Name: capsular serotyping of streptococcus pneumoniae by latex agglutination
Uploaded: 2014-09-25T00:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
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This work was part of the PneuCarriage project, funded by the Bill and Melinda Gates Foundation with contribution by the Victorian Government&#8217;s Operational Infrastructure Support Program.

사내 라텍스 시약의 1 준비 <ol><li> 글리신 완충 용액의 제조 (GBS) <ol><li> 1.5 g 글리신 11.7 g 나트륨 클로라이드 및 200 ㎖의 유리 비이커에 증류수 100 ㎖를 추가한다. </li><li> 마그네틱 교반기를 사용하여 용해 혼합한다. </li><li> 측정 실린더에 500 ㎖의 혼합물을 전송하고 200 ㎖의 총 증류수를 추가한다. </li><li> , 200 ㎖의 비이커로 다시 이동시켜 용액 pH를 확인하고 5 M 수산화 나트륨으로 8.2로 조정한다. 참고 : 수산화 나트륨은 부식성은, 개인 보호 장비를 착용 할 것. </li><li> 필터는 250 ml의 preautoclaved 스크류 캡 유리 병에 0.22 μM 필터 및 몇몇 60ml를 주사기를 사용하여 용액을 소독. </li><li> 실온에서 보관하십시오. </li></ol></li><li> 0.2 % 소 혈청 알부민으로 제조 GBS <ol><li> 200 ㎖의 유리 비커에 소 혈청 알부민 (BSA) 분말 0.2 g과 GBS 100 ㎖를 넣고 자기 교반기를 사용하여 용해 혼합한다. </li><li> 필터250 ml의 preautoclaved 스크류 캡 유리 병에 60 ㎖의 여러 주사기를 이용하여 0.22 μM 필터를 통해 살균 용액. </li><li> 4 ℃에서 보관하십시오. </li></ol></li><li> 라텍스 시약 준비 <ol><li> 하단의 microfuge 튜브 라운드 2 ㎖의 레이블. 참고 : 둥근 바닥 튜브는 항체 첨부 파일에 영향을 미칠 수있는 입자의 침전을 최소화하는 데 사용됩니다. </li><li> 멸균 팁 미세 원심 분리 튜브에 GBS의 975 μl를 추가로 P1000 피펫을 사용하여 한 라텍스 시약 (즉, 풀, 그룹, 유형 또는 요소) 준비되고 적절한 폐렴 구균 항혈청의 25 μl를 추가합니다. 혼합 다섯 번 반전. </li><li> 멸균 생리 식염수를 1080 μL하여 라텍스 입자의 120 μl를 첨가하여 폴리스티렌 라텍스 입자 1:10 희석. 주 :이 큰 볼륨으로 만들 수 있지만, 라텍스 시약을 생산하는 신선한마다 이루어져야한다. </li><li> 1 (단계 1.3.3에서 준비) 1:10 라텍스 현탁액의 1000 μl를 추가,000 ㎕의 1시 40분 항혈청 서스펜션 (단계 1.3.2에서 준비). 혼합 다섯 번 반전. </li><li> 천천히 회전하는 바퀴에 37 ° C에서 품어 (예를 들어, 38.5 cm 직경의 바퀴 4 회전) 2 시간 동안. </li><li> 1,100 X g에서 15 분 동안 원심 분리기. 뜨는을 취소하고 부드럽게 멸균 생리 식염수 2 ml의 펠렛을 재현 탁. </li><li> 1,100 X g에서 15 분 동안 원심 분리기. 뜨는을 취소하고 GBS 1 ㎖를 추가하고 부드럽게 펠렛을 재현 탁. </li><li> 레이블이 5 ㎖ 중에 라텍스 현탁액을 피펫 튜브 출장 나사. GBS의 또 다른 한 ML을 추가합니다. </li><li> GBS는 (산도 8.2) (단계 1.2에서 준비) (/ V w) 0.2 % BSA를 포함하는 2 ㎖를 추가합니다. 10 % 방부제로 아 지드 화 나트륨의 (w / v)의 용액 40 μl를 추가합니다. 참고 : 아 지드 화 나트륨은 흡입하면 위험하고, 피부와 눈에 자극을 일으킬 수 있습니다. 이 흡입 노출의 위험을 최소화 따라 그것은 분말 형태가 아닌 제조 10 % 용액을 구입하는 것이 바람직하다. 장갑을 포함하여 개인 보호 장비 (이 시약을 취급 할 때, D의 고글)을 착용해야합니다. 자세한 내용은 물질 안전 데이터 시트를 참조한다. </li><li> 4 ° C에서 보관 라텍스 시약. </li></ol></li><li> 음성 대조군 라텍스 시약의 제조 <ol><li> 하단의 microfuge 튜브 라운드 2 ㎖의 레이블. 참고 : 둥근 바닥 튜브는 항체 첨부 파일에 영향을 미칠 수있는 입자의 침전을 최소화하는 데 사용됩니다. </li><li> 멸균 팁 미세 원심 분리 튜브에 GBS의 975 μl를 추가로 P1000 피펫을 사용하여 한 25 ㎕의 정상 토끼 항혈청을 추가합니다. 혼합 다섯 번 반전. </li><li> 설명한 것처럼 위의 1.3.10에 1.3.3 </li></ol></li></ol> 2 품질 관리 라텍스 시약 (QC) <ol><li> RT에 라텍스 시약을 준비한다. 즉시 사용하기 전에 부드럽게 튜브를 여러 번 반전 라텍스 시약을 혼합한다. </li><li> 유리 현미경 슬라이드에 15 μl를 피펫 팅에 의해 autoagglutination을위한 시약을 확인하고 단계 4.7 이하 4.8과 같이 진행합니다. 어떤이 없어야합니다라텍스 입자의 gglutination. 시약은 흰색과 부드러운 나타납니다. </li><li> 낮은 통로 폐구균 패널에 대한 시약을 테스트합니다. 