Name: imaging ca2+ responses during shigella infection of epithelial cells
Uploaded: 2018-05-24T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
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원고 편집에 그녀의 도움에 감사 제니 리 Thomassin 하 고. 작품은 ANR에 의해 지원 되었다 MITOPATHO 및 PATHIMMUN를 부여, PSL IDEX Shigaforce Labex Memolife를 부여. Chunhui 태양은 중국 장학금 위원회에서 박사 그랜트의 받는 사람입니다. 로 랑 Combettes와가 트 란 반 Nhieu는 WBI 프랑스 exchange Tournesol 프로그램 N ° 31268YG의 받는 사람 (Wallonie Bruxelles 국제, Fonds 드 라 검색 과학, Ministère 프랑스어 데 레 아 페르 étrangères 등등 européennes, Ministère 데 l'Enseignement supérieur 동부 표준시 드 라 Recherche dans le 간부 des Partenariats 휴버트 Curien).

1입니다. 준비
<ol><li>
박테리아 준비
	<ol>
<li>박테리아를 접시-Shigella 야생-타입 스트레인 (M90T-AfaE) AfaE adhesin 표현-는 trypticase에 간장 (TCS) 한 접시 포함 0.01% 콩고 레드 (CR)와 18 h 37 ° c.에 대 한 그들을 품 어 참고: 그들의 재현성을 높이기 위해 단계 1.1.1에서에서 얻은 Shigella 접시 4 ° C에 저장 됩니다 및 CR 매체에 모든 식민지 빨갛게 될 것 결국 시간이 지남에 있기 때문에, 1 주일 이내 사용 해야 합니다.</li>
		<li>조 흔 격판덮개에서 3 빨간 식민지를 수확 하 여 TCS 국물 사전 문화를 예방. 참고: 3 식민지와 접종 누구의 독성 플라스 미드 유전자 재결합을 겪고 있다 단일 클론 선택의 가능성을 제한 하 수행 됩니다.</li>
		<li>200 rpm에서 37 ° C에서 16 h 떨고 인큐베이터에서 액체 세균성 문화를 성장. 75 mg/mL의 최종 농도에 암 피 실린을 추가 합니다. 으로 항생제의 과잉 큰 독성 플라스 미드의 손실로 이어질 수 있습니다 항생제 농도가 최소 억제 농도, x 3를 넘지 말아야 한다. 참고: Shigella 독성 플라스 미드의 유지 보수는 도금 크롬 플레이트 적절 한 항생제 농도와 보완에 세균성 문화에 의해 확인 되어야 한다. 백색 식민지의 플라스 미드 손실을 나타냅니다.</li>
		<li>TCS 문화 1: 100 희석에 세균성 사전 문화를 예방 200 rpm에서 2 h 떨고 인큐베이터에서 37 ° C에서 그것을 품 어. 600에서 광학 밀도 확인 nm (OD600nm)는 0.2-0.4.</li>
		<li>21 ° C에서 13000 x g에서 2 분 동안 세균성 문화를 원심 및 EM 매체 (120 mM NaCl, KCl 7mm, 1.8 m m CaCl2, 0.8 m m MgCl2, 5 mM 포도 당, 및 25 mM HEPES의 해당 볼륨에서 펠 릿 resuspend pH 7.3 =).</li>
		<li>0.1의 최종 OD600nm 에서 EM 버퍼에 세균 현 탁 액을 희석 하 고 즉시 그것을 사용 하 여 또는 21 ° C에 저장 그것을 사용 하 여 다음 60 분 이내.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
세포 준비
	<ol>
<li>1 g/l 포도 당의 DMEM에 문화 HeLa 세포 10% 태아 종 아리 혈 청 (FCS) 보충 10% CO2와 37 ° C에서 그들을 성장 하 고. TC-7 포도 당의 4.5 g/L와 DMEM 성장 10 %FCS 및 비 본질적인 아미노산 10% CO2를 포함 하는 37 ° C 배양 기에서 포함 된 성장.</li>
		<li>셀에 대 한 유지 보수, 성장 접촉 저해를 방지 하려면 정기적으로 셀 분할 confluent 상태로; 연결 이것은 높은 캘리포니아2 + 프로브 로딩/transfection 효율을 중요 합니다.</li>
		<li>6 잘 플레이트 3 x 105 셀/잘 HeLa 세포에 대 한 실험 전날의 조밀도에 있는 살 균 25 m m 직경 원형 coverslips에 HeLa 세포를 플레이트.</li>
		<li>TC-7 셀, trypsinize 및 셀. 에 4 × 105 셀/잘 씨 및 그들에 품 10% CO2에서 37 ° C에서 5-7 일 어-인큐베이터는 극성이 있도록 실험 하기 전에.<ol>
<li>세포 배양 실험의 날까지 매일 새로 고칩니다. 참고: 유리 하단 35 m m 직경 일회용 챔버 또한 포함 하는 coverslips 웰 스 하는 대신 사용할 수 있습니다. 후자는 사용, 열띤된 무대를 통해 온도 제어 또는 목표는 충분 한, 그리고 온도 인큐베이션 챔버에 장착 된 현미경 단계가 필요 합니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>실험의 주 매체를 제거 하 고 세척 3 셀 x 21 ° c.에 1 mL 안에 매체와</li>
	<li>로드 3 m Fluo-4-오전14 21 ° c.에 30 분 안에 버퍼에 셀 참고: 하위 confluent HeLa 세포의 로드는 주요 문제를 발생 하지 않습니다, 하는 동안 편광된 TC 7 셀의 로드 자주 이기종 고 가난 하 게 효율적입니다. 이 셀에 대 한 우리가 로드 효율 분산 에이전트의 추가 의해 향상 됩니다 발견-pluronic 산-0.1%의와 20 µ M에의 최종 농도에서 음이온 운송업 자 억제 물 bromosulfophtalein의 최종 농도에 Fluo-4-오전-포함 된 Em입니다. 화학 비율을 사용 하 여 프로브 또는 유전자 인코딩-무서 워 프로브 필요한 듀얼 수집 수집 로컬 Ca2 + 응답의 이미징에 필요한 속도와 호환 되지 않습니다.</li>
