저자는 EGFP(+) HEK 293 세포를 제공 하기 위한 데이터와 카를로스 부에 노의 수집 하는 동안 제공 하는 우수한 지원 쉴라 Monfort, 브렌다 마르티네스, 카를로스 Micó, 알베르토 Muñoz와 마누엘 몰리 나 감사. 이 작품은 부분적으로 지원 되었다: Fundación Séneca, Agencia 데 많은 y 과학, Región 드 무르시아, 스페인 (JT) (번호 부여: 11935/파이/09); 레드 드 Terapia Celular, ISCIII-서브 성배입니다. Redes, VI PN 데 나 + D + 2008-2011 (no를 부여 합니다. RD12/0019/0001) (JMM), 공동 구조의 유럽 연합 (페더) (JMM); 자금 융자 그리고, 독서 대학, 영국 (AG, GB) (중앙 자금). Funders 연구 설계, 데이터 수집 및 분석, 결정 게시 또는 원고의 준비에 전혀 역할을 했다.

여기에 설명 된 실험 대학 무르시아, 스페인의 윤리 연구 위원회에 의해 승인 했다 고 유럽 연합 지침 2010/63/유럽 위원회의에 따라 수행 했다. 설명 하는 단계는 작업의 계획의 일부를 전적으로이 종이 동반 비디오 촬영을 위해 수행 되지 표준 작동 프로토콜에서 수행 했다.
1. 셀과 포유류 표정 벡터의 준비
참고: 여기, 우리가 간략하게 설명 준비 및 셀 선 (인간 미 발달 신장 293 (HEK 293));의 transfection에 대 한 프로토콜 그러나, 적절 한 셀의 셀 유형에 대 한 특정 프로토콜 최적화 (예를 들어, 줄기 세포) 이어야 한다.
<ol><li>높은 포도 당 Dulbecco HEK 293 세포는이 글의 중간 (DMEM) 10% 태아 종 아리 혈 청 (FCS), 1% 나트륨 pyruvate, 2mm 글루타민, 1% 페니실린/스, 보충 하 고 5%를 포함 하는 습도 분위기에서 37 ° C에서 incubated 수정의 유지 CO2 . 일단 셀 하위 confluent 1: 3의 비율로 분할.</li>
	<li>분할 셀 미디어, 발음와 살 균 성 세척 한 번는 식 염 수 (PBS)을 버퍼링 시작 하 고 초과 PBS를 제거 한 다음 트립 신-Ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA) (5 분, 37 ° C) x 0.5 2.5 mL와 함께 품 어.<ol>
<li>DMEM 미디어 (위에서 설명한 대로 보충)의 한 볼륨 추가 반응을, 중지 하 고 다음 천천히 그리고 부드럽게 위아래로 전자 피 펫으로 발음 하 여 세포를 분리.</li>
	</ol>
</li>
	<li>다음, 적절 한 컨테이너 (예를 들어, 15-50 mL 원뿔 원심 분리기 튜브)에 세포 현 탁 액을 전송. Centrifuge 스윙 양동이 (100 x g)에 상쾌한 삭제 하 고, 두 번 살 균 PBS 가진 펠 릿을 세척.</li>
	<li>신선한 문화 플라스 크 또는 로컬 실험실 관행에 따라 큰 요리에 신선한 DMEM 미디어 및 적절 한 셀 밀도 (예를 들어, 75 cm2 플라스 크에 1 x 106 셀)에 씨앗에 펠 렛을 resuspend.<ol>
<li>2 일 마다 신선한 미디어와 기존 미디어를 교체 합니다. 참고: 표정 벡터 pIRES1hyg에서 파생 되었고 제조업체의 지침에 따라 앞에서 설명한21사용. p(EGFP) IRES1hyg로 BamHI + 노트를 BamHI로 pEGFP-n 1에서 삽입 + 노트 소화 pIRES1hyg21EGFP cDNA subcloning 의해 생성 된.</li>
	</ol>
</li>
	<li>transfection, 전에 1 일 0.5 x 12 또는 24 잘 조직 배양 배지에서 105 셀/c m2 의 조밀도에 씨 HEK 293 세포.</li>
	<li>Transfection 당일 별도 1.5 mL microcentrifuge 관 (1 관/잘)에서 DNA 지질 transfection 시 약 단지를 준비 합니다.<ol>
<li>각 튜브에 감소 된 혈 청 매체의 250 µ L을 추가 하 여 시작 하 고 다음 4 µ g의 DNA를 추가 (부드럽게 혼합).</li>
		<li>그 후, 각 관에 10 µ L 지질 transfection 시 약의 이전 준비 믹스 및 감소 된 혈 청 매체의 250 µ L에서 250 µ L을 추가 (다시 부드럽게 혼합).</li>
		<li>마지막으로, transfections, DNA 지질 transfection 시 단지 4 h, HEK 293 세포를 배양 하 여 진행 DMEM 매체 보충 (단계 1.1), 위에서 설명한 대로 대체 하 고 또 다른 48 h. 안정적인 수행 약물 선택에 대 한 품 어 100 µ g/mL hygromycin B.와 transfectants</li>
	</ol>
</li>
	<li>트립 신 (1.2 단계) 위에서 설명한 대로 HEK 293 세포를 분리 합니다. 씻은 후 멸 균 PBS에 셀, 마지막 셀 5 x 106/mL의 농도 달성 하기 위해 (예를 들어, 10 %v / v PBS에 InI), 적절 한 차량에 resuspend.</li>
</ol>2입니다. 토끼의 준비
참고: 최적의 형태 및 동물의 심장의 기능을 평가 하는 IMI에 대 한 토끼와 변환기의 위치. 따라서, 그것은 실험 설계에 의해 정의 된 대로 완전 한 echocardiographic 시험20 IMI (아래 참조), 이전 및 이후의 시간 지점에서 수행 하는 것이 좋습니다. 이것은 특성을 평가 하는 기준 해 부와 기능적인 동물에서 심장의 주사를 받게 되며 또한 심장의 기능에 IMI의 효과 평가 하고자 합니다.
<ol><li>심장 혈관 이미징에 대 한 멀게 패션에서 고 수의 내과 및 심장 초음파/유럽 협회의 미국 사회의 미국 대학 심장 초음파 위원회의 지침에 따라이 검사를 수행 22 , 23 , 24.</li>
	<li>전체 echocardiographic 연구를 통해 동시 1-리드 심전도 (ECG) 추적을 가져옵니다.</li>
	<li>마 취 제와 함께 토끼를 anesthetize 10 mg/kg, medetomidine 200 µ g/k g, 근육 (인스턴트 메신저) 주사와 함께.</li>
	<li>마 취의 관리에 따라 10-20 분 후 마 취의 수준을 확인 합니다.</li>
	<li>널리 가슴 머리를 제거 하는 머리 깎기를 사용 하 여 (예를 들어, 하위 xiphoid 지역 목 아래) (그림 1A).</li>
