This work was supported by grants from the Institute of Science and Technology of the Federal District (ICyTDF, 64/2012 to EO) and the Mexican Council for Science and Technology (Conacyt, 179895 to MS).

E. 1. 구축 및 유지 아메바 문화 <ol><li> (다른 오염 생물의 전체 무료) axenically 성장 Entamoeba 아메바 균주 HML의 1 × 10 5 trophozoites : IMSS는 테프론 라이너 스크류 캡 (또는있는 일회용 T-1 × 10 6 trophozoites와 18 125 X 16 MM 문화 튜브를 복제 25 플라스크) 15 ㎖ (또는 TYI-S-33 매체의 T-25 플라스크에 50 ㎖) (TYI 국물이 3 % 다이아몬드 비타민 혼합물, 10 %의 열 불 활성화 성인 소 혈청, 0.5 IU / ㎖ 페니실린, 35 μg로 보충 / ㎖, 37 ℃에서 인큐베이터에 스트렙토 마이신) 19 </li><li> 48-96 시간 간격으로 통상 대수 증식기 유리 배양 관에 부착 trophozoites를 해제 빙수 욕에서 50-10 분 동안 배양 튜브 얌전 순서 (도 1) 동안 수확 trophozoites. </li><li> 원뿔 튜브에 문화를 전송하고 CEL을 분산하도록 여러 번 반전LS. 혈구 (Neubauer의 챔버)를 사용하여 세포 수를 결정하고 신선한 TYI-S-33의 매체를 포함하는 문화 튜브에 접종을 전송합니다. <ol><li> 더 이상 부화 기간 (~ 5 일 동안 ~ 3 × 10 5 세포) 짧은 기간 동안 높은 숫자 (1 ~ 하루 ~ 1 × 10 6 세포)에 아메바의 낮은 숫자를 사용합니다. 계산 접종이 바람직하지만 접종의 예상 볼륨이 실현되도록 ​​수립 문화가 예측된다. </li><li> 각 실험에 대한 세포 수를 최적화하는 trophozoites의 양을 적정한다. </li><li> 부주의로 오염이나 튜브 파손의 경우 백업을 가지고 병렬 중복 문화를 유지한다. </li></ol></li><li> 캡 튜브는 단단하고 수평 각도를 기울이면 5 °에서 37 ° C에서 그들을 품어. </li><li> 문화의 과도한 성장이 많은 용해 세포를 포함 할 수 있기 때문에, 정기적으로 육안 검사에 의해 문화를 확인합니다. </li></ol> MDCK 문화 2. 구축 및 유지 &lt;/ P&gt; <ol><li> (Madin 다비 송곳니 신장) 세포 / 0.08 U (인슐린, 페니실린 (100 IU / ㎖), 스트렙토 마이신 (100 ㎎ / ㎖)와 보충 DMEM 매체 10 ㎖로 처분 할 수있는 T-75 플라스크에 I (고 저항)를 입력 MDCK 성장 37 ° C에서 5 % CO 2, 95 % 공기의 가습 분위기 ㎖)과 10 %의 신생아 혈청 </li><li> 셀을 분할하려면, 거꾸로 현미경에 그 (것)들을 검사한다. 그들은 ~ 8​​5-100% 합류 할 때 셀을 분할합니다. </li><li> 멸균 후드와 문화에서 미디어를 제거하는 멸균 유리 파스퇴르 피펫에 진공 흡입기를 사용합니다. 세포를 긁어 피하려면, 하단 모서리에서 거꾸로 플라스크 대기음 미디어를 켭니다. </li><li> T-25 플라스크의 경우 (5 ㎖ T-75 플라스크에 데워진 PBS (140 mM의 염화나트륨, 2.7 밀리미터의 KCl, 10 mM의 나 2 HPO 4, 1.8 mM의 KH 2 PO 4, 산도 7.4) 10 ㎖를 분배 ) 부드럽게 세포를 씻어 플라스크 바위. 진공 흡인에 의해 PBS를 제거합니다. 혈청, 트립신을 억제하기 때문에 광범위한 세척이 필요합니다. </li><li> (T-25 플라스크에 0.5 ㎖를 사용)과 부드럽게 트립신 전지 층을 덮도록 플라스크를 흔들 T-75 플라스크에 0.05 % 트립신 1.5ml의 디스펜스. </li><li> 인큐베이터에서 5 ~ 10 분 (정확한 시간은 트립신의 활동에 따라 다름)에 품어. </li><li> 빛에 술병을 들고으로 전지의 분리를 확인하고 세포를 흐르는 찾는다. 세포 분리 (반올림 세포)도 현미경을 사용하여 확인할 수 있습니다. 종종 세포가 플라스크의 측면에 빠르고 부드러운 때리고과 빠른 놓습니다. </li><li> T-75 플라스크 (T-25 플라스크에 대한 5 ㎖)을 보충 DMEM 15 ML을 추가합니다. 로 pipetting 아래로 4 ~ 5 배 세포를 Resuspend. </li><li> 세포를 전파하기 위해, 신선한 DMEM 배지와 세포 현탁액 1:5 희석. 세포 수는 혈구 계를 사용하여이 지점에서 결정될 수 있지만, 특정 분석을위한 특별한 형식으로 세포를 분리하는 경우이 보통 단지 필요하다. </li></ol> Trophozoite 총 해물 3. 준비 <ol><li> CU에서 trophozoites를 분리빙수 욕에서 5-10 분 동안 튜브를 얌전 의해 LTURE 튜브. 4 ℃에서 10 분 동안 360 XG에서 원뿔 튜브와 원심 분리기로 문화 무균 이동 조심스럽게, 경사 분리하여 상층 액을 버린다 펠릿에 얼음처럼 차가운 PBS를 추가, 10 분 동안 360 XG에서 다시 세포와 원심 분리기를 분산하기 위해 튜브를 여러 번 반전. TYI-S-33 매체의 모든 흔적을 제거하기 위해 두 번이 단계를 반복합니다. </li><li> 혈구를 사용하여 trophozoites 번호를 확인합니다. </li><li> 를 Lyse 동결 해동 사이클에 의해 trophozoites. 1 분 동안 액체 질소에, 얼음처럼 차가운 PBS에 희석 trophozoites의 측정 접종 (60 trophozoites / ㎖)를 스냅 동결. 적극적으로 4 ° C와 소용돌이에서 샘플을 녹여. 세포 용해를 완료하기 위해 동결 융해 3 번 반복합니다. </li><li> 0.02 %의 β-머 캅토 에탄올로 용해 액에 존재하는 단백질 분해 효소를 활성화합니다. </li></ol> Trophozoite 분비 제품 4. 준비 <ol><li> 단계 3.2에 3.1를 수행합니다. </li><li> 결정혈구를 사용하고 트리 판 블루 배제 테스트 (20)를 적용하는 시점에서 세포 수 및 생존력 : <ol><li> 50 ML 원뿔 관에 9 × 10 6 3 ML 얼음처럼 차가운 PBS에 trophozoites 및 전송 세포를 희석. 현탁액의 10 μl를 타고 0.4 % 트리 판 블루 stock 용액의 pH 7.2의 1 μl를 추가합니다. </li><li> 낮은 배율로 세포를 계산하는 Neubauer의 챔버를 사용합니다. </li><li> 모든 셀을 계산하고 푸른 세포가 색소를 촬영하고 죽은 것으로 간주해야하기 때문에, 파란색 셀의 수를 구분합니다. </li><li> 셀의 전체 개수에 의해 생존 세포의 수를 나누어 100을 곱함으로써 생존 세포의 백분율을 계산한다. </li></ol></li><li> 수평 각도를 기울이면 5 °에서 2 시간 동안 37 ° C에서 인큐베이터에 trophozoite 서스펜션을 포함하는 원뿔 튜브를 전송합니다. </li><li> 10 분 360 XG에서 분비 된 제품, 원심 분리기 튜브를 수집합니다. 일회용 멸균 주사기를 사용하여 조심스럽게 SU에게 수집맑은 상등, 펠릿으로부터 trophozoites과 시료의 오염을 방지. 0.22 μm의 셀룰로오스 아세테이트 막을 통해 뜨는을 전달하여 어떤 전송 세포를 제거합니다. 0.02 %의 β-머 캅토 에탄올과 단백질 분해 효소를 활성화합니다. </li><li> 죽은 세포에서 방출 분자와 추정 원하지 않는 오염을 버리고, 세포 생존 능력의 트리 판 블루 배제 시험을 다시 적용합니다. 4.2 단계에서 얻어진 세포의 생존과 총 수는 동일해야합니다. 이 경우가 아니라면, 수집 된 상등액을 포함하는 단백질을 분비 할 수뿐만 아니라 폐기되어야한다. </li></ol> Trophozoites, Trophozoite 해물 또는 분비 제품과 MDCK 세포의 5. 