	<li>워시 샘플 3 x EM와 버퍼 그리고 추가 EM buffer 오전 moiety의 가수분해 수 있도록 21 ° C의 1 mL에 그들을 품 어. 즉시 또는 다음 90 분 (21 ° C에서 유지 하는) 내 사용 Fluo-4 셀 로드.</li>
</ol>2. 감염 및 로컬 Ca2 + 응답의 이미지 수집
<ol><li>이미징 챔버 또는 유리 하단 챔버 Fluo-4 로드 셀을 포함 하는 coverslip을 놓습니다. 영상 실에서 샘플을 세척 또는 유리 하단 일회용 챔버 EM 버퍼 잠재적으로 셀 세포에서 발생 하는 화합물을 제거 하는 3 배. 안에 버퍼의 1 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>장소는 거꾸로 형광 현미경 스테이지 챔버 33 ° c.에가 열 참고:이 온도 로컬 응답을 시각화 하기 위해 Shigella 침공 프로세스와 호환 최적의 온도 Ca2 + 응답의 둔화 사이 타협으로 선택 됩니다. 우리가 침수 기름 목표 X 63을 사용 하 여 (NA = 1.25) 단계 대조 고리를 장착.</li>
	<li>현미경 필드를 선택 하 고 설정 수집 매개 변수를 포함 하 여 노출 시간 및 binning Fluo-4 형광 신호를 최적화 하기 위해 필요한 경우. 참고: 로컬 Ca2 + 이미징의 주요 과제는 낮은 진폭 및 응답의 작은 기간 요구 수집 30 매 양 여러 상용 백 조명 EM CCD 또는 C-MOS 카메라 제시 필수 로컬 Ca2 + 응답 Fluo-4를 사용 하 여 검색에 감도. 검출 감도 photodamage 또는 높은 주파수에서 Fluo-4의 형광 여기에 연결 하는 자발적인 응답 같은 유물을 제한 하는 중요 한 문제 이기도 합니다. 여기, 470의 LED 기반 조명 nm, 480 ± 40 nm 대역 통과 여기 필터, 505 nm dichroic 필터와는 527 ± 30 nm 대역 통과 방출 1.0 중립 밀도 필터를 함께 최대 강도의 5%에서 사용 되는 이러한 문제를 최소화 하기 위해 사용 되었다 아래 제한 기간의 취득의 스트림입니다. 로컬 Ca2 + 120 s 스트림의 배치 하 여 신호 분석을 정기적으로 수행 되었다. 이러한 낮은 조명 조건에서 fluorophore photobleaching 하지 2 분-스트림 인수 동안 관찰 되었다. 다양 한 분야에 사용 됩니다 제공에 같은 샘플에 연속 인수를 수행할 수 있습니다. 일반적으로 첫 번째 인수 스트림 자발적인 응답의 부재를 보장 하기 위해 박테리아 자극의 부재에서 컨트롤 필드에서 수행 됩니다. 자발적인 응답을 관찰 하는 경우 응답 없음은 관찰 될 때까지 샘플 EM 버퍼와 세척 된다.</li>
	<li>박테리아 샘플을 추가 하려면 상공에서 EM 버퍼의 500 µ L을 제거 하 고 500 µ L 세균 현 탁 액 0.05, 선택한 현미경 분야; 이동 되지 않도록 적절 한 주의 함께 마지막 세600nm 를 단계 1.1.6에서에서 준비의 추가 볼륨은 박테리아와 세포 샘플에 박테리아의 균질 배급의 적당 한 혼합을 확인 합니다.</li>
	<li>세균 이외에는 수집을 수행 합니다. 또는 인수 10 분 사용 조건 하에서 세포에 앙금을 박테리아에 필요한 시간에 해당 세균 또한 다음을 수행 합니다. 인수 스트림의 끝에 박테리아는 세포 막 주름 세균성 내 습 사이트와 관련 된 문의 시각화 하기 위해 선택된 된 필드의 위상 대조 이미지를 취득 합니다.</li>
	<li>이미지 인수, 파일 절감 및 전체 프로세스를 커버 하는 새로운 필드의 선택의 기간에 받을 간격 2.5, 단계와 인수 절차를 반복 합니다. 참고: 이질균, 우리 발견 수집 20 분, 5 분 마다 스트림 10 분 세균 침전, 침공 이벤트의 대부분을 커버 수 다음.</li>
	<li>인수 절차의 끝에, 캘리포니아2 + ionophore ionomycin 샘플의 Ca2 + 신호의 최대 진폭을 결정 하는 2 µ M의 최종 농도 추가 합니다. 이미지까지 신호 안정화, 보통 10 분 미만 대 한 모든 3-5 s.</li>
	<li>캘리포니아2 +의 부재에서 형광 신호를 확인 하기 위해 10 mM의 최종 농도에 캘리포니아2 + chelator EGTA를 추가 하 여 따라. 이미지까지 신호 안정화, 보통 10 분 미만 대 한 모든 3-5 s. 참고: 글로벌 Ca2 + 유사의 상대적으로 느린 역학, 때문에 수행이 인수 (안에, 스트리밍 모드), 캘리포니아2 + 연속 치료 동안 같은 미세한 필드에 이미지에 대 한 수 있도록 모든 3-5 s.</li>
</ol>3입니다. 분석
<ol><li>같은 투자 수익에 기준 형광 δ/F0, δ의 관심 (ROI)의 지역 평균 형광 강도의 변화를 나타냅니다 및 F0 의 비율으로 시간이 지남에 cytosolic 캘리포니아2 + 유사 익스프레스는 셀 없는 분야의 관련 없는 영역을 뺍니다.<ol>
<li>해당 기준선 수준; 하 다양 한 분야에 각 셀에 대 한 기저 형광 수준 제거 이러한 수준 낮은 주파수 때문에 명확 하 게 결정 될 수 있다 고 상대적으로 짧은 기간 주어진된 스트림 수집에 로컬 Ca2 + 반응의. 참고: 계량 응답 질문에 관련 된 공부 하는 병원 성 모델의 눈에 띄는 기능. 고아 하 게, 다양 한 매개 변수는 고려 캘리포니아2 + 신호, 로컬 또는 전역 Ca2 + 응답으로 기간, 진폭, 및 이러한 응답의 빈도 보여주는 셀의 주파수를 포함 분석 하. 이질균 및 현지 응답, 분석의 다른 중요 한 측면 세균성 내 습 사이트와 응답의 공간 협회입니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>전역 또는 로컬 응답을 보여주는 반응 세포의 비율, 척도를 그릴 ROIs 셀, 시계열 Fluo-4 강도의 변화에 해당.<ol>
<li>가양성을 득점 하지 않으려면 로컬 Ca2 + 응답, 평균 형광 강도 셀 기준의 3 배 위의 배경 유사 또는 기간 적어도 200 ms의 진폭 등을 식별 하는 엄격한 매개 변수를 설정 합니다. 참고: 일반적으로 작은 로컬 Ca2 + 응답 구별 될 수 있다 어떤 배경 잡음에서 그들의 프로필. ROIs 지역 변이의 탐지에 대 한 허용 하도록 충분 한 형광 신호를 통합 하기에 충분 해야 합니다. Fluo-4 검출의 강도 따라 이러한 ROIs 2-5 m m에서 배열 하는 직경을 가진 원형에 해당할 수 있습니다.</li>