	<li>오른쪽 forelimb (mediocubital 지역)의 두 뒷 다리 사지 (mediotibial 지역)의 내부 얼굴에 1-2 cm2 의 추가 영역을 면도 (그림 1B).</li>
	<li>접착제 ECG 전극 동기적 과정 (그림 1C) 심장 박동을 모니터링 하는 사지의 면도 영역에 배치 합니다.</li>
	<li>(그림 1C) 테이블에 연결 된 외과 테이프를 사용 하 여 뻗은 팔 다리와 동물 열 담요에 부정사 decubitus 위치에 놓습니다.<ol>
<li>귀는 근육이 수축 거꾸로 뒤는 머리/토끼, 그리고 있기 때문에이 절차를 통해 동물의 흉부의 정확한 위치를 유지 하는 데 도움이 그것의 앞 발 보다 낮은 위치에서 다는 것을 확인 하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>동물 얼굴 마스크 전체 절차 (100%, 2-3 L/min)에 걸쳐 산소를 관리 하는 동안 자연스럽 게 호흡을 허용 합니다.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56699/56699fig1.jpg"> 그림 1입니다. IMI는 토끼의 준비. (A) 흉부;에서 헤어 클립 (B) 사지;에서 헤어 클립 (C) 전극을 연결 하 고 열 담요에 뻗은 다리는 토끼를 위치. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56699/56699fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
3. 경 피 적인 대비 IMI 심장 초음파 기반 기술 토끼에
<ol><li>청소 하 고 소독 액체를 기반 솔루션으로 흉부의 피부.<ol>
<li>전체 절차를 통해 무 균 기술을 사용 하 여 현재 모범 사례에 따라.</li>
		<li>가능 하다 면, 그리고 합리적으로 가능한 경우, 포함 하 되이 제한 되지 않음, 가운, 장갑, 외과 상처 커튼, 살 균 초음파로는 테이블에 대 한 자료를 드레싱 살 균 살 균 소재를 사용 하 여 완전히 멸 균 절차 수행 트랜스듀서 커버 및 살 균 초음파 젤. 이 최소 수신 IMI, 동물 병원 균 도입의 위험을 줄일 것 이다 이며 임상 설정 (예를 들어, 심장 찔린 동안)에 표준 연습. 참고: 그것은 항상 로컬 기관에 적용 가능한 동물 연구의 지역 및 국가 규정 및 국가 연습 진행을 권장.</li>
	</ol>
</li>
	<li>가슴 및 변환기, 그리고 실험의 목 변환기 코드 초음파 전송 젤을 적용, 종종 해부학을 시각화 하 고 있는 IMI에 대 한 계획에 도움이 되는 동물의 심장의 빠른 창 스캔 합니다.</li>
	<li>4회-6번째 있는 공간, 2-3 cm는 부각의 각으로 오른쪽 parasternal 라인에서 변환기를 수동으로 배치 ~ 흉 벽 (그림 2A)의 오른쪽에 관하여 90 °.</li>
	<li>있는 공간으로 그것의 anteroposterior 및 젖꼭지 근육의 수준에서 수정 된 짧은 축 보기를 최적화 하기 위해 dorsoventral 각도 변환기의 위치를 조정 합니다. 오른쪽 심 실 (RV), 좌 심 실 (LV), interventricular 심장 (IVS), 후부 벽 (비밀 번호), 뿐만 아니라 anterolateral (알) 및 (그림 2B) posteromedial (오후) 젖꼭지 근육이이 보기에서 확인 합니다.<ol>
<li>(예를 들어, 버튼, 다이얼) 시스템에 적절 한 컨트롤을 사용 하 여 깊이 크게 증가 하 여 넓은 시야를가지고.</li>
		<li>이 보기, 뿐만 아니라 endocardial 및 epicardial 등고선의 적절 한 차별화에 대칭 이미지를 얻기에 특히 주의 하 고, 필요한 경우 이미지 최적화 컨트롤 (예를 들어, 이득)을 통해 조정.</li>
	</ol>
</li>
	<li>일단 최적의 echocardiographic 보기 (그림 2B)을 얻을 두 번째 연산자 IMI (아래 참조)를 수행 하는 동안, 절차의 나머지 부분에 걸쳐이 위치를 유지 합니다.<ol>
<li>변환기를 들고, 하는 동안 은폐 해야 항상 직면 하 고 있을 앞으로, 이후 단계 (그림 2A, C)에 바늘의 정렬 되므로 변환기 방향 표시 하지 마십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>24 G 바늘 1 mL 주사기에 연결, 왼쪽된 hemithorax의 피부 근처 바늘 변환기에 관하여 대칭 미러링 위치에 놓습니다. 그런 다음, 수동으로 정렬 바늘의 각도 변환기 방향 마크와 함께 ~ 90 ° (그림 2C), 천천히 바늘을 통해 피부와 흉 강에 진출. 참고:이 위치 및 방향에서 경 피 적인 바늘 삽입을 용이 하 게 초음파 빔 (2D 그림, E)의 비행기에서 바늘의 시각화 되므로 실시간으로 모니터링 하 고, 필요한 경우의 조정 (그림 2 G, H) 심근의 대상 지역 기준으로 바늘의 위치입니다.</li>
	<li>대상 위치에서 팁을 천천히 제공 하는 injectate (최대 사출 사이트 당 0.25 mL) 10-30 s (그림 2E), 치료를 천천히 그리고 부드럽게 주입 심근의 범위를 증가 하는 동안 바늘을 제거 하는 동안 내.<ol>
<li>InI를 사용 하 여 10% (v/v)에 희석 PBS 표준화 기술, 그리고 현장에 추적에 대 한 확인 심근 내의 모든 4 개의 IMI 사이트의 성공적인 대상으로 역량, 또한 취득 하는 동안 심한 병 리와 histopathology (참조 대표 결과)입니다. 역량 달성 되 면 원하는 경우 InI 적당 한 상업적인 초음파 대비 에이전트에 의해 대체 수 있습니다. 참고: 10% (v/v) InI에에서 희석 PBS 또는 셀 없이 과거 hyperechogenicity (즉, 에코 밝은 모양)에서 심근 결과에 주입 (그림 2E, F)의 대상 사이트에서의 배달. 과도 감속 또는 조 숙한 심 실 수축 (예를 들면, 절연 couplets, 세 쌍둥이)와 관련 된 심장 박동의 가속은 epicardium와 바늘의 첫 접촉에서 자주 관찰 된다 뿐만 아니라 동안 또는 IMI 직후. 그러나, 아니 생명을 위협 하는 부정맥, 개발 하 고 심각한 부작용은 거의 IMI 사출 사이트 당 injectate의 최대 0.25 mL (1.25 x 106 셀)를 사용 하 여 관찰 ( 대표 결과 토론을 참조).</li>
	</ol>
</li>
	<li>(3 심 실 왼쪽에 무료 벽 (LVFW)와 IVS에서) 4 개의 대상 IMI 사이트의 각각에 0.25 mL의 주입을 완료 하는 데 필요한 바늘의 부각의 각의 미묘한 변화를 수행 합니다.</li>