상호 작용 <ol><li> 라이브 trophozoites (1:1의 MDCK - 투 - 아메바 비율)에 합류 MDCK 세포 단일 층을 품어, trophozoite 해물 (MDCK - 투 - 아메바 1:2 비율) 또는 분비 제품 (1 MDCK - 투 - 아메바 비율 : 10) 2 30 분 (그림 2A) 37 ° C에서. </li><li> 언 바운드 분자 또는 trophozoites을 제거하기 위해 얼음처럼 차가운 PBS와 상피 세포 다섯 번 씻으십시오. </li></ol> 면역 형광 검사를위한 샘플 6. 준비 <ol><li> 24 멀티 웰 세포 배양 접시 안에 배치 멸균 유리 커버 슬립에 문화 MDCK 세포. 그들이 합류의 100 %에 도달 할 때까지 거꾸로 현미경의 세포를 검사합니다. 그런 다음, 신선한 보충 DMEM 배지 1 ml의 매체를 대체하고 더 24 시간 동안 37 ° C 배양기에 플레이트를 전송합니다. </li><li> 진공 흡입기 및 멸균 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 매체를 제거하고 각 웰에 따뜻한 PBS 1 ㎖를 추가합니다. PBS를 제거하고 신선한 PBS로 세척을 반복합니다. 유리 피펫 우물의 바닥에서 세포가 긁히지 않도록주의하십시오. </li><li> 라이브 trophozoites (T), trophozoite 총 해물 (TL)과 분비 제품 (SP) : 따뜻한 PBS 1 ㎖에 희석 trophozoites의 다른 조건을 추가합니다. <ol><li> 2 또는 30 분 동안 인큐베이터에서 배양 플레이트를 넣습니다. </li><li> MDCK 세포가 E.와 함께 배양해야하는지 하나라는 시간 0 분, 두 개의 제어 조건을 준비 아메바하지만 따뜻한 PBS 1 ㎖와; 이 경우 이차 항체 제어와 같은 다른 조건은 2 또는 30 분 동안 T, TL 또는 SP와 MDCK을 배양하고 기본 항체와 부화를 생략합니다. </li></ol></li><li> 언 바운드 분자 또는 trophozoites을 제거하기 위해 차가운​​ PBS와 상피 세포 다섯 번 씻으십시오. </li><li> 수정 및 C. -20 °에서 30 분 동안 96 % 에탄올 1 ㎖로 세포를 투과 </li><li> 에탄올을 제거하려면, 실온에서 1 ㎖의 PBS로 3 빠른 세척을 수행합니다. </li><li> 시료의 건조를 방지하기 위해 습한 챔버에서 다음 단계를 수행 <ol><li> 폐쇄 및 샘플을 안전하게 배치 할 수있는 젖은 종이 타월로 가득 수 있습니다 가능한 평면 상자를 사용합니다. 예를 들어, 빈 피펫 팁 상자가 아니라이 목적을 제공합니다. </li><li> 챔버 내부에 균일하게 파라 필름 층과 피펫 블록의 25 μl를 배치각 coverslip에 대한 솔루션 (0.5 % BSA)을 주입. </li><li> 미세 집게와 우물 밖으로 커버 슬립을 조심스럽게 여과지 가장자리에서 물기를 제거하고 세포가 차단 솔루션을 향 차단 솔루션 (0.5 % BSA)을 포함하는 드롭에 커버 슬립을 넣어. 실온에서 1 시간 동안 샘플을 배양한다. </li></ol></li><li> PBS의 기본 항체의 혼합물을 준비 IgM 항체 마우스 방지 EhCPADH112 (mα-EhCPADH112 1:10 희석)와 IgG의 토끼 반 ZO-1 (Pα-ZO-1, 1:100 희석). </li><li> 습기 상자와 펫 각 coverslip에 대한 항체 용액 25 μL에서 파라 필름의 신선한 시트를 놓습니다. </li><li> 블로킹 용액으로부터 커버 슬립을 올리고 여과지를 이용하여 에지에서 과도한 액체를 건조하고, 세포가 항체 용액을 향하게 알갱이에 넣지. 4 ℃에서 하룻밤 샘플을 품어 </li><li> (상단에 셀 측) 24 멀티 웰의 우물에 각 coverslip에 넣어 1 ㎖의 PBS를 추가합니다. <ol><li&gt; 언 바운드 분자를 제거하는 PBS 1 ㎖와 다섯 번 씻으십시오. </li></ol></li><li> FITC 결합 염소 항 - 마우스 IgM 항체 (1:100 희석) 및 TRITC (1시 50분 희석)에 결합 된 염소 항 - IgG의 토끼 : PBS의 형광 차 항체의 혼합물을 준비합니다. </li><li> 습기 상자와 펫 각 coverslip에 대한 이차 항체 용액 25 μL로 파라 필름의 신선한 시트를 놓습니다. </li><li> 6.10에서와 같이 샘플을 전송하고 형광 염료의 탈색을 방지하기 위해 어둠 속에서 실온에서 1 시간 동안 배양한다. 6.11.1 단계를 반복합니다. </li><li> 핵 염색의 경우, 상온에서 0.05 ㎜ DAPI 용액 200 ㎕를 3 분 동안 부화와 빛으로부터 보호합니다. 6.11.1 단계를 반복합니다. </li><li> 형광 염료를 절약 Vecta 방패 유리 현미경 슬라이드에 장착 솔루션을 antifade 5 μL로 커버 슬립 (세포가 아래로 향하게)을 배치합니다. 샘플 건조를 방지하기 위해 매니큐어를 사용하는 커버 전표를 밀봉. </li><li> 장기 기억,에 슬라이드를 계속-20 ° C에서 현미경 슬라이드 상자 </li><li> Z-스택 섹션과 XZ-평면 (그림 2A)를 통해 공 초점 현미경으로 준비를 분석합니다. </li></ol> 프로테아제 억제제 또는 특정 항체와 Trophozoites 7. 보육 <ol><li> 반복 3.2 3.1 단계를 반복합니다. 각 실험 조건의 경우, 4에서 20 분 동안 단백질 분해 효소 (전체 1 ㎜ 및 40 ㎍ / ㎖의 E-64) 억제제 또는 EhCPADH112 (mαEhCPADH112)에 30 μg의 단일 클론 항체 (21) (50 ㎕의 PBS에 재현 탁) 1 × 10 5 trophozoites을 품어 ° C (그림 2B). 단계 8.5에서 설명한대로 공동 배양 분석을 위해 이러한 준비를 사용합니다. </li></ol> 8. Transepithelial 전기 저항의 측정 (TER) <ol><li> 멸균 트랜스 웰 투과 지원 (0.4 μm의 기공 크기)에 문화 MDCK 세포. 상부 구획에서, 100 ㎕의 세포 현탁액 및 하부 구획에 배치보충 DMEM 배지 600 μl를 놓습니다. <ol><li> 주기적으로 중간 수준을 확인합니다. 필요에 따라 새로운 매체를 추가 할 수 있습니다. </li><li> 그들이 합류의 100 %에 도달 할 때까지 거꾸로 현미경의 세포를 검사합니다. 2-3 일마다 중간 변경합니다. </li><li> 세포 부착 (필요한 경우)을 개선하기 위해, 세포 현탁액을 추가하기 전에 DMEM에서 37 ° C에서 하룻밤 트랜스 웰 필터를 평형. </li></ol></li><li> 에탄올에 침지 후드 STX2 전극을 소독하고 멸균 PBS에서 UV 빛 아래 15 분 각각에 대한. EVOM 상피 voltohmmeter에 전극을 연결하고 저항 모드를 선택합니다. </li><li> 각 트랜스 웰의 상부 구획에서 매체를 수집하고이를 풀. 이 미디어 혼합물의 50 μl를 타고 trophozoites 현탁액 50 μL (PBS에 1 × 10 5 trophozoites) 또는 만 PBS (대조군)와 결합. 각 트랜스 웰의 유사한 혼합물을 사용합니다. </li><li> 각 트랜스 웰의 containin의 상부 챔버에 혼합물을 추가G MDCK 세포. 실험 조건은 trophozoites (제어)없이 trophozoites 또는 단백 분해 효소 억제제 또는 mαEhCPADH112 사전 배양 trophozoites와 공동 문화를 MDCK 세포를 포함한다. 필터에 의해 제공되는 저항을 제거하기 위해, 단지 배지로 배양 트랜스 웰을 사용한다. 각 실험 조건은 적어도 세 개의 트랜스 웰하십시오. </li><li> 즉시, 각 트랜스 웰에 STX2 전극을 찍기 TER을 측정합니다. <ol><li> 긴 전극이 하부 챔버의 바닥을 만지고 짧은 전극 (그림 2B 참조) 상부 구획 중간에 포함되어 있는지 확인합니다. </li><li> 마다 수직으로 전극을 보유해야합니다. 이것은 크게, 재현성을 향상시킬 것입니다. 이 데이터의 변화로 이어질 것으로 이동하거나 측정하는 동안 전극을 기울 마십시오. </li></ol></li><li> 이 측정은 초기 TER 값으로 간주해야한다. 그 후, 다음 과정을 모니터링 TER30 분. </li><li> TER 최종 값을 계산하기 위해, 전용 필터의 TER 값을 뺀다. 다른 실험에서 결과를 비교하려면 100 % (그림 2B)로 다음을 고려하여 초기 값으로 각 데이터 포인트를 정상화. </li></ol>

