistent manipulations of the ligature for timed occlusion(s) and reperfusion or intramyocardial injections, can also affect the survival rate so optimization and consistency are critical.

Numerous genetic manipulations and/or intramyocardial injections of genes, proteins, cells, and/or biomaterials are superimposed upon the dimension of time in studies of acute ischemia/ reperfusion injury and chronic remodeling in mice. This video illustrates the microsurgical procedures for ischemia/reperfusion, permanent coronary artery ligation, and intramyocardial injection studies.

경색의 Murine 모델에서 관상 동맥 내고과 Intramyocardial 사출

Mouse models are a valuable tool for studying acute injury and chronic remodeling of the myocardium in vivo.  With the advent of genetic modifications to ...

연구

의학

Reduction in Left Ventricular Wall Stress and Improvement in Function in Failing Hearts using Algisyl-LVR

Injection of Algisyl-LVR, a treatment under clinical development, is intended to treat patients with dilated cardiomyopathy. This treatment was recently used for the first time in patients who had symptomatic heart failure. In all patients, cardiac function of the left ventricle (LV) improved significantly, as manifested by consistent reduction of the LV volume and wall stress. Here we describe this novel treatment procedure and the methods used to quantify its effects on LV wall stress and function.
Algisyl-LVR is a biopolymer gel consisting of Na+-Alginate and Ca2+-Alginate. The treatment procedure was carried out by mixing these two components and then combining them into one syringe for intramyocardial injections. This mixture was injected at 10 to 19 locations mid-way between the base and apex of the LV free wall in patients.
Magnetic resonance imaging (MRI), together with mathematical modeling, was used to quantify the effects of this treatment in patients before treatment and at various time points during recovery. The epicardial and endocardial surfaces were first digitized from the MR images to reconstruct the LV geometry at end-systole and at end-diastole. Left ventricular cavity volumes were then measured from these reconstructed surfaces.
Mathematical models of the LV were created from these MRI-reconstructed surfaces to calculate regional myofiber stress. Each LV model was constructed so that 1) it deforms according to a previously validated stress-strain relationship of the myocardium, and 2) the predicted LV cavity volume from these models matches the corresponding MRI-measured volume at end-diastole and end-systole. Diastolic filling was simulated by loading the LV endocardial surface with a prescribed end-diastolic pressure. Systolic contraction was simulated by concurrently loading the endocardial surface with a prescribed end-systolic pressure and adding active contraction in the myofiber direction. Regional myofiber stress at end-diastole and end-systole was computed from the deformed LV based on the stress-strain relationship.

This article describes procedures for implanting a novel hydrogel in failing hearts and quantifying its effect on left ventricular wall stress and function. These procedures have been successfully applied in dogs and humans.

Algisyl-LVR을 사용하여 마음을 실패의 기능에서 왼쪽 심실 벽 스트레스와 개선의 감소

Injection of  Algisyl-LVR, a treatment under clinical development, is intended to treat  patients with dilated cardiomyopathy. This treatment was recently ...

Ultrasound-guided Transthoracic Intramyocardial Injection in Mice

Murine models of cardiovascular disease are important for investigating pathophysiological mechanisms and exploring potential regenerative therapies. Experiments involving myocardial injection are currently performed by direct surgical access through a thoracotomy. While convenient when performed at the time of another experimental manipulation such as coronary artery ligation, the need for an invasive procedure for intramyocardial delivery limits potential experimental designs. With ever improving ultrasound resolution and advanced noninvasive imaging modalities, it is now feasible to routinely perform ultrasound-guided, percutaneous intramyocardial injection. This modality efficiently and reliably delivers agents to a targeted region of myocardium. Advantages of this technique include the avoidance of surgical morbidity, the facility to target regions of myocardium selectively under ultrasound guidance, and the opportunity to deliver injectate to the myocardium at multiple, predetermined time intervals. With practiced technique, complications from intramyocardial injection are rare, and mice quickly return to normal activity on recovery from anesthetic. Following the steps outlined in this protocol, the operator with basic echocardiography experience can quickly become competent in this versatile, minimally invasive technique.

Echocardiography-guided percutaneous intramyocardial injection represents an efficient, reliable, and targetable modality for the delivery of gene transfer agents or cells into the murine heart. Following the steps outlined in this protocol, the operator can quickly become competent in this versatile, minimally invasive technique.

마우스의 초음파 유도 경 흉부 심근 내 주입

Murine models of cardiovascular disease are important for investigating pathophysiological mechanisms and exploring potential regenerative therapies. ...