균주의 패널은 &#39;대상&#39;혈청 형의 분리 (시약에 대한 특정 혈청 형이 테스트중인)와 &#39;비 대상&#39;혈청 형 (일반적으로 교차하지 않아야 다른 혈청 형의 균주를 포함해야 3 단계에서와 같이 제조 갓 문화를 사용하여 ) 시약과 반응. QC를 받고 각 라텍스 시약 각 표적 및 비 표적 혈청 형 중 적어도 하나의 분리를 포함한다. 특정 혈청 형의 하나의 대상 또는 비 표적 혈청, 시험이 상이한 균주가있는 경우. 참고 : 테스트 패널은 침략 질환 및 / 또는 형 문화 컬렉션 드문 일부는 각 혈청 형의 여러 가지 균주를 포함해야한다. 그들은 종종 (데이터는 도시하지 않음)의 혈청 형에 대한 추가 요구하는 것처럼시켜 상기 용량 O 테스트, 어떤 캐리지 분리 포함하는 것이 바람직하다시약 F와 시약이 침략과 마차 분리 모두 혈청 형의 가능성이 할 수있는 것을 보장한다. </li><li> 대상 및 비 대상 폐렴 구균 라텍스 시약 테스트를 진행, 3 단계와 4 단계에 설명 된 방법에 따라 분리합니다. </li><li> 적어도 이후 매년 다음 생산 시간과의 품질 관리 시약. NOTE : 시약 QC를 통과하지 않는 경우, 배치가 폐기하고 새로운 준비가 이루어져야한다. 반복 QC 오류가 발생하는 경우 우리는 시약 Ortika 외., 2013 팔과 아래의 설명에 설명 된 다른 방법을 사용하여 생성 할 것을 권장합니다. </li></ol> 혈청 형에 대한 폐렴 구균 문화의 3 준비 <ol><li> 멸균 된 루프를 사용하여 폐렴 구균의 단일 콜로니를 선택 기본 접종 플레이트 표면의 약 삼분을 덮도록 고체 비 선택적 혈액 한천이 상을 분리하고 연속. 하나의 식민지 킬. 참고 : defibrinated 말이나 양의 혈액으로부터 제조 된 플레이트에 적합하다; 하지만 인간의 혈액이나 citrated 동물의 혈액 준비 혈액 판은 없습니다. </li><li> 5 % CO 2의 분위기에서 37 ° C에서 판 O / N을 품어. </li><li> 순도 접시에 성장을 관찰하고 혈청 형에 대한 충분한 성장이 있는지 평가합니다. 참고 : 폐렴 구균 분리의 순수 문화는 혈청 형이 필요합니다. 플레이트 표면의 약 삼분을 다루는 우리의 경험, 합류, 또는 합류 근처 성장에서 일반적으로 혈청 형을 완료하기에 충분하다. 폐렴 구균 문화가 자기 분해하는 경향이있을 수 있습니다으로, 혈청 형을 위해 준비 문화는 하위 문화의 24 시간 내에서 테스트해야합니다. 혈청 형이 개시되기 전에 15 개 이상의 20 분에 인큐베이터에서 배양 플레이트를하지 마십시오. </li></ol> (4) 실시 라텍스 응집의 혈청 형 <ol><li> 약을 실온으로 가온을 냉장고에서 모든 라텍스 시약을 제거하고 수30 분을 펼쳐줍니다. 즉시 사용하기 전에 부드럽게 시약을 혼합 튜브를 반전. </li><li> 현미경 슬라이드 레이블. </li><li> 현미경 슬라이드에 음성 대조군 라텍스 시약의 15 μl를 놓습니다. </li><li> 루프가 약 절반이되도록합니다 멸균 일회용 1 μL 루프를 사용하면 폐렴 구균 문화의 스윕을. </li><li> 부드럽게 대조군 라텍스 시약의 방울 주변 슬라이드의 표면에 접종 얼룩. 접종은 유리 슬라이드에 표시해야한다. </li><li> 신속하고 철저 루프를 사용하여 음성 대조군 라텍스 시약으로 균액을 혼합한다. 드롭은 초기 크기보다 더 확산되지 않도록하십시오. </li><li> 양쪽 끝을 잡고 슬라이드를 선택합니다. 앞뒤로 1 분 동안 슬라이드 락. 천천히 움직이는 액체를 유지하고 드롭의 크기가 증가하지 않도록주의하십시오. 참고 : 또는 접시 로커를 사용합니다. </li><li> 거시적 응집 (즉,에 의해 관찰육안)와 검은 배경에 대해 정학을 취소합니다. </li><li> 음성 대조군 라텍스 시약은 응집을 표시하거나 삭제는 위의 단계를 4.1-4.8에서 음성 대조군 라텍스 시약 테스트 라텍스 시약을 교체, 문화 테스트를 계속합니다. 신선한 루프마​​다 사용되어야합니다. 풀로 시작하는 라텍스 시약 테스트를 진행합니다. </li><li> 양성 얻을 때까지 연속으로 &#39;풀&#39;라텍스 시약 각을 테스트합니다. NOTE :. 예, 제 슬라이드 세 대부분 풀에 대한 테스트에 의해 특정 혈청 형 (의 로컬 빈도를 반영하는 &#39;라운드&#39;에서 수행 될 수있다 풀 테스팅 순서 양성 반응이 얻어지지 않은 경우, 테스트 ) 등 긍정적 인 반응을 얻을 때까지, 다음 세 번째 슬라이드에 남아있는 풀 가능성이 높습니다. 이것은 가장 흔한 혈청​​ 필요한 시간 및 시약을 최소화 먼저 테스트되도록. </li><li>항혈청 제조업체의 키를 사용하면 긍정적 인 풀에 표시되는 개별있는 항혈청을 결정합니다. </li><li> 위의 단계를 4.1-4.8과 &#39;그룹&#39;또는 &#39;종류&#39;를 결정하기 위해 개별적으로 긍정적 풀에 포함 된 그룹 또는 각 유형을 테스트합니다. </li><li> 항혈청 제조업체의 키를 참조하여 결과를 확인합니다. &#39;타입&#39;결정되는 경우 (예를 들면, 혈청 형 5)는, 더 이상의 테스트가 필요하지 않으므로이 결과가 기록된다. </li><li> &#39;그룹&#39;판정 된 경우 (예를 들어, 그룹 (19)) 다음, 테스트 될 요인을 결정하기 위해 제조업 키 참조. 개인의 요인 &#39;라텍스 시약 테스트를 계속하고 최종 혈청 형 (예를 들면, 혈청 형 19B)를 결정합니다. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