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Appendix 3, (2001).</li><li>Arroyo, R., Orozco, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+and+identification+of+an+Entamoeba+histolytica+adhesin.">Localization and identification of an Entamoeba histolytica adhesin.</a> Mol Biochem Parasitol. 23, 151-158 (1987).</li><li>Diamond, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axenic+cultivation+of+Entamoeba+hitolytica.">Axenic cultivation of Entamoeba hitolytica.</a> Science. 134, 336-337 (1961).</li><li>Diamond, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+of+axenic+cultivation+of+Entamoeba+histolytica+Schaudinn,+1903+and+E.+histolytica-like+amebae.">Techniques of axenic cultivation of Entamoeba histolytica Schaudinn, 1903 and E. histolytica-like amebae.</a> J Parasitol. 54, 1047-1056 (1968).</li><li>Dukes, J. D., Whitley, P., Chalmers, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MDCK+variety+pack:+choosing+the+right+strain.">The MDCK variety pack: choosing the right strain.</a> BMC Cell Biol. 12, (2011).</li><li>Espinosa-Cantellano, M., Martinez-Palomo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+intestinal+amebiasis:+from+molecules+to+disease.">Pathogenesis of intestinal amebiasis: from molecules to disease.</a> Clin Microbiol Rev. 13, 318-331 (2000).</li><li>Martinez-Palomo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+bases+of+the+cytolytic+mechanisms+of+Entamoeba+histolytica.">Structural bases of the cytolytic mechanisms of Entamoeba histolytica.</a> J Protozool. 32, 166-175 (1985).</li><li>Martinez-Lopez, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+EhADH112+recombinant+polypeptide+inhibits+cell+destruction+and+liver+abscess+formation+by+Entamoeba+histolytica+trophozoites.">The EhADH112 recombinant polypeptide inhibits cell destruction and liver abscess formation by Entamoeba histolytica trophozoites.</a> Cell Microbiol. 6, 367-376 (2004).</li><li>Ocadiz-Ruiz, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+the+silencing+of+the+Ehcp112+gene+on+the+in+vitro+virulence+of+Entamoeba+histolytica.">Effect of the silencing of the Ehcp112 gene on the in vitro virulence of Entamoeba histolytica.</a> Parasit Vectors. 6, 248 (2013).</li><li>Johnson, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+imaging+techniques+to+studies+of+epithelial+tight+junctions.">Applications of imaging techniques to studies of epithelial tight junctions.</a> Adv Drug Deliv Rev. 57, 111-121 (2005).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

E.에 의해 상피 감염 동안 체외 호스트 병원체 상호 작용을 연구하기 위해 아메바, 그것은 상피 세포와 trophozoites 모두의 잘 확립 된 문화와 함께 작동하는 데있어 매우 중요합니다. 예를 들어, 이전의, E. 아메바의 문화는 일반적으로 세균이나 trypanosomatids (22, 23)의 특정 종과 공동으로 설립했다. E.의 그러나 공동 재배 숙주 세포에서 관찰 된 효과가 명백하?...