Murine Model of Femoral Artery Wire Injury with Implantation of a Perivascular Drug Delivery Patch

Percutaneous interventions including balloon angioplasty and stenting have been used to restore blood flow in vessels with occlusive vascular disease. While these therapies lead to the rapid restoration of blood flow, these technologies remain limited by restenosis in the case of bare metal stents and angioplasty, or reduced healing and possibly enhanced risk of thrombosis in the case of drug eluting stents. A key pathophysiological mechanism in the formation of restenosis is intimal hyperplasia caused by the activation of vascular smooth muscle cells and inflammation due to arterial stretch and injury. Surgeries that induce arterial injury in genetically modified mice are useful for the mechanistic study of the vascular response to injury but are often technically challenging to perform in mouse models due to the their small size and lack of appropriate sized devices. We describe two approaches for a surgical technique that induces endothelial denudation and arterial stretch in the femoral artery of mice to produce robust neointimal hyperplasia. The first approach creates an arteriotomy in the muscular branch of the femoral artery to obtain vascular access. Following wire injury this arterial branch is ligated to close the arteriotomy. A second approach creates an arteriotomy in the main femoral artery that is later closed through localized cautery. This method allows for vascular access through a larger vessel and, consequently, provides a less technically demanding procedure that can be used in smaller mice. Following either method of arterial injury, a degradable drug delivery patch can be placed over or around the injured artery to deliver therapeutic agents.

We describe a surgical technique that produces wire injury in the femoral artery of mice to induce neointimal hyperplasia to serve as a model testing system for the perivascular delivery of therapeutic compounds for the inhibition of restenosis.

혈관 주위 약물 전달 패치의 주입과 대퇴 동맥 와이어 부상의 쥐 모델

Percutaneous interventions including balloon angioplasty and stenting have been used to restore blood flow in vessels with occlusive vascular disease. ...

Induction and Assessment of Ischemia-reperfusion Injury in Langendorff-perfused Rat Hearts

The biochemical events surrounding ischemia reperfusion injury in the acute setting are of great importance to furthering novel treatment options for myocardial infarction and cardiac complications of thoracic surgery. The ability of certain drugs to precondition the myocardium against ischemia reperfusion injury has led to multiple clinical trials, with little success. The isolated heart model allows acute observation of the functional effects of ischemia reperfusion injury in real time, including the effects of various pharmacological interventions administered at any time-point before or within the ischemia-reperfusion injury window. Since brief periods of ischemia can precondition the heart against ischemic injury, in situ aortic cannulation is performed to allow for functional assessment of non-preconditioned myocardium. A saline filled balloon is placed into the left ventricle to allow for real-time measurement of pressure generation. Ischemic injury is simulated by the cessation of perfusion buffer flow, followed by reperfusion. The duration of both ischemia and reperfusion can be modulated to examine biochemical events at any given time-point. Although the Langendorff isolated heart model does not allow for the consideration of systemic events affecting ischemia and reperfusion, it is an excellent model for the examination of acute functional and biochemical events within the window of ischemia reperfusion injury as well as the effect of pharmacological intervention on cardiac pre- and postconditioning. The goal of this protocol is to demonstrate how to perform in situ aortic cannulation and heart excision followed by ischemia/reperfusion injury in the Langendorff model.

The isolated rat heart is an enduring model for ischemia reperfusion injury. Here, we describe the process of harvesting the beating heart from a rat via in situ aortic cannulation, Langendorff perfusion of the heart, simulated ischemia-reperfusion injury, and infarct staining to confirm the extent of ischemic insult.

랑겐 돌프 - 관류 쥐 마음에 유도 및 허혈 - 재관류 손상의 평가

The biochemical events surrounding ischemia reperfusion injury in the acute setting are of great importance to furthering novel treatment options for ...

Percutaneous Contrast Echocardiography-guided Intramyocardial Injection and Cell Delivery in a Large Preclinical Model