라텍스 응집는 폐렴 구균 혈청 형에 대한 간단하고 신속하고 저렴한 방법입니다. 상업 폐렴 구균 라텍스 응집 시약을 사용할 수 있습니다,하지만 그들은 현재 알려진 모든 폐렴 구균은 10, 12 혈청 형 구분하지 않습니다. 그러나, 라텍스 응집 시약을 쉽게 특정 폐렴 구균 캡슐 항원에 대해 발생 살 항혈청을 사용하여 자체적으로 생성 될 수있다. 여기에 설명 된 방법에서, 항체는 수동적 라텍스 응집 시약의 세트를 만들기 위해 라텍스 입자에 부착된다. 폐렴 구균의 다당류 캡슐 (18, 19)를 분리에 라텍스 입자에 결합 된 특이 항체가 항원에 연결할 때 긍정적 인 라텍스 반응이 발생합니다. 항체에 부착 된 라텍스 입자는 특정 항체 - 항원 반응을 확대없이 가시화 될 수있다. 라텍스 응집은 높은 처리량 실험실에 적합한 방법입니다자원이 부족한 설정에 대한 교리. 라텍스 응집 방법의 주요 장점이 더 전문적인 장비는 테스트를 수행하는 데 필요한되지 않도록하고, 시약은 4 ° C 팔에 저장 될 때 최소 2 년의 수명을 가지고 있고, 그것이 저렴하고 간단하고 빠른 것을 수행 할 수 있습니다. 라텍스 응집에 의해 폐렴 구균 혈청 형을 분리하면 약 10 분 소요되며, 최대 네 개의 라텍스 시약은 하나의 슬라이드에 병렬로 테스트 할 수 있습니다. 혈청 형의 유병률이 중요한 역학 설정 알려져 있다면 또한, 테스트는 테스트 Quellung 17와 마찬가지로 가장 일반적인 혈청 형을 포함하는 풀 라운드에서 시작하여 수행 될 수있다. 이 접근법은 혈청 형을 결정하는 데 필요한 시험 횟수를 최소화한다. 방법은 또한 서로 다른 사업자 간의 재현성이다 (데이터는 미도시). 라텍스 응집 혈청 형의 단점은 시약을 제조하는 것은 약 4 시간을 가지고, 시간 소모적이라는 것이다; 여러 reage하지만NTS 쉽게 병렬로 제조 할 수있다. 또한, 일부 항원 일부 항혈청과 교차 반응의 결과로, 다른 혈청 형에 걸쳐 공통 (예를 들어, 혈청 형 29, 42, 35 그룹). (일반적으로 더 문제가 교차 반응하는 항체를 제거하기 위해 미리 흡수된다) 항혈청과 반응 추가적인 테이블을 사용하는 것은 존재하는 혈청 형을 구별하기 위해 제조자에 의해 제공되는 경우에는, 이러한 교차 반응은 잘 특징 지어진다. 항체는 라텍스 입자에 제대로 정렬되지 않은 경우도 교차 할 수 라텍스 시약은 반응; 이들은 품질 관리 실패로 감지된다. 우리의 경험에 의하면, 엄격한 QC는 시중에서 판매하는 항혈청을 생산에 사용되는 경우에도이 방법의 성공의 핵심입니다. QC 시약 당 약 15 분 소요되며 상기 균주로 적절한 QC의 집합에 의존하고있다. 여기서 설명한 방법은 양성 반응 웰 WI를 제공 시약 초래시험 기간 얇은. 우리의 경험에 의하면, 오탐 (false positive) (데이터는 제시하지 않음) 실제로는 드물다. 가끔 위음성 반응이 관찰된다; 일반적으로 이러한 특정 항혈청 알려진 문제 (예, 혈청군 6 균주는 풀 B 항혈청과 반응하지 않을 수 있음), 또는 분리에 의해 캡슐 식의 다운 조절에 관한 것이다. 거짓 양성 반응 또는 음 &#39;블라인드&#39;말단 결과로 이어질 것이다 대부분의 경우에서와 같이 제조업체에서 제공 algrorithm 혈청 형을 사용하고, 또한 중요하다. 반응은 해석하기 어려운 경우 이러한 경우, 그리고, 우리는 Quellung 반응 같은 대체 방법으로 반복 테스트 및 / 또는 테스트를 권장합니다. 일부 문제는 때때로 만족 라텍스 시약을 만들기 위해 필요합니다. 여기에 설명 된 방법에서, 항체는 수동 흡착 15,19 통해 라텍스 입자에 부착되기 때문에 중요한 변수는 얼마나 잘 이용 결정 항체의 농도이고,라텍스 입자의 표면을 피복하고, 항체의 활성 부위 15,20 후속 정렬된다. 과잉 또는 불충분 한 항체를 라텍스 입자에 부착되는 경우에 결과적으로, 항체 - 항원 반응은 최적이 아닐 것이며, 불만족 15,20,21 시약을 제조 할 수있다. 항체가가 항혈청의 다른 많은 다릅니다으로, 희석 일련의 표준 잘 팔을 수행 시약을 생산하지 않을 수 있습니다. 유용한 출발점 항혈청의 1시 40분 희석을 사용하는 것이며, 이것이 성공적이지 않을 경우, 상기 항혈청을 희석한다. 우리의 경험에서 이것은 보통 문제 8 건을 해결합니다. 소수의 경우에서 시약은 대상이 분리 테스트 할 때 서스펜션의 삭제를 수반하지 않는 약한 응집을 표시 할 수 있습니다. 시약의 품질이 개선되지 않지만, 양호한 시약은 일반적으로 원심 분리를 생략하여 제조 할 수 있으며, 세척 8,22 단계 항혈청 희석 이러한 경우 </sup&gt;. 항체 코팅 된 라텍스 입자는 다양한 미생물 15,20의 탐지, 식별 또는 혈청 형에 대한 진단 미생물학에서 일반적으로 사용된다. 이와 같이, 여기에 기재된 방법은 다른 목적을 위해 라텍스 시약의 제조에 적합 할 수있는, 적절한 항혈청 제공이 가능하고 적절한 QC 절차가 채택된​​다.