Entamoeba의 아메바는 염증과 설사. E.의 원인이 인간의 아메바 증, 장 감염의 책임있는 단일 셀의 원생 동물이다 아메바는 연간 5000 만 개인에게까지 감염 있지만, 감염된 사람의 약 10 %는 아메바 증 1에 관련된 증상을 개발할 수 있습니다. 감염 E를 포함하는 오염 된 음식이나 물을 섭취에 발생 아메바 포낭. 소장에서, 낭종은 결장 점액을 준수하고 2 증식 라이브 trophozoites을 생산하고 있습니다. Trophozoites은 일반적으로 대변을 통해 배설된다 낭종을 형성한다. 다른 경우 아직 알 수없는 이유로, trophozoites는 장 상피 층을 중단하고 기본 조직을 공격. 최악의 경우에, 그들은 혈류를 입력하고 3 간 등의 다른 장기에 영향을 미친다. 상피 장벽을 깨고 합류 세포를 유지 상피 transmembranal 구조의 중단을 요구합니다. 상피 세포연락처 타이트 (TJ)로 구성된 정점 접합부 복합체 형성 및 접합 (AJ)에있는 adherens, 4를 데즈 모섬 있습니다. 가장 꼭대기 접합 TJ 있으며, 따라서 이들은 E. 의해 상하게 제 베리어 호스트 침입 동안 아메바와 다른 병원균. TJ는 같은 인접 셀의 수용체와 호모 또는 heterophilic 상호 작용에 관여 claudins, occludin 및 접합부 접착 분자 (JAM)로 transmembranal 접착 수용체로 구성되어 있습니다. 그들은 세포 내 상피 세포에 더 기계적 강도를 제공하는 굴지의 골격에 부착 수용체를 연결 (ZO) 가족 zonula의 occludens의 발판 분자에 의해 바인딩됩니다. TJ는 과도한 물과 용질의 누설을 방지, 창자 루멘에서 장 조직을 밀봉 할 책임이 있습니다. TJ는 기생충에 의해 중단 된 후 따라서, 조직은 침략있다. E. (I) TARG에 아메바의 접착에 관련된 사람들 : 아메바 같은 다양한 분자를 분비등의 셀 (5); 세포 외 유출에 의해 숙주 세포의 살해에 참여하는 (ⅱ) 막 - 활성 인자, 예를 들어 칭했다 이온 채널 형성 펩티드 6,7 amoebapores; 그리고 (iii) 세포 외 매트릭스 단백질을 분해 및 조직 붕괴 5,8,9을 중재 단백. 함께 EhCPADH112 착체를 형성 시스테인 프로테아제 EhCP112 및 유착 분자 EhADH112 두 E. 아르 아메바 TJ (10)의 분해에 중요한 역할을하는 단백질을 독성. 라이브 trophozoites, 자신의 총 해물과 분비 제품은 상피 장벽의 TJ 복잡하고 기능 장애의 분자 변화를 유도한다. 이 연구에서, EhCP112 및 EhADH112 따라서 E.에게 용이 occludin 내면화하고 세포 단백질의 저하로 이어지는 claudin-1 단백질과 상호 작용하는 것을 알 수있다 세포층의 경로를 통해 아메바 입구. 우리의 데이터와 그 오F 다른 그룹 11-17 강력 기생충의 침입을 허용 특정 호스트 병원체 상호 작용의 필요성을 제안합니다. 이러한 상호 작용의 분자 기초를 이루는 것은 아메바 증의 발병 기전에 대한 이해를 위해 가장 중요합니다. 증가 된 세포층의 투과성을 특징 trophozoites 의해 TJ의 선택적 교란, transepithelial 전기 저항의 감소 (TER)에 의해 측정 될 수있다. 호스트 상피으로 기생 단백질의 전이는 면역 형광 염색과 공 초점 레이저 현미경도 가능 직접 상호 작용을 나타내는 상피 접합부 마커 아메바 독성 요인의 공동 현지화를 공개 할 수있는 방법으로 측정 할 수 있습니다. 이 문서에서는, 우리는 상피 세포와 trophozoites가 재배 수확 및 호스트 병원체 상호 작용과 그 영향을 검토하기 위해 조작하는 방법을 자세히 설명합니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Entamoeba histolytica HM1:IMSS, Clone A&#160;</td>
			<td>IMSS Hospital, Mexico</td>
			<td>Without/number</td>
			<td>Virulent trophozoites18&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="8">TYI broth</td>
			<td rowspan="8">Becton, Dickinson and Company 
			Merck 
			Merck 
			Merck 
			J.T. Baker 
			Reproquifin 
			SIGMA-Aldrich 
			SIGMA-Aldrich</td>
			<td rowspan="8">211862 
			K35625437 626 
			21578 
			4873 
			3252-01 
			CAS 50-81-7 
			C7880 
			F-5879</td>
			<td rowspan="8">3.45% BBL Biosate peptone 
			58 mM glucose 
			39 mM NaCl 
			5 mM KH2PO4 
			6.5 mM K2HPO4 
			16.3 mM ascorbic acid 
			8.1 mM L-cysteine 
			&#160;0.1 mM ferric ammonium citrate, adjust pH 6.819</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum adult</td>
			<td>Microlab , Labs., Mex.</td>
			<td>SU146</td>
			<td>Use at 10% and inactivated to 56&#176; C for 30 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond&#160; vitamin&#160; mixture- Tween 80</td>
			<td>In vitro</td>
			<td>SR-07</td>
			<td>Use at 3%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin&#160;</td>
			<td>Lakeside,&#160; M&#233;x.</td>
			<td>34564SSA IV</td>
			<td>0.5 IU/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin&#160;</td>
			<td>Lakeside,&#160; M&#233;x.</td>
			<td>75757SSA IV</td>
			<td>35 &#181;g/ mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrex 15 mL screw cap culture tubes with PTFE lined phenolic caps</td>
			<td>Corning-Pyrex</td>
			<td>9826-16X</td>
			<td>16x125 mm, capacity 15 mL and caps fabricated from special formula resistant to effects of temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture plates, 6 Well</td>
			<td>Corning-Costar</td>
			<td>3516</td>
			<td>Sterile plates, well diameter 34.8 mm and growth area 9.5 cm2.&#160; Rings on lid prevent cross-contamination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25cm2 cell culture flask</td>
			<td>Corning-Costar</td>
			<td>430168</td>
			<td>Canted neck flasks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDCK (Madin Darby canine kidney) type I</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>CCL34</td>
			<td>Kidney epithelial cells grown between the 60th and 90th passage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM medium&#160;</td>
			<td>Gibco&#160;</td>
			<td>12800-017</td>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium with high glucose.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neonate Calf Serum</td>
			<td>In vitro</td>
			<td>S-02</td>
			<td>Use at 10%.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin mixture&#160;</td>
			<td>In vitro&#160;</td>
			<td>A-01</td>
			<td>Stock solution 10,000 U/&#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin&#160;&#160;</td>
			<td>AMSA</td>
			<td>398MJ94SSA IV</td>
			<td>Stock solution 100 IU/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin solution&#160;</td>
			<td>In vitro</td>
			<td>EN-005</td>
			<td>0.05% enzyme solution without calcium and magnesium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75cm2 cell culture flask</td>
			<td>Corning-Costar</td>
			<td>430720</td>
			<td>Canted neck flasks for trophozoite culture in TYI-S-33 medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transwell permeable supports</td>
			<td>Corning-Costar</td>
			<td>3470</td>
			<td>0.4. &#181;m polyster membrane, 6.5 mm insert in 24 well plate, growth area 0.3 cm2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well cell culture dish&#160;&#160;</td>
			<td>Corning-Costar</td>
			<td>3524</td>
			<td>Clear polystyrene, treated for optimal cell attachment, sterilized by gamma radiation and certified non-pyrogenic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete Mini</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11836 153 001</td>
			<td>Protease inhibitor cocktail inhibits a broad spectrum of serine, cysteine and metallo-proteases. Final concentration 1 mM&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-epoxysuccinyl-L-leucylamido (4-guanidino) butane (E-64)</td>
			<td>SIGMA-Aldrich</td>
			<td>E3132</td>
			<td>Cystein protease inhibitor, final concentration 40 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p&#945;ZO-1&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>402200</td>
			<td>IgG rabbit policlonal&#160; antibody&#160; against&#160; a synthetic peptide in the middle region of the ZO-1 human protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>m&#945;EhCPADH112</td>
			<td>Homemade antibody</td>
			<td>Without/ Number</td>
			<td>IgM mouse monoclonal antibody&#160; against&#160; 444-601 epitope located at C-terminal of EhCPADH11221,27</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-goat anti-mouse IgM</td>
			<td>Zymed</td>
			<td>62-6811</td>
			<td>Fluorescein isotiocyanate (FITC)-labelled goat anti-mouse secondary&#160; antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRITC- goat anti-rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Zymed</td>
			<td>816114</td>
			<td>Tetramethyl-rhodamine isothiocyanate (TRITC)-labelled&#160; goat anti-rabbit IgG&#160; secondary antibody.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STX2 Electrode</td>
			<td>World Precision Instrument&#160;</td>
			<td>102711</td>
			<td>Consists of a fixed pair of double electrodes, 4 mm wide and 1 mm thick. Each stick of the electrode pair contains a silver/silver-chloride pellet for measuring voltage and a silver electrode for passing current. For use with EVOM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOM epithelial voltohmmeter</td>
			<td>World Precision Instrument&#160;</td>
			<td>12111</td>
			<td>Use in resistance mode and maintain unplugged during TER measurements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer chamber</td>
			<td>MEARIENFELD</td>
			<td>610610</td>
			<td>Hemocytometer&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica TCS_SP5_MO</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Without/number</td>
			<td>Laser confocal microscopy with Leica microsystems CMS Gmbh/leica Las af Lite/BIN software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield</td>
			<td>Vector Laboratories, Inc.</td>
			<td>H-1000</td>
			<td>Mounting medium for fluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#180;, 6-diamino-2-phenylindole (Dapi)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>D-9542</td>
			<td>0.05 mM final concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>US Biological</td>
			<td>A-1310</td>
			<td>0.5%&#160; final concentration for blocking solution</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of the epithelial damage produced by entamoeba histolytica infection