		<li>로컬 또는 글로벌 응답 인지 확인 하기 위해 동일한 셀의 고유 영역에 2 지역에서 평균 Fluo-4 형광 강도의 변화를 측정 합니다. 참고: 셀의 다 수의 분석 이미징 선택된 영역에 대 한 시간별 평균 형광 강도의 변이의 온라인 스크린 디스플레이 허용 하는 소프트웨어의 사용에 의해 촉진 된다. 상용 이미징 소프트웨어는 같은 옵션, 하지만이 또한 수행할 수 있습니다 투자 수익 강도 진화 플러그인을 사용 하 여 얼음 프리웨어를 사용 하 여.</li>
		<li>로컬 응답을 보여주는 셀의 비율을 결정 합니다. 참고:이 비율을 지원 하기 위해 충분 한 숫자에 있어야 현미경 분야에서 분석 하는 셀의 총 수에서 계산 되는 통계적으로 의미는 비-파라 메 트릭 테스트를 사용 하 여.</li>
		<li>로컬 응답의 기간을 결정 합니다. 참고: 로컬 Ca2 + 응답 구별 될 수 있다 더 그들의 기간 범위에 따라 (즉, 5, 10 s 사이 또는 10 위, 500 밀리초 보다 작아야 s) Shigella 침공 사이트와 함께 그들의 협회.</li>
	</ol>
</li>
	<li>응답의 진폭을 수량화 합니다. 첫째, 최대 캘리포니아2 + 및 셀 배경 수준 단계 2.1.7에서 결정 보정. Fluo-4 부하 각 셀에 대 한 다를 수 있습니다 이후 필드에 개별 셀에 대 한 이러한 결정을 수행 합니다.<ol>
<li>최대 응답의 상대적 비율로 응답의 진폭을 표현 한다.</li>
		<li>통계 뒤에 잠재적인 차이 응답의 진폭에 샘플을 분석 하는 파라메트릭 테스트 정상 테스트를 사용 하 여 테스트를 수행 합니다.</li>
		<li>시각 이미지는 해당 단계에서 세균을 이용한 막 주름을 각각 그들의 지 방화에 의해 세균성 내 습 사이트를 기준으로 이러한 반응의 협회를 확인 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Ashida, H., Ogawa, M., Kim, M., Mimuro, H., Sasakawa, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteria+and+host+interactions+in+the+gut+epithelial+barrier.">Bacteria and host interactions in the gut epithelial barrier.</a> Nature Chemical Biology. 8 (1), 36-45 (2012).</li><li>Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+versatility+and+universality+of+calcium+signaling.">The versatility and universality of calcium signaling.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 1 (1), 11-21 (2000).</li><li>Strehler, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+membrane+calcium+ATPases:+from+generic+Ca(2+)+sump+pumps+to+versatile+systems+for+fine-tuning+cellular+Ca(2).">Plasma membrane calcium ATPases: from generic Ca(2+) sump pumps to versatile systems for fine-tuning cellular Ca(2).</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 460 (1), 26-33 (2015).</li><li>Muallem, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decoding+Ca2++signals:+a+question+of+timing.">Decoding Ca2+ signals: a question of timing.</a> Journal of Cell Biology. 170 (2), 173-175 (2005).</li><li>Uhlen, P., Fritz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemistry+of+calcium+oscillations.">Biochemistry of calcium oscillations.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 396 (1), 28-32 (2010).</li><li>Carneiro, L. 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H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Shigella+type+III+effector+IpgD+recodes+Ca2++signals+during+invasion+of+epithelial+cells.">The Shigella type III effector IpgD recodes Ca2+ signals during invasion of epithelial cells.</a> The EMBO Journal. 36 (17), 2567-2580 (2017).</li><li>Allaoui, A., Menard, R., Sansonetti, P. J., Parsot, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+Shigella+flexneri+IpgD+and+IpgF+genes,+which+are+located+in+the+proximal+part+of+the+mxi+locus.">Characterization of the Shigella flexneri IpgD and IpgF genes, which are located in the proximal part of the mxi locus.</a> Infection and Immunity. 61 (5), 1707-1714 (1993).</li></ol>