폐렴 구균 (폐렴 구균)는 5 세 미만의 아동의 이환율과 사망률의 주요 원인입니다 오래 전 세계적으로, 특히 자원이 부족한 설정 1,2. 폐렴, 패혈증과 같은 생명을 위협하는 조건에 국소 감염에서 폐렴 구균 질환의 범위 및 1,2 수막염. 폐렴 구균의 90 개 이상의 혈청 형이 확인 된 자신의 피막 다당류 세의 차이에 기초하고있다. 현재 백신은 캡슐 다당류를 대상으로 침습성 질환 사를 일으키는 주요 혈청 형에서 보호 기능을 제공합니다. 폐렴 구균 혈청 형 균주를하는 캐리지와 질병에 대한 백신의 효과를 평가뿐만 아니라, 광범위한 역학 5,6 정보를 제공하는 것이 중요하다. 폐렴 구균 혈청 형에 대한 현재의 &#39;금 표준&#39;방법은 Quellung 시험이지만, 시간 소모적이며 PERFO 일부 기술이 필요RM 7. 라텍스 응집은 세계 보건기구 (WHO) 7 권장하는 다른 혈청 형 방법입니다. 라텍스 응집을 수행 할 수 신속하고 간단하며, 전 세계적으로 8-11 많은 실험실에서 사용된다. 중요한 것은, 라텍스 응집는 폐렴 구균 혈청 형 10,12-14에 대한 Quellung 시험에 필적하는 정확도를 보여 주었다. 전반적으로,이 방법은 자원이 부족한 설정뿐만 아니라 높은 처리량 실험실에 이상적입니다. 라텍스 응집 시약 ( &#39;라텍스 시약&#39;) 라텍스 입자 (15)에 대한 항체의 부착에 의해 만들어집니다. 양성 반응에서, 이러한 표지 된 입자는 특정 항원의 존재 하에서 응집. 상업 라텍스 시약은 혈청 형의 제한된 범위에 사용할 수 있습니다. 라텍스 시약도 시판 10 항혈청을 사용하여 자체 제조 할 수있다. 항혈청의 혼합물 ( &#39;풀&#39;)뿐만 아니라 고유의 폐렴 구균 항혈청erogroups (예를 들어, 그룹 19), 각각의 혈청 형 (예를 들면, 혈청 형 5), 특정 항원 ( &#39;요인&#39;, 예를 들면., 혈청 형 19A를 인식 요인 19C) 또한 그룹 내에서 혈청 형을 정의는 16 사용할 수 있습니다. 이 원고는 라텍스 입자에 시판 항혈청의 수동적 인 첨부 파일을 사용하여 라텍스 시약의 생산의 주요 단계를 설명합니다. 이 방법의 품질 관리 (QC) 양태를 설명하며, 폐렴 구균 혈청 형에 대한 라텍스 시약의 사용을위한 프로토콜을 포함한다.