Entamoeba의 아메바는 인간의 아메바 증의 원인 물질, 열대 국가에서 설사와 간 농양의 주요 원인이다. 감염은 장 상피 세포와 병원체의 상호 작용에 의해 시작됩니다. 이러한 상호 작용은 꽉 접합 (TJ)로 세포 간 구조의 붕괴로 연결됩니다. TJ는 창자 루멘에서 호스트 조직을 분리하는 상피 층의 밀봉을 보장합니다. 최근의 연구에 기생 단백질 EhCPADH112으로 TJ의 중단이 E.의 전제 조건임을 증거를 제공 상피 장벽 기능 장애를 동반 아메바 침공. 따라서, E. 동안 TJ 분해에 관련된 분자 메커니즘의 분석 아메바 침공은 아메바 증의 발병 기전에 대한 우리의 이해를 개선하기 위해 매우 중요합니다. 이 문서에서는 초기 호스트 병원체 상호 작용의 평가 및 기생충의 침입 가능성을 확인하기 쉬운 모델을 제시한다. 분석 할 매개 변수 T를 포함ransepithelial 전기 저항, 상피 세포 표면 수용체, 표현의 변화와 상피 접합부 마커 및 상피 세포 내 기생충 분자의 현지화 현지화와 EhCPADH112의 상호 작용.

성공적인 E.에 대한 아메바의 문화는 중요한 두 가지 조건이 충족되어야합니다 로그 단계에서 무균 조건과 수확의 성장. E.의 이전, 문화 아메바는 쉽게 세균이나 trypanosomatids 22의 특정 종과 공동으로 설립되었다. 그러나, 요즘은 대사 박테리아, 곰팡이, 원생 동물, 또는 후생 동물 세포없는 환경에있는 아메바의 무기한 subcultivati​​on을 의미하는이 기생충의 무?...

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Analysis of the Epithelial Damage Produced by Entamoeba histolytica Infection

Entamoeba 아메바에 의한 인체 감염은 아메바 증, 열대 국가에서 설사의 주요 원인으로 이어집니다. 감염은 세포 - 세포 연락처 개방 결과적으로 설사, 때때로 간 감염에 의해 다음 도발, 장 상피 세포와 병원체 상호 작용에 의해 시작됩니다. 이 문서는 아메바 증의 발병 기전에 대한 우리의 이해를 개선하기 위해 초기 호스트 병원체 상호 작용을 평가하는 모델을 제공합니다.

