이 프로토콜은 급성 심장 독성 검사뿐만 아니라 심부전 치료의 효능을 테스트하는 데 사용할 수있는 생리적 조건하에서 6 일 동안 심장 조직 섹션을 잘라내고 배분하기위한 것입니다. 이 배양 시스템은 임상 전 및 임상 테스트 결과 사이의 격차를 좁히는 급성 심장 독성 테스트를 위한 시투 모델에서 강력한 예측 인간이 될 가능성이 있습니다. 절차를 시연하는 것은 우리의 실험실에서 실험실 매니저 인 칭후이 쿠 (Qinghui Qu)가 될 것입니다.
돼지 심장 조직 조각을 얻으려면 먼저 진동의 조직 목욕 냉각 재킷에 얼음을 추가하고 욕조에 티로드 용액을 추가하십시오. 1리터 플라스틱 항아리를 사용하여 티슈 목욕 냉각 재킷에서 녹은 얼음 유출을 수집하고 돼지 심장을 생물 안전 캐비닛에 신선한 차가운 심근 용액 1 리터가 들어있는 트레이로 옮춥니다. 개폐성 멸균 메스를 사용하여 심장을 해부하여 왼쪽 심실을 분리하고 직사각형 면도날을 사용하여 왼쪽 심실을 1~2개의 큐브 센티미터 블록으로 자른다.
슬라이스를 위한 하나의 티슈 블록을 따로 놓고 남은 티슈 블록 조각을 얼음 위에 차가운 티로드 용액50 밀리리터 튜브에 넣습니다. 예약된 티슈 블록을 부드럽게 마사지하고 진동의 금속 샘플 홀더에 1~2방울의 티슈 접착제를 추가합니다. 접착제에 약 1 평방 센티미터의 표면적으로 4 %의 천 블록을 붙이고 한천에 1 ~ 2 방울의 조직 접착제를 추가하십시오.
심장 블록을 가능한 한 홀더에 평평하게 사용하여 천 심장 에피카르듐 측에 부착하고 심장 블록으로 조직 홀더를 진동의 슬라이스 목욕에 놓습니다. 심장 블록을 조직 접착제에 내려다보이는 심장 에피카르듐 측과 함께 한고에 붙이고 조직이 가능한 한 평평하다는 것을 확인하는 것이 중요합니다. 그런 다음 산소 튜브를 스티로데 액스로 채워진 슬라이스 욕조와 금속 트레이에 부착하고 40 마이크로미터 세포 스트레이너를 금속 트레이에 배치하여 슬라이스할 때 심장 조직 섹션을 수집합니다.
진동 작동 소프트웨어를 사용하여 블레이드와 샘플의 높이를 조정하여 블레이드가 조직의 상단에 가깝지만 유두 근육 과 액체 가 조직과 블레이드를 덮고 있습니다. 조직을 자르기 시작하는 위치를 조정하려면 사전을 선택합니다. 속도를 높이기 위해 슬라이스를 누르고 노브를 사용하여 블레이드를 조직의 가장자리쪽으로 이동시킵니다.
슬라이스를 다시 눌러 중지하고 진행하여 프로세스를 비활성화합니다. 그런 다음 표시된 대로 절단 매개 변수를 조정하고 슬라이스를 눌러 조직을 자르기 시작합니다. 블레이드가 조직의 끝에 도달하지만 표본 홀더의 끝에 도달하기 전에 다시 슬라이스를 눌러 다시 멈추고 다시 눌러 시작 위치로 돌아갑니다.
슬라이스가 전체 길이에 도달하고 좋은 품질의 것으로 보일 때, 부드럽게 필요한 심장에서 조각을 탈구하는 집게와 봄 가위를 사용하여 목욕에서 조직을 수집하기 위해 차가운 Tyrode 솔루션으로 채워진 플라스틱 파스퇴르 파이펫을 사용합니다. 산소티로드 욕조의 단일 세포 스트레이너에 수집된 각 슬라이스를 놓고 파이펫의 용액을 사용하여 세포 스트레이너 표면의 조직을 누릅니다. 그런 다음 금속 와셔를 조직의 상단에 놓고 그것을 누를 수 있습니다.
산소타이로드 용액에서 적어도 1시간 후, 각 슬라이스의 바깥쪽을 다듬어 고르지 못한 가장자리를 제거하고 각 슬라이스의 끝을 6mm 너비의 멸균 된 폴리우레탄 프린터 타이밍 벨트에 내장 된 금속 와이어가 내장 된 상태로 고정하십시오. 지원되는 심장 조각을 6밀리리터의 배양 배지를 포함하는 6웰 플레이트에 넣고 멸균 집게를 사용하여 조직이 우물의 중심에 있는지 확인합니다. 플레이트 커버가 조직을 만지지 않고 플레이트의 곡선면이 플레이트의 각진 측면과 일치하도록 플레이트 에 플레이트를 배치하고 사각형 모서리가 정렬되도록주의하십시오.
슬라이스를 섭씨 37도, 이산화탄소 인큐베이터 5%에 넣습니다. 배양 슈퍼네이터를 하루에 세 번 신선한 산소 배양 배지의 6 밀리리터로 대체하십시오. 커버를 세포 배양 전기 자극기와 연결하고 자극기를 조정하여 10볼트의 전기와 1.2 헤르츠 주파수를 심장 슬라이스에 지속적으로 전달합니다.
자극을 연결한 후 심장 조각이 박동하기 시작합니다. 매일 정오 의 미디어 변화 동안, 배양 접시에서 자극 플레이트 커버를 교체하여 독성 흑연 입자가 배양 배지로 방출되는 것을 방지한다. 사용된 커버가 전기 회로의 물 손상을 방지하기 위해 전기 자극기를 위해 케이블에 연결되는 흰색 폼 플러그를 삽입하고 플레이트 커버를 2X 항생제/항mycotic으로 보충된 오토클레이브 수의 목욕에 배치합니다.
다음 날, 플레이트 커버를 70%에탄올 욕조에서 5~15분 동안 오염제거한 후 3분 동안 2X 항생제/항마이코틱으로 보충된 신선한 오토클레이브 수조로 커버를 옮기는 것입니다. 플레이트 커버를 헹구고, 에탄올 스프레이 클린 보풀 프리 와이프를 사용하여 플라스틱 부품의 잔류물을 제거하고 흰색 폼 플러그를 제거하십시오. 그런 다음 덮개를 배양 판에 다시 넣을 준비가 되었습니다.
이 새로운 생체 모방 배양 설정을 사용하여, 돼지 심장 슬라이스 생존력은 MTT 분석에 의해 평가된 대로 6일 동안 유지되었습니다. 처음 6 일 동안, 신선한 심장 조각에 대 한 관찰 하는 응답과 유사, 돼지 심장 슬라이스 심근 세포 내에서 아무 자발적인 칼슘 과도. 심근세포는 외부 전기 및 베타 부전 자극에 반응했습니다.
또한, 이소프로테레놀에 대한 수축력 및 반응은 신선한 심장 조각에서 관찰된 것과 유사한 최대 6일 동안 심장 슬라이스 배양에서 유지되었다. MTT 생존 가능성 분석, 면역 염색, 전자 현미경 검사, 칼슘 과도 측정, 수축 기능 평가, 신진 대사 평가 및 분석을 포함한 여러 구조적 및 기능적 평가가 심장 조각에서 수행될 수 있습니다. 우리는 현재 돼지와 인간의 심장 조각에 대한 관심의 급성 심장 독성및 약물 및 유전자 치료의 효능을 테스트하기 위해이 배양 시스템을 사용하고 있습니다.