<table><tbody><tr><td>Microparticles based on polystyrene, 800 nm</td><td>Sigma</td><td>65984-10 ml-F</td><td>Or other volumes as required</td></tr><tr><td>Normal rabbit serum</td><td>Antibodies Australia&amp;nbsp;</td><td>NRS-1ml</td><td>Or other volumes as required, bring to RT before use</td></tr><tr><td>Pneumococcus (Neufeld) antisera</td><td>SSI Diagnostica</td><td>Various</td><td>Bring to RT before use&lt;br/&gt; &lt;a href=&quot;http://www.ssi.dk/ssidiagnostica&quot;&gt;http://www.ssi.dk/ssidiagnostica&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Sterile Bovine Albumin&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A-4503</td><td>Bring to rRT before use</td></tr><tr><td>Sodium azide 10% (v/v) solution&amp;nbsp;</td><td>VWR International</td><td>ROAC3902/100ml</td><td>Caution: hazardous if inhaled; skin and eye irritant</td></tr><tr><td>Eppendorf Safe-Lock tubes, 2 ml</td><td>Eppendorf</td><td>0030 120.094</td><td>Round bottom</td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Merck</td><td>10241.AP</td><td></td></tr><tr><td>Calibrated disposable inoculating loops 1 &amp;micro;l</td><td>Copan</td><td>CD175SO1</td><td></td></tr><tr><td>Glass microscope slides 76 mm x 26 mm</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>LBS 2950RC</td><td></td></tr><tr><td>5 M NaOH</td><td>BDH</td><td>10252</td><td>Caution: highly corrosive</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Merck</td><td>10119.05</td><td></td></tr><tr><td>Horse Blood Agar (HBA) plates</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PP2001</td><td>Bring to RT before use&lt;br/&gt; &lt;a href=&quot;http://www.thermofisher.com.au/&quot;&gt;http://www.thermofisher.com.au&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Rotating wheel</td><td>Wyble Engineering Development Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polystyrene flat bottom screw cap tube, 5 ml</td><td>Technoplas</td><td>S5016SU</td><td></td></tr><tr><td>60 ml syringes without needles</td><td>Terumo</td><td>SS-60L</td><td></td></tr><tr><td>Millex-GP syringe filter unit, 0.22 &amp;micro;m</td><td>Merck Millipore</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>Brochure on Neufeld antisera</td><td>Statens Serum Institut</td><td></td><td>Key to determining serotypes&lt;br/&gt; &lt;a href=&quot;http://www.ssi.dk/ssidiagnostica&quot;&gt;http://www.ssi.dk/ssidiagnostica&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Key to pneumococcal factor serum</td><td>Statens Serum Institut</td><td>18058</td><td>For determining serotype within Groups&lt;br/&gt; &lt;a href=&quot;http://www.ssi.dk/ssidiagnostica&quot;&gt;http://www.ssi.dk/ssidiagnostica&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>*alternative sources are available for most materials</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

capsular serotyping of streptococcus pneumoniae by latex agglutination

Latex agglutination reagents are widely used in microbial diagnosis, identification and serotyping. Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) is a major cause of morbidity and mortality world-wide. Current vaccines target the pneumococcal capsule, and there are over 90 capsular serotypes. Serotyping pneumococcal isolates is therefore important for assessing the impact of vaccination programs and for epidemiological purposes. The World Health Organization has recommended latex agglutination as an alternative method to the &#8216;gold standard&#8217; Quellung test for serotyping pneumococci. Latex agglutination is a relatively simple, quick and inexpensive method; and is therefore suitable for resource-poor settings as well as laboratories with high-volume workloads. Latex agglutination reagents can be prepared in-house utilizing commercially-sourced antibodies that are passively attached to latex particles. This manuscript describes a method of production and quality control of latex agglutination reagents, and details a sequential testing approach which is time- and cost-effective. 
This method of production and quality control may also be suitable for other testing purposes.

라텍스 입자에 부착 형 특정 항체는 폐렴 구균의 캡슐에 결합하고, 항체 표지 입자의 응집 15 계속된다 때 긍정적 인 라텍스 반응이 발생합니다. 그림 1A는 배경의 볼 응집 및 청산을 특징으로 긍정적 인 반응을 나타낸다 서스펜션. 부정적 반응은 부드럽고 흰색 (그림 1B)에 남아있는 라텍스 응집 시약 서스펜션이 특징입니다. 양성 반응 한 최소 시간 간격 (약 20 초에서 통상 검출)이 종료되기 전에 관찰 할 수 있도록한다 시약은 최적화된다. 우리는 1 분의 시간 간격 후에 반응을 읽는하지 않는 것이 좋습니다. 아주 가끔, 반응이 배경 서스펜션의 제거와 함께, 또는 전혀 배경 지우기와 &#39;힘줄&#39;표시되지 드롭의 가장자리 주위에 약한 응집을 표시 (데이터가 표시되지 않음). 이들은 대부분 아르 등<html> LY 부정적인 반응. 이러한 경우, 우리는 재검사 및 / 또는 다른 혈청 형 방식 (예 Quellung 반응 17)를 사용하여 더 조사를 권장합니다. <img alt="그림 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51747/51747fig1highres.jpg" width="500" /> 그림 1 양극과 음극 라텍스 응집 반응. 폐렴 구균의 준비는 긍정적 인 반응 (A) 또는 부정적인 반응 (B)를 표시 라텍스 응집 시약과 혼합 분리합니다. 배경 비운 함께 융합은 .There은 음성 대조군 라텍스 시약 또는 부정적인 테스트 반응 (B)에서 가시적 응집없는 양성 반응 (A)에서 볼 수있다. 사진 팔의 사용은 권한이.&quot;대상 =&quot;_ 빈은 &quot;&gt;이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae by Latex Agglutination

유액 응집 시험은 폐렴 구균 혈청 형을위한 간단하고 신속하고 저렴한 방법, 또한 진단 미생물학 널리 적용되어왔다. 이 원고는 라텍스 응집 시약, 품질 관리 절차의 내재화 및 폐렴 혈청 형이 기술의 애플리케이션을 설명한다.

의 캡슐 혈청 형<em&gt; 폐렴 구균</em&gt; 라텍스 응집에 의해

Latex agglutination reagents are widely used in microbial diagnosis, identification and serotyping. Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) is a major ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae by Latex Agglutination

21.7K 조회수.  Murdoch Childrens Research Institute.  유액 응집 시험은 폐렴 구균 혈청 형을위한 간단하고 신속하고 저렴한 방법, 또한 진단 미생물학 널리 적용되어왔다. 이 원고는 라텍스 응집 시약, 품질 관리 절차의 내재화 및 폐렴 혈청 형이 기술의 애플리케이션을 설명한다. 

