DT는 르 퐁 드 공들인 뒤 퀘벡 - 자연 등 기술 (FQRNT)와 MITACS 높이기 전략 원정대에서 박사 재학에 의해 지원되었다. CMC는 르 퐁 드 공들인 엉 상테 뒤 퀘벡 (FRSQ)와 어니스트 오타와 심장 연구소의 대학에서 마가렛 포드 심장 부여 연구 활동에서 박사 재학에 의해 지원되었다. EOB는 운영 보조금 건강 연구의 캐나다 연구소 (CIHR)에서 MOP80204과 마음에서 T6335과 온타리오의 뇌졸중 재단에 의해 지원되었다. CIHR과 메드 트로닉은 집단적으로 피어 리뷰 연구 의자 (URC # 57093)와 EOB를 제공합니다. AEP는 자연 과학 및 공학 연구위원회 (NSERC) 디스커버리 그랜트 NSERC 발견 가속기 보충에 의해 투자하고 감사 한 캐나다 연구 의자 (CRC) 프로그램 및 온타리오 주에서 조기 연구원 상의 지원을 인정한다.

단일 세포의 1. 기계 변형 <ol><li> 임베디드 형광 구슬을 가진 PDMS 기판의 제조 이전에 기판의 제조에, 물 해결책에있는 형광 마이크로 스피어의 소수성으로 인해 PDMS에 구슬 혼합을 향상시키기 위해 이소프로판올에 재현 탁하고 있습니다. <ol><li> 10 분 동안 16,200 XG에 1.5 ML의 microcentrifuge 관과 원심 분리기에 형광 마이크로 피펫 500 μL. </li><li> 뜨는을 취소하고 추가 이소프로판올 500 μL은 소용돌이로 교반의 5 분으로 하였다. 어떤 큰 입자가 침강 집계 있도록하기 위해 어둠 속에서 밤새 옆 유리 병을 넣어. </li><li> 다음 날 아침, 조심스럽게 깨끗한 마이크로 원심 유리 병에 뜨는을 제거합니다. 이 비드 용액을 5 개 이상의 기판을 제조하는데 사용될 수있다. 주 : 구슬 솔루션은 다음 3 일 동안 침전 할 것입니다. 펠렛을 재현 탁 않도록주의하십시오. </li><li> 제공된 경화제 0.5 g을 붓고과학적인 균형을 사용하여 1.5 ML의 마이크로 원심 유리 병에 PDMS 키트. 연속적인 단계로, 각 추가 사이에 1 분 동안 소용돌이로 교반, (6 개 15 μL의 추가에) 비즈 90 μL의 총을 추가합니다. 옆으로 설정합니다. </li><li> PDMS의 10g을 달아 형광 비드로 보충 경화제 0.5 g과 적어도 12 분 동안 혼합한다. </li><li> 제조업체의 지시에 따라 표준 포토 리소그래피 기술을 이용하여 SU-8 2050 십자가 모양의 몰드를 제작. 사용되는 금형은 320 ㎛의 높이 13.4 cm 2의 면적 (그림 3). 형은 428 μL 또는 PDMS의 440 밀리그램을 포함 할 수 있습니다. </li><li> 전송 피펫을 사용하여 십자가 모양의 금형에 구슬과 PDMS의 400 밀리그램을 넣어 80 ℃에서 2 시간 동안 치료 경화 후, 주형 (도 5a)로부터 기판을 벗긴다. 기판은 그것의 기계적 특성에 상당한 변화를 나타내지 않고, 실온에서 2 주간 배양 접시에서 유지 될 수있다. </리&gt; <li> 직경 약 4mm의 최종 크기와 페트리 접시에 (1:20 비율로 PDMS 경화제)와 80 ° C (그림 5B)에서 2 시간 동안 거꾸로 그들을 치료 PDMS의 방울을 붓는다. 이러한 고정 기능은 주 페트리 접시에 보관하실 수 있습니다. NOTE : 경화 공정 중에 평탄화로부터 방울을 방지하기 위해 거꾸로 접시를 유지한다. </li><li> 에어 플라즈마 치료 (30 W에서 30 초) 기판과 8 고정 기능을 제공합니다. 기판 (그림 5C)에 존재하는 사각형 모양의 들여 쓰기의 4 mm의 거리에서 기판의 양쪽에있는 기능을 결합한다. </li></ol></li><li> 클램프에 막 설치 <ol><li> 클램프의 홈이있는 부분의 주위에 원통형 기판의 각 끝을 감싸고 위로부터 2 개의 고정 나사 (그림 2B 및 그림 5D-E)와 함께 제자리에 고정. </li><li> 클램프 홀더 4 클램프 나사와 일회용 T를 사용하여 PDMS (비율 1:20) 부어기판 클램프 그루브 원통형 부분 사이에서 인터페이스를 ransfer 피펫. 1.5 mm 육각 키를 사용하여 홈이 원통 부분의 주위에 경화 PDMS를 확산. </li><li> 완전히 모세관 작용에 의해 채워지고 2 시간 (그림 5 층) 80 ° C에서 어셈블리를 치료할 때까지 홈에 PDMS (1:20) 붓는다. </li></ol></li><li> 막에서 셀 시드 <ol><li> 에어 플라즈마 치료 (30 W에서 30 초) 콜라겐 코팅이 가능하도록 기판을 소독 및 기능화하는 전체 집합. </li><li> 세포를 실온에서 1 시간 동안 쥐 꼬리 콜라겐을 16 ㎍ / ㎖로 보충 된 0.02 M 아세트산 1 ㎖ 시드 될 기판의 영역을 기능화. 원하는 최종 콜라겐 농도가 5 ㎍ / cm 2입니다. </li><li> 인산염 완충액으로 기판의 3 배를 세척하고 실온에서 건조 적어도 10 분 동안 식히십시오. </li><li> 10 % 소 태아 오는 보충 문화 매체의 40 μl를 추가합니다m 및 1cm 2의 면적 덮도록 상기 기판의 중앙부에서 2000 세포를 포함하는 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신 (셀 밀도 : 20 세포 / mm 2). 세포 밀도는 실험 요구 사항에 따라 변경 될 수 있습니다. </li><li> 기판은 그 위에 세포를 포함하는 배양 배지의 드롭 위로 향하게 표준 세포 배양 인큐베이터에서 전체 어셈블리를. 참고 : 어셈블리 기판이 세포가 단단하게 부착 할 수 있도록 적어도 3 시간 동안 향하도록 유지해야합니다. 증발을 방지하기 위해, 따뜻한 문화 매체의 30 μL은 기판의 드롭 3 시간 동안 매 45 분에 추가됩니다. </li><li> 3 시간 후, 기판을 담그고 세포가 증식 할 수 있도록 밤새 품어 신선한 배지로 가득 페트리 접시에 전체 어셈블리를 플립. </li><li> 다음 날, HEPES 버퍼 소금 솔루션 (HBSS를 준비, 헤 페스, 염화나트륨 120 밀리미터,의 KCl 5.3 밀리미터, 망초 0.8 밀리미터, 염화칼슘 1.8 ㎜, 드의 11.1 mm의 20 mM의xtrose). 7.4으로 산도를 조정합니다. 참고 : HBSS 용액을 매일 준비하고 실험하는 동안 37 ° C로 유지되어야한다. 이 생리 용액 정상 조직 / 혈액 환경을 흉내 현미경 스테이지에서 세포를 유지하기 위해 사용된다. </li><li> 반전 위상차 또는 형광 현미경 마운트 BAXS 플랫폼과 모터의 클램프 기판 조립품의 세트 업을 탑재합니다. HEPES 버퍼 (그림 2D)와 페트리 접시 히터 내부의 페트리 접시를 채우십시오. </li></ol></li></ol> 작은 구경의 선박 2. 강성 측정 <ol><li> 준비하기 <ol><li> 크렙스 생리 솔루션 : 118.1 mM의 NaCl을, 11.1 mM의 D-글루코스, 25 mM의 탄산 수소 나트륨, 4.7 밀리미터의 KCl, 1.2 mM의 망초, 1.2 ㎜ KH 2 PO 4, 2.5 mM의 염화칼슘 용액을 준비합니다. 7.4로 pH를 조정하고, 30 분간 carbogen 의료 가스 (95 % O2 / 5 % CO 2)와 용액에 산소. 참고 : 크렙스 soluti입니다에 매일 준비하고 실험하는 동안 37 ° C로 유지되어야한다. 이 생리적 솔루션은 정상 조직 / 혈액 환경을 흉내 살아있는 조직을 유지하는 데 사용됩니다. </li><li> 외과 용 가위, 굽은 핀셋, 마이크로 가위, 외과 해부 현미경, 50 ㎖ 폴리 프로필렌의 원심 분리기 튜브, 10 ㎖의 혈청 피펫 : 절개 대동맥 혈관의 기계적 평가를위한 장비를 수집합니다. 수술 및 실험 절차는 무균 조건을 필요로하지 않습니다. 미리로드 셀과 함께 BAXS 플랫폼의 클​​램프를 장착합니다. </li></ol></li><li> 조직 분리 및 해부 실험 동물을 포함한 모든 실험 절차는 국가의 사용자의 실험 동물의 관리 및 사용을위한 건강 가이드를 준수 기관, &#39;사용자의 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 받아야합니다. <ol><li> 99 % CO 2의 흡입으로 마우스 안락사를 수행합니다 (7 PSI)플렉시 유리 챔버 (그림 6A)에. </li><li> 오픈 마우스의 복부와 마우스를 피 흉부 대동맥을 잘라. </li><li> 다이어프램, 흉곽과 폐 엽 (叶) (그림 6B)를 제거합니다. 참고 : 조직 손상의 위험을 최소화 대동맥에 부착 된 마음을 유지하고 직접 용기에 닿지 않도록하지만, 마음을 사용하여 조작 할 수 있습니다. </li><li> 부드럽게 용기와 척추 사이에 절단하여 심장, 대동맥 근부 및 흉부 대동맥을 제거합니다. 참고 : 조직 손상 (그림 6C)의 내부 구조를 유지하기 위해 절단하는 동안 용기의 모든 신도를 유도하지 마십시오. </li><li> 즉시 담그고 크렙스 용액에 심장과 대동맥을 유지합니다. </li><li> 잘라 내기 및주의 깊게 혈전을 제거하는 크렙스 용액에 대동맥을 씻는다. 마이크로 가위, 핀셋, 외과 해부 현미경 (그림 6D-E)를 사용하여 결합 조직을 제거합니다. 참고 : 모든 선박의 길이를 유지하고 AOR을 사용선박의 방향을 결정하는 TIC 루트. </li></ol></li><li> 선박 치수 측정 및 설치 용기의 강성을 확인하려면 언로드 용기 치수가 필요하고 보정 현미경으로 확인할 수 있습니다. <ol><li> 길이가 약 2 ㎜의 대동맥 고리를 잘라 정밀 (그림 6 층-G)를 설정 보정 현미경을 사용하여 길이를 측정합니다. 크렙스 용액에 옆이 세그먼트를 넣습니다. </li><li> 2mm 세그먼트 (그림 6 층)의 각각의 사이에 가능한 한 작은 다른 대동맥 고리를 잘라. 루멘이 위로 향 현미경 유리 슬라이드에이 작은 세그먼트를 넣고 교정 현미경 설정 (그림 6H)를 사용하여 벽 두께를 측정합니다. </li><li> 크렙스 용액으로 BAXS 플랫폼에서 페트리 접시를 입력하고 (그림 4C의 확대 그림) 당기 핀에 2mm의 대동맥 링 세그먼트를 삽입합니다. </li></ol></li></ol> GE = &quot;항상&quot;&gt; <img alt="그림 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51454/51454fig5highres.jpg" width="500" /> 치료 후 그림 5. PDMS 기판의 제조 및 설치.는), 기판은 조심스럽게 SU-8 2050 형을 벗겨. B) PDMS 만든 기능을 앵커 페트리 접시에 따로 넣고에 기판을 보호하는 데 도움이됩니다 4 클램프에 장착 된 기판의 기판이어서 클램프 홀더에 장착되는 4 클램프 (인셋 참조) 상에 장착된다. D)를 장착하기위한 준비 기능 정박와 페이. C) 기판. E) 상세한 그림. F 기판 아래 홈에 PDMS를 붓는) 절차. 화살표는 천천히 모세관 현상에 의해 홈을 채우는 PDMS를 보여줍니다. 454fig6highres.jpg &quot;폭 =&quot;500 &quot;/&gt; 그림 6. 준비 및 흉부 대동맥의 분리.) 길이 복부 절개를 통해 수술기구와 안락사 마우스. B)를 준비, 흉곽과 폐의 LOB가 제거됩니다. C) 대동맥은 신중하게 조작 할 마음을 사용하여 제거 조직. D) 심장과 대동맥은 크렙스 생리 솔루션에 배치됩니다. 대동맥은 모든 결합 조직을 제거하여 청소한다. 두께 측정에 사용되는 작은 세그먼트와 함께 강성 평가에 사용되는 심장과 대동맥. F) 대동맥 세그먼트. GH)의 정확한 길이 (G) 및 두께를 나타내는 E) 상세한 그림 (H)에게 각 용기의 세그먼트들은 역 현미경 및 분석 프로그램을 이용하여 평가된다.