저자는 선언할 수 없다.

이 원고는 우리 Shigella의 확장된 활동 동안 글로벌 Ca2 + 응답 Shigella 침공의 상대적으로 짧은 활동 기간 동안 로컬 Ca2 + 신호를 따라 설계 된 프로토콜을 설명 합니다. 아래 키를 캘리포니아2 + 의 검색을 최적화 하기 위해 해결 되어야 할 문제를 찾을 수 있습니다 생물 학적 과정을 어떤 방해를 최소화 하면서 신호.
화학 대 유전자에 캘?...

캘리포니아2 + cytoskeletal 개편, 선 동적인 응답 및 호스트 병원 체 상호 작용1,2,3에 관련 된 세포 죽음 통로 포함 하 여 모든 알려진된 세포 프로세스를 통제 한다. 생리 적인 조건 하에서 기초 cytosolic 캘리포니아2 + 농도 낮은 수백 nM 범위에에서 있지만 주 작동 근 자극에 따라 일시적 증가를 받게 될 수 있습니다. 이 변이 자주 플라즈마 및 바인딩과 그물 막에 펌프와 채널의 행동을 통해 진동 동작을 표시합니다. 이러한 진동의 패턴 기간, 기간, 및 캘리포니아2 + 증가의 진폭에 의해 특징 및 세포, 차례 차례로, Ca2 + 코드4,5로 알려져 있습니다 무엇에 특정 응답을 방 아 쇠에 의해 해독 . 병 적인 조건 하에서 cytosolic 캘리포니아2 + 농도 증가 지속된 미토 콘 드리 아 막의 permeabilization 및 프로-apoptotic 또는 괴 사 성 요인6,의 출시와 관련 된 세포 죽음으로 이어질 수 있습니다. 7.
이질균, 세균성이 질의 원인이 되는 에이전트 유형 III 분 비 체계 (T3SS)8,9를 사용 하 여 호스트 셀에 이펙터를 주입 하 여 상피 세포를 침입 한다. Shigella 침공 호스트 세포의 지역 및 글로벌 Ca2 + 신호는 T3SS에 의해 elicited와 연결 됩니다. 기 공 형성에 관해서는 독 소, 호스트 세포 막에 삽입 하 고이 필요 T3SS 이펙터의 주입은 T3SS translocon PLC 및 이노 시 톨 (1, 4, 5) trisphosphate (InsP3)의 활성화에 대 한 책임-종속 Ca2 + 릴리즈입니다. 지역화 된 PLC 자극과 생산 말라는 예외적인 오랫동안 InsP3 종속 Ca2 + Shigella 침공 결과의 사이트에서의 축적의 조합10을릴리스 합니다. 유형 III 이펙터 IpgD, phosphatidyl 4, 5 bisphosphate (PIP2)-4-인산 가수분해 효소, 제한 지역 PIP2, 로컬 Ca2 + 의 감 금에 기여 하는 InsP3를 생성 하는 PLC에 대 한 사용 가능한 기판의 수량을 제어 함으로써 세균성 내 습 사이트11,12에 응답 합니다. 이러한 로컬 Ca2 + 응답 가능성이 Shigella 침공 사이트10걸 중 합에 기여 한다. 그러나 이질균에 의해, elicited 또한 글로벌 캘리포니아2 + 응답 세균성 내 습 프로세스에 불가결 하지만 플라즈마 막에서 connexin hemichannels의 열고는 세포 외에서 ATP의 릴리스 트리거 구획입니다. 출시 된 ATP paracrine 방식으로 행동, 캘리포니아2 + 진동 응답 감염된 셀 옆 셀에 자극. IpgD 글로벌 Ca2 + 응답을 형성 하는 느린 역학과 엉뚱한 고립 된 응답에 대 한 책임 이기도 합니다. 결국, 장기간된 세균 감염 시 IpgD InsP3 중재 Ca2 + 신호 억제에 지도 한다. 캘리포니아2 + 신호는 간섭를 통해 IpgD 지연 캘리포니아2 +-종속 calpain 활성화 초점 접착 구조의 해체와 조기 분리로 이어지는 셀13감염.
캘리포니아2 + 신호 병의 중요 한 측면에 관련 된, 하는 동안 미생물의 사용 다양을 한 클래식 주 작동 근 연구에서 발생 하지 않는 기술적인 문제를 발생 시킵니다. 프로토콜 설명 여기는 일반적으로 사용 되 형광 캘리포니아2 + 화학 표시기 Fluo-4 우리 Shigella 감염 시 로컬 Ca2 + 신호 특성 설계를 사용 합니다. 이러한 신호 검출을 위한 중요 한 단계는 캘리포니아2 + 신호에 세균성 이펙터의 역할을 특성화 하는 데 필요한 그들의 정량 분석에 대 한 구현 절차 뿐만 아니라 설명 합니다.