에 의해 제작 상피 손상의 분석<em&gt; Entamoeba 아메바</em&gt; 감염

Entamoeba histolytica is the causative agent of human amoebiasis, a major cause of diarrhea and hepatic abscess in tropical countries. Infection is ...

analysis-epithelial-damage-produced-entamoeba-histolytica

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Analysis of the Epithelial Damage Produced by Entamoeba histolytica Infection

18.6K 조회수.  Center for Research and Advanced Studies of the National Polytechnic Institute.  Entamoeba 아메바에 의한 인체 감염은 아메바 증, 열대 국가에서 설사의 주요 원인으로 이어집니다. 감염은 세포 - 세포 연락처 개방 결과적으로 설사, 때때로 간 감염에 의해 다음 도발, 장 상피 세포와 병원체 상호 작용에 의해 시작됩니다. 이 문서는 아메바 증의 발병 기전에 대한 우리의 이해를 개선하기 위해 초기 호스트 병원체 상호 작용을 평가하는 ...

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In vitro tRNA Methylation Assay with the Entamoeba histolytica DNA and tRNA Methyltransferase Dnmt2 (Ehmeth) Enzyme

Protozoan parasites are among the most devastating infectious agents of humans responsible for a variety of diseases including amebiasis, which is one of the three most common causes of death from parasitic disease. The agent of amebiasis is the amoeba parasite Entamoeba histolytica that exists under two stages: the infective cyst found in food or water and the invasive trophozoite living in the intestine. The clinical manifestations of amebiasis range from being asymptomatic to colitis, dysentery or liver abscesses. E. histolytica is one of the rare unicellular parasite with 5-methylcytosine (5mC) in its genome. 1, 2 It contains a single DNA methyltransferase, Ehmeth, that belongs to the Dnmt2 family. 2 A role for Dnmt2 in the control of repetitive elements has been established in E. histolytica, 3 Dictyostelium discoideum 4,5 and Drosophila. 6 Our recent work has shown that Ehmeth methylates tRNAAsp, and this finding indicates that this enzyme has a dual DNA/tRNAAsp methyltransferase activity. 7 This observation is in agreement with the dual activity that has been reported for D. discoideum and D. melanogaster. 8 The functional significance of the DNA/tRNA specificity of Dnmt2 enzymes is still unknown. To address this question, a method to determine the tRNA methyltransferase activity of Dnmt2 proteins was established. In this video, we describe a straightforward approach to prepare an adequate tRNA substrate for Dnmt2 and a method to measure its tRNA methyltransferase activity.

In vitro tRNA Methylation Assay with the Entamoeba histolytica DNA and tRNA Methyltransferase Dnmt2 Ehmeth Enzyme

This protocol describes the preparation of a synthetic tRNA substrate for the Entamoeba histolytica DNA/tRNA methyltransferase 2 (Dnmt2) homolog Ehmeth and the measure of its methyltransferase activity. This experimental approach can be used for investigating the activity of other Dnmt2 proteins.

Entamoeba histolytica DNA와 tRNA Methyltransferase Dnmt2 (Ehmeth) 효소를 체외 tRNA의 Methylation 분석에서

Protozoan parasites are among the most devastating infectious agents of humans responsible for a variety of diseases including amebiasis, which is one of ...

연구

면역학 및 감염병학

Development of a Negative Selectable Marker for Entamoeba histolytica

Entamoeba histolytica is the causative agent of amebiasis and infects up to 10% of the world's population. The molecular techniques that have enabled the up- and down-regulation of gene expression rely on the transfection of stably maintained plasmids. While these have increased our understanding of Entamoeba virulence factors, the capacity to integrate exogenous DNA into genome, which would allow reverse genetics experiments, would be a significant advantage in the study of this parasite. The challenges presented by this organism include inability to select for homologous recombination events and difficulty to cure episomal plasmid DNA from transfected trophozoites. The later results in a high background of exogenous DNA, a major problem in the identification of trophozoites in which a bona fide genomic integration event has occurred. We report the development of a negative selection system based upon transgenic expression of a yeast cytosine deaminase and uracil phosphoribosyl transferase chimera (FCU1) and selection with prodrug 5-fluorocytosine (5-FC). The FCU1 enzyme converts non-toxic 5-FC into toxic 5-fluorouracil and 5-fluorouridine-5'-monophosphate. E. histolytica lines expressing FCU1 were found to be 30 fold more sensitive to the prodrug compared to the control strain.

Development of a Negative Selectable Marker for Entamoeba histolytica

We report development of a negative selection system in E. histolytica based upon transgenic expression of a chimeric protein (FCU1) and selection with the prodrug 5-fluorocytosine. The FCU1 protein is a fusion of yeast cytosine deaminase and uracil phosphoribosyltransferase. Expression of FCU1 resulted in increased E. histolytica sensitivity towards 5-fluorocytosine.

에 대한 부정적인 선택 마커의 개발 Entamoeba histolytica</em

Entamoeba histolytica is the causative agent of amebiasis and infects up to 10% of the world's population. The molecular techniques that have enabled the ...

Application of a Mouse Ligated Peyer&#x2019;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed to them and occasionally to pathogens. The gut-associated lymphoid tissue (GALT) play a key role for induction of the mucosal immune response to these microbes1, 2. To initiate the mucosal immune response, the mucosal antigens must be transported from the gut lumen across the epithelial barrier into organized lymphoid follicles such as Peyer's patches. This antigen transcytosis is mediated by specialized epithelial M cells3, 4. M cells are atypical epithelial cells that actively phagocytose macromolecules and microbes. Unlike dendritic cells (DCs) and macrophages, which target antigens to lysosomes for degradation, M cells mainly transcytose the internalized antigens. This vigorous macromolecular transcytosis through M cells delivers antigen to the underlying organized lymphoid follicles and is believed to be essential for initiating antigen-specific mucosal immune responses. However, the molecular mechanisms promoting this antigen uptake by M cells are largely unknown. We have previously reported that glycoprotein 2 (Gp2), specifically expressed on the apical plasma membrane of M cells among enterocytes, serves as a transcytotic receptor for a subset of commensal and pathogenic enterobacteria, including Escherichia coli and Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. Typhimurium), by recognizing FimH, a component of type I pili on the bacterial outer membrane 5. Here, we present a method for the application of a mouse Peyer's patch intestinal loop assay to evaluate bacterial uptake by M cells. This method is an improved version of the mouse intestinal loop assay previously described 6, 7. The improved points are as follows: 1. Isoflurane was used as an anesthetic agent. 2. Approximately 1 cm ligated intestinal loop including Peyer's patch was set up. 3. Bacteria taken up by M cells were fluorescently labeled by fluorescence labeling reagent or by overexpressing fluorescent protein such as green fluorescent protein (GFP). 4. M cells in the follicle-associated epithelium covering Peyer's patch were detected by whole-mount immunostainig with anti Gp2 antibody. 5. Fluorescent bacterial transcytosis by M cells were observed by confocal microscopic analysis. The mouse Peyer's patch intestinal loop assay could supply the answer what kind of commensal or pathogenic bacteria transcytosed by M cells, and may lead us to understand the molecular mechanism of how to stimulate mucosal immune system through M cells.