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J., Chien, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+of+the+effects+of+mechanical+stretch+on+vascular+smooth+muscle+cells.">Molecular basis of the effects of mechanical stretch on vascular smooth muscle cells.</a> J Biomech. 40, 947-960 (2007).</li><li>Frydrychowicz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-resolved+magnetic+resonance+angiography+and+flow-sensitive+4-dimensional+magnetic+resonance+imaging+at+3+Tesla+for+blood+flow+and+wall+shear+stress+analysis.">Time-resolved magnetic resonance angiography and flow-sensitive 4-dimensional magnetic resonance imaging at 3 Tesla for blood flow and wall shear stress analysis.</a> The Journal of thoracic and cardiovascular surgery. 136, 400-407 (2008).</li><li>Boccafoschi, F., Mosca, C., Bosetti, M., Cannas, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+mechanical+stretching+in+the+activation+and+localization+of+adhesion+proteins+and+related+intracellular+molecules.">The role of mechanical stretching in the activation and localization of adhesion proteins and related intracellular molecules.</a> J Cell Biochem. 112, 1403-1409 (2011).</li><li>Yang, G., Crawford, R. C., Wang, J. H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proliferation+and+collagen+production+of+human+patellar+tendon+fibroblasts+in+response+to+cyclic+uniaxial+stretching+in+serum-free+conditions.">Proliferation and collagen production of human patellar tendon fibroblasts in response to cyclic uniaxial stretching in serum-free conditions.</a> J Biomech. 37, 1543-1550 (2004).</li><li>Goldyn, A. M., Rioja, B. A., Spatz, J. P., Ballestrem, C., Kemkemer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force-induced+cell+polarisation+is+linked+to+RhoA-driven+microtubule-independent+focal-adhesion+sliding.">Force-induced cell polarisation is linked to RhoA-driven microtubule-independent focal-adhesion sliding.</a> J Cell Sci. 122, 3644-3651 (2009).</li><li>Heo, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiber+stretch+and+reorientation+modulates+mesenchymal+stem+cell+morphology+and+fibrous+gene+expression+on+oriented+nanofibrous+microenvironments.">Fiber stretch and reorientation modulates mesenchymal stem cell morphology and fibrous gene expression on oriented nanofibrous microenvironments.</a> Ann Biomed Eng. 39, 2780-2790 (2011).</li><li>Zdero, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linear+and+torsional+mechanical+characteristics+of+intact+and+reconstructed+scapholunate+ligaments.">Linear and torsional mechanical characteristics of intact and reconstructed scapholunate ligaments.</a> J Biomech Eng. 131, (2009).</li></ol>

저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

여기에 제시된 BAXS 플랫폼은 단일 세포의 조사에서 전체 조직에, mechanobiology의 연구에서 많은 실험을 용이하게한다. 또한, 플랫폼은 다수의 기계적인 자극 실험 및 다축 인장 시험을 허용하고 매우 유연한 구성이다. 이 플랫폼은 또한 생리 학적 조건에서 세포와 조직의 유지를 가능하게하고 스트레칭 실험시 현미경을 동시에 할 수 있습니다. 설치 클램프의 적절한 세트를 사용할 때 이전 섹션에서...

