저자는이 작품은 가능한 한 모든 동료, 특히 마야 Balamane, 엘리자베스 존스턴 화이트, 샤론 Sjoblom, 그렉 오르 딩 Zakhona Gumede, Xolile Kineri, Phindile Mabaso, Lungisa Ndwandwe, 제임스 가비, 개빈 콥, Senzo Maphanga, Terusha Chetty을 인정하고 싶습니다 , Kevi Naidoo, 앤드류 Skingsley, 캐서린 스토트, 그리고 Lungani Ndwandwe. 저자는 또한 건강의 부와 Hlabisa HIV 치료 및 관리 프로그램을 작동 아프리카 센터 직원의 모든 직원에게 감사의 말씀을 전합니다.

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	<li>Shao, Y., Williamson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+HIV-1+epidemic:+low-+to+middle-income+countries.">The HIV-1 epidemic: low- to middle-income countries.</a> Cold Spring Harbor Persp. Med. 2, (2012).</li><li>Mutevedzi, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scale-up+of+a+decentralized+HIV+treatment+programme+in+rural+KwaZulu-Natal,+South+Africa:+does+rapid+expansion+affect+patient+outcomes.">Scale-up of a decentralized HIV treatment programme in rural KwaZulu-Natal, South Africa: does rapid expansion affect patient outcomes.</a> Bull. World Health Organ. 88, 593-600 (2010).</li><li>Houlihan, C. 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<div> 건강 시스템을 강화하고 HIV 치료 실패 (HIV-:이 작품은 웰컴 트러스트 (Wellcome Trust) (082384/Z/07/Z), 유럽 연합 (SANTE 2007 147-790), 질병에 대한 미국 센터에 의해 지원되었다가 CAPRISA (프로젝트 제목을 통해 제어 TFC)), 그리고 스위스 남아프리카 공화국 공동 연구 프로그램 (SSJRP)라는 제목의 연구 보조금 &quot;스위스 보호 해주는 / 남아프리카 공화국 : 단백질 생물 정보학 자원 개발이 중요한 건강 관련 병원균에 대한&quot;. RL은 웰컴 트러스트 (Wellcome Trust)에 의해 지원됩니다 (허가 번호 090999 / Z / 09 / Z). 출자자는 연구 설계, 데이터 수집 및 분석, 게시 할 수있는 의사 결정, 또는 원고의 준비에 역할을했다. 저자는 더 경쟁 재정적 이익을 선언하지 않습니다. </div>

여러 저렴한 비용으로 사내 방법은 33, 34, 36 HIV 약제 내성 유전자형이 더 저렴한 만들려고하는 노력에 설명되어있다. 자원 제한 설정에서 항 레트로 바이러스 치료에 대한 개인에 대한 치료의 연속체에 약물 저항 테스트를 통합 할 필요성 의심의 여지가 없다. 그러나,보고 된 방법 중 대부분은 집단 수준에서 약제 내성의 감시에 약제 내성 유전자형의 적용에 초점을 맞춘다. 토성 / 생활 기술의 유전자형 방법은 감시 및 약제 내성 감시를위한 완벽하게 통합 된 프로토콜입니다. 이 방법은 임상 관리에 대한 보고서의 약제 내성과 세대의 해석에 대부분 오픈 소스와 오픈 액세스 생물 정보학 자원을 구현하는 저렴한 프로토콜 될 수 있도록 설계되었습니다. 그것은 될 수있는 FDA 승인 Viroseq 유전자형 방법에 비교하여 나타내었다성공적으로 증폭 된 실험실 패널 샘플을 100 % ANRS 숙련도 시험 샘플의 패널에서 약제 내성 변이를 식별하는 정확한. 정확도는 또한 서브 타입 C 바이러스, 남부 아프리카에서 가장 지배적 인 하위 유형의 임상 샘플을 평가 하였다. 방법 CRF02_AG가 유행이다 세계의 다른 부분에 사용되는 경우에있어서 그것이 그러나 아형 및 B.에 있었던 것에 아형 C 샘플 최저 정확, 방법시기 프라이머의 변형이 필요하다 CRF02_AG을 표시했다 패널 샘플을 증폭하는 데 실패했습니다. 서브 타입의 분포가 38 이질적이고 또는 M (33)를 바이러스 모든 그룹에 민감 프라이머의 타락한 세트, 36 지역에서 사용할 수 있습니다. 역전사 및 PCR의 감도는 500 ㎖ 같은 플라즈마의 높은 볼륨에서 RNA를 추출함으로써 증가 될 수있다. 혈장은 원심 수QIAamp 바이러스 RNA 추출 미니 키트가 설명 된대로 프로토콜을 진행하기 전에 바이러스 입자를 집중하는 90 분 동안 21,000 XG에서 uged. 도시 된 바와 같이, 새로운 방법은 개별 환자 관리를위한 포괄적 인 보고서를 생성하는 추가적인 장점이 있습니다. 이 보고서는 RegaDB에서 유전자형의 통합, 면역 학적 및 바이러스 학적 모니터링 데이터뿐만 아니라 임상 치료의 역사입니다. 이것은 동일하게 상세한 환자의 임상 기록의 검토뿐만 아니라 치료 권장 다음에 저항 프로파일에 대한 자세한 실험 해석을 동반한다. 보고서를 검토하고 환자에 대한 치료 권장 사항을 제공하는 전문 의사의 사용은 간호사 실무자뿐만 아니라 점점 작업의 이동에 대한 WHO 권장 사항의 일환으로 남아프리카 공화국에있는 예술을 제공하고 경험이 임상에 대한 많이 필요한 멘토링을 제공한다. 이러한 임상보고서는 약제 내성 관리에 거의 또는 전혀 경험이있는 임상의를위한 효과적인 교재로 표시되었습니다. 환자 관점에서, 우리의 방법은 전문 HIV 서비스에 액세스하는 중앙 사이트에 여행 할 필요가 줄어 듭니다. 따라서, 전체적으로 촬영 기술 프로토콜은 HIV 약제 내성 관리는 HIV 감염자 실패 예술에 대한 치료의 연속체로, 저렴한 비용으로 통합 될 수있는 좋은 플랫폼을 제공합니다. 생성 된 데이터는 여행자의 약제 내성의 진화 및 전송을 평가하기 위해 역학적 목적을 위해 사용될 수있다. 생성 된 폴 조각의 크기는 인구 수준에서 전염병의 더 나은 이해를 만들어 더 복잡한 계통 발생 학적 분석에 충분합니다.