Application of a Mouse Ligated Peyer&amp;#8217;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

M cells in a specialized follicle-associated epithelium covering Peyer&#x2019;s patches play an important role for the mucosal immunosurveillance in gut-associated lymphoid tissue. Here we described the evaluation method for bacterial transcytosis by M cells in vivo. This method provides a method to understand M-cell function in the immune system.

마우스의 응용은 M 세포에 의해 박테리아 이해를 평가하는 Peyer의 패치 장 루프 분석 출혈도 잡았

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed ...

Flow Cytometric Isolation of Primary Murine Type II Alveolar Epithelial Cells for Functional and Molecular Studies

Throughout the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII) to various aspects of immune regulation in the lung has been increasingly recognized. AECII have been shown to participate in cytokine production in inflamed airways and to even act as antigen-presenting cells in both infection and T-cell mediated autoimmunity 1-8. Therefore, they are especially interesting also in clinical contexts such as airway hyper-reactivity to foreign and self-antigens as well as infections that directly or indirectly target AECII. However, our understanding of the detailed immunologic functions served by alveolar type II epithelial cells in the healthy lung as well as in inflammation remains fragmentary. Many studies regarding AECII function are performed using mouse or human alveolar epithelial cell lines 9-12. Working with cell lines certainly offers a range of benefits, such as the availability of large numbers of cells for extensive analyses. However, we believe the use of primary murine AECII allows a better understanding of the role of this cell type in complex processes like infection or autoimmune inflammation. Primary murine AECII can be isolated directly from animals suffering from such respiratory conditions, meaning they have been subject to all additional extrinsic factors playing a role in the analyzed setting. As an example, viable AECII can be isolated from mice intranasally infected with influenza A virus, which primarily targets these cells for replication 13. Importantly, through ex vivo infection of AECII isolated from healthy mice, studies of the cellular responses mounted upon infection can be further extended.
Our protocol for the isolation of primary murine AECII is based on enzymatic digestion of the mouse lung followed by labeling of the resulting cell suspension with antibodies specific for CD11c, CD11b, F4/80, CD19, CD45 and CD16/CD32. Granular AECII are then identified as the unlabeled and sideward scatter high (SSChigh) cell population and are separated by fluorescence activated cell sorting 3.
In comparison to alternative methods of isolating primary epithelial cells from mouse lungs, our protocol for flow cytometric isolation of AECII by negative selection yields untouched, highly viable and pure AECII in relatively short time. Additionally, and in contrast to conventional methods of isolation by panning and depletion of lymphocytes via binding of antibody-coupled magnetic beads 14, 15, flow cytometric cell-sorting allows discrimination by means of cell size and granularity. Given that instrumentation for flow cytometric cell sorting is available, the described procedure can be applied at relatively low costs. Next to standard antibodies and enzymes for lung disintegration, no additional reagents such as magnetic beads are required. The isolated cells are suitable for a wide range of functional and molecular studies, which include in vitro culture and T-cell stimulation assays as well as transcriptome, proteome or secretome analyses 3, 4.

We describe the rapid isolation of primary murine type II alveolar epithelial cells (AECII) by flow cytometric negative selection. These AECII show high viability and purity and are suitable for a wide range of functional and molecular studies regarding their role in respiratory conditions such as autoimmune or infectious diseases.

기능 및 분자 연구 기본 손쥐 유형 II 폐포 상피 세포의 흐름 Cytometric 절연

Throughout  the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII)  to various aspects of immune regulation in the lung has been ...

Analysis of the Solvent Accessibility of Cysteine Residues on Maize rayado fino virus Virus-like Particles Produced in Nicotiana benthamiana Plants and Cross-linking of Peptides to VLPs

Mimicking and exploiting virus properties and physicochemical and physical characteristics holds promise to provide solutions to some of the world's most pressing challenges. The sheer range and types of viruses coupled with their intriguing properties potentially give endless opportunities for applications in virus-based technologies. Viruses have the ability to self- assemble into particles with discrete shape and size, specificity of symmetry, polyvalence, and stable properties under a wide range of temperature and pH conditions. Not surprisingly, with such a remarkable range of properties, viruses are proposed for use in biomaterials 9, vaccines 14, 15, electronic materials, chemical tools, and molecular electronic containers4, 5, 10, 11, 16, 18, 12.
In order to utilize viruses in nanotechnology, they must be modified from their natural forms to impart new functions. This challenging process can be performed through several mechanisms including genetic modification of the viral genome and chemically attaching foreign or desired molecules to the virus particle reactive groups 8. The ability to modify a virus primarily depends upon the physiochemical and physical properties of the virus. In addition, the genetic or physiochemical modifications need to be performed without adversely affecting the virus native structure and virus function. Maize rayado fino virus (MRFV) coat proteins self-assemble in Escherichia coli producing stable and empty VLPs that are stabilized by protein-protein interactions and that can be used in virus-based technologies applications 8. VLPs produced in tobacco plants were examined as a scaffold on which a variety of peptides can be covalently displayed 13. Here, we describe the steps to 1) determine which of the solvent-accessible cysteines in a virus capsid are available for modification, and 2) bioconjugate peptides to the modified capsids. By using native or mutationally-inserted amino acid residues and standard coupling technologies, a wide variety of materials have been displayed on the surface of plant viruses such as, Brome mosaic virus 3, Carnation mottle virus 12, Cowpea chlorotic mottle virus 6, Tobacco mosaic virus 17, Turnip yellow mosaic virus 1, and MRFV 13.

Analysis of the Solvent Accessibility of Cysteine Residues on Maize rayado fino virus Virus-like Particles Produced in Nicotiana benthamiana Plants and Cross-linking of Peptides to VLPs

A method to analyze the solvent accessibility of the thiol group of cysteine residues of Maize rayado fino virus (MRFV)-virus-like particles (VLPs) followed by a peptide cross-linking reaction is described. The method takes advantage of the availability of several chemical groups on the surface of the VLPs that can be targets for specific reactions.

시스테인 잔류 물을 용매 접근성에 대한 분석<em&gt; 옥수수 rayado fino 바이러스</em에서 생산&gt; 바이러스 같은 입자<em&gt; Nicotiana benthamiana</emVLPs에 펩티드의&gt; 식물과 교차 연결

Mimicking  and exploiting virus properties and physicochemical and physical  characteristics holds promise to provide solutions to some of  the world's ...

Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae by Latex Agglutination

Latex agglutination reagents are widely used in microbial diagnosis, identification and serotyping. Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) is a major cause of morbidity and mortality world-wide. Current vaccines target the pneumococcal capsule, and there are over 90 capsular serotypes. Serotyping pneumococcal isolates is therefore important for assessing the impact of vaccination programs and for epidemiological purposes. The World Health Organization has recommended latex agglutination as an alternative method to the &#8216;gold standard&#8217; Quellung test for serotyping pneumococci. Latex agglutination is a relatively simple, quick and inexpensive method; and is therefore suitable for resource-poor settings as well as laboratories with high-volume workloads. Latex agglutination reagents can be prepared in-house utilizing commercially-sourced antibodies that are passively attached to latex particles. This manuscript describes a method of production and quality control of latex agglutination reagents, and details a sequential testing approach which is time- and cost-effective. 
This method of production and quality control may also be suitable for other testing purposes.

Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae by Latex Agglutination

Latex agglutination testing is a simple, rapid and inexpensive method for serotyping Streptococcus pneumoniae, and has also been widely applied in diagnostic microbiology. This manuscript describes the in-house production of latex agglutination reagents, quality control procedures and the application of this technique to pneumococcal serotyping.

의 캡슐 혈청 형<em&gt; 폐렴 구균</em&gt; 라텍스 응집에 의해

Latex agglutination reagents are widely used in microbial diagnosis, identification and serotyping. Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) is a major ...

Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH

Defective DNA repair leads to increased genomic instability, which is the root cause of mutations that lead to tumorigenesis. Analysis of the frequency and type of chromosome aberrations in different cell types allows defects in DNA repair pathways to be elucidated. Understanding mammalian DNA repair biology has been greatly helped by the production of mice with knockouts in specific genes. The goal of this protocol is to quantify genomic instability in mouse B lymphocytes. Labeling of the telomeres using PNA-FISH probes (peptide nucleic acid - fluorescent in situ hybridization) facilitates the rapid analysis of genomic instability in metaphase chromosome spreads. B cells have specific advantages relative to fibroblasts, because they have normal ploidy and a higher mitotic index. Short-term culture of B cells therefore enables precise measurement of genomic instability in a primary cell population which is likely to have fewer secondary genetic mutations than what is typically found in transformed fibroblasts or patient cell lines.

DNA repair pathways are essential for maintenance of genomic integrity and preventing mutation and cancer. The goal of this protocol is to quantify genomic instability by direct observation of chromosome aberrations in metaphase spreads from mouse B cells using fluorescent in situ hybridization (FISH) for telomeric DNA repeats.

PNA-FISH에 의해 마우스 B 림프구에서 염색체 이상을 신속하게 분석

Defective DNA repair leads to increased genomic instability, which is the root cause of mutations that lead to tumorigenesis. Analysis of the frequency ...

Use of the Soft-agar Overlay Technique to Screen for Bacterially Produced Inhibitory Compounds

The soft-agar overlay technique was originally developed over 70 years ago and has been widely used in several areas of microbiological research, including work with bacteriophages and bacteriocins, proteinaceous antibacterial agents. This approach is relatively inexpensive, with minimal resource requirements. This technique consists of spotting supernatant from a donor strain (potentially harboring a toxic compound(s)) onto a solidified soft agar overlay that is seeded with a bacterial test strain (potentially sensitive to the toxic compound(s)). We utilized this technique to screen a library of Pseudomonas syringae strains for intraspecific killing. By combining this approach with a precipitation step and targeted gene deletions, multiple toxic compounds produced by the same strain can be differentiated. The two antagonistic agents commonly recovered using this technique are bacteriophages and bacteriocins. These two agents can be differentiated using two simple additional tests. Performing a serial dilution on a supernatant containing bacteriophage will result in individual plaques becoming less in number with greater dilution, whereas serial dilution of a supernatant containing bacteriocin will result a clearing zone that becomes uniformly more turbid with greater dilution. Additionally, a bacteriophage will produce a clearing zone when spotted onto a fresh soft agar overlay seeded with the same strain, whereas a bacteriocin will not produce a clearing zone when transferred to a fresh soft agar lawn, owing to the dilution of the bacteriocin.

We describe a simple method for screening bacterial cultures for the production of compounds inhibitory towards other bacteria.

소프트 한천 오버레이 기법의 사용은 세균 생산 억제 화합물에 대한 화면으로

The soft-agar overlay technique was originally developed over 70 years ago and has been widely used in several areas of microbiological research, ...

Imaging Ca2+ Responses During Shigella Infection of Epithelial Cells

Ca2+ is a ubiquitous ion involved in all known cellular processes. While global Ca2+ responses may affect cell fate, local variations in free Ca2+ cytosolic concentrations, linked to release from internal stores or an influx through plasma membrane channels, regulate cortical cell processes. Pathogens that adhere to or invade host cells trigger a reorganization of the actin cytoskeleton underlying the host plasma membrane, which likely affects both global and local Ca2+ signaling. Because these events may occur at low frequencies in a pseudo-stochastic manner over extended kinetics, the analysis of Ca2+ signals induced by pathogens raises major technical challenges that need to be addressed.
Here, we report protocols for the detection of global and local Ca2+ signals upon a Shigella infection of epithelial cells. In these protocols, artefacts linked to a prolonged exposure and photodamage associated with the excitation of Ca2+ fluorescent probes are troubleshot by stringently controlling the acquisition parameters over defined time periods during a Shigella invasion. Procedures are implemented to rigorously analyze the amplitude and frequency of global cytosolic Ca2+ signals during extended infection kinetics using the chemical probe Fluo-4.

Imaging Ca2+ Responses During Shigella Infection of Epithelial Cells

Here, we present protocols to visualize calcium (Ca2+) responses elicited by HeLa cells infected by Shigella. By optimizing the parameters of bacterial infection and imaging with Ca2+ fluorescent probes, atypical global and local Ca2+ signals induced by bacteria over a large range of infection kinetics are characterized.

상피 세포의 Shigella 감염 동안 캘리포니아2 + 응답 이미징

Ca2+ is a ubiquitous ion involved in all known cellular processes. While global Ca2+ responses may affect cell fate, local variations in free Ca2+ ...

Characterization of Human Monocyte Subsets by Whole Blood Flow Cytometry Analysis

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can have pathological significance. An ideal method for examining alterations to monocytes is whole blood flow cytometry as the minimal handling of samples by this method limits artifactual cell activation. However, many different approaches are taken to gate the monocyte subsets leading to inconsistent identification of the subsets between studies. Here we demonstrate a method using whole blood flow cytometry to identify and characterize human monocyte subsets (classical, intermediate, and non-classical). We outline how to prepare the blood samples for flow cytometry, gate the subsets (ensure contaminating cells have been removed), and determine monocyte subset expression of surface markers &#8212; in this example M1 and M2 markers. This protocol can be extended to other studies that require a standard gating method for assessing monocyte subset proportions and monocyte subset expression of other functional markers.

Here we present a protocol for characterizing monocyte subsets by whole blood flow cytometry. This includes outlining how to gate the subsets and assess their expression of surface markers and giving an example of the assessment of the expression of M1 (inflammatory) and M2 markers (anti-inflammatory).

전체 혈액에 의해 인간 Monocyte 하위 집합의 Flow Cytometry 분석

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can ...