	<li>경 피 적인 대비 심장 초음파-가이드 IMI 절차를 완료 한 후 (예를 들어, 직렬 ECG 추적 및 24 시간 Holter 심전도 통해), 심장 리듬을 평가 하 고 검사 직렬 창 echocardiographic의 부재를 확인 하 합병증, 동물 완전히 가벼운 주기 룸에 마 취 및 다음 전송에서 복구 될 때까지.<ol>
<li>여기, 우리는 24 h에 대 한 심장 리듬에 InI와 IMI의 효과 모니터링 하는 데 24 시간 Holter ECG 사용 합니다. 이 위해, 우리 정상 표현 형 (일반 그룹)와 6 토끼의 그룹 및 독 소 루비 (cardiotoxic 안트라사이클린 약물, 암;의 처리에 일반적으로 사용의 정 맥 행정을 받은 6 토끼의 그룹 비교 DOX 그룹) 2 mg/kg의 복용량에 / 8 주, 주 다음 두 동료 InI와 IMI를 받았다.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56699/56699fig2.jpg"> 그림 2 . 토끼에서 경 피 적인 대비 심장 초음파-가이드 intramyocardial 주입. (A)의 각도에서 오른쪽 hemithorax에 변환기의 배치 ~ 90 °. (B) 토끼에 젖꼭지 근육의 수준에서 심장의 parasternal 짧은 축 보기 (PSSX)의 대표 이미지. (C)의 각도에서 바늘의 맞춤 ~ 변환기 방향 표시를 기준으로 90 °. (D) 심장 (참고 바늘 초음파 광속의 평면에 쉽게 시각 이다)의 PSSX 뷰에서 대상 사이트에서 바늘의 위치입니다. (E 와 F) 인도 잉크 (화살촉 강조 과거 hyperechogenicity)와 intramyocardial 주입 시 대상 사이트에서 hyperechogenicity의 데모. (G) LV 챔버에 바늘의 실수로 위치 (화살촉 바늘 샤프트 강조). (H) Repositioning LV 무료 벽에 바늘의 (화살촉 바늘 샤프트 강조). RV를 = 우 심; 라스베가스 = 왼쪽된 심 실; IVS = interventricular 심장; 비밀 번호 = 후부 벽; 알 = anterolateral 젖꼭지 근육; 오후 = posteromedial 젖꼭지 근육. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56699/56699fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
4. 게시물 IMI 분석
<ol><li>토끼에서 심장 조직 샘플의 histopathological 분석을 수행 합니다.<ol>
<li>10% 포름알데히드, 다음과 같이 에탄올 농도 증가 함께 탈수 뒤에 조직 24 h에 대 한 수정: • 1 x 70% (60 분) • 1 x 95 %ethanol/5% 메탄올 (60 분) • 1 x 100% (60 분) • 1 x 100% (90 분) • 1 x 100% (120 분) 참고: 위의 모든 외피는 실 온 (RT)에서 실시 됩니다. 100% 크 실 렌 (1 시간, RT), 두 번 대체 다음, 그리고 마지막으로 두 단계 (60 분, 58 ° C)25에 파라핀에 포함.</li>
		<li>톰25와 4-5 µ m 조직 섹션을 수행 합니다. 슬라이드에 섹션을 탑재 합니다.</li>
		<li>Masson의 trichrome 방법25,,2627와 hematoxylin에 오신 얼룩이 수행 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>조직 섹션에서 이식된 마음에서 immunohistochemistry EGFP(+) HEK 293 세포 (예를 들어, avidin 비타민 b 복합체 복합물 (ABC) 메서드를 사용 하 여), 간단히 검색을 수행.<ol>
<li>드 왁 스 100% 크 실 렌 (10 분, RT)에서 4-5 µ m 두꺼운 심장 섹션. 감소 하는 에탄올 농도 솔루션 (100% (2 분)에 2 배, 2 x 95% (2 분), 70% (2 분)에 1 x; 50% (2 분)에 1 x; 1 x 30% (2 분), 1 x ddH2O (2 분)) 실시간으로 세척 하 여 조직 리하이드레이션</li>
		<li>(준비가 30% H2O2, 고 추가 메탄올의 재고 솔루션의 5 mL와 함께 최대 50 mL의 총 볼륨) 메탄올 (에서 희석 3% H2O2 의 100 µ L로 섹션을 취재 하 여 내 인 성 과산화 효소 억제를 수행 품 어 30 분, RT), 그리고 다음 Tris 버퍼 염 분 (TBS, pH 7.6)와 침수로 세척.</li>
		<li>0.1%의 100 µ L로 섹션을 취재 하 여 효소 처리를 통해 항 원 unmasking 수행 (0.01 g 10 mL TBS에에서 희석 나 준비) 나 (12 분, RT를 품 어), TBS (5 분, RT) 다음 씻어.</li>
		<li>차단 하는 솔루션 (TBS에서 10%에서 정상 염소 혈 청)에서 품 어 (30 분, RT), 슬라이드 당 100 µ L를 사용 하 여 및 TBS (5 분, RT)로 씻어.</li>
		<li>(1 시간, 30 ° C), 1 차적인 항 체 (TBS에서 1: 500)으로 닭 반 녹색 형광 단백질 (GFP)와 incubate 그리고 TBS (5 분, RT)로 씻어.</li>
		<li>(1 시간, 30 ° C), 이차 항 체 biotinylated 염소-안티-닭고기 IgG (TBS에서 1: 250)와 incubate 고 TBS (5 분, RT)와 다음 씻어.</li>
		<li>Avidin 비타민 b 복합체 복합물 (20 분, 30 ° C)와 함께 incubate 및 다음 3,30-diaminobenzidine tetrahydrochloride (한 덩어리) (RT, 5-10 분)를 사용 하 여 레이블.</li>
		<li>마지막으로 세척 되며 오신 방법25를 사용 하 여 counterstain 섹션에 RT, 에탄올 농도 (1 x 30% (2 분), 50% (2 분)에 1 x, 70% (2 분)에 1 x; 2 x 95% (2 분), 100% (2 분)에 2 배) 증가 하 여 탈수 하 고 커버 슬라이드를 탑재. 긍정적인, 부정적인 isotype 컨트롤 뿐만 아니라이 포함 됩니다. 참고: 위에서 설명한 간단한 프로토콜은 아닙니다 일반 immunohistochemistry; 관심의 조직에 대 한 최적화는 필요 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