기계적인 미세 환경은 조직의 발달 및 항상성에 또한 질병 1-6에 지대한 영향을 미칠 예컨대 증식, 이동 및 분화와 같은 다양한 세포 기능에 중요한 역할을한다. 수년에 걸쳐, 실험의 여러 도구는 기계적으로 세포 나 조직을 자극하고 기본 mechanobiology에 대한 우리의 이해를 증가시키고 질병 6-17의 발병과 진행을 공부하는 것을 목표로 생물 조직의 기계적 특성을 측정하는 데 사용되었다. 그러나, 하나는 종종 특정 연구의 목적을 달성하기 위하여 여러 가지 실험 장치에 의존한다. 이 문서에서는 기계적 특성 및 기계적 힘이 전체 조직 저울의 길이에 하위 세포 생물학에서 재생하는 역할을 조사 연구를 허용하는 단일, 멀티 기능, 이축 연신 (BAXS) 플랫폼을 제공합니다. BAXS 플랫폼은 quantificatio 수 있습니다뿐만 아니라,또한 기계적 격리 조직의 특성 만의 N은 생체 내에서 발생하는 연신 그들의 응답을 이해하기 위해 살아있는 세포로, 간단한 복소 및 동적 스트레인 필드를 적용하는 능력을 용이하게한다. BAXS 플랫폼은 세포와 조직에 기계적인 테스트와 동요 동안 라이브 세포 현미경을 수행 할 수있는 능력을 유지합니다. BAXS 플랫폼은 세포 수준에서, 기판 변형의 효과를 조사하여 생체 조직 (도 1a)에서 인장 시험을 수행하는 데 사용할 수있는 맞춤식 장치이다. 알루미늄 히터는 표준 10 cm 페트리 접시를 수용 및 온도 제어기와 캡톤 히터 (도 1b)를 사용하여 37 ° C에서 어떠한 생리적 용액을 유지하기 위해 제조 하였다. 이 BAXS 플랫폼은 반전 위상 콘트라스트 및 / 또는 형광 현미경에 통합 및 동시 영상 (그림 1C)을 허용 할 수 있습니다.요컨데, BAXS 플랫폼은 이동 부분이이 수직축 (도 1D)을 따라 배향 소형 선형 모션 볼 베어링 슬라이드 상에 장착되어있는 4 개의 선형 보이스 코일 모터로 구성된다. 선형 위치 결정 스테이지 (도 1E)를 사용한다 클램핑 시스템의 수직 운동을 허용하기 위해 4 개의 모터의 각각에 장착된다. 각 모터의 위치는 500 nm의 해상도 (그림 1 층)와 광 인코더에 의해 모니터링된다. 네 개의 모터가 독립적으로 동작 명령 (그림 1G)를 실행하기 위해 옵티컬 엔코더 피드백을 이용한 모션 컨트롤러로 제어된다. LabVIEW는 인터페이스는 세포 또는 조직 샘플의, 완전히, 사용자 정의 정적 및 동적 변형을 생성하기 위해 변위의 크기, 속도 및 각 모터의 가속을 완전히 제어 할 수 있습니다. 세포에서 변형을 유도하는 데 사용되는 기술은 단순히 allowin함으로써 달성된다g 세포 단단히 플렉시블 투명 기판에 부착하고 BAXS 플랫폼의 네 개의 모터를 사용하여이 기판을 연신한다. BAXS 플랫폼은 음성 코일 모터에 기판을 연결하는 클램프의 맞춤 설계 세트로 장착 할 수 있습니다. 이 목적을 위해, 우리는 폴리 디메틸 실록산 (PDMS)로 이루어지는 유연하며 투명 기판이, (도 2A-C 및도 3)에 접속 될 수있는 클램프 세트를 설계했다. 클램프 생리적 용액에 노출 될 수있는 바와 같이, 모든 부품은 멸균 수 있도록 스테인레스 스틸로 기계 가공 하였다. 이러한 클램프 정중 (도 2d)를 연신하는 동안 기판 상에 스트레스를 최소화하면서 이미지 품질을 향상시키기 위해 현미경 대물 최대한 가까운 기판을 가지고 고안되었다. 동일한 BAXS 플랫폼은 ADAP와 클램프 적절한 세트를 사용하여, 작은 조직 샘플의 강성을 정량화하는데 사용될 수있다테드 조직 샘플 및 힘을 감시하는 로드셀 지원한다. 여러 가지 방법이 BAXS 플랫폼 모터에 조직을 마운트 가지고 갈 수있다; 이 경우에는 스텐레스 곤충 minutiens 핀은 인장 시험 (도 4A-B)를 수행하기 위해 혈관 조직의 개구부를 통해 연결 할 수있다. 대안 적으로, 천연 열지 않고 두꺼운 조직에 대한 조직 가장자리 역시 보이스 코일 모터에 부착 또는 생물학적 접착제와 작은 유리 슬라이드에 접착 및 클램프 모터에 연결된 클램프 위치에 유지 될 수있다. 인장을 수행하기 위해 소형 로드셀이 요구되는 테스트 용이 BAXS 플랫폼 모터에 혼입 및 연신 사이클 (도 4C) 동안 조직에 작용하는 힘을 측정 할 수있다. BAXS 플랫폼은 네 개의 모터로 구성 될 때, 제 2로드 셀을 도입 한 두 개의 직교하는 방향을 따라 인장 시험을 수행 할 수있다. 이 기능은 하나의 quantif 할 수 있습니다Y 동일한 실험을하는 동안 두 개의 수직 방향에 따라 단일 조직의 기계적 강성. 중요한 사실은, 모든 구성에서, 셀 또는 또한 조직 샘플은 항상 사용자에게 액세스 온도 조절 욕에서 유지된다. 이 능력은 샘플의 시간 응답을 조사하기 위해서 샘플 연신 동안 약리 제제의 도입을 허용한다. 도립 현미경의 광축이 막히지 남아 또한, 현미경의 모든 형태는 여전히 사용자가 이용할 수있다. BAXS 플랫폼의 네 개의 모터가 독립적으로 작동 마지막으로, 그 샘플에 높은 구성 변형 필드를 적용하는 것이 가능하다. 생체 세포와 조직이 노출되는 복잡하고 반대하는이 플랫폼에보다 적절하게 모방 할 수있는 스트레칭 이방성 전통적인 축 연신 플랫폼 7,13,15,18,19합니다. 또한, 물리적 특성변형 필드의 실험 기간 동안 즉석에서 변경 될 수 있습니다. 이러한 능력은 사용자가 시간적으로 매우 복잡한 이방성의 다양한 수, 및 공간적으로 다양한 변형 필드 세포 및 조직 수준의 응답을 검사 할 수있다. 이 문서는 장점과 한계에 BAXS 플랫폼뿐만 아니라 디자인, 작동 원리, 그리고 단일 세포 및 전체 조직 실험에 대한 실험 내용을 설명합니다. <img alt="그림 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51454/51454fig1highres.jpg" width="500" /> BAXS 플랫폼의 그림 1. 개요. 네 보이스 코일 모터 플랫폼 수행 라이브 거꾸로 현미경에 장착 할 수 있습니다) 37 ° C. C에서 세포와 조직을 유지하기 위해 사용되는 배양 접시 히터. B) 상세한 그림을 보여주는 BAXS 플랫폼의 윗면) 스트레칭 실험 도중 세포 이미징.D) 보이스 코일 모터의 상세한 그림; 클램핑 시스템 모션 컨트롤러. G) 상세 사진에 모터의 실시간 위치를 제공하는 광학 인코더의. F) 상세 사진의 수직 변위를 허용하는 선형 위치 결정 스테이지의 플랫폼의 이동 부분. E) 상세한 그림 네 개의 보이스 코일 모터로 네 광학 엔코더 입력과 전원 출력을 나타낸 모션 컨트롤러. <img alt="그림 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51454/51454fig2highres.jpg" width="500" /> 그림 2. 세포 스트레칭 실험 시스템을 클램핑. 기판은 그것의 앵커 featur와 클램프의 원통형 부분의 주위에 싸여있다. C)를 연신위한 보이스 코일 모터에 PDMS 기판을 연결하는 데 사용되는 클램프의 상세를 도시 AB) 이미지에스 상단에있는 홈에 앉아. 그런 다음, 기판 상단 홈에 기능을 고정 / 기판을 밀어 고정 나사를 사용하여 고정한다. 클램프 자리에 기판을 들고 BAXS 플랫폼의 D) 그림. 삽입물은 부착 세포는 단지 커버 슬립과 현미경 대물 위에 앉아있는 기판의 세부를 도시한다. <img alt="그림 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51454/51454fig3highres.jpg" width="500" /> 도 3. 막과 클램핑 시스템의 재료의 명세서. 주요부의 치수를 나타낸 도면 셀 연신 실험을 수행하기 위해 이축 플랫폼에 통합. <img alt="그림 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51454/51454fig4highres.jpg" width="500" /> 그림 4. 예소 구경 혈관의 강성 평가 1mm 직경 쥐 대동맥에서 변형을 유도하기 위해 사용되는 클램핑 시스템. AB) 상세한 그림 클램핑 시스템의 충분한. 스테인레스 스틸 핀은주의 깊게 선박이 두 핀에 클램프 선박 및 고정 모터와 왼쪽 클램프 사이에 부착 된 로드셀을 들고 BAXS 플랫폼. C) 그림을 슬라이드 할 수 있도록 열려있는 삼각형으로 형성되었다. 삽입 된 핀에 장착 된 용기에 대한 자세한 높은 전망을 보여줍니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="849">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">PDMS</td>
			<td style="width:155px;">Ellsworth Adhesives</td>
			<td style="width:255px;">184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td>
			<td style="width:167px;">The ratio base to cross-linker used in this protocol is 20:1. Mix in a laminar hood to keep dust from contamining your&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">FluoSpheres fluorescent microspheres</td>
			<td style="width:155px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:255px;">F8810</td>
			<td>Keep away from light.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Linear voice coil</td>
			<td style="width:155px;">Moticont</td>
			<td style="width:255px;">LVCM-051-051-01</td>
			<td>The motro comes in two pieces (magnet and coil). It has to be mounted on a ball bearing sytem to be functional.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Ball bearing slide</td>
			<td style="width:155px;">Edmund Optics</td>
			<td style="width:255px;">NT37-360</td>
			<td>Miniature and Small Linear Motion Ball Bearing Slides</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">linear positioning stage</td>
			<td style="width:155px;">Edmund Optics</td>
			<td style="width:255px;">38-960</td>
			<td>Center Drive 1.25&#34; Square Linear Translation Stages</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">optical encoder</td>
			<td style="width:155px;">GSI microE systems</td>
			<td style="width:255px;">Mercury II 1600S - 0.5um resolution</td>
			<td>reflective incremental encoder.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:273px;">motion controller</td>