남부 아프리카에서 HIV 전염병은 특히 남아프리카 공화국 2, 3, 항 레트로 바이러스 치료 (ART)에 개인의 동반 지수 증가와 함께 급속 한 발전하고있다. 발생 4를 줄이고 자원 제한 설정에서 기대 수명 (RLS)을 5 증가에 큰 규모의 치료 프로그램의 역학적 영향에 대한 증거로 축적 계속, 예술의 범위를 확대하기위한 노력이 강화 될 것이다. 검사 및 치료 프로그램에 따라 예방 도구 6, 7과 같은 치료의 사용으로 가이드 라인의 진화는 치료에 대한 개인의 절대 수는 더욱 증가 할 것을 의미합니다. 개인의 큰 숫자는 예술에 대한 개인의 평균 수명은 HIV에 감염되지 않은 인구 8의 가까워지면서 오랜 시간 동안 예술에있을 것입니다. HIV의 약제 내성의 발달 및 전송 ALWA 마련되어YS ART 9-12의 성과에 대한 위협으로 간주되었다. 따라서, 많은 개인은 ART에 개시 될 때보다 엄격한 감시 및 약물 저항의 모니터링을위한 필요성이 존재한다. 유전형 약제 내성 (GRT) 테스트는 감시뿐만 아니라 예술을받는 개인의 HIV-1 약제 내성 모니터링 모두 선진국에서 성공적으로 사용되어왔다. 이 설정에서, GRT는 HIV-1에 감염된 사람들을위한 치료의 연속성에 통합되었습니다. 대부분의 국제 가이드 라인은 성인이나 ART (첫 번째 줄과 두 번째 줄) 13-15 실패 소아 환자에 대한 GRT를 추천, 소아의 어머니에 아이 전송 (PMTCT)식이 요법의 예방에 노출 된 환자 만, 이후 16 감염과 함께 설정에서 심하게 감염된 개인 13 ~ 15 사이에서 전송 약물 저항의 높은 수준. 그러나, 비용, 기술 및 인프라 요구 사항은 implemen을 제한RLS의 약제 내성 감시와 유사한 접근 방법 테이션. 남아프리카 공화국 에이즈 치료 및 모니터링 가이드 라인은 현재 첫 선 17식이 요법 실패하는 사람들을위한 예술의 안내 선택에 GRT의 사용을 권장하지 않습니다. 개인은 주로 한 바이러스 (HIV-1 RNA 바이러스 부하) 매개 변수를 기반으로 전환됩니다. 그러나 2012 년, 남부 아프리카의 HIV 임상의 사회는 최초의 남부 아프리카의 ARV 약물 저항 테스트 가이드 라인 (18)을 발표했다. 이 지침은 첫 번째 줄과 두 번째 줄 ART 실패한 모든 성인과 PMTCT (18)에 노출 감염된 유아와 어린이를위한 GRT 테스트를 권장합니다. 남부 아프리카 19-29로 전송 약물 저항의 높은 수준에 대한 현재의 증거가 없기 때문에 그러나, GRT 심하게 감염된 개인에 대해 18을 사용하지 않는 것이 좋습니다. 그것은 이러한 추천 몇몇 국가 트레으로 시간이 지남에 따라 통합 될 것으로 기대된다지역의 다양한 국가의 atment 및 모니터링 지침. 이미 2013 년 남아프리카 공화국의 치료 지침에 성인을위한 두 번째 라인 실패의 시간과 아이들 (30)에 대한 첫 번째 또는 두 번째 라인 PI 기반 요법의 실패시에 GRT의 추천은 지금있다. 그것은 남아 프리카 공화국에서 치료 지침에 GRT를 도입하는 것은 잠재적으로 비용 중립 될 것으로 나타났습니다. 진정으로 두 번째 라인 치료로 전환 할 필요가 환자를 식별하는 GRT를 사용하여, 상대적으로 고가의 첫 번째 줄의 약물보다 두 번째 라인 요법 약물의 비용을 고려하면 프로그램에 대한 추가 비용을 발생하지 않습니다. 또, GRT 또한, 실패 다른 이유를 식별 치료 옵션을 보존하고 신흥 저항 패턴 (31)에 대한 정보를 생성 할 수있다. 따라서, 더욱 프리, 케어의 질을 향상시키기 위해 약물 저항 모니터링 방법의 비용을 감소시킬 필요가D 결과. 여기서, 우리는 역전사 중합 효소 연쇄 반응 (PCR) 및 시퀀싱 (표 1)뿐만 아니라 약제 내성 해석 대부분 오픈 소스 소프트웨어 일반 (오픈 소스) 프라이머를 사용하도록 설계 GRT 방법을 제시한다. 임상 관리의 경우, 프로토콜은 국가의 치료 지침에 밀착성을 가진 실험실 약제 내성 보고서의 전문 해석과 함께 종합적인 검토 및보고 방법에 의해 칭찬. 프로토콜은 네 가지 구성 요소로 나누어 져 1) HIV 리보 핵산 (RNA) 추출, 2) 역전사 중합 효소 연쇄 반응 (PCR) 바이러스 성 대상의 확대, 3) 시퀀싱 및 크로마토 그램, 정렬의 분석을위한 4) 생물 정보학 방법, 큐 레이션 및 시퀀스 데이터의 해석.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Superscript III 1st strand Synthesis kit</td>
			<td style="width:372px;">Life Technologies</td>
			<td align="right" style="width:119px;">18080051</td>
			<td style="width:265px;">Reverse Transcription</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">SATURN/LiFE Technologies Custom Primers</td>
			<td style="width:372px;">Life Technologies</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4473517</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Platinum Taq</td>
			<td style="width:372px;">Life Technologies</td>
			<td align="right" style="width:119px;">10966026</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">PureLink QUICK PCR Purification Kit</td>
			<td style="width:372px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">K310002</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Viroseq</td>
			<td style="width:372px;">ABBOTT</td>
			<td style="width:119px;">4J94-20</td>
			<td>Reverse Transcription and PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Agarose Tablets (Dnase/Rnase free)</td>
			<td style="width:372px;">BIOLINE</td>
			<td style="width:119px;">BIO-41027</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">TBE Buffer</td>
			<td style="width:372px;">MERCK</td>
			<td style="width:119px;">1.06177.2500</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">O&#39;Range Ruler 200bp DNA Ladder</td>
			<td style="width:372px;">Fermentas</td>
			<td style="width:119px;">FE SM0633</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Novel Juice</td>
			<td style="width:372px;">GeneDireX</td>
			<td style="width:119px;">LD001-1000&#160;</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">MiniBis Bioimaging System</td>
			<td style="width:372px;">DNR Bioimaging Systems Ltd</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Gel Documentation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Power Pac 300&#160;</td>
			<td style="width:372px;">BIORAD</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Gel Electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Big Dye Terminator Kit ver 3.1</td>
			<td style="width:372px;">Life Technologies</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4337456</td>
			<td>Sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Arrays</td>
			<td style="width:372px;">Life Technolgies</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4319899</td>
			<td>Sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">PoP</td>
			<td style="width:372px;">Life technologies</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4363785</td>
			<td>Sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">10 x EDTA Buffer</td>
			<td style="width:372px;">Life Technologies</td>
			<td align="right" style="width:119px;">402824</td>
			<td>Sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Formamide</td>
			<td style="width:372px;">Life Technologies</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4311320</td>
			<td>Sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">5 x Sequencing Buffer</td>
			<td style="width:372px;">Life Tecgnologies</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4336697</td>
			<td>Sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">3130 xl Genetic Analyzer</td>
			<td style="width:372px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">GeneAmp PCR System 9700</td>
			<td style="width:372px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>RT/PCR/Sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Centrifuge 5804</td>
			<td style="width:372px;">EPPENDORF</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Sample Processing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Centrifuge 5415R</td>
			<td style="width:372px;">EPPENDORF</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>RNA Extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Centrifuge 5415R</td>
			<td style="width:372px;">EPPENDORF</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>RT and PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Centrifuge 5415D</td>
			<td style="width:372px;">EPPENDORF</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>PCR Product Clean up</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Centrifuge 5810</td>
			<td style="width:372px;">EPPENDORF</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Sequencing Clean up</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Picofuge</td>
			<td style="width:372px;">BIORAD</td>
			<td style="width:119px;">C1301-230V</td>
			<td>RT and PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Vortex Genius 3</td>
			<td style="width:372px;">IKA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>RNA Extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Vortex Genius 3</td>
			<td style="width:372px;">IKA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>reagent preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Vortex mixer</td>
			<td style="width:372px;">IKA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Sequencing Clean up</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">NanoDrop 2000 UV/VIS spectrophotometer</td>
			<td style="width:372px;">ThermoScientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>DNA quantification&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">3M Sodium Acetate</td>
			<td style="width:372px;">MERCK</td>
			<td align="right" style="width:119px;">567422</td>
			<td>Sequencing Clean up</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Absolute Ethanol</td>
			<td style="width:372px;">MERCK</td>
			<td style="width:119px;">SAAR2233540LP</td>
			<td>Sequencing Clean up</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">1.5ml SARSTEDT Tubes</td>
			<td style="width:372px;">BIODEX</td>
			<td style="width:119px;">72.692.005</td>
			<td>RNA Extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">2ml SARSTEDT&#160; Tubes</td>
			<td style="width:372px;">BIODEX</td>
			<td style="width:119px;">72.693.005</td>
			<td>RNA Extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">2ml Collection tubes</td>
			<td style="width:372px;">SCIENTIFIC GROUP</td>
			<td style="width:119px;">MCT-200-NC/S</td>
			<td>RNA Extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Optical MicroAmp 96 Well reaction plates</td>
			<td style="width:372px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">N8010560</td>
			<td>Sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">200ul 8 Strip StarPCR Tubes with attached flat caps</td>
			<td style="width:372px;">STAR Lab - supplied by CELTIC</td>
			<td style="width:119px;">A1402-3700</td>
			<td>RT and PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">200ul PCR individual tubes</td>
			<td style="width:372px;">Scientific Group</td>
			<td style="width:119px;">CR/3745</td>
			<td>RT and PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Geneious&#160;</td>
			<td style="width:372px;">Biomatters</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Sequence analysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Internet Access</td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Preferrably high speed</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Web resources</td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">hivdb.stanford.edu</td>
			<td style="width:372px;">Stanford University</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Drug reistance analysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">http://bioafrica.mrc.ac.za:8080/regadb-ui/RegaDB</td>
			<td style="width:372px;">SATuRN</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>database</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">http://bioafrica.mrc.ac.za/tools/pppweb.html</td>
			<td style="width:372px;">SATuRN</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Sequence quality tool</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an affordable hiv-1 drug resistance monitoring method for resource limited settings