<table><tbody><tr><td>Fluo-4 AM</td><td>Invitrogen</td><td>F14201</td><td></td></tr><tr><td>Metamorph version 7.7</td><td>Universal Imaging</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CoolLED illumination system pE-2</td><td>Roper Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>micro-dish 35 mm, high&amp;nbsp;</td><td>IBIDI</td><td>81156</td><td></td></tr><tr><td>Trypticase Soy (TCS) broth</td><td>Thermofisher</td><td></td><td>B11768</td></tr><tr><td>TCS agar</td><td>Thermofisher</td><td></td><td>B11043</td></tr><tr><td>Congo red</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>75768</td></tr><tr><td>M90T-AfaE</td><td>Sun et al. 2017</td><td>&lt;em&gt;Shigella flexneri&lt;/em&gt; serotype V. expressing the AfaE adhesin</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;ipgD&lt;/em&gt;-AfaE</td><td>Sun et al. 2017</td><td>isogenic ipgD mutant strain expressing the AfaE adhesin</td><td></td></tr></tbody></table>

imaging ca2+ responses during shigella infection of epithelial cells

캘리포니아2 + 모든 알려진된 세포질 과정에서 포함 된 유비 쿼터 스 이온 이다. 글로벌 Ca2 + 응답 세포 운명에 영향을 미칠 수 있습니다, 하는 동안 무료 캘리포니아2 + cytosolic 농도에서 내부 상점 또는 원형질 막 채널을 통해 유입에서 릴리스 연결할 로컬 유사 대뇌 피 질의 세포 프로세스를 통제 한다. 병원 체는 준수 또는 호스트 셀 트리거 기본 호스트 원형질 막, 글로벌 및 로컬 Ca2 + 신호에 영향을 미치는 가능성이 있는 걸 골격의 개편을 침공. 이러한 이벤트는 확장된 활동을 통해 의사 확률적으로 낮은 주파수에서 발생할 수 있습니다, 때문에 병원 균에 의해 유도 된 Ca2 + 신호 분석 해결 되어야 할 주요 기술 과제를 발생 시킵니다.
여기, 우리는 글로벌 및 로컬 Ca2 + 신호 상피 세포의 Shigella 감염 시의 검출에 대 한 프로토콜을 보고합니다. 이러한 프로토콜에 장기간된 노출에 연결 된 인공 물 및 photodamage 캘리포니아2 + 형광 프로브의 여기와 관련 된는 엄격 하 게는 동안 정의 된 시간 기간 동안 수집 매개 변수를 제어 하 여 트러블 슈팅을 Shigella 침공. 절차는 엄격 하 게 분석 하는 진폭 글로벌 cytosolic 캘리포니아2 + 신호 주파수 확장된 감염 속도 론 화학 프로브 Fluo-4 사용 하는 동안 구현 됩니다.

Shigella 침공은 관련 된 비정형 오랫동안 로컬 Ca2 + 응답:
위에서 언급 한 프로토콜에 따라 Fluo-4 로드 HeLa 세포 WT Shigella 와 도전 그리고 스트림 인수 Ca2 + 신호 분석을 수행 했다. 대표적인 실험 단일 셀, 그리고 해당 단계 대조 이미지 (그림 1A, 왼쪽에 대 한 관심의 영역에서 평균 ...

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Imaging Ca2+ Responses During Shigella Infection of Epithelial Cells

여기, 선물이 HeLa 세포 이질균에 감염 하 여 elicited 칼슘 (캘리포니아2 +) 응답을 시각화 하는 프로토콜. 세균 감염의 매개 변수를 최적화 하 고 캘리포니아2 + 형광 프로브 이미징, 비정형 글로벌 및 로컬 Ca2 + 신호 감염 활동의 넓은 범위를 통해 박테리아에 의해 유도 된 특징 이다.

상피 세포의 Shigella 감염 동안 캘리포니아2 + 응답 이미징

Ca2+ is a ubiquitous ion involved in all known cellular processes. While global Ca2+ responses may affect cell fate, local variations in free Ca2+ ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imaging Ca2+ Responses During Shigella Infection of Epithelial Cells

5.4K 조회수.  Collège de France. 여기, 선물이 HeLa 세포 이질균에 감염 하 여 elicited 칼슘 (캘리포니아2 +) 응답을 시각화 하는 프로토콜. 세균 감염의 매개 변수를 최적화 하 고 캘리포니아2 + 형광 프로브 이미징, 비정형 글로벌 및 로컬 Ca2 + 신호 감염 활동의 넓은 범위를 통해 박테리아에 의해 유도 된 특징 이다.