			<td style="width:155px;">Galil</td>
			<td style="width:255px;">DMC-2143(DIN)-DC48 with AMP-20440</td>
			<td>4 axis controller with a 4 axis amplifier</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">load cell&#160;</td>
			<td style="width:155px;">Honeywell</td>
			<td style="width:255px;">31 low</td>
			<td>miniature load cell with a range of 0-150 g</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Insect minutiens pins (0,20mm)</td>
			<td style="width:155px;">Pin Service Austerlitz Insect pins</td>
			<td style="width:255px;"></td>
			<td>Stainless steel pins that are bended in an opened triangle shape</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">SU-8 2050</td>
			<td style="width:155px;">Micro Chem</td>
			<td style="width:255px;">SU-8 2050</td>
			<td>Permanent epoxy negative photoresist. Keep away from heat and light</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Air-plasma treatment system</td>
			<td style="width:155px;">Glowresearch</td>
			<td style="width:255px;"></td>
			<td>Autoglow Oxygen Plasma System</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Rat-tail collagen</td>
			<td style="width:155px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:255px;">A10483-01</td>
			<td>Collagen I, Rat Tail 5mg/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Hoechst 33342</td>
			<td style="width:155px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:255px;">R37605</td>
			<td>DNA-specific fluorescent dye. Keep in the fridge.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:273px;">Kapton (Polyimide Film) Insulated Flexible Heaters</td>
			<td style="width:155px;">omega.ca</td>
			<td style="width:255px;">KHLV-0504/(10)-P</td>
			<td>28V flexible heaters; can be supplied with a 24V</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:273px;">1/16 DIN Autotune Temperature and Process Controllers</td>
			<td style="width:155px;">omega.ca</td>
			<td style="width:255px;">CN63200-R1-LV</td>
			<td>Temperature controller; supply 24 V.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">DMEM culture medium</td>
			<td style="width:155px;">Hyclone</td>
			<td style="width:255px;">SH3024301</td>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified 30 Eagle Medium. Keep at 4 C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:155px;">Hyclone</td>
			<td style="width:255px;">SV30010</td>
			<td>Keep stock frozen. Keep working solution at 4 C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td style="width:155px;">Hyclone</td>
			<td style="width:255px;">SH3039603C</td>
			<td>Keep frozen.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Trypsin 0,05%</td>
			<td style="width:155px;">Hyclone</td>
			<td style="width:255px;">SH30236,02</td>
			<td>Keep frozen. Digestion of cell attachement proteins for subcultivation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Hepes</td>
			<td style="width:155px;">Wisent Inc</td>
			<td style="width:255px;">330-050-EL</td>
			<td>HEPES-buffered salt solution&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">NaCl</td>
			<td style="width:155px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:255px;">BP358-1</td>
			<td>HEPES-buffered salt solution / Krebs physiological solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">KCl</td>
			<td style="width:155px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:255px;">BP366-500</td>
			<td>HEPES-buffered salt solution / Krebs physiological solution</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:273px;">MgSO4</td>
			<td style="width:155px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:255px;">M65-500</td>
			<td>HEPES-buffered salt solution / Krebs physiological solution</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:273px;">CaCl2</td>
			<td style="width:155px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:255px;">C614-500</td>
			<td>HEPES-buffered salt solution / Krebs physiological solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Dextrose</td>
			<td style="width:155px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:255px;">BP220-1</td>
			<td>HEPES-buffered salt solution / Krebs physiological solution</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:273px;">NaHCO3</td>
			<td style="width:155px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:255px;">BP328-1</td>
			<td>Krebs physiological solution</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:273px;">KH2PO4</td>
			<td style="width:155px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:255px;">BP362-500</td>
			<td>Krebs physiological solution</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:273px;">Carbogen 95% O2/ 5% CO2</td>
			<td style="width:155px;">Lindle</td>
			<td style="width:255px;">DIN:02154749</td>
			<td>Krebs physiological solution oxygenation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Nocodazole</td>
			<td style="width:155px;">Sigma</td>
			<td style="width:255px;">M1404</td>
			<td>Microtubules depolymerization agent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Cytochalasin-D</td>
			<td style="width:155px;">Sigma</td>
			<td style="width:255px;">C8273</td>
			<td>Actin filaments depolymerization agent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Anti-&#945;-SMA-FITC</td>
			<td style="width:155px;">Sigma</td>
			<td style="width:255px;">F3777</td>
			<td>Used to stain and quantify smooth muscle cells content</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Picrosirius red stain</td>
			<td style="width:155px;">Fluka</td>
			<td style="width:255px;">43665</td>
			<td>Used to stain and quantify collagen content</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a novel stretching platform for applications in cell and tissue mechanobiology