Cell and gene therapy are exciting and promising strategies for the purpose of cardiac regeneration in the setting of heart failure with reduced ejection fraction (HFrEF). Before they can be considered for use, and implemented in humans, extensive preclinical studies are required in large animal models to evaluate the safety, efficacy, and fate of the injectate (e.g., stem cells) once delivered into the myocardium. Small rodent models offer advantages (e.g., cost effectiveness, amenability for genetic manipulation); however, given inherent limitations of these models, the findings in these rarely translate into the clinic. Conversely, large animal models such as rabbits, have advantages (e.g., similar cardiac electrophysiology compared to humans and other large animals), whilst retaining a good cost-effective balance. Here, we demonstrate how to perform a percutaneous contrast echocardiography-guided intramyocardial injection (IMI) technique, which is minimally invasive, safe, well tolerated, and very effective in the targeted delivery of injectates, including cells, into several locations within the myocardium of a rabbit model. For the implementation of this technique, we also have taken advantage of a widely available clinical echocardiography system. After putting in practice the protocol described here, a researcher with basic ultrasound knowledge will become competent in the performance of this versatile and minimally invasive technique for routine use in experiments, aimed at hypothesis testing of the capabilities of cardiac regenerative therapeutics in the rabbit model. Once competency is achieved, the whole procedure can be performed within 25 min after anaesthetizing the rabbit.

Novel therapeutic strategies in cardiac regenerative medicine require extensive and detailed studies in large preclinical animal models before they can be considered for use in humans. Here, we demonstrate a percutaneous contrast echocardiography-guided intramyocardial injection technique in rabbits, which is valuable for hypothesis testing the efficacy of such novel therapies.

경 피 적인 대비 심장 초음파-가이드 Intramyocardial 주입 및 큰 전 임상 모델에서 셀 배달

Cell and gene therapy are exciting and promising strategies for the purpose of cardiac regeneration in the setting of heart failure with reduced ejection ...

A Rat Carotid Artery Pressure-Controlled Segmental Balloon Injury with Periadventitial Therapeutic Application

Cardiovascular disease remains the leading cause of death and disability worldwide, in part due to atherosclerosis. Atherosclerotic plaque narrows the luminal surface area in arteries thereby reducing adequate blood flow to organs and distal tissues. Clinically, revascularization procedures such as balloon angioplasty with or without stent placement aim to restore blood flow. Although these procedures reestablish blood flow by reducing plaque burden, they damage the vessel wall, which initiates the arterial healing response. The prolonged healing response causes arterial restenosis, or re-narrowing, ultimately limiting the long-term success of these revascularization procedures. Therefore, preclinical animal models are integral for analyzing the pathophysiological mechanisms driving restenosis, and provide the opportunity to test novel therapeutic strategies. Murine models are cheaper and easier to operate on than large animal models. Balloon or wire injury are the two commonly accepted injury modalities used in murine models. Balloon injury models in particular mimic the clinical angioplasty procedure and cause adequate damage to the artery for the development of restenosis. Herein we describe the surgical details for performing and histologically analyzing the modified, pressure-controlled rat carotid artery balloon injury model. Additionally, this protocol highlights how local periadventitial application of therapeutics can be used to inhibit neointimal hyperplasia. Lastly, we present light sheet fluorescence microscopy as a novel approach for imaging and visualizing the arterial injury in three-dimensions.

The rat carotid artery balloon injury mimics the clinical angioplasty procedure performed to restore blood flow in atherosclerotic vessels. This model induces the arterial injury response by distending the arterial wall, and denuding the intimal layer of endothelial cells, ultimately causing remodeling and an intimal hyperplastic response.

쥐 경동맥 압력 제어 세그먼트 풍선 부상 과식 치료 응용 프로그램

Cardiovascular disease remains the leading cause of death and disability worldwide, in part due to atherosclerosis. Atherosclerotic plaque narrows the ...

Slicing and Culturing Pig Hearts under Physiological Conditions

Many novel drugs fail in clinical studies due to cardiotoxic side effects as the currently available in vitro assays and in vivo animal models poorly predict human cardiac liabilities, posing a multi-billion-dollar burden on the pharmaceutical industry. Hence, there is a worldwide unmet medical need for better approaches to identify drug cardiotoxicity before undertaking costly and time consuming &#39;first in man&#39; trials. Currently, only immature cardiac cells (human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes [hiPSC-CMs]) are used to test therapeutic efficiency and drug toxicity as they are the only human cardiac cells that can be cultured for prolonged periods required to test drug efficacy and toxicity. However, a single cell type cannot replicate the phenotype of the complex 3D heart tissue which is formed of multiple cell types. Importantly, the effect of drugs needs to be tested on adult cardiomyocytes, which have different characteristics and toxicity responses compared to immature hiPSC-CMs. Culturing human heart slices is a promising model of intact human myocardium. This technology provides access to a complete multicellular system that mimics the human heart tissue and reflects the physiological or pathological conditions of the human myocardium. Recently, through optimization of the culture media components and the culture conditions to include continuous electrical stimulation at 1.2 Hz and intermittent oxygenation of the culture medium, we developed a new culture system setup that preserves viability and functionality of human and pig heart slices for 6 days in culture. In the current protocol, we are detailing the method for slicing and culturing pig heart as an example. The same protocol is used to culture slices from human, dog, sheep, or cat hearts. This culture system has the potential to become a powerful predictive human in situ model for acute cardiotoxicity testing that closes the gap between preclinical and clinical testing results.