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Particle Agglutination Method for Poliovirus Identification

In the Global Polio Eradication Initiative, laboratory diagnosis plays a critical role by isolating and identifying PV from the stool samples of acute flaccid paralysis (AFP) cases. In the World Health Organization (WHO) Global Polio Laboratory Network, PV isolation and identification are currently being performed by using cell culture system and real-time RT-PCR, respectively. In the post-eradication era of PV, simple and rapid identification procedures would be helpful for rapid confirmation of polio cases at the national laboratories. In the present study, we will show the procedure of novel PA assay developed for PV identification. This PA assay utilizes interaction of PV receptor (PVR) molecule and virion that is specific and uniform affinity to all the serotypes of PV. The procedure is simple (one step procedure in reaction plates) and rapid (results can be obtained within 2 h of reaction), and the result is visually observed (observation of agglutination of gelatin particles).

A recently developed novel particle agglutination (PA) assay utilizing virus receptor molecule allowed a rapid and easy identification of poliovirus (PV). In this article, we will show the procedure for the PA assay for PV identification.

Poliovirus 식별을위한 입자 응집 방법

In the Global Polio Eradication Initiative, laboratory diagnosis plays a critical role by isolating and identifying PV from the stool samples of acute ...

연구

면역학 및 감염병학

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant strains. Carbohydrate substrate binding proteins (SBPs) represent viable targets for the development of protein-based vaccines and new antimicrobials because of their extracellular localization and the centrality of carbohydrate import for pneumococcal metabolism, respectively. Described here is a rationalized integrated protocol to carry out a comprehensive characterization of SP0092, which can be extended to other carbohydrate SBPs from the pneumococcus and other bacteria. This procedure can aid the structure-based design of inhibitors for this class of proteins. Presented in the first part of this manuscript are protocols for biochemical analysis by thermal shift assay, multi angle light scattering (MALS), and size exclusion chromatography (SEC), which optimize the stability and homogeneity of the sample directed to crystallization trials and so enhance the probability of success. The second part of this procedure describes the characterization of the SBP crystals using a tunable wavelength anomalous diffraction synchrotron beamline, and data collection protocols for measuring data that can be used to resolve the crystallized protein structure.

A streamlined protocol for performing an extensive biochemical and structural characterization of a carbohydrate substrate binding protein from Streptococcus pneumoniae is presented.

탄수화물 전송 기질 바인딩 단백질 SP0092의 생 화 학적 및 구조적 특성

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

생화학

Experimental Human Pneumococcal Carriage

Experimental human pneumococcal carriage (EHPC) is scientifically important because nasopharyngeal carriage of Streptococcus pneumoniae is both the major source of transmission and the prerequisite of invasive disease. A model of carriage will allow accurate determination of the immunological correlates of protection, the immunizing effect of carriage and the effect of host pressure on the pathogen in the nasopharyngeal niche. Further, methods of carriage detection useful in epidemiologic studies, including vaccine studies, can be compared.
Aim
We aim to develop an EHPC platform that is a safe and useful reproducible method that could be used to down-select candidate novel pneumococcal vaccines with prevention of carriage as a surrogate of vaccine induced immunity. It will work towards testing of candidate vaccines and descriptions of the mechanisms underlying EHPC and vaccine protection from carriage1. Current conjugate vaccines against pneumococcus protect children from invasive disease although new vaccines are urgently needed as the current vaccine does not confer optimal protection against non-bacteraemic pneumonia and there has been evidence of serotype replacement with non-vaccine serotypes2-4.
Method
We inoculate with S. pneumoniae suspended in 100 &mu;l of saline. Safety is a major factor in the development of the EHPC model and is achieved through intensive volunteer screening and monitoring. A safety committee consisting of clinicians and scientists that are independent from the study provides objective feedback on a weekly basis.
The bacterial inoculum is standardized and requires that no animal products are inoculated into volunteers (vegetable-based media and saline). The doses required for colonization (104-105) are much lower than those used in animal models (107)5. Detecting pneumococcal carriage is enhanced by a high volume (ideally &gt;10 ml) nasal wash that is relatively mucus free. This protocol will deal with the most important parts of the protocol in turn. These are (a) volunteer selection, (b) pneumococcal inoculum preparation, (c) inoculation, (d) follow-up and (e) carriage detection.
Results
Our current protocol has been safe in over 100 volunteers at a range of doses using two different bacterial serotypes6. A dose ranging study using S. pneumoniae 6B and 23F is currently being conducted to determine the optimal inoculation dose for 50% carriage. A predicted 50% rate of carriage will allow the EHPC model to have high sensitivity for vaccine efficacy with small study numbers.

Experimental human pneumococcal carriage offers a natural model of carriage and a potential model for use in vaccine development. This technique is valuable yet complex and involves clinical risk by introducing a pathogen into a human. We have developed a detailed protocol.

실험 인간 폐렴의 운송

Experimental human pneumococcal carriage (EHPC) is scientifically important because nasopharyngeal carriage of Streptococcus pneumoniae is both the major ...