HIV-1 약 저항은 심각 항 레트로 바이러스 치료 (ART)의 효과 및 영향을 손상시킬 가능성이있다. 사하라 사막 이남의 아프리카에있는 예술 프로그램을 계속 확장으로, 예술에 개인은 밀접하게 약제 내성의 출현을 감시해야한다. ART에 이미 내성 바이러스 균주의 전송을 추적 할 수있는 전송 약물 저항의 감시도 중요합니다. 유전자형이 비싸고 정교한 실험 및 데이터 관리 인프라를 필요로하기 때문에 불행하게도, 약제 내성 검사는 여전히 자원 제한 설정에 쉽게 액세스 할 수 없습니다. 개인 관리 및 전송 약제 내성을 평가하기 위해 오픈 프리 유전형 약제 내성 모니터링 방법을 설명한다. 이 방법은 약제 내성 패턴의 해석과 개별 환자 보고서의 생성을위한 무료 오픈 소스 소프트웨어를 사용합니다. 유전자형 프로토콜은 AV와 혈장보다 큰 95 %의 증폭 율이iral로드&gt; 1000 HIV-1 RNA에 복사 / ㎖. 감도는 바이러스 부하 &lt;1000 HIV-1 RNA에 복사 / ㎖에서 상당히 감소한다. 여기에 설명 된 방법은 미국 식품의 약국 (FDA), Viroseq 유전자형 방법에 의해 승인 된 테스팅을 HIV-1 약물 저항의 방법에 대하여 검증 하였다. 여기에 기술 된 방법의 제한은 자동화하고 동일한 패널 아형 및 B를 증폭 있지만 그것은 또한, 샘플의 유효성 패널 순환 재조합 형태 CRF02_AG를 증폭 실패한되지 않는다는 사실을 포함한다.