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Application of a Mouse Ligated Peyer&#x2019;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed to them and occasionally to pathogens. The gut-associated lymphoid tissue (GALT) play a key role for induction of the mucosal immune response to these microbes1, 2. To initiate the mucosal immune response, the mucosal antigens must be transported from the gut lumen across the epithelial barrier into organized lymphoid follicles such as Peyer's patches. This antigen transcytosis is mediated by specialized epithelial M cells3, 4. M cells are atypical epithelial cells that actively phagocytose macromolecules and microbes. Unlike dendritic cells (DCs) and macrophages, which target antigens to lysosomes for degradation, M cells mainly transcytose the internalized antigens. This vigorous macromolecular transcytosis through M cells delivers antigen to the underlying organized lymphoid follicles and is believed to be essential for initiating antigen-specific mucosal immune responses. However, the molecular mechanisms promoting this antigen uptake by M cells are largely unknown. We have previously reported that glycoprotein 2 (Gp2), specifically expressed on the apical plasma membrane of M cells among enterocytes, serves as a transcytotic receptor for a subset of commensal and pathogenic enterobacteria, including Escherichia coli and Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. Typhimurium), by recognizing FimH, a component of type I pili on the bacterial outer membrane 5. Here, we present a method for the application of a mouse Peyer's patch intestinal loop assay to evaluate bacterial uptake by M cells. This method is an improved version of the mouse intestinal loop assay previously described 6, 7. The improved points are as follows: 1. Isoflurane was used as an anesthetic agent. 2. Approximately 1 cm ligated intestinal loop including Peyer's patch was set up. 3. Bacteria taken up by M cells were fluorescently labeled by fluorescence labeling reagent or by overexpressing fluorescent protein such as green fluorescent protein (GFP). 4. M cells in the follicle-associated epithelium covering Peyer's patch were detected by whole-mount immunostainig with anti Gp2 antibody. 5. Fluorescent bacterial transcytosis by M cells were observed by confocal microscopic analysis. The mouse Peyer's patch intestinal loop assay could supply the answer what kind of commensal or pathogenic bacteria transcytosed by M cells, and may lead us to understand the molecular mechanism of how to stimulate mucosal immune system through M cells.

Application of a Mouse Ligated Peyer&#8217;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

M cells in a specialized follicle-associated epithelium covering Peyer&#x2019;s patches play an important role for the mucosal immunosurveillance in gut-associated lymphoid tissue. Here we described the evaluation method for bacterial transcytosis by M cells in vivo. This method provides a method to understand M-cell function in the immune system.

마우스의 응용은 M 세포에 의해 박테리아 이해를 평가하는 Peyer의 패치 장 루프 분석 출혈도 잡았

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed ...

연구

면역학 및 감염병학

Flow Cytometric Isolation of Primary Murine Type II Alveolar Epithelial Cells for Functional and Molecular Studies

Throughout the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII) to various aspects of immune regulation in the lung has been increasingly recognized. AECII have been shown to participate in cytokine production in inflamed airways and to even act as antigen-presenting cells in both infection and T-cell mediated autoimmunity 1-8. Therefore, they are especially interesting also in clinical contexts such as airway hyper-reactivity to foreign and self-antigens as well as infections that directly or indirectly target AECII. However, our understanding of the detailed immunologic functions served by alveolar type II epithelial cells in the healthy lung as well as in inflammation remains fragmentary. Many studies regarding AECII function are performed using mouse or human alveolar epithelial cell lines 9-12. Working with cell lines certainly offers a range of benefits, such as the availability of large numbers of cells for extensive analyses. However, we believe the use of primary murine AECII allows a better understanding of the role of this cell type in complex processes like infection or autoimmune inflammation. Primary murine AECII can be isolated directly from animals suffering from such respiratory conditions, meaning they have been subject to all additional extrinsic factors playing a role in the analyzed setting. As an example, viable AECII can be isolated from mice intranasally infected with influenza A virus, which primarily targets these cells for replication 13. Importantly, through ex vivo infection of AECII isolated from healthy mice, studies of the cellular responses mounted upon infection can be further extended.
Our protocol for the isolation of primary murine AECII is based on enzymatic digestion of the mouse lung followed by labeling of the resulting cell suspension with antibodies specific for CD11c, CD11b, F4/80, CD19, CD45 and CD16/CD32. Granular AECII are then identified as the unlabeled and sideward scatter high (SSChigh) cell population and are separated by fluorescence activated cell sorting 3.
In comparison to alternative methods of isolating primary epithelial cells from mouse lungs, our protocol for flow cytometric isolation of AECII by negative selection yields untouched, highly viable and pure AECII in relatively short time. Additionally, and in contrast to conventional methods of isolation by panning and depletion of lymphocytes via binding of antibody-coupled magnetic beads 14, 15, flow cytometric cell-sorting allows discrimination by means of cell size and granularity. Given that instrumentation for flow cytometric cell sorting is available, the described procedure can be applied at relatively low costs. Next to standard antibodies and enzymes for lung disintegration, no additional reagents such as magnetic beads are required. The isolated cells are suitable for a wide range of functional and molecular studies, which include in vitro culture and T-cell stimulation assays as well as transcriptome, proteome or secretome analyses 3, 4.

We describe the rapid isolation of primary murine type II alveolar epithelial cells (AECII) by flow cytometric negative selection. These AECII show high viability and purity and are suitable for a wide range of functional and molecular studies regarding their role in respiratory conditions such as autoimmune or infectious diseases.

기능 및 분자 연구 기본 손쥐 유형 II 폐포 상피 세포의 흐름 Cytometric 절연

Throughout  the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII)  to various aspects of immune regulation in the lung has been ...