기본 목표는의 사용을 활용 하는 동안 토끼 (대형 크기의 전 임상 동물 모델)17,18, 심근으로 줄기 세포의 배달을 위해 사용 될 수 있는 최소 침 습 기술을 개발 하는 상대적으로 저렴 한 이미징 시스템을 쉽게 사용할 수 많은 임상 연구 센터. 여기, 우리 임상 심장 초음파 시스템을 사용 하 여, 표시 하 고 InI, 추적 기능 제자리에 와 echogenic 속성, 심?...

세포 및 유전자 치료 흥미로운 고도 HFrEF에 부상된 심근 재생/수리에 대 한 전략을 개발. 몇 가지 연구는 지속적으로 intracoronary 또는 정 맥 경로1,2 이상의 IMI의 우수성을 증명 하고있다 셀 배달의 다른 노선의 효과 (예를 들어, 셀 유지 비율)을 비교 , 3 , 4 , 5. 따라서, 그것은 놀라운 부상된 심근의 줄기 세포 치료의 변환 모델에 대 한 연구의 큰 비율 IMI는 오픈 가슴 절차6,7에서에서 직접 보기 아래 수행을 통해 injectate 제공 . 그러나,이 접근 peri 절차 사망률 (자주 아래 보고)8의 위험을 운반 절차의 침략 적인 본질을 포함 한 몇 가지 제한이 있다. 또한, 직접 보기 아래 IMI는 심 실 구멍에 실수로 주입에 대 한 가능성을 제거 하지 않습니다. 임상 연습에서 오픈 가슴 수술 동안 IMI 치료 세포 배달, 예를 들어에 대 한 적절 한 방법이 될 수, 동안 관상동맥 우회 이식 수술 (관상); 그러나,이 방법은 않을 수 있습니다 셀 배달에 대 한 적절 한 비-허 혈 성 근원 (예를 들어, HFrEF 안트라사이클린 유발 심근 (AICM)을 보조)의 글로벌 심근에.
의심의 여지가 그 허 혈 성 심장 질환 (IHD)는 HFrEF의 가장 일반적인 원인입니다 (~ 66%)9,10; 그러나, AICM를 포함 하 여 비-허 혈 성 심근 여전히 영향을 미치는 환자 HFrEF (33%)9 의 상당 비율을 차지 . 실제로, 임상 종양학의 최근 발전 귀착되 유럽, 암 환자12의 향상 된 생존에 대 한 전반적인 트렌드와 비슷한 숫자의 견적 미국 혼자11, 암 10 백만 이상의 생존자 ,13. 따라서, 환자 수가 증가 주어진와 같은 줄기 세포 이식 줄기 세포 전달의 효과적이 고 최소 침 습 루트의 시험 뿐 아니라 비-허 혈 성 심장 근육 병 증에 대 한 최대 중요성은 소설 치료의 혜택을 탐험, cardiotoxicity 보조 항 암 약물에 의해 영향을 받습니다.
노트, 가설 연구 부상된 심근을 자주으로 수리 재생성을 목표로 줄기 세포 치료를 사용 하 여 테스트 (예:마우스, 쥐) 작은 설치류의 사용을 포함. 이러한 모델 종종 일반적으로 일부 연결된 한계 (예를 들면, 반향)14있는 선형 배열 트랜스듀서를 장착 하는 심근 기능의 평가 위한 비싼 높은 주파수 초음파 시스템을 필요로 합니다. 그러나, 토끼, 대표 하는 대형 전 임상 모델을 다른 모델 HFrEF에서 줄기 세포 치료의 가설에 대 한 몇 가지 장점이 있다. 따라서, 쥐 및 쥐, 달리 토끼 유지 Ca+ 2 교통 시스템 및 인간과 기타 큰 동물 (예:개, 돼지)15,16,17의 유사한 세포 생리학 ,,1819. 또 다른 장점은, 심장 초음파 이미징 사용 하 여 상대적으로 저렴 한과 널리 임상 심장 초음파 시스템 상대적으로 높은 주파수 위상 배열 트랜스듀서, 예를 들면, 12mhz와 같은 대 한 그들의 순종은 그 신생아 및 소아 심장에서 자주 사용 됩니다. 이러한 시스템 첨단 기술, 우수한 echocardiographic 이미징 허용 하 고 그들은 고조파 이미징20의 우월의 활용. 또한,에 배달 심장 재생 요법 (예를 들어, 줄기 세포 치료)의 잠재력, 그들의 안전, 효능, cardiomyogenic 잠재력으로 평가 injectate의 운명의 한 번의 광범위 한 가설에 심근, 인간의 사용에 대 한 간주 될 수 있습니다 그리고 그들은 큰 전 임상 동물 모델, 토끼17,19의 사용을 필요로 하기 전에 필수입니다. 여기, 우리는 줄기 세포 이식에 기초를 둔 치료 비-허 혈 성 심근20 대를 겨냥 하는 임상 심장 초음파 시스템을 사용 하 여 경 피 적인 대비-심장 초음파 유도 IMI 통해 셀 배달에 대 한 최소 침 습 기술을 설명합니다 . 우리는 또한 토끼 심장에 injectate의 한 초음파 대비 에이전트와 제자리에서 추적으로 인도 잉크 (InI, 또한으로 알려진 중국 잉크)의 혜택을 설명합니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="890">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">HD11 XE Ultrasound System</td>
			<td style="width:131px;">Philips</td>
			<td style="width:183px;">10670267</td>
			<td style="width:259px;">Echocardiography system.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">S12-4</td>
			<td style="width:131px;">Philips</td>
			<td style="width:183px;">B01YgG</td>
			<td>4-12 MHz phase array transducer</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;">Ultrasound Transmision Gel (Aquasone)</td>
			<td style="width:131px;">Parket laboratories Inc</td>
			<td style="width:183px;">N 01-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vasovet 24G</td>
			<td style="width:131px;">Braun</td>
			<td style="width:183px;">REF 381212</td>
			<td>&#160;over-the-needle catheter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Omnifix-F 1 ml syringe</td>
			<td style="width:131px;">Braun</td>
			<td style="width:183px;">9161406V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Imalgene (Ketamine)</td>
			<td style="width:131px;">Merial</td>
			<td style="width:183px;">RN 9767</td>
			<td>Veterinary prescription is necessary</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Domtor (Medetomidine)</td>
			<td style="width:131px;">Esteve</td>
			<td style="width:183px;">CN 570686.3</td>
			<td>Veterinary prescription is necessary</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Heating Pad</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Faber-Castel TG1</td>
			<td style="width:131px;">Faber-Castel</td>
			<td style="width:183px;">16 33 99</td>
			<td style="width:259px;">India (China) Ink</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Holter Syneflash</td>
			<td style="width:131px;">Ela medical</td>
			<td style="width:183px;">SF0003044S</td>
			<td style="width:259px;">24 h Holter ECG system.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Electrodes Blue Sensor&#174;</td>
			<td style="width:131px;">Ambu (NUMED)</td>
			<td style="width:183px;">VLC-00-S</td>
			<td style="width:259px;">Holter ECG electrodes.</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:319px;">Microtome</td>
			<td style="width:131px;">Leica Biosystems</td>
			<td style="width:183px;">RM2155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Microscope</td>
			<td style="width:131px;">Olimpus</td>
			<td style="width:183px;">CO11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:319px;">ABC Vector Elite</td>
			<td style="width:131px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:183px;">PK-6200</td>
			<td>Avidin Biotin Complex Kit.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Chicken anti-GFP antibody</td>
			<td style="width:131px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:183px;">A10262</td>
			<td>Primary antibody.</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:319px;">Biotinylated goat-anti-chicken IgG Antibody</td>
			<td style="width:131px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:183px;">BA-9010</td>
			<td>Secondary Antibody.</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:319px;">3,30-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB)</td>
			<td style="width:131px;">DAKO (Agilent)</td>
			<td style="width:183px;">S3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:319px;">Fluorescence Microscope</td>
			<td style="width:131px;">Carl Zeiss 
			MicroImaging</td>
			<td style="width:183px;">Zeiss AX10 Axioskop</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Holter ECG</td>
			<td>Elamedical</td>
			<td>Syneflash SF0003044S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:319px;">Dulbecco&#8217;s modified Eagle medium (DMEM)&#160;</td>
			<td style="width:131px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:183px;">11965084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">10% fetal calf serum (FCS)</td>
			<td style="width:131px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:183px;">11573397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:319px;">0.05% Trypsin-Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td style="width:131px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:183px;">25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:319px;">Lipofectamine 2000 (Lipid transfection reagent)</td>
			<td style="width:131px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:183px;">11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Reduced serum medium (Opti-MEM)</td>
			<td style="width:131px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:183px;">31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:319px;">Hygromycin B</td>
			<td style="width:131px;">Calbiochem (MERCK)</td>
			<td style="width:183px;">400051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Xylene (histological)</td>
			<td style="width:131px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:183px;">X3S-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Hydrogen Peroxide Solution (H2O2)</td>
			<td style="width:131px;">Sigma</td>
			<td style="width:183px;">H1009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Pronase</td>
			<td style="width:131px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:183px;">53-702-250KU</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