검증 방법은 이전에보고 된 방법 (20)의 변형이었다. FDA에 의해 승인되었습니다 Viroseq의 유전자형 방법은 유효성 검사의 기준 방법으로 사용되었다. AIDS에 대한 연구 및 바이러스 성 간염 (ANRS)에 대한 프랑스의 국립 기관에서 얻은 숙련도 시험 샘플의 패널은 두 가지 방법 사이의 주요 비교에 사용되었다. 두 유전자형 방법은 성공적으로 두 가지 방법에 의해 증폭 된 샘플 HIVDB 프로그램에 의해 해석 등 모든 임상 적으로 중요한 약제 내성 관련 돌연변이를 식별하는 100 % 조화 된이었다. 표 6에 나타낸 바와 같이, 3 켤레 염기 서열은 99.5 % 동일 하였다. 예측 된 아미노산 서열은 100 % 동일 하였다. 다섯 중 하나의 샘플을 성공적으로 Viroseq에 의해 증폭 될 수 없습니다. Viroseq 의해 증폭되지 샘플 이외에, 사내 방법이 도시 된 두 번째 샘플을 증폭하는데 실패Viroseq에 의해 순환 재조합 바이러스 (CRF02_AG)이 될 수 있습니다. 두 방법으로 증폭 된 3 개의 시료는 서브 타입 B (2 개 샘플)과 서브 타입 A (하나의 샘플)이었다. <img alt="그림 5" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/51242/51242fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51242/51242fig5.jpg" /> 그림 5. 시퀀스 품질 보증의 한 부분으로 수행 HKY 이웃 가입 나무의 사용은. 매우 짧은 유전자 거리와 순서 네 쌍 / 클러스터가 있습니다. RES655과 RES655_1 사이의 유전 적 거리 (같은 샘플을 다른 일에 순서가) 0.003이다. 유전 적 거리가 다른 역학적으로 연결되지 않은 개인의 샘플 (0.075) 너무 짧로는 RES637_1/RES638 쌍과 잠재적 인 오류입니다. RES638_1에 비해 0.075의 거리와 나무의 다른 RES637 있습니다. CQ01/CQ02 클러스터가 제안하는 두 개의 샘플패널에서 동일한 샘플의 중복입니다. 그들은 REGA 하위 유형의 도구에 의해 할당 된 하위 유형을 확인하는 서브 타입 B의 레퍼런스 시퀀스와 함께 클러스터. REGA의 하위 유형의 도구는 각각 A와 CRF02_AG로 분류 된 반면, CQ05 및 CQ04은 각각 서브 타입과 G로 클러스터. HIV의 하위 유형과 재결합에 대한 또 다른 유용한 도구 http://www.datamonkey.org에서 확인할 수 있습니다 SCUEL입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51242/51242fig5highres.jpg" target="_blank">더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 5 개의 샘플의 패널은 자체 방식의 정밀도를 평가하기 위해 사용되었다. 텐 복제 유전자형은 5 개 샘플의 각각에 대해 생성되었다. 16 모세관 3130xl 유전 분석기를 사용하여, 50 유전자형의 48, 24에서 실행 생성 당일 제조 하였다. 모든 5 개의 샘플의 경우, 예측 된 아미노산 서열은 복제물 사이에 100 % 일치율되었습니다. 핵산 서열, 회의용감수는&gt; 99 % 페어 유사했다. 이 방법의 사용의 제 2 년 동안, 육십 샘플 시퀀싱 RNA 추출로부터 무작위로 반복 하였다. 시퀀스의 품질 평가 점수와 반복 실험 간의 혼합 기지의 수 사이에 통계적으로 유의 한 차이가 없었다. 육십쌍 대한 뉴클레오티드 및 아미노산 두 쌍 비교는 99 % 이상의 동일 하였다. 따라서 모든 쌍에 대한 약제 내성 돌연변이는 100 % 조화 된이었다. 비용 절감 RT, PCR 및 시퀀싱 반응 볼륨 생성 시퀀스의 품질의 저하없이, 적어도 절반, 일본어 제 20, 32을 기준으로 감소 하였다. 이것은 RT와 PCR 단계를 위해 50 %의 비용 절감을 가능하게했다. 새로운 방법은 원래 순서로 여섯 시퀀싱 프라이머와 함께 작동하도록 설계되었습니다<html> 프로테아제 유전자 및 역전사 효소 유전자 (20), (32)의 제 300 코돈 99 코돈. 비슷한 방법으로는 6 ~ 8 프라이머 33, 34을 사용합니다. 때로는 seprately 35, 36 프로테아제와 RT 유전자 시퀀싱하지만 일부 최근에 출판 된 방법은, 6 개 이하의 프라이머를 사용했습니다. 우리는 6-4 시퀀싱 프라이머의 수를 줄이기 위해 모색 (도 6) <img alt="그림 6" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51242/51242fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51242/51242fig6.jpg" /> 그림 6. 99 HIV-1 프로테아제 코돈 및 역전사 효소 유전자의 첫 코돈 300을 덮고 1197 염기쌍의 POL 시퀀스의 생성을위한 여섯 개의 VS 시퀀싱 프라이머에서 연속 서열 비교.242/51242fig6highres.jpg &quot;대상 =&quot;_blank &quot;&gt; 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오. 여섯 프라이머 (17)에서 생성 된 샘플들의 집합에서 서열이 프라이머 (MAW46 및 RTY) 배제 후 생성 된 서열과 비교 하​​였다. 하위 시퀀스 품질 평가 점수에 유의 한 차이는 없었다 (14) 서브 타입 C, 두 개의 하위 유형 B, 하나의 하위 유형 A.했다. 다시, 핵산 (17) 쌍 사이의 평균 페어 신원은 아미노산 수준에서 99 % 및 100 %이었다. 따라서, 6-4 시퀀싱 프라이머를 감소 거의 세 번째로 시퀀싱 비용의 감소 결과. 이 프로토콜에서 사용하는 유일한 독점 소프트웨어 도구는 시퀀스 어셈블리 Geneious했다. 약제 내성 해석 도구뿐만 아니라, 보고서 도구를 생성하는 모든 무료 오픈 액세스 도구입니다. 이 독점 소프트웨어의 사용과 관련된 비용을 제거함으로써 더욱 비용을 감소시킨다. 또한, collectivE 협상이 프로토콜에 대한 시약은 생활 기술에서 쉽게 액세스 할 수 있도록 키트에 패키지 및 토성 / 생활 기술은 방법 37 유전형으로 사용할 수있었습니다. 또한, 토성 회원은 할인 된 가격에 시약에 액세스 할 수 있습니다. 임상 설정 설명 프로토콜 크와 줄루 나탈 (주)의 농촌 지역 사회의 모니터링 및 약제 내성 감시에 구현되었습니다. (604) 유전자형의 총&gt; 1,000 RNA에 복사 / ml의 바이러스 부하 샘플 95 %의 증폭률 2010 년 12 월 월 ~ 2013 임상 샘플로부터 생성되었습니다. 이 임상 HIV 약제 내성 연구는 크와 줄루 나탈 (주)의 대학 (참조 BF052/10)의 생물 의학 연구 윤리위원회와 건강의 크와 줄루 나탈 (주) 부 (참조 HRKM 10분의 176)의 건강 연구위원회에 의해 승인되었습니다. 개별 환자의 보고서를 생성하고 병원으로 다시 보내졌다환자 관리를위한. 일흔 두 (72) 유전자형은, 전송 약제 내성 연구의 감시의 일환으로 발생하는 많은 잠재 인구 기반 HIV 감시 연구에 중첩되었다. 기본 샘플은 EDTA의 마이크로 튜브에 수집 바늘 찌르기 전혈했다. 유전자형에서 79 % (19)의 증폭률이 있었다. 감시 연구 샘플의 유전자형에 대한 윤리 승인 크와 줄루 나탈 (주) 바이오 메디컬 연구 윤리위원회의 대학 (참조 BE066107)에서 얻었다. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> 프라이머 이름 </td><td> 순서 </td><td> 길이 </td><td> 방향 </td><td> HXB2 위치 </td><td></td></tr><tr><td> MAW-26 </td><td> TTGGAAATGTGGAAA GGAAGGAC </td><td> 23 </td><td> 앞으로 </td><td> 2028년에서 2050년까지 </td><td> 1 차 PCR </td></tr><tr><td> RT-21 </td><td> CTGTATTTCAGCTATC AAGTCCTTTGATGGG </td><td> 31 </td><td> 역 </td><td> 3539-3509 </td><td> 1 차 PCR </td></tr><tr><td> 프로 - 1 </td><td> TAGAGCCAACAGCCC CACCA </td><td> (20) </td><td> 앞으로 </td><td> 2147년부터 2166년까지 </td><td> 2 차 PCR </td></tr><tr><td> RT-20 </td><td> CTGCCAATTCTAATTC TGCTTC </td><td> 22 </td><td> 역 </td><td> 3462-3441 </td><td> 2 차 PCR </td></tr><tr><td> RTC1F </td><td> ACCTACACCTGTCAA CATAATTG </td><td> 23 </td><td> 앞으로 </td><td> 2486년부터 2508년까지 </td><td> 시퀀싱 </td></tr><tr><td> RTC2R </td><td> TGTCAATGGCCATTG TTTAACCTTTGG </td><td> 27 </td><td> 역 </td><td> 2630년부터 2604년까지 </td><td> 시퀀싱 </td></tr><tr><td> RTC3F </td><td> CACCAGGGATTAGAT ATCAATATAATGTGC </td><td> (30) </td><td> 앞으로 </td><td> 2956년부터 2994년까지 </td><td> 시퀀싱 </td></tr><tr><td> RTC4R </td><td> CTAAATCAGATCCTAC ATACAAGTCATCC </td><td> 29 </td><td> 역 </td><td> 3129-3101 </td><td> 시퀀싱 </td></tr><tr><td> RT-Y </td><td> GTGTCTCATTGTTTAT ACTAGG </td><td> 22 </td><td> 역 </td><td> 2967년부터 2946년까지 </td><td> 시퀀싱 </td></tr><tr><td> MAW-46 </td><td> TCCCTCAGATCACTC TTTGGCAACGAC </td><td> 27 </td><td> 앞으로 </td><td> 2251년에서 2277년까지 </td><td> 시퀀싱 </td></tr></tbody></table> 표 1. 전사, PCR, 및 모든 99 HIV-1 프로테아제 코돈 및 역방향 trascriptase 유전자의 첫 코돈 300을 덮고 1197 염기쌍 POL 단편의 생성에 사용 시퀀싱 커스텀 역방향 프라이머. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> RT21 (5pmol/ml) </td><td> 0.5 </td><td> 0.2 </td></tr><tr><td> 의 dNTP (10 ㎜) </td><td> 0.5 </td><td> 0.4 </td></tr><tr><td> 합계 </td><td> 1 </td><td></td></tr></tbody></table> 표 2. 의 dNTP / 프라이머는 역전사 반응 동안 혼합한다. <table border= &quot;0&quot;cellpadding이 = &quot;0&quot;cellspacing = &quot;0&quot;&gt; <tbody><tr><td> 시약 </td><td> 볼륨 (ML) / 반응 </td><td> 농도 / 반응 </td></tr><tr><td> 먼저 스트랜드 버퍼 (10 배) </td><td> 1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> MgCl2를 (25 밀리미터) </td><td> 2 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> DTT (0.1 M) </td><td> 1 </td><td> 0.008 </td></tr><tr><td> RNaseOUT (40 U / ㎖) </td><td> 0.5 </td><td> 16 </td></tr><tr><td> 첨자 III 역전사 (200U/ml) </td><td> 0.5 </td><td> 8 </td></tr><tr><td> 합계 </td><td> 5 </td><td></td></tr></tbody></table> 표 3. 효소는 역전사 반응 동안 혼합한다. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> 시약 </td><td> 볼륨 (ML) / 반응 </td><td> 최종 농도 / 반응 </td></tr><tr><td> DEPC 처리 수 </td><td> 18.4 </td><td> - &lt;/ TD&gt; </tr><tr><td> PCR 버퍼 (10 배) </td><td> 2.5 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> MgCI 2 (50 MM) </td><td> 1 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> 의 dNTP 혼합 (10 ㎜) </td><td> 0.5 </td><td> 0.2 </td></tr><tr><td> 비뚤어진 프라이머 (5 pmol의 / ㎖) </td><td> 0.25 </td><td> 0.05 </td></tr><tr><td> 역방향 프라이머 (5 pmol의 / ㎖) </td><td> 0.25 </td><td> 0.05 </td></tr><tr><td> 백금의 Taq 중합 효소 (5 U / ㎖) </td><td> 0.1 </td><td> 0.02 </td></tr><tr><td> 소계 </td><td> 23 </td><td> - </td></tr></tbody></table> 표 4. 중첩 된 PCR을위한 마스터 믹스. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> 시약 </td><td> 볼륨 (ML) / 반응 </td><td> 농도 / 반응 </td></tr><tr><td> DEPC 처리 수 </td><td> 6.1 </td><td></td></tr><tr><td> 시퀀싱 버퍼 (배) </td><td> 2 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 프라이머 (3.2 pmol의 / ㎖) </td><td> 0.5 </td><td> 0.16 </td></tr><tr><td> 큰 염료 종료 시퀀싱 믹스 </td><td> 0.4 </td><td> - </td></tr><tr><td> 합계 </td><td> 9 </td><td></td></tr></tbody></table> 표 5. 시퀀싱 반응에 대한 마스터 믹스. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td align="center" colspan="4"> Viroseq </td><td align="center" colspan="4"> 실내 </td><td rowspan="2"> % NA 비슷한 </td></tr><tr><td> 샘플 ID </td><td> 하위 유형 </td><td> 품질 평가 점수 </td><td> PR 돌연변이 </td><td> RT 돌연변이 </td><td> 하위 유형 </td><td> 품질 평가 점수 </td><td> PR 돌연변이 </td><td> RT 돌연변이 </td></tr><tr><td> CQ01 </td><td> B </td><td> 99.9 </td><td> M46L, I54L, V82A, L90M </td><td> D67N, T69D, K70R, M184V, T215V, K219Q </td><td> B </td><td> 99.2 </td><td> M46L, I54L, V82A, L90M </td><td> D67N, T69D, K70R, M184V, T215V, K219Q </td><td> (100) </td></tr><tr><td> CQ02 </td><td> B </td><td> 99.5 </td><td> M46L, I54L, V82A, L90M </td><td> D67N, T69D, K70R, M184V, T215V, K219Q </td><td> B </td><td> 99.5 </td><td> M46L, I54L, V82A, L90M </td><td> D67N, T69D, K70R, M184V, T215V, K219Q </td><td> (100) </td></tr><tr><td> CQ03 </td><td> NA </td><td> NA </td><td></td><td></td><td> NA </td><td> NA </td><td></td><td> NA </td><td> NA </td></tr><tr><td> CQ04 </td><td> CRF02_AG </td><td> 98.4 </td><td> I54V, V82F, I84V </td><td> M41L, L74I, L210W, T215Y, V108I, Y181C </td><td> NA </td><td> NA </td><td> NA </td><td> NA </td><td> NA </td></tr><tr><td> CQ05 </td><td> </td><td> 99.7 </td><td></td><td> K103N </td><td> </td><td> 93 </td><td></td><td> K103N </td><td> (100) </td></tr></tbody></table> 표 6. 비교 resulViroseq 유전형 방법 및 ANRS 의해 제공된 샘플의 패널을 사용하여 내부 메소드 간의 병렬 분석 TS.