This protocol describes how to slice and culture heart tissue under physiological conditions for 6 days. This culture system could be used as a platform for testing the efficacy of novel heart failure therapeutics as well as reliable testing of acute cardiotoxicity in a 3D heart model.

생리적 조건하에서 돼지 하트 를 자르고 배양

Many novel drugs fail in clinical studies due to cardiotoxic side effects as the currently available in vitro assays and in vivo animal models poorly ...

Delayed Intramyocardial Delivery of Stem Cells after Ischemia Reperfusion Injury in a Murine Model

There is significant interest in the use of stem cells (SCs) for the recovery of cardiac function in individuals with myocardial injuries. Most commonly, cardiac stem cell therapy is studied by delivering SCs concurrently with the induction of myocardial injury. However, this approach presents two significant limitations: the early hostile pro-inflammatory ischemic environment may affect the survival of transplanted SCs, and it does not represent the subacute infarction scenario where SCs will likely be used. Here we describe a two-part series of surgical procedures for the induction of ischemia-reperfusion injury and delivery of mesenchymal stem cells (MSCs). This method of stem cell administration may allow for the longer viability and retention around damaged tissue by circumventing the initial immune response. A model of ischemia reperfusion injury was induced in mice accompanied by the delivery of mesenchymal stem cells (3.0 x 105), stably expressing the reporter gene firefly luciferase under the constitutively expressed CMV promoter, intramyocardially 7 days later. The animals were imaged via ultrasound and bioluminescent imaging for confirmation of injury and injection of cells, respectively. Importantly, there was no added complication rate when performing this two-procedure approach for SC delivery. This method of stem cell administration, collectively with the utilization of state-of-the-art reporter genes, may allow for the in vivo study of viability and retention of transplanted SCs in a situation of chronic ischemia commonly seen clinically, while also circumventing the initial pro-inflammatory response. In summary, we established a protocol for the delayed delivery of stem cells into the myocardium, which can be used as a potential new approach in promoting regeneration of the damaged tissue.

Stems cells are continuously investigated as potential treatments for individuals with myocardial damage, however, their decreased viability and retention within injured tissue can impact their long-term efficacy. In this manuscript we describe an alternative method for stem cell delivery in a murine model of ischemia reperfusion injury.

뮤린 모델에서 허혈혈 재관류 부상 후 줄기 세포의 지연 된 자궁 내 납품

There is significant interest in the use of stem cells (SCs) for the recovery of cardiac function in individuals with myocardial injuries. Most commonly, ...

Intramyocardial Transplantation of MSC-Loading Injectable Hydrogels after Myocardial Infarction in a Murine Model

One of the major issues facing current cardiac stem cell therapies for preventing postinfarct heart failure is the low retention and survival rates of transplanted cells within the injured myocardium, limiting their therapeutic efficacy. Recently, the use of scaffolding biomaterials has gained attention for improving and maximizing stem cell therapy. The objective of this protocol is to introduce a simple and straightforward technique to transplant bone marrow-derived mesenchymal stem cells (MSCs) using injectable hydroxyphenyl propionic acid (GH) hydrogels; the hydrogels are favorable as a cell delivery platform for cardiac tissue engineering applications due to their ability to be cross-linked in situ and high biocompatibility. We present a simple method to fabricate MSC-loading GH hydrogels (MSC/hydrogels) and evaluate their survival and proliferation in three-dimensional (3D) in vitro culture. In addition, we demonstrate a technique for intramyocardial transplantation of MSC/hydrogels in mice, describing a surgical procedure to induce myocardial infarction (MI) via left anterior descending (LAD) coronary artery ligation and subsequent MSC/hydrogels transplantation.

Stem cell-based therapy has emerged as an efficient strategy to repair injured cardiac tissues after myocardial infarction. We provide an optimal in vivo application for stem cell transplantation using gelatin hydrogels that are able to be enzymatically cross-linked.

Murine 모델에서 심근 경색 후 MSC 로딩 주사용 하이드로겔의 자궁 내 이식

One of the major issues facing current cardiac stem cell therapies for preventing postinfarct heart failure is the low retention and survival rates of ...