Single Cell Measurements of Vacuolar Rupture Caused by Intracellular Pathogens

Shigella flexneri are pathogenic bacteria that invade host cells entering into an endocytic vacuole. Subsequently, the rupture of this membrane-enclosed compartment allows bacteria to move within the cytosol, proliferate and further invade neighboring cells. Mycobacterium tuberculosis is phagocytosed by immune cells, and has recently been shown to rupture phagosomal membrane in macrophages. We developed a robust assay for tracking phagosomal membrane disruption after host cell entry of Shigella flexneri or Mycobacterium tuberculosis. The approach makes use of CCF4, a FRET reporter sensitive to &beta;-lactamase that equilibrates in the cytosol of host cells. Upon invasion of host cells by bacterial pathogens, the probe remains intact as long as the bacteria reside in membrane-enclosed compartments. After disruption of the vacuole, &beta;-lactamase activity on the surface of the intracellular pathogen cleaves CCF4 instantly leading to a loss of FRET signal and switching its emission spectrum. This robust ratiometric assay yields accurate information about the timing of vacuolar rupture induced by the invading bacteria, and it can be coupled to automated microscopy and image processing by specialized algorithms for the detection of the emission signals of the FRET donor and acceptor. Further, it allows investigating the dynamics of vacuolar disruption elicited by intracellular bacteria in real time in single cells. Finally, it is perfectly suited for high-throughput analysis with a spatio-temporal resolution exceeding previous methods. Here, we provide the experimental details of exemplary protocols for the CCF4 vacuolar rupture assay on HeLa cells and THP-1 macrophages for time-lapse experiments or end points experiments using Shigella flexneri as well as multiple mycobacterial strains such as Mycobacterium marinum, Mycobacterium bovis, and Mycobacterium tuberculosis.

We describe a method for tracking the endomembrane rupture elicited by the intracellular bacteria Shigella flexneri and Mycobacterium tuberculosis upon host cell invasion. Our assay makes use of CCF4, a host cytoplasmic FRET probe in live or fixed cells. This reporter is degraded by an enzyme activity present on the bacterial surface.

액포 파열의 단일 세포 측정은 세포 내 병원균에 의해 발생

Shigella flexneri are pathogenic bacteria that invade host cells entering into an endocytic vacuole. Subsequently, the rupture of this membrane-enclosed ...

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Nasopharyngeal colonization by Streptococcus pneumoniae is a prerequisite to invasion to the lungs or bloodstream1. This organism is capable of colonizing the mucosal surface of the nasopharynx, where it can reside, multiply and eventually overcome host defences to invade to other tissues of the host. Establishment of an infection in the normally lower respiratory tract results in pneumonia. Alternatively, the bacteria can disseminate into the bloodstream causing bacteraemia, which is associated with high mortality rates2, or else lead directly to the development of pneumococcal meningitis. Understanding the kinetics of, and immune responses to, nasopharyngeal colonization is an important aspect of S. pneumoniae infection models.
Our mouse model of intranasal colonization is adapted from human models3 and has been used by multiple research groups in the study of host-pathogen responses in the nasopharynx4-7. In the first part of the model, we use a clinical isolate of S. pneumoniae to establish a self-limiting bacterial colonization that is similar to carriage events in human adults. The procedure detailed herein involves preparation of a bacterial inoculum, followed by the establishment of a colonization event through delivery of the inoculum via an intranasal route of administration. Resident macrophages are the predominant cell type in the nasopharynx during the steady state. Typically, there are few lymphocytes present in uninfected mice8, however mucosal colonization will lead to low- to high-grade inflammation (depending on the virulence of the bacterial species and strain) that will result in an immune response and the subsequent recruitment of host immune cells. These cells can be isolated by a lavage of the tracheal contents through the nares, and correlated to the density of colonization bacteria to better understand the kinetics of the infection.

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Colonization of the murine nasopharynx with Streptococcus pneumoniae and the subsequent extraction of adherent or recruited cells is described. This technique involves flushing the nasopharynx and collection of the fluid through the nares and is adaptable for various readouts, including differential cell quantification and analysis of mRNA expression in situ.

연쇄상 구균 폐렴으로 비강 내 식민지 화 중 염증 반응의 특성화

Nasopharyngeal colonization by Streptococcus pneumoniae is a prerequisite to invasion to the lungs or bloodstream1. This organism is capable of colonizing ...

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen presenting cell (APC) types found in a normal thymus and it is well established that they play distinct roles during thymic selection. These cells are localized in distinct microenvironments in the thymus and each APC type makes up only a minor population of cells. To further understand the biology of these cell types, characterization of these cell populations is highly desirable but due to their low frequency, isolation of any of these cell types requires an efficient and reproducible procedure. This protocol details a method to obtain cells suitable for characterization of diverse cellular properties. Thymic tissue is mechanically disrupted and after different steps of enzymatic digestion, the resulting cell suspension is enriched using a Percoll density centrifugation step. For isolation of myeloid DC (CD11c+), cells from the low-density fraction (LDF) are immunoselected by magnetic cell sorting. Enrichment of TEC populations (mTEC, cTEC) is achieved by depletion of hematopoietic (CD45hi) cells from the low-density Percoll cell fraction allowing their subsequent isolation via fluorescence activated cell sorting (FACS) using specific cell markers. The isolated cells can be used for different downstream applications.

This protocol details a method to isolate antigen presenting cells from human thymus via different steps of enzymatic digestion of the tissue followed by density centrifugation of the single cell suspension and finally magnetic and/or FACS sorting of the cell populations of interest.