percutaneous contrast echocardiography-guided intramyocardial injection and cell delivery in a large preclinical model

세포 및 유전자 치료는 흥분 하 고 심장 마비와의 설정에서 심장 재생을 위해 유망 전략 감소 방출 분수 (HFrEF). 전에 그들은 사용을 위해 고려 하 고 인간에서 구현 수, 광범위 한 임상 연구 필요 큰 동물 모델에서 안전, 효능, 심근에 전달 한 번 injectate (예를들면, 줄기 세포)의 운명을 평가 합니다. 작은 설치류 모델 제공 장점 (예를 들어, 비용 효율성, 유전자 조작에 대 한 순종); 그러나, 이러한 연구 결과 거의 진료소로 변환 이러한 모델의 한계를 감안할 때. 반대로, 토끼, 동물 모델을 큰 장점 (예, 인간 및 다른 큰 동물에 비해 비슷한 심장 전기 생리학), 있다 좋은 비용 효율적인 균형을 유지 하는 동안. 여기는 경 피 적인 대비 심장 초음파-가이드 intramyocardial 주입 (IMI) 기술, 최소 침 습, 안전 하 고, 잘 용납 하 고 셀을 포함 하 여 injectates의 대상된 배달에 매우 효과적인 수행 하는 방법을 보여 줍니다. 토끼 모델의 심근 내에서 여러 위치에 이 기술 구현 하기 위한 우리 또한 널리 임상 심장 초음파 시스템의 장점을 촬영 했습니다. 두기 후에 연습에서 여기에 설명 된 프로토콜, 기본 초음파 기술 연구원 실험, 가설의 목적에서 일상적인 사용을 위한이 다양 하 고 최소한 침략 적 기법의 성능에 유능한 될 것 이다는 토끼 모델에서 심장 재생 치료제의 기능. 역량을 달성 하 고, 일단 모든 절차 토끼 anaesthetizing 후 25 분 내에서 수행할 수 있습니다.