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An Affordable HIV-1 Drug Resistance Monitoring Method for Resource Limited Settings

항 레트로 바이러스 치료 (ART)를 실패한 HIV-1에 감염된 개인에 대한 약제 내성 검사는 미래의 치료법을 안내하고 치료 결과를 향상시킬 수 있습니다. 높은 HIV의 유행하지만 자원 제한 설정에서 최적화 개인과 집단의 건강 결과는 궁극적으로 저렴하고 접근 약제 내성 유전자형과 해석 방법이 필요합니다.

자원 제한 설정에 대한 경제적 인 HIV-1 약제 내성 모니터링 방법

HIV-1 drug resistance has the potential to seriously compromise the effectiveness and impact of antiretroviral therapy (ART). As ART programs in ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

18.4K 조회수.  University of KwaZulu-Natal, Durban, South Africa.  항 레트로 바이러스 치료 (ART)를 실패한 HIV-1에 감염된 개인에 대한 약제 내성 검사는 미래의 치료법을 안내하고 치료 결과를 향상시킬 수 있습니다. 높은 HIV의 유행하지만 자원 제한 설정에서 최적화 개인과 집단의 건강 결과는 궁극적으로 저렴하고 접근 약제 내성 유전자형과 해석 방법이 필요합니다. 

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Method for Novel Anti-Cancer Drug Development using Tumor Explants of Surgical Specimens

The current therapies for malignant glioma have only palliative effect. For therapeutic development, one hurdle is the discrepancy of efficacy determined by current drug efficacy tests and the efficacy on patients. Thus, novel and reliable methods for evaluating drug efficacy are warranted in pre-clinical phase. In vitro culture of tumor tissues, including cell lines, has substantial phenotypic, genetic, and epigenetic alterations of cancer cells caused by artificial environment of cell culture, which may not reflect the biology of original tumors in situ. Xenograft models with the immunodeficient mice also have limitations, i.e., the lack of immune system and interspecies genetic and epigenetic discrepancies in microenvironment. Here, we demonstrate a novel method using the surgical specimens of malignant glioma as undissociated tumor blocks to evaluate treatment effects. To validate this method, data with the current first-line chemotherapeutic agent, temozolomide (TMZ), are described.


We used the freshly-removed surgical specimen of malignant glioma for our experiments. We performed intratumoral injection of TMZ or other drug candidates, followed by incubation and analysis on surgical specimens. Here, we sought to establish a tumor tissue explant method as a platform to determine the efficacy of novel anti-cancer therapies so that we may be able to overcome, at least, some of the current limitations and fill the existing gap between the current experimental data and the efficacy on an actual patient's tumor. This method may have the potential to accelerate identifying novel chemotherapeutic agents for solid cancer treatment.

Here, we established a method for drug efficacy testing with surgical specimens of brain tumors, termed &#x201C;tumor explant method&#x201D;. With this method, we can evaluate drug efficacy without breaking the microenvironment of solid tumors. To validate reliability of this method, we describe representative data with our glioma specimen treated with the current first-line chemotherapeutic agent, temozolomide.

외과 종양 표본의 Explants를 사용하여 소설 안티 - 암 의약품 개발을위한 방법


The current therapies for malignant glioma have only palliative effect. For therapeutic development, one hurdle is the discrepancy of efficacy determined ...

연구

의학

An Orthotopic Murine Model of Human Prostate Cancer Metastasis

Our laboratory has developed a novel orthotopic implantation model of human prostate cancer (PCa). As PCa death is not due to the primary tumor, but rather the formation of distinct metastasis, the ability to effectively model this progression pre-clinically is of high value. In this model, cells are directly implanted into the ventral lobe of the prostate in Balb/c athymic mice, and allowed to progress for 4-6 weeks. At experiment termination, several distinct endpoints can be measured, such as size and molecular characterization of the primary tumor, the presence and quantification of circulating tumor cells in the blood and bone marrow, and formation of metastasis to the lung. In addition to a variety of endpoints, this model provides a picture of a cells ability to invade and escape the primary organ, enter and survive in the circulatory system, and implant and grow in a secondary site. This model has been used effectively to measure metastatic response to both changes in protein expression as well as to response to small molecule therapeutics, in a short turnaround time.

This orthotopic model of human prostate cancer allows for quantification of tumor size, circulating tumor cells, and formation of distinct metastasis to the lung. As cells must escape the primary organ, enter the blood stream, and implant into a secondary site, this model effectively recapitulates the scenario in humans.

인간의 전립선 암 전이의 동소 쥐과 모델

Our laboratory has developed a novel orthotopic implantation model of  human prostate cancer (PCa). As PCa death is not due to the primary tumor, but  ...