세포와 조직에 기계적인 힘의 응용 프로그램이나 그 수있는 도구는 생물학적 조직의 기계적 특성이 기본 mechanobiology의 이해에 크게 기여 정량화 할 수 있습니다. 이 기술은 광범위하게 각종 질병의 발병과 진행이 크게 기계적 신호에 의해 영향을하는 방법을 설명하는 데 사용되었다. 이 문서는 기계적으로 하나의 세포를 자극하거나 조직의 기계적 강도를 정량화 할 수 있습니다 다기능 축 연신 (BAXS) 플랫폼을 제공합니다. BAXS 플랫폼은 독립적으로 제어 할 수있는 네 개의 보이스 코일 모터로 구성되어 있습니다. 단일 세포는 하나, 복잡한 동적 및 공간적 변화 스트레인 필드에 세포를 노출 할 수 있도록 모터에 부착 될 수있는 유연한 기판상에서 배양 될 수있다. 반대로, 로드셀을 통합하여, 하나는 이들이 변형 사이클에 노출 될 때 기본 조직의 기계적 특성을 정량화 할 수있다.두 경우 모두, 클램프의 적절한 세트를 설계해야하고 단단히 유연성 기판 또는 그 조직을 유지하기 위하여 BAXS 플랫폼 모터에 장착. BAXS 플랫폼은 연신 실험 동안 샘플의 구조적 또는 생화학 적 반응을 조사하기 위해 동시 투과광 및 / 또는 형광 이미징을 수행하는 도립 현미경에 장착 될 수있다. 이 문서에서는 BAXS 플랫폼의 디자인과 사용의 실험 세부 사항을 제공하고 단일 셀 및 전체 조직 연구에 대한 결과를 제시한다. BAXS 플랫폼은 기판 변형시키고 절연 쥐 대동맥의 강성을 측정하는 것에 응답하여 하나의 마우스 근원 세포 세포에서 핵의 변형을 측정 하였다. BAXS 플랫폼은 하위 세포, 세포 및 전체 조직 수준에서 신규 mechanobiological 통찰력을 제공하기 위해 다양한 광학 microscopies과 결합 될 수있는 다양한 도구이다.