경 피 적인 대비 심장 초음파-가이드 IMI InI:
위에서 설명한 프로토콜을 사용 하 고 바늘의 팁의 최적의 위치는 심장 초음파와 시작 하는 주입에 의해 확인 되었다, 일단 과거 hyperechogenicity InI의 전달 중 관찰 되었다 (PBS에 10 %v / v) (그림 2E) 대상 지역 (그림 2F) IMI 뿐만 조?...

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Percutaneous Contrast Echocardiography-guided Intramyocardial Injection and Cell Delivery in a Large Preclinical Model

경 피 적인 대비 심장 초음파-가이드 Intramyocardial 주입 및 큰 전 임상 모델에서 셀 배달

심장 재생 의학에 새로운 치료 전략 인 간에 있는 사용에 대 한 간주 될 수 있습니다 전에 큰 전 임상 동물 모델에서 광범위 하 고 상세한 연구를 요구 한다. 여기, 우리는 같은 소설 치료의 효능을 시험 하는 가설에 대 한 귀중 한 토끼, 경 피 적인 대비 심장 초음파-가이드 intramyocardial 주입 기술을 보여줍니다.

Cell and gene therapy are exciting and promising strategies for the purpose of cardiac regeneration in the setting of heart failure with reduced ejection ...

percutaneous-contrast-echocardiography-guided-intramyocardial

Research

JoVE Journal

Medicine

11.5K 조회수.  University of Reading. 심장 재생 의학에 새로운 치료 전략 인 간에 있는 사용에 대 한 간주 될 수 있습니다 전에 큰 전 임상 동물 모델에서 광범위 하 고 상세한 연구를 요구 한다. 여기, 우리는 같은 소설 치료의 효능을 시험 하는 가설에 대 한 귀중 한 토끼, 경 피 적인 대비 심장 초음파-가이드 intramyocardial 주입 기술을 보여줍니다.

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Coronary Artery Ligation and Intramyocardial Injection in a Murine Model of Infarction

Mouse models are a valuable tool for studying acute injury and chronic remodeling of the myocardium in vivo. With the advent of genetic modifications to the whole organism or the myocardium and an array of biological and/or synthetic materials, there is great potential for any combination of these to assuage the extent of acute ischemic injury and impede the onset of heart failure pursuant to myocardial remodeling. 
Here we present the methods and materials used to reliably perform this microsurgery and the modifications involved for temporary (with reperfusion) or permanent coronary artery occlusion studies as well as intramyocardial injections. The effects on the heart that can be seen during the procedure and at the termination of the experiment in addition to histological evaluation will verify efficacy. 
Briefly, surgical preparation involves anesthetizing the mice, removing the fur on the chest, and then disinfecting the surgical area. Intratracheal intubation is achieved by transesophageal illumination using a fiber optic light. The tubing is then connected to a ventilator. An incision made on the chest exposes the pectoral muscles which will be cut to view the ribs. For ischemia/reperfusion studies, a 1 cm piece of PE tubing placed over the heart is used to tie the ligature to so that occlusion/reperfusion can be customized. For intramyocardial injections, a Hamilton syringe with sterile 30gauge beveled needle is used. When the myocardial manipulations are complete, the rib cage, the pectoral muscles, and the skin are closed sequentially. Line block analgesia is effected by 0.25% marcaine in sterile saline which is applied to muscle layer prior to closure of the skin. The mice are given a subcutaneous injection of saline and placed in a warming chamber until they are sternally recumbent. They are then returned to the vivarium and housed under standard conditions until the time of tissue collection. At the time of sacrifice, the mice are anesthetized, the heart is arrested in diastole with KCl or BDM, rinsed with saline, and immersed in fixative. Subsequently, routine procedures for processing, embedding, sectioning, and histological staining are performed. 
Nonsurgical intubation of a mouse and the microsurgical manipulations described make this a technically challenging model to learn and achieve reproducibility. These procedures, combined with the difficulty in performing consistent manipulations of the ligature for timed occlusion(s) and reperfusion or intramyocardial injections, can also affect the survival rate so optimization and consistency are critical.

Numerous genetic manipulations and/or intramyocardial injections of genes, proteins, cells, and/or biomaterials are superimposed upon the dimension of time in studies of acute ischemia/ reperfusion injury and chronic remodeling in mice. This video illustrates the microsurgical procedures for ischemia/reperfusion, permanent coronary artery ligation, and intramyocardial injection studies.

경색의 Murine 모델에서 관상 동맥 내고과 Intramyocardial 사출

Mouse models are a valuable tool for studying acute injury and chronic remodeling of the myocardium in vivo.  With the advent of genetic modifications to ...

연구

의학

Gene Transfer for Ischemic Heart Failure in a Preclinical Model

Various emerging technologies are being developed for patients with heart failure. Well-established preclinical evaluations are necessary to determine their efficacy and safety.
Gene therapy using viral vectors is one of the most promising approaches for treating cardiac diseases. Viral delivery of various different genes by changing the carrier gene has immeasurable therapeutic potential.
In this video, the full process of an animal model of heart failure creation followed by gene transfer is presented using a swine model. First, myocardial infarction is created by occluding the proximal left anterior descending coronary artery. Heart remodeling results in chronic heart failure. Unique to our model is a fairly large scar which truly reflects patients with severe heart failure who require aggressive therapy for positive outcomes. After myocardial infarct creation and development of scar tissue, an intracoronary injection of virus is demonstrated with simultaneous nitroglycerine infusion. Our injection method provides simple and efficient gene transfer with enhanced gene expression. This combination of a myocardial infarct swine model with intracoronary virus delivery has proven to be a consistent and reproducible methodology, which helps not only to test the effect of individual gene, but also compare the efficacy of many genes as therapeutic candidates.

A method of gene transfer for the treatment of ischemic heart failure is described using a swine model of myocardial infarction. Our simple and reproducible method enables us to readily evaluate the efficacy of various gene transfers with a very simple and reproducible way.

잠복기 모델에서 허혈성 심장 마비에 대한 유전자 전송

Various emerging technologies are being developed for patients with heart failure. Well-established preclinical evaluations are necessary to determine ...