Techniques for Processing Eyes Implanted with a Retinal Prosthesis for Localized Histopathological Analysis: Part 2 Epiretinal Implants with Retinal Tacks

Retinal prostheses for the treatment of certain forms of blindness are gaining traction in clinical trials around the world with commercial devices currently entering the market. In order to evaluate the safety of these devices, in preclinical studies, reliable techniques are needed. However, the hard metal components utilised in some retinal implants are not compatible with traditional histological processes, particularly in consideration for the delicate nature of the surrounding tissue. Here we describe techniques for assessing the health of the eye directly adjacent to a retinal implant secured epiretinally with a metal tack.
Retinal prostheses feature electrode arrays in contact with eye tissue. The most commonly used location for implantation is the epiretinal location (posterior chamber of the eye), where the implant is secured to the retina with a metal tack that penetrates all the layers of the eye. Previous methods have not been able to assess the proximal ocular tissue with the tack in situ, due to the inability of traditional histological techniques to cut metal objects. Consequently, it has been difficult to assess localized damage, if present, caused by tack insertion.
Therefore, we developed a technique for visualizing the tissue around a retinal tack and implant. We have modified an established technique, used for processing and visualizing hard bony tissue around a cochlear implant, for the soft delicate tissues of the eye. We orientated and embedded the fixed eye tissue, including the implant and retinal tack, in epoxy resin, to stabilise and protect the structure of the sample. Embedded samples were then ground, polished, stained, and imaged under various magnifications at incremental depths through the sample. This technique allowed the reliable assessment of eye tissue integrity and cytoarchitecture adjacent to the metal tack.

Here we describe histological techniques for visualising ocular tissue directly adjacent to a metal epiretinal tack and retinal prosthesis.

현지화 된 조직 병리학 적 분석을위한 망막 보철물로 이식 된 가공 눈을위한 기술 : 파트 망막 끌어 올릴 2 망막 임플란트

Retinal prostheses for the treatment of certain forms of blindness are gaining traction in clinical trials around the world with commercial devices ...

Encapsulation Thermogenic Preadipocytes for Transplantation into Adipose Tissue Depots

Cell encapsulation was developed to entrap viable cells within semi-permeable membranes. The engrafted encapsulated cells can exchange low molecular weight metabolites in tissues of the treated host to achieve long-term survival. The semipermeable membrane allows engrafted encapsulated cells to avoid rejection by the immune system. The encapsulation procedure was designed to enable a controlled release of bioactive compounds, such as insulin, other hormones, and cytokines. Here we describe a method for encapsulation of catabolic cells, which consume lipids for heat production and energy dissipation (thermogenesis) in the intra-abdominal adipose tissue of obese mice. Encapsulation of thermogenic catabolic cells may be potentially applicable to the prevention and treatment of obesity and type 2 diabetes. Another potential application of catabolic cells may include detoxification from alcohols or other toxic metabolites and environmental pollutants.

Here, we present a protocol for encapsulation of catabolic cells, which consume lipids for heat production in intra-abdominal adipose tissue and increase energy dissipation in obese mice.

지방 조직의 종점에 이식 캡슐화 열 발생 Preadipocytes

Cell encapsulation was developed to entrap viable cells within semi-permeable membranes. The engrafted encapsulated cells can exchange low molecular ...

Implementation of In Vitro Drug Resistance Assays: Maximizing the Potential for Uncovering Clinically Relevant Resistance Mechanisms

Although targeted therapies are initially effective, resistance inevitably emerges. Several methods, such as genetic analysis of resistant clinical specimens, have been applied to uncover these resistance mechanisms to facilitate follow-up care. Although these approaches have led to clinically relevant discoveries, difficulties in attaining the relevant patient material or in deconvoluting the genomic data collected from these specimens have severely hampered the path towards a cure. To this end, we here describe a tool for expeditious discovery that may guide improvement in first-line therapies and alternative clinical management strategies. By coupling preclinical in vitro or in vivo drug selection with next-generation sequencing, it is possible to identify genomic structural variations and/or gene expression alterations that may serve as functional drivers of resistance. This approach facilitates the spontaneous emergence of alterations, enhancing the probability that these mechanisms may be observed in the patients. In this protocol we provide guidelines to maximize the potential for uncovering single nucleotide variants that drive resistance using adherent lines.

Implementation of In Vitro Drug Resistance Assays: Maximizing the Potential for Uncovering Clinically Relevant Resistance Mechanisms

Drug resistance to targeted therapeutics is widespread and the need to identify mechanisms of resistance--prior to or following clinical onset--is critical for guiding alternative clinical management strategies. Here, we present a protocol to couple derivation of drug-resistant lines in vitro with sequencing to expedite discovery of these mechanisms.

구현<em&gt; 체외</em&gt; 약물 저항 분석법 : 임상 적 저항 메커니즘을 폭로 가능성을 극대화

Although targeted therapies are initially effective, resistance inevitably emerges. Several methods, such as genetic analysis of resistant clinical ...

Bioluminescence-Based Tumor Quantification Method for Monitoring Tumor Progression and Treatment Effects in Mouse Lymphoma Models

Although bioluminescence imaging (BLI) shows promise for monitoring tumor burden in animal models of cancer, these analyses remain mostly qualitative. Here we describe a method for bioluminescence imaging to obtain a semi-quantitative analysis of tumor burden and treatment response. This method is based on the calculation of a luminoscore, a value that allows comparisons of two animals from the same or different experiments. Current BLI instruments enable the calculation of this luminoscore, which relies mainly on the acquisition conditions (back and front acquisitions) and the drawing of the region of interest (manual markup around the mouse). Using two previously described mouse lymphoma models based on cell engraftment, we show that the luminoscore method can serve as a noninvasive way to verify successful tumor cell inoculation, monitor tumor burden, and evaluate the effects of in situ cancer treatment (CpG-DNA). Finally, we show that this method suits different experimental designs. We suggest that this method be used for early estimates of treatment response in preclinical small-animal studies.

Bioluminescence imaging is a well-known tool for localizing tumors and metastases, but quantification of these images often requires complex calculations and particular instruments. We describe the easy-to-use luminoscore method, based on precise acquisition conditions, requiring no calculations, and enabling tumor burden and treatment response to be monitored in mouse models.

마우스 림프종 모델의 모니터링 종양의 진행과 치료 효과에 대한 생물 발광 기반 종양 정량 방법

Although bioluminescence imaging (BLI) shows promise for monitoring tumor burden in animal models of cancer, these analyses remain mostly qualitative. ...

An Improved Method for Rapid Intubation of the Trachea in Mice

Despite some anatomical and physiological differences, mouse models continue to be an essential tool for studying human lung disease. Bleomycin toxicity is a commonly used model to study both acute lung injury and fibrosis, and multiple methods have been developed for administering bleomycin (and other toxic agents) into the lungs. However, many of these approaches, such as transtracheal instillation, have inherent drawbacks, including the need for strong anesthetics and survival surgery. This paper reports a quick, reproducible method of intratracheal intubation that involves mild inhaled anesthesia, visualization of the trachea, and the use of a surrogate spirometer to confirm exposure. As a proof of concept, 8-12 week old C57BL/6 mice were administered either 2.0 U/kg of bleomycin or an equivalent volume of PBS, and both damage and fibrotic endpoints were measured post-exposure. This procedure allows researchers to treat a large cohort of mice in a relatively short period with little expense and minimal post-procedure care.