스트레칭 셀 BAXS 플랫폼은 하나의 마우스 근원 세포 세포에서 핵의 기계적 응답 (C2C12) 25 %의 기판의 변형에 노출을 조사하기 위해 사용 하였다. 근원 세포 세포는 근육 조직에서 발견하고 지속적으로 생체 내에서 기계적 스트레칭 및 압축에 노출되어 있습니다. 세포핵의 형상이나 기계적 성질은 유전자 발현 및 전사 활성 (20, 21)의 조절에 또한 발?...

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A Novel Stretching Platform for Applications in Cell and Tissue Mechanobiology

우리는이 문서에서 복잡한 이방성 축 기계적 변형에 하나의 세포 반응을 조사하고 생체 조직의 기계적 특성을 정량화하는 데 사용할 수있는 새로운 스트레칭 플랫폼을 제시한다.

세포와 조직 Mechanobiology의 응용 프로그램에 대한 새로운 스트레칭 플랫폼

Tools that allow the application of mechanical forces to cells and tissues or that can quantify the mechanical properties of biological tissues have ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

11.7K 조회수.  University of Ottawa.  우리는이 문서에서 복잡한 이방성 축 기계적 변형에 하나의 세포 반응을 조사하고 생체 조직의 기계적 특성을 정량화하는 데 사용할 수있는 새로운 스트레칭 플랫폼을 제시한다. 

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Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1 While microcontact printing can be employed to directly print a large number of molecules, including proteins,2 DNA,3 and silanes,4 the formation of self-assembled monolayers (SAMs) from long chain alkane thiols on gold provides a simple way to confine proteins and cells to specific patterns containing adhesive and resistant regions. This confinement can be used to control cell morphology and is useful for examining a variety of questions in protein and cell biology. Here, we describe a general method for the creation of well-defined protein patterns for cellular studies.5 This process involves three steps: the production of a patterned master using photolithography, the creation of a PDMS stamp, and microcontact printing of a gold-coated substrate. Once patterned, these cell culture substrates are capable of confining proteins and/or cells (primary cells or cell lines) to the pattern.
The use of self-assembled monolayer chemistry allows for precise control over the patterned protein/cell adhesive regions and non-adhesive regions; this cannot be achieved using direct protein stamping. Hexadecanethiol, the long chain alkane thiol used in the microcontact printing step, produces a hydrophobic surface that readily adsorbs protein from solution. The glycol-terminated thiol, used for backfilling the non-printed regions of the substrate, creates a monolayer that is resistant to protein adsorption and therefore cell growth.6 These thiol monomers produce highly structured monolayers that precisely define regions of the substrate that can support protein adsorption and cell growth. As a result, these substrates are useful for a wide variety of applications from the study of intercellular behavior7 to the creation of microelectronics.8
While other types of monolayer chemistry have been used for cell culture studies, including work from our group using trichlorosilanes to create patterns directly on glass substrates,9 patterned monolayers formed from alkane thiols on gold are straight-forward to prepare. Moreover, the monomers used for monolayer preparation are commercially available, stable, and do not require storage or handling under inert atmosphere. Patterned substrates prepared from alkane thiols can also be recycled and reused several times, maintaining cell confinement.10

Self-assembled monolayers (SAMs) formed from long chain alkane thiols on gold provide well-defined substrates for the formation of protein patterns and cell confinement. Microcontact printing of hexadecanethiol using a polydimethylsiloxane (PDMS) stamp followed by backfilling with a glycol-terminated alkane thiol monomer produces a pattern where protein and cells adsorb only to the stamped hexadecanethiol region.

단백질과 세포 교도소에 대한 2 차원 문양의 기판 만들기

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

연구

생체공학

Sandwich-like Microenvironments to Harness Cell/Material Interactions

Cell culture has been traditionally carried out on bi-dimensional (2D) substrates where cells adhere using ventral receptors to the biomaterial surface. However in vivo, most of the cells are completely surrounded by the extracellular matrix (ECM), resulting in a three-dimensional (3D) distribution of receptors. This may trigger differences in the outside-in signaling pathways and thus in cell behavior.
This article shows that stimulating the dorsal receptors of cells already adhered to a 2D substrate by overlaying a film of a new material (a sandwich-like culture) triggers important changes with respect to standard 2D cultures. Furthermore, the simultaneous excitation of ventral and dorsal receptors shifts cell behavior closer to that found in 3D environments. Additionally, due to the nature of the system, a sandwich-like culture is a versatile tool that allows the study of different parameters in cell/material interactions, e.g., topography, stiffness and different protein coatings at both the ventral and dorsal sides. Finally, since sandwich-like cultures are based on 2D substrates, several analysis procedures already developed for standard 2D cultures can be used normally, overcoming more complex procedures needed for 3D systems.