Intramyocardial Cell Delivery: Observations in Murine Hearts

Previous studies showed that cell delivery promotes cardiac function amelioration by release of cytokines and factors that increase cardiac tissue revascularization and cell survival. In addition, further observations revealed that specific stem cells, such as cardiac stem cells, mesenchymal stem cells and cardiospheres have the ability to integrate within the surrounding myocardium by differentiating into cardiomyocytes, smooth muscle cells and endothelial cells.
Here, we present the materials and methods to reliably deliver noncontractile cells into the left ventricular wall of immunodepleted mice. The salient steps of this microsurgical procedure involve anesthesia and analgesia injection, intratracheal intubation, incision to open the chest and expose the heart and delivery of cells by a sterile 30-gauge needle and a precision microliter syringe.
Tissue processing consisting of heart harvesting, embedding, sectioning and histological staining showed that intramyocardial cell injection produced a small damage in the epicardial area, as well as in the ventricular wall. Noncontractile cells were retained into the myocardial wall of immunocompromised mice and were surrounded by a layer of fibrotic tissue, likely to protect from cardiac pressure and mechanical load.

Intramyocardial cell delivery in murine models of cardiovascular diseases, such as hypertension or myocardial infarction, is widely used to test the therapeutic potential of different cell types in regenerative studies. Therefore, a detailed description and a clear visualization of this surgical procedure will help to define the limits and advantages of cardiovascular cell therapeutic analyses in small rodents.

심근 내 휴대 납품 : 쥐과 마음의 관찰

Previous studies showed that cell delivery promotes cardiac function amelioration by release of cytokines and factors that increase cardiac tissue ...

Ultrasound-guided Transthoracic Intramyocardial Injection in Mice

Murine models of cardiovascular disease are important for investigating pathophysiological mechanisms and exploring potential regenerative therapies. Experiments involving myocardial injection are currently performed by direct surgical access through a thoracotomy. While convenient when performed at the time of another experimental manipulation such as coronary artery ligation, the need for an invasive procedure for intramyocardial delivery limits potential experimental designs. With ever improving ultrasound resolution and advanced noninvasive imaging modalities, it is now feasible to routinely perform ultrasound-guided, percutaneous intramyocardial injection. This modality efficiently and reliably delivers agents to a targeted region of myocardium. Advantages of this technique include the avoidance of surgical morbidity, the facility to target regions of myocardium selectively under ultrasound guidance, and the opportunity to deliver injectate to the myocardium at multiple, predetermined time intervals. With practiced technique, complications from intramyocardial injection are rare, and mice quickly return to normal activity on recovery from anesthetic. Following the steps outlined in this protocol, the operator with basic echocardiography experience can quickly become competent in this versatile, minimally invasive technique.

Echocardiography-guided percutaneous intramyocardial injection represents an efficient, reliable, and targetable modality for the delivery of gene transfer agents or cells into the murine heart. Following the steps outlined in this protocol, the operator can quickly become competent in this versatile, minimally invasive technique.

마우스의 초음파 유도 경 흉부 심근 내 주입

Murine models of cardiovascular disease are important for investigating pathophysiological mechanisms and exploring potential regenerative therapies. ...

A Preclinical Murine Model of Hepatic Metastases

Numerous murine models have been developed to study human cancers and advance the understanding of cancer treatment and development. Here, a preclinical, murine pancreatic tumor model of hepatic metastases via a hemispleen injection of syngeneic murine pancreatic tumor cells is described. This model mimics many of the clinical conditions in patients with metastatic disease to the liver. Mice consistently develop metastases in the liver allowing for investigation of the metastatic process, experimental therapy testing, and tumor immunology research.

A preclinical, murine model of hepatic metastases performed via a hemispleen injection technique.

간 전이의 전임상 쥐과 모델

Numerous murine models have been developed to study human cancers and advance the understanding of cancer treatment and development. Here, a preclinical, ...

A Surgical Procedure for Resecting the Mouse Rib: A Model for Large-Scale Long Bone Repair

This protocol introduces researchers to a new model for large-scale bone repair utilizing the mouse rib. The procedure details the following: preparation of the animal for surgery, opening the thoracic body wall, exposing the desired rib from the surrounding intercostal muscles, excising the desired section of rib without inducing a pneumothorax, and closing the incisions. Compared to the bones of the appendicular skeleton, the ribs are highly accessible. In addition, no internal or external fixator is necessary since the adjacent ribs provide a natural fixation. The surgery uses commercially available supplies, is straightforward to learn, and well-tolerated by the animal. The procedure can be carried out with or without removing the surrounding periosteum, and therefore the contribution of the periosteum to repair can be assessed. Results indicate that if the periosteum is retained, robust repair occurs in 1 - 2 months. We expect that use of this protocol will stimulate research into rib repair and that the findings will facilitate the development of new ways to stimulate bone repair in other locations around the body.

The overall goal of this procedure is to successfully resect a portion of bone from the rib of a mouse. The procedure was developed as a model to study large-scale long bone repair.

마우스 리브를 절제하는 수술 : 대규모 긴 뼈 수리에 대한 모델

This protocol introduces researchers to a new model for large-scale bone repair utilizing the mouse rib. The procedure details the following: preparation ...

Contractions of Human-iPSC-derived Cardiomyocyte Syncytia Measured with a Ca-sensitive Fluorescent Dye in Temperature-controlled 384-well Plates

Spontaneously contracting syncytia of cardiomyocytes derived from human-induced pluripotent stem cells (hiPSC-CM) are a useful model of human cardiac physiology and pharmacology. Various methods have been proposed to record this spontaneous activity and to evaluate drug effects, but many of these methods suffer from limited throughput and/or physiological relevance. We developed a high-throughput screening system to quantify the effects of exogenous compounds on hiPSC-CM's beating frequency, using a Ca-sensitive fluorescent dye and a temperature-controlled imaging multi-well plate reader. We describe how to prepare the cell plates and the compound plates and how to run the automated assay to achieve high sensitivity and reproducibility. We also describe how to transform and analyze the fluorescence data to provide reliable measures of drug effects on spontaneous rhythm. This assay can be used in drug discovery programs to guide chemical optimization away from, or toward, compounds affecting human cardiac function.

Spontaneously contracting syncytia of cardiomyocytes derived from human-induced pluripotent stem cells are useful models of human cardiac physiology and pharmacology. Here we present a high-throughput screening system to quantify the effects of exogenous compounds on beating frequency, using a Ca-sensitive fluorescent dye and a temperature-controlled imaging multi-well plate reader.