This article presents a rapid and simple method for administering bleomycin directly into the mouse trachea via intubation. Key advantages of this method are that it is highly reproducible, easy to master, and does not require specialized equipment or lengthy recovery times.

마우스의기도 신속 삽관 용 개선 된 방법

Despite some anatomical and physiological differences, mouse models continue to be an essential tool for studying human lung disease. Bleomycin toxicity ...

Pancreatic Duct Infusion: An Effective and Selective Method of Drug and Viral Delivery

The pancreas is a bifunctional organ with both endocrine and exocrine components. A number of pathologies can afflict the pancreas, including diabetes, pancreatitis, and pancreatic cancer. All three of these diseases mark active areas of study, not only to develop immediate therapy, but also to better understand their pathophysiology. There are few tools to further these areas of study. Pancreatic duct infusion is an important technique that can allow for lineage tracing, gene introduction, and cell line-specific targeting. The technique requires the intricate dissection of the second portion of the duodenum and ampulla, followed by the occlusion of the bile duct and the cannulation of the pancreatic duct. Although the technique is technically challenging at first, the applications are myriad. Ambiguity in the specifics of the procedure between groups highlighted the need for a standard protocol. This work describes the expression of a green fluorescent protein (GFP) within the pancreas after the pancreatic duct infusion of a viral vector expressing GFP versus a sham surgery. The infusion and therefore expression is specific to the pancreas, without expression present in any other tissue type.

Pancreatic duct infusion is an important technique that can allow for lineage tracing, gene introduction, and cell line-specific targeting. A pancreatic duct infusion technique for drug and viral delivery to pancreatic cells is presented here.

췌장 덕트 주입: 효과적이고 선택적 약물 및 바이러스 성 전달 방법

The pancreas is a bifunctional organ with both endocrine and exocrine components. A number of pathologies can afflict the pancreas, including diabetes, ...

Optimized LC-MS/MS Method for the High-throughput Analysis of Clinical Samples of Ivacaftor, Its Major Metabolites, and Lumacaftor in Biological Fluids of Cystic Fibrosis Patients

Defects in the cystic fibrosis trans-membrane conductance regulator (CFTR) are the cause of cystic fibrosis (CF), a disease with life-threatening pulmonary manifestations. Ivacaftor (IVA) and ivacaftor-lumacaftor (LUMA) combination are two new breakthrough CF drugs that directly modulate the activity and trafficking of the defective CFTR-protein. However, there is still a dearth of understanding on pharmacokinetic/pharmacodynamic parameters and the pharmacology of ivacaftor and lumacaftor. The HPLC-MS technique for the simultaneous analysis of the concentrations of ivacaftor, hydroxymethyl-ivacaftor, ivacaftor-carboxylate, and lumacaftor in biological fluids in patients receiving standard ivacaftor or ivacaftor-lumacaftor combination therapy has previously been developed by our group and partially validated to FDA standards. However, to allow the high-throughput analysis of a larger number of patient samples, our group has optimized the reported method through the use of a smaller pore size reverse-phase chromatography column (2.6 &#181;m, C8 100 &#197;; 50 x 2.1 mm) and a gradient solvent system (0-1 min: 40% B; 1-2 min: 40-70% B; 2-2.7 min: held at 70% B; 2.7-2.8 min: 70-90% B; 2.8-4.0 min: 90% B washing; 4.0-4.1 min: 90-40% B; 4.1-6.0 min: held at 40% B) instead of an isocratic elution. The goal of this study was to reduce the HPLC-MS analysis time per sample dramatically from ~15 min to only 6 min per sample, which is essential for the analysis of a large amount of patient samples. This expedient method will be of considerable utility for studies into the exposure-response relationships of these breakthrough CF drugs.

Ivacaftor and ivacaftor-lumacaftor combination are two new CF drugs. However, there is still a dearth of understanding on their PK/PD and pharmacology. We present an optimized HPLC-MS technique for the simultaneous analysis of ivacaftor and its major metabolites, and lumacaftor.

Ivacaftor, 그것의 주요 대사 산물, 및 생물 학적 체액의 낭 성 섬유 증 환자에서 Lumacaftor의 임상 샘플의 높은 처리량 분석에 대 한 최적화 된 LC-MS/MS 방법

Defects in the cystic fibrosis trans-membrane conductance regulator (CFTR) are the cause of cystic fibrosis (CF), a disease with life-threatening ...

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

The aim of this protocol presents an optimized procedure for the purification and cultivation of pBECs and to establish in vitro blood-brain barrier (BBB) models based on pBECs in mono-culture (MC), MC with astrocyte-conditioned medium (ACM), and non-contact co-culture (NCC) with astrocytes of porcine or rat origin. pBECs were isolated and cultured from fragments of capillaries from the brain cortices of domestic pigs 5-6 months old. These fragments were purified by careful removal of meninges, isolation and homogenization of grey matter, filtration, enzymatic digestion, and centrifugation. To further eliminate contaminating cells, the capillary fragments were cultured with puromycin-containing medium. When 60-95% confluent, pBECs growing from the capillary fragments were passaged to permeable membrane filter inserts and established in the models. To increase barrier tightness and BBB characteristic phenotype of pBECs, the cells were treated with the following differentiation factors: membrane permeant 8-CPT-cAMP (here abbreviated cAMP), hydrocortisone, and a phosphodiesterase inhibitor, RO-20-1724 (RO). The procedure was carried out over a period of 9-11 days, and when establishing the NCC model, the astrocytes were cultured 2-8 weeks in advance. Adherence to the described procedures in the protocol has allowed the establishment of endothelial layers with highly restricted paracellular permeability, with the NCC model showing an average transendothelial electrical resistance (TEER) of 1249 &#177; 80 &#937; cm2, and paracellular permeability (Papp) for Lucifer Yellow of 0.90 10-6 &#177; 0.13 10-6 cm sec-1 (mean &#177; SEM, n=55). Further evaluation of this pBEC phenotype showed good expression of the tight junctional proteins claudin 5, ZO-1, occludin and adherens junction protein p120 catenin. The model presented can be used for a range of studies of the BBB in health and disease and, with the highly restrictive paracellular permeability, this model is suitable for studies of transport and intracellular trafficking.

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

The aim of the protocol is to present an optimized procedure for the establishment of an in vitro blood-brain barrier (BBB) model based on primary porcine brain endothelial cells (pBECs). The model shows high reproducibility, high tightness, and is suitable for studies of transport and intracellular trafficking in drug discovery.

생체 외에서 혈액-뇌 장벽 돼지 뇌 내 피 세포를 기반으로 하는 모델의 설립에 대 한 방법 개선

The aim of this protocol presents an optimized procedure for the purification and cultivation of pBECs and to establish in vitro blood-brain barrier (BBB) ...