The following protocol describes the procedure to assemble sandwich-like cultures to be used as an intermediate stage between bi-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) cellular environments. The engineered systems can have applications in microscopy, biomechanics, biochemistry and cell biology assays.

샌드위치 같은 미세 환경은 셀 / 재료의 상호 작용을 활용하는

Cell culture has been traditionally carried out on bi-dimensional (2D) substrates where cells adhere using ventral receptors to the biomaterial surface. ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet high-throughput, method to perform single-cell culture experiments. Here, we report a microfluidic chip-based strategy for high-efficiency single-cell isolation (~77%) and demonstrate its capability of performing long-term single-cell culture (up to 7 d) and cellular heterogeneity analysis using clonogenic assay. These applications were demonstrated with KT98 mouse neural stem cells, and A549 and MDA-MB-435 human cancer cells. High single-cell isolation efficiency and long-term culture capability are achieved by using different sizes of microwells on the top and bottom of the microfluidic channel. The small microwell array is designed for precisely isolating single-cells, and the large microwell array is used for single-cell clonal culture in the microfluidic chip. This microfluidic platform constitutes an attractive approach for single-cell culture applications, due to its flexibility of adjustable cell culture spaces for different culture strategies, without decreasing isolation efficiency.

Here, we present a protocol for isolating and culturing single cells with a microfluidic platform, which utilizes a new microwell design concept to allow for high-efficiency single cell isolation and long-term clonal culture.

높은 처리량 단일 세포의 분리 및 문화를위한 미세 유체 플랫폼

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

Light-mediated Formation and Patterning of Hydrogels for Cell Culture Applications

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In particular, light-mediated click reactions, such as photoinitiated thiol&#8722;ene and thiol&#8722;yne reactions, afford spatiotemporal control over material properties and allow the design of systems with a high degree of user-directed property control. Fabrication and modification of hydrogel-based biomaterials using the precision afforded by light and the versatility offered by these thiol&#8722;X photoclick chemistries are of growing interest, particularly for the culture of cells within well-defined, biomimetic microenvironments. Here, we describe methods for the photoencapsulation of cells and subsequent photopatterning of biochemical cues within hydrogel matrices using versatile and modular building blocks polymerized by a thiol&#8722;ene photoclick reaction. Specifically, an approach is presented for constructing hydrogels from allyloxycarbonyl (Alloc)-functionalized peptide crosslinks and pendant peptide moieties and thiol-functionalized poly(ethylene glycol) (PEG) that rapidly polymerize in the presence of lithium acylphosphinate photoinitiator and cytocompatible doses of long wavelength ultraviolet (UV) light. Facile techniques to visualize photopatterning and quantify the concentration of peptides added are described. Additionally, methods are established for encapsulating cells, specifically human mesenchymal stem cells, and determining their viability and activity. While the formation and initial patterning of thiol-alloc hydrogels are shown here, these techniques broadly may be applied to a number of other light and radical-initiated material systems (e.g., thiol-norbornene, thiol-acrylate) to generate patterned substrates.

We describe a sequential process for light-mediated formation and subsequent biochemical patterning of synthetic hydrogel matrices for three-dimensional cell culture applications. The construction and modification of hydrogels with cytocompatible photoclick chemistry is demonstrated. Additionally, facile techniques to quantify and observe patterns and determine cell viability within these hydrogels are presented.

세포 배양 응용 프로그램에 대한 히드로 겔의 빛 매개 형성 및 패터닝

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In ...

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional Poly(&#949;-caprolactone) Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

This tutorial reflects on the fundamental principles and guidelines for electrospinning writing with polymer melts, an additive manufacturing technology with great potential for biomedical applications. The technique facilitates the direct deposition of biocompatible polymer fibers to fabricate well-ordered scaffolds in the sub-micron to micro scale range. The establishment of a stable, viscoelastic, polymer jet between a spinneret and a collector is achieved using an applied voltage and can be direct-written. A significant benefit of a typical porous scaffold is a high surface-to-volume ratio which provides increased effective adhesion sites for cell attachment and growth. Controlling the printing process by fine-tuning the system parameters enables high reproducibility in the quality of the printed scaffolds. It also provides a flexible manufacturing platform for users to tailor the morphological structures of the scaffolds to their specific requirements. For this purpose, we present a protocol to obtain different fiber diameters using melt electrospinning writing (MEW) with a guided amendment of the parameters, including flow rate, voltage and collection speed. Furthermore, we demonstrate how to optimize the jet, discuss often experienced technical challenges, explain troubleshooting techniques and showcase a wide range of printable scaffold architectures.

This protocol serves as a comprehensive guideline to fabricate scaffolds via electrospinning with polymer melts in a direct writing mode. We systematically outline the process and define the appropriate parameter settings for achieving targeted scaffold architectures.

조직 공학 응용 프로그램에 대 한 제어 형태학과 3 차원 Poly(ε-caprolactone) 장비의 전기 글 녹아

This tutorial reflects on the fundamental principles and guidelines for electrospinning writing with polymer melts, an additive manufacturing technology ...

An Ultrahigh-throughput Microfluidic Platform for Single-cell Genome Sequencing

Sequencing technologies have undergone a paradigm shift from bulk to single-cell resolution in response to an evolving understanding of the role of cellular heterogeneity in biological systems. However, single-cell sequencing of large populations has been hampered by limitations in processing genomes for sequencing. In this paper, we describe a method for single-cell genome sequencing (SiC-seq) which uses droplet microfluidics to isolate, amplify, and barcode the genomes of single cells. Cell encapsulation in microgels allows the compartmentalized purification and tagmentation of DNA, while a microfluidic merger efficiently pairs each genome with a unique single-cell oligonucleotide barcode, allowing &gt;50,000 single cells to be sequenced per run. The sequencing data is demultiplexed by barcode, generating groups of reads originating from single cells. As a high-throughput and low-bias method of single-cell sequencing, SiC-seq will enable a broader range of genomic studies targeted at diverse cell populations.

Single-cell sequencing reveals genotypic heterogeneity in biological systems, but current technologies lack the throughput necessary for the deep profiling of community composition and function. Here, we describe a microfluidic workflow for sequencing &gt;50,000 single-cell genomes from diverse cell populations.

단일 셀 게놈 시퀀싱 초고 처리량 미세 플랫폼

Sequencing technologies have undergone a paradigm shift from bulk to single-cell resolution in response to an evolving understanding of the role of ...