Spontaneously contracting syncytia of cardiomyocytes derived from human-induced pluripotent stem cells (hiPSC-CM) are a useful model of human cardiac ...

Preclinical Model of Hind Limb Ischemia in Diabetic Rabbits

Peripheral vascular disease is a widespread clinical problem that affects millions of patients worldwide. A major consequence of peripheral vascular disease is the development of ischemia. In severe cases, patients can develop critical limb ischemia in which they experience constant pain and an increased risk of limb amputation. Current therapies for peripheral ischemia include bypass surgery or percutaneous interventions such as angioplasty with stenting or atherectomy to restore blood flow. However, these treatments often fail to the continued progression of vascular disease or restenosis or are contraindicated due to the overall poor health of the patient. A promising potential approach to treat peripheral ischemia involves the induction of therapeutic neovascularization to allow the patient to develop collateral vasculature. This newly formed network alleviates peripheral ischemia by restoring perfusion to the affected area. The most frequently employed preclinical model for peripheral ischemia utilizes the creation of hind limb ischemia in healthy rabbits through femoral artery ligation. In the past, however, there has been a strong disconnect between the success of preclinical studies and the failure of clinical trials regarding treatments for peripheral ischemia. Healthy animals typically have robust vascular regeneration in response to surgically induced ischemia, in contrast to the reduced vascularity and regeneration in patients with chronic peripheral ischemia. Here, we describe an optimized animal model for peripheral ischemia in rabbits that includes hyperlipidemia and diabetes. This model has reduced collateral formation and blood pressure recovery in comparison to a model with a higher cholesterol diet. Thus, the model may provide better correlation with human patients with compromised angiogenesis from the common co-morbidities that accompany peripheral vascular disease.

We describe a surgical procedure used to induce peripheral ischemia in rabbits with hyperlipidemia and diabetes. This surgery acts as a preclinical model for conditions experienced in peripheral artery disease in patients. Angiography is also described as a means to measure the extent of introduced ischemia and recovery of perfusion.

당뇨병 토끼에서의 뒷 사지의 전 임상 모델

Peripheral vascular disease is a widespread clinical problem that affects millions of patients worldwide. A major consequence of peripheral vascular ...

In Vitro Model of Coronary Angiogenesis

Here, we describe an in vitro culture assay to study coronary angiogenesis. Coronary vessels feed the heart muscle and are of clinical importance. Defects in these vessels represent severe health risks such as in atherosclerosis, which can lead to myocardial infarctions and heart failures in patients. Consequently, coronary artery disease is one of the leading causes of death worldwide. Despite its clinical importance, relatively little progress has been made on how to regenerate damaged coronary arteries. Nevertheless, recent progress has been made in understanding the cellular origin and differentiation pathways of coronary vessel development. The advent of tools and technologies that allow researchers to fluorescently label progenitor cells, follow their fate, and visualize progenies in vivo have been instrumental in understanding coronary vessel development. In vivo studies are valuable, but have limitations in terms of speed, accessibility, and flexibility in experimental design. Alternatively, accurate in vitro models of coronary angiogenesis can circumvent these limitations and allow researchers to interrogate important biological questions with speed and flexibility. The lack of appropriate in vitro model systems may have hindered the progress in understanding the cellular and molecular mechanisms of coronary vessel growth. Here, we describe an in vitro culture system to grow coronary vessels from the sinus venosus (SV) and endocardium (Endo), the two progenitor tissues from which many of the coronary vessels arise. We also confirmed that the cultures accurately recapitulate some of the known in vivo mechanisms. For instance, we show that the angiogenic sprouts in culture from SV downregulate COUP-TFII expression similar to what is observed in vivo. In addition, we show that VEGF-A, a well-known angiogenic factor in vivo, robustly stimulates angiogenesis from both the SV and Endo cultures. Collectively, we have devised an accurate in vitro culture model to study coronary angiogenesis.

In vitro models of coronary angiogenesis can be utilized for the discovery of the cellular and molecular mechanisms of coronary angiogenesis. In vitro explant cultures of sinus venosus and endocardium tissues show robust growth in response to VEGF-A and display a similar pattern of COUP-TFII expression as in vivo.

관상 동맥 혈관 신생의 체외 모델

Here, we describe an in vitro culture assay to study coronary angiogenesis. Coronary vessels feed the heart muscle and are of clinical importance. Defects ...

Delayed Intramyocardial Delivery of Stem Cells after Ischemia Reperfusion Injury in a Murine Model

There is significant interest in the use of stem cells (SCs) for the recovery of cardiac function in individuals with myocardial injuries. Most commonly, cardiac stem cell therapy is studied by delivering SCs concurrently with the induction of myocardial injury. However, this approach presents two significant limitations: the early hostile pro-inflammatory ischemic environment may affect the survival of transplanted SCs, and it does not represent the subacute infarction scenario where SCs will likely be used. Here we describe a two-part series of surgical procedures for the induction of ischemia-reperfusion injury and delivery of mesenchymal stem cells (MSCs). This method of stem cell administration may allow for the longer viability and retention around damaged tissue by circumventing the initial immune response. A model of ischemia reperfusion injury was induced in mice accompanied by the delivery of mesenchymal stem cells (3.0 x 105), stably expressing the reporter gene firefly luciferase under the constitutively expressed CMV promoter, intramyocardially 7 days later. The animals were imaged via ultrasound and bioluminescent imaging for confirmation of injury and injection of cells, respectively. Importantly, there was no added complication rate when performing this two-procedure approach for SC delivery. This method of stem cell administration, collectively with the utilization of state-of-the-art reporter genes, may allow for the in vivo study of viability and retention of transplanted SCs in a situation of chronic ischemia commonly seen clinically, while also circumventing the initial pro-inflammatory response. In summary, we established a protocol for the delayed delivery of stem cells into the myocardium, which can be used as a potential new approach in promoting regeneration of the damaged tissue.

Stems cells are continuously investigated as potential treatments for individuals with myocardial damage, however, their decreased viability and retention within injured tissue can impact their long-term efficacy. In this manuscript we describe an alternative method for stem cell delivery in a murine model of ischemia reperfusion injury.

뮤린 모델에서 허혈혈 재관류 부상 후 줄기 세포의 지연 된 자궁 내 납품

There is significant interest in the use of stem cells (SCs) for the recovery of cardiac function in individuals with myocardial injuries. Most commonly, ...