의학

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Nasopharyngeal colonization by Streptococcus pneumoniae is a prerequisite to invasion to the lungs or bloodstream1. This organism is capable of colonizing the mucosal surface of the nasopharynx, where it can reside, multiply and eventually overcome host defences to invade to other tissues of the host. Establishment of an infection in the normally lower respiratory tract results in pneumonia. Alternatively, the bacteria can disseminate into the bloodstream causing bacteraemia, which is associated with high mortality rates2, or else lead directly to the development of pneumococcal meningitis. Understanding the kinetics of, and immune responses to, nasopharyngeal colonization is an important aspect of S. pneumoniae infection models.
Our mouse model of intranasal colonization is adapted from human models3 and has been used by multiple research groups in the study of host-pathogen responses in the nasopharynx4-7. In the first part of the model, we use a clinical isolate of S. pneumoniae to establish a self-limiting bacterial colonization that is similar to carriage events in human adults. The procedure detailed herein involves preparation of a bacterial inoculum, followed by the establishment of a colonization event through delivery of the inoculum via an intranasal route of administration. Resident macrophages are the predominant cell type in the nasopharynx during the steady state. Typically, there are few lymphocytes present in uninfected mice8, however mucosal colonization will lead to low- to high-grade inflammation (depending on the virulence of the bacterial species and strain) that will result in an immune response and the subsequent recruitment of host immune cells. These cells can be isolated by a lavage of the tracheal contents through the nares, and correlated to the density of colonization bacteria to better understand the kinetics of the infection.

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Colonization of the murine nasopharynx with Streptococcus pneumoniae and the subsequent extraction of adherent or recruited cells is described. This technique involves flushing the nasopharynx and collection of the fluid through the nares and is adaptable for various readouts, including differential cell quantification and analysis of mRNA expression in situ.

연쇄상 구균 폐렴으로 비강 내 식민지 화 중 염증 반응의 특성화

Nasopharyngeal colonization by Streptococcus pneumoniae is a prerequisite to invasion to the lungs or bloodstream1. This organism is capable of colonizing ...

Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae Using the Quellung Reaction

There are over 90 different capsular serotypes of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus). As well as being a tool for understanding pneumococcal epidemiology, capsular serotyping can provide useful information for vaccine efficacy and impact studies.&#160;The Quellung reaction is the gold standard method for pneumococcal capsular serotyping. The method involves testing a pneumococcal cell suspension with pooled and specific antisera directed against the capsular polysaccharide. The antigen-antibody reactions are observed microscopically. The protocol has three main steps: 1) preparation of a bacterial cell suspension, 2) mixing of cells and antisera on a glass slide, and 3) reading the Quellung reaction using a microscope. The Quellung reaction is reasonably simple to perform and can be applied wherever a suitable microscope and antisera are available.

Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae Using the Quellung Reaction

The Quellung reaction is the gold standard technique for serotyping Streptococcus pneumoniae. This technique utilizes a microscope and specific pneumococcal antisera and is commonly used in reference and research laboratories worldwide.

의 캡슐 혈청 형<em&gt; 폐렴 구균</em&gt; Quellung 반응을 이용하여

There are over 90 different capsular serotypes of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus). As well as being a tool for understanding pneumococcal ...

Visualization of Streptococcus pneumoniae within Cardiac Microlesions and Subsequent Cardiac Remodeling

During bacteremia Streptococcus pneumoniae can translocate across the vascular endothelium into the myocardium and form discrete bacteria-filled microscopic lesions (microlesions) that are remarkable due to the absence of infiltrating immune cells. Due to their release of cardiotoxic products, S. pneumoniae within microlesions are thought to contribute to the heart failure that is frequently observed during fulminate invasive pneumococcal disease in adults. Herein is demonstrated a protocol for experimental mouse infection that leads to reproducible cardiac microlesion formation within 30 hr. Instruction is provided on microlesion identification in hematoxylin &#38; eosin stained heart sections and the morphological distinctions between early and late microlesions are highlighted. Instruction is provided on a protocol for verification of S. pneumoniae within microlesions using antibodies against pneumococcal capsular polysaccharide and immunofluorescent microscopy. Last, a protocol for antibiotic intervention that rescues infected mice and for the detection and assessment of scar formation in the hearts of convalescent mice is provided. Together, these protocols will facilitate the investigation of the molecular mechanisms underlying pneumococcal cardiac invasion, cardiomyocyte death, cardiac remodeling as a result of exposure to S. pneumoniae, and the immune response to the pneumococci in the heart.

Visualization of Streptococcus pneumoniae within Cardiac Microlesions and Subsequent Cardiac Remodeling

Streptococcus pneumoniae forms discrete non-purulent microscopic lesions in the heart. Outlined is the protocol for a murine model of cardiac microlesion formation. Instruction is provided on microlesion visualization using microscopy, discrimination between early and late microlesions, and methods to detect cardiac remodeling in hearts of convalescent animals.

시각화<em&gt; 폐렴 구균</em&gt; 심장 Microlesions 및 후속 심장 리모델링 내

During bacteremia Streptococcus pneumoniae can translocate across the vascular endothelium into the myocardium and form discrete bacteria-filled ...

Homogeneous Glycoconjugate Produced by Combined Unnatural Amino Acid Incorporation and Click-Chemistry for Vaccine Purposes

Genetic code expansion is a powerful tool to introduce unnatural amino acids (UAAs) into proteins to modify their characteristics, to study or create new protein functions or to have access to protein conjugates. Stop codon suppression, in particular amber codon suppression, has emerged as the most popular method to genetically introduce UAAs at defined positions. This methodology is herein applied to the preparation of a carrier protein containing an UAA harboring a bioorthogonal functional group. This reactive handle can next be used to specifically and efficiently graft a synthetic oligosaccharide hapten to provide a homogeneous glycoconjugate vaccine. The protocol is limited to the synthesis of glycoconjugates in a 1:1 carbohydrate hapten/carrier protein ratio but amenable to numerous pairs of biorthogonal functional groups. Glycococonjugate vaccine homogeneity is an important criterion to ensure complete physico-chemical characterization, thereby, satisfying more and more demanding drug regulatory agency recommendations, a criterion which is unmet by classical conjugation strategies. Moreover, this protocol makes it possible to finely tune the structure of the actual conjugate vaccine, giving rise to tools to address structure-immunogenicity relationships.