A Novel Tenorrhaphy Suture Technique with Tissue Engineered Collagen Graft to Repair Large Tendon Defects

Surgical management of large tendon defects with tendon grafts is challenging, as there are a finite number of sites where donors can be readily identified and used. Currently, this gap is filled with tendon auto-, allo-, xeno-, or artificial grafts, but clinical methods to secure them are not necessarily translatable to animals because of the scale. In order to evaluate new biomaterials or study a tendon graft made up of collagen type 1, we have developed a modified suture technique to help maintain the engineered tendon in alignment with the tendon ends. Mechanical properties of these grafts are inferior to the native tendon. To incorporate engineered tendon into clinically relevant models of loaded repair, a strategy was adopted to offload the tissue engineered tendon graft and allow for the maturation and integration of the engineered tendon in vivo until a mechanically sound neo-tendon was formed. We describe this technique using incorporation of the collagen type 1 tissue engineered tendon construct.

In this paper, we present an in vitro and in situ protocol to repair a tendon gap of up to 1.5 cm by filling it with engineered collagen graft. This was performed by developing a modified suture technique to take the mechanical load until the graft matures into the host tissue.

큰 힘줄 결함을 복구하는 조직 엔지니어링 콜라겐 이식과 새로운 테노르래피 봉합사 기술

Surgical management of large tendon defects with tendon grafts is challenging, as there are a finite number of sites where donors can be readily ...

A Microfluidic Platform for Stimulating Chondrocytes with Dynamic Compression

Mechanical stimuli are known to modulate biological functions of cells and tissues. Recent studies have suggested that compressive stress alters growth plate cartilage architecture and results in growth modulation of long bones of children. To determine the role of compressive stress in bone growth, we created a microfluidic device actuated by pneumatic pressure, to dynamically (or statically) compress growth plate chondrocytes embedded in alginate hydrogel cylinders. In this article, we describe detailed methods for fabricating and characterizing this device. The advantages of our protocol are: 1) Five different magnitudes of compressive stress can be generated on five technical replicates in a single platform, 2) It is easy to visualize cell morphology via a conventional light microscope, 3) Cells can be rapidly isolated from the device after compression to facilitate downstream assays, and 4) The platform can be applied to study mechanobiology of any cell type that can grow in hydrogels.

This article provides detailed methods for fabricating and characterizing a pneumatically actuating microfluidic device for chondrocyte compression.

동적 압축으로 연골 세포 자극을 위한 미세 유체 플랫폼

Mechanical stimuli are known to modulate biological functions of cells and tissues. Recent studies have suggested that compressive stress alters growth ...

Establishing Single-Cell Based Co-Cultures in a Deterministic Manner with a Microfluidic Chip

Cell co-culture assays have been widely used for studying cell-cell interactions between different cell types to better understand the biology of diseases including cancer. However, it is challenging to clarify the complex mechanism of intercellular interactions in highly heterogeneous cell populations using conventional co-culture systems because the heterogeneity of the cell subpopulation is obscured by the average values; the conventional co-culture systems can only be used to describe the population signal, but are incapable of tracking individual cells behavior. Furthermore, conventional single-cell experimental methods have low efficiency in cell manipulation because of the Poisson distribution. Microfabricated devices are an emerging technology for single-cell studies because they can accurately manipulate single cells at high-throughput and can reduce sample and reagent consumption. Here, we describe the concept and application of a microfluidic chip for multiple single-cell co-cultures. The chip can efficiently capture multiple types of single cells in a culture chamber (~46%) and has a sufficient culture space useful to study the cells&#39; behavior (e.g., migration, proliferation, etc.) under cell-cell interaction at the single-cell level. Lymphatic endothelial cells and oral squamous cell carcinoma were used to perform a single-cell co-culture experiment on the microfluidic platform for live multiple single-cell interaction studies.

This report describes a microfluidic chip-based method to set up a single cell culture experiment in which high-efficiency pairing and microscopic analysis of multiple single cells can be achieved.

미세 유체 칩으로 결정적인 방식으로 단일 셀 기반 공동 배양 구축

Cell co-culture assays have been widely used for studying cell-cell interactions between different cell types to better understand the biology of diseases ...

Simultaneous Quantification of Selected Kynurenines Analyzed by Liquid Chromatography-Mass Spectrometry in Medium Collected from Cancer Cell Cultures

The kynurenine pathway and the tryptophan catabolites called kynurenines have received increased attention for their involvement in immune regulation and cancer biology. An in vitro cell culture assay is often used to learn about the contribution of different tryptophan catabolites in a disease mechanism and for testing therapeutic strategies. Cell culture medium that is rich in secreted metabolites and signaling molecules reflects the status of tryptophan metabolism and other cellular events. New protocols for the reliable quantification of multiple kynurenines in the complex cell culture medium are desired to allow for a reliable and quick analysis of multiple samples. This can be accomplished with liquid chromatography coupled with mass spectrometry. This powerful technique is employed in many clinical and research laboratories for the quantification of metabolites and can be used for measuring kynurenines.
Presented here is the use of liquid chromatography coupled with single quadrupole mass spectrometry (LC-SQ) for the simultaneous determination of four kynurenines, i.e., kynurenine, 3-hydroxykynurenine, 3-hydroxyanthranilic, and xanthurenic acid in the medium collected from in vitro cultured cancer cells. SQ detector is simple to use and less expensive compared to other mass spectrometers. In the SQ-MS analysis, multiple ions from the sample are generated and separated according to their specific mass-to-charge ratio (m/z), followed by the detection using a Single Ion Monitoring (SIM) mode.
This paper draws the attention on the advantages of the reported method and indicates some weak points. It is focused on critical elements of LC-SQ analysis including sample preparation along with chromatography and mass spectrometry analysis. The quality control, method calibration conditions and matrix effect issues are also discussed. We described a simple application of 3-nitrotyrosine as one analog standard for all target analytes. As confirmed by experiments with human ovary and breast cancer cells, the proposed LC-SQ method&#160;generates reliable results and can be further applied to other in vitro cellular models.

Described here is a protocol for the determination of four different tryptophan metabolites generated in the kynurenine pathway (kynurenine, 3-hydroxykynurenine, xanthurenic acid, 3-hydroxyanthranilic acid) in the medium collected from cancer cell cultures analyzed by liquid chromatography coupled with a single quadrupole mass spectrometry.

암 세포 배양에서 수집된 매체에서 액체 크로마토그래피 질량 분광법에 의해 분석된 선택된 Kynurenines의 동시 정량화

The kynurenine pathway and the tryptophan catabolites called kynurenines have received increased attention for their involvement in immune regulation and ...