인간의 흉선에서 골수 수지상 세포와 상피 세포의 분리

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote its motility and dissemination. New work has shown that proteins involved in actin-based motility are also linked to autophagy, an intracellular degradation process crucial for cell autonomous immunity. Strikingly, host cells may prevent actin-based motility of S. flexneri by compartmentalizing bacteria inside &#8216;septin cages&#8217; and targeting them to autophagy. These observations indicate that a more complete understanding of septins, a family of filamentous GTP-binding proteins, will provide new insights into the process of autophagy. This report describes protocols to monitor autophagy-cytoskeleton interactions caused by S. flexneri in vitro using tissue culture cells and in vivo using zebrafish larvae. These protocols enable investigation of intracellular mechanisms that control bacterial dissemination at the molecular, cellular, and whole organism level.

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

To counteract pathogen dissemination, host cells reorganize their cytoskeleton to compartmentalize bacteria and induce autophagy. Using Shigella infection of tissue culture cells, host and pathogen determinants underlying this process are identified and characterized. Using zebrafish models of Shigella infection, the role of discovered molecules and mechanisms are investigated in vivo.

사용<em&gt; 시겔 flexneri</em&gt; 자식 작용 - 세포 뼈대의 상호 작용을 연구하는

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. typhimurium bacteria are quickly detected and phagocytized by macrophages, and contained in vesicles known as phagosomes in order to be degraded. Isolation of S. typhimurium-containing phagosomes have been widely used to study how S. typhimurium infection alters the process of phagosome maturation to prevent bacterial degradation. Classically, the isolation of bacteria-containing phagosomes has been performed by sucrose gradient centrifugation. However, this process is time-consuming, and requires specialized equipment and a certain degree of dexterity. Described here is a simple and quick method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin-streptavidin-conjugated magnetic beads. Phagosomes obtained by this method can be suspended in any buffer of choice, allowing the utilization of isolated phagosomes for a broad range of assays, such as protein, metabolite, and lipid analysis. In summary, this method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes is specific, efficient, rapid, requires minimum equipment, and is more versatile than the classical method of isolation by sucrose gradient-ultracentrifugation.

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

We describe here a simple and quick method for the isolation of Salmonella typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin and streptavidin.

살 모 넬 라 typhimurium의 절연-대 식 세포에서 Phagosomes를 포함 하

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

바이러스에 감염된 인간 장 오가노이드 단층의 칼슘 이미징

Live Calcium Imaging of Virus-Infected Human Intestinal Organoid Monolayers Using Genetically Encoded Calcium Indicators

Calcium signaling is an integral regulator of nearly every tissue. Within the intestinal epithelium, calcium is involved in the regulation of secretory activity, actin dynamics, inflammatory responses, stem cell proliferation, and many other uncharacterized cellular functions. As such, mapping calcium signaling dynamics within the intestinal epithelium can provide insight into homeostatic cellular processes and unveil unique responses to various stimuli. Human intestinal organoids (HIOs) are a high-throughput, human-derived model to study the intestinal epithelium and thus represent a useful system to investigate calcium dynamics. This paper describes a protocol to stably transduce HIOs with genetically encoded calcium indicators (GECIs), perform live fluorescence microscopy, and analyze imaging data to meaningfully characterize calcium signals. As a representative example, 3-dimensional HIOs were transduced with lentivirus to stably express GCaMP6s, a green fluorescent protein-based cytosolic GECI. The engineered HIOs were then dispersed into a single-cell suspension and seeded as monolayers. After differentiation, the HIO monolayers were infected with rotavirus and/or treated with drugs known to stimulate a calcium response. An epifluorescence microscope fitted with a temperature-controlled, humidified live-imaging chamber allowed for long-term imaging of infected or drug-treated monolayers. Following imaging, acquired images were analyzed using the freely available analysis software, ImageJ. Overall, this work establishes an adaptable pipeline for characterizing cellular signaling in HIOs.

저자 스포트라이트: 장 상피 신호의 바이러스 파괴 조사 – 연구 통찰력 및 향후 방향 

This protocol describes an approach for performing calcium imaging in virus-infected human intestinal organoids and offers an approach to analysis.

유전적으로 인코딩된 칼슘 지표를 사용한 바이러스 감염 인간 장 오가노이드 단층의 라이브 칼슘 이미징

Calcium signaling is an integral regulator of nearly every tissue. Within the intestinal epithelium, calcium is involved in the regulation of secretory ...

상피 세포의 Shigella 감염 동안 캘리포니아^{2 +} 응답 이미징

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마우스의 응용은 M 세포에 의해 박테리아 이해를 평가하는 Peyer의 패치 장 루프 분석 출혈도 잡았

기능 및 분자 연구 기본 손쥐 유형 II 폐포 상피 세포의 흐름 Cytometric 절연

액포 파열의 단일 세포 측정은 세포 내 병원균에 의해 발생

연쇄상 구균 폐렴으로 비강 내 식민지 화 중 염증 반응의 특성화

인간의 흉선에서 골수 수지상 세포와 상피 세포의 분리

사용

살 모 넬 라 typhimurium의 절연-대 식 세포에서 Phagosomes를 포함 하

유전적으로 인코딩된 칼슘 지표를 사용한 바이러스 감염 인간 장 오가노이드 단층의 라이브 칼슘 이미징

유전적으로 인코딩된 칼슘 지표를 사용한 바이러스 감염 인간 장 오가노이드 단층의 라이브 칼슘 이미징

유전적으로 인코딩된 칼슘 지표를 사용한 바이러스 감염 인간 장 오가노이드 단층의 라이브 칼슘 이미징