Genetic code expansion is applied for the introduction of an unnatural amino acid bearing a biorthogonal functional group on a carrier protein at a defined site. The biorthogonal function is further used for the site-selective coupling of a carbohydrate antigen to provide a homogeneous glycoconjugate vaccine.

백신 목적을 위해 결합된 부자연스러운 아미노산 통합 및 클릭 화학에 의해 생성된 균일한 글리코콘주게이트

Genetic code expansion is a powerful tool to introduce unnatural amino acids (UAAs) into proteins to modify their characteristics, to study or create new ...

생체공학

Opsonophagocytic Killing Assay to Assess Immunological Responses Against Bacterial Pathogens

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental procedure in which phagocytic cells are co-cultured with bacterial units. The immune cells will phagocytose and kill the bacterial cultures in a complement-dependent manner. The efficiency of the immune-mediated cell killing is dependent on a number of factors and can be used to determine how different bacterial cultures compare with regard to resistance to cell death. In this way, the efficacy of potential immune-based therapeutics can be assessed against specific bacterial strains and/or serotypes. In this protocol, we describe a simplified OPKA that utilizes basic culture conditions and cell counting to determine bacterial cell viability after co-culture with treatment conditions and HL-60 immune cells. This method has been successfully utilized with a number of different pneumococcal serotypes, capsular and acapsular strains, and other bacterial species. The advantages of this OPKA protocol are its simplicity, versatility (as this assay is not limited to antibody treatments as opsonins), and minimization of time and reagents to assess basic experimental groups.

This opsonophagocytic killing assay is used to compare the ability of phagocytic immune cells to respond to and kill bacteria based on different treatments and/or conditions. Classically, this assay serves as the gold&#160;standard for assessing effector functions of antibodies raised against a bacterium as opsonin.

Opsonophagocytic 살해 분석 결과 세균성 병원 체에 대 한 면역학 응답을 평가 하

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental ...

Opsono-Adherence Assay to Evaluate Functional Antibodies in Vaccine Development Against Bacillus anthracis and Other Encapsulated Pathogens

The opsono-adherence assay is a functional assay that enumerates the attachment of bacterial pathogens to professional phagocytes. Because adherence is requisite to phagocytosis and killing, the assay is an alternative method to&#160;opsono-phagocytic killing assays. An advantage of the opsono-adherence&#160;assay is the option of using inactivated pathogens and mammalian cell lines, which allows standardization across multiple experiments. The use of an inactivated pathogen in the assay also facilitates work with biosafety level 3 infectious agents and other virulent pathogens. In our work, the opsono-adherence assay was used to assess the functional ability of antibodies, from sera of animals immunized with an anthrax capsule-based vaccine, to induce adherence of fixed Bacillus anthracis to a mouse macrophage cell line, RAW 264.7. Automated fluorescence microscopy was used to capture images of bacilli adhering to macrophages. Increased adherence was correlated with the presence of anti-capsule antibodies in the serum. Non-human primates that exhibited high serum anti-capsule antibody concentrations were protected from anthrax challenge. Thus, the opsono-adherence assay can be used to elucidate the biological functions of antigen specific antibodies in sera, to evaluate the efficacy of vaccine candidates and other therapeutics, and to serve as a possible correlate of immunity.&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;

Opsono-Adherence Assay to Evaluate Functional Antibodies in Vaccine Development Against Bacillus anthracis and Other Encapsulated Pathogens

The opsono-adherence assay is an alternative method to the opsono-phagocytic killing assay to evaluate the opsonic functions of antibodies in vaccine development.

바실러스 탄트라시스 및 기타 캡슐화된 병원균에 대한 백신 개발에서 기능적 항체를 평가하는 Opsono-준수 분석

The opsono-adherence assay is a functional assay that enumerates the attachment of bacterial pathogens to professional phagocytes. Because adherence is ...

Constructing Mutants in Serotype 1 Streptococcus pneumoniae strain 519/43

Streptococcus pneumoniae serotype 1 remains a huge problem in low-and-middle income countries, particularly in sub-Saharan Africa. Despite its importance, studies in this serotype have been hindered by the lack of genetic tools to modify it. In this study, we describe a method to genetically modify a serotype 1 clinical isolate (strain 519/43). Interestingly, this was achieved by exploiting the Pneumococcus&#8217; ability to naturally acquire DNA. However, unlike most pneumococci, the use of linear DNA was not successful; to mutate this important strain, a suicide plasmid had to be used. This methodology has provided the means for a deeper understanding of this elusive serotype, both in terms of its biology and pathogenicity. To validate the method, the major known pneumococcal toxin, pneumolysin, was mutated because it has a well-known and easy to follow phenotype. We showed that the mutant, as expected, lost its ability to lyse red blood cells. By being able to mutate an important gene in the serotype of interest, we were able to observe different phenotypes for loss of function mutants upon intraperitoneal and intranasal infections from the ones observed for other serotypes. In summary, this study proves that strain 519/43 (serotype 1) can be genetically modified.

Constructing Mutants in Serotype 1 Streptococcus pneumoniae strain 519/43

Here, we describe a S. pneumoniae serotype 1 strain 519/43 that can be genetically modified by using its ability to naturally acquire DNA and a suicide-plasmid. As proof of principle, an isogenic mutant in the pneumolysin (ply) gene was made.

혈청형 1 Streptococcus pneumoniae 균주 519/43에서 돌연변이 구성

Streptococcus pneumoniae serotype 1 remains a huge problem in low-and-middle income countries, particularly in sub-Saharan Africa. Despite its importance, ...

의 캡슐 혈청 형

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