이 작품은 NIH 보조금 R00 CA160574 (SFB)으로하고 (SMM에) 럿 거스 생명 공학 교육 프로그램의 교제에 의해 지원됩니다.

이 절차는 럿 거스에서 기관 동물 관리 및 사용위원회, 뉴저지 주립 대학에 의해 승인되었습니다. 마우스는 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 NIH 가이드에 따라 처리 하였다. 과학자들은 설립 승인 지침은 자신의 국가 및 기관 동물 조직을 문의해야합니다. 시작하기 전에 표 1에 나와있는 솔루션을 준비합니다. 1 B 세포의 분리 및 활성화 경추 탈구이어서 CO 2를 사용하여 마우스를 안락사. 몸의 왼쪽면이 위로 오도록 마우스를 위치시키고 모피에 습기가 될 때까지 70 % 에탄올로 마우스를 스프레이. 2 ML 세척 버퍼를 가지는 35mm 조직 배양 접시에 비장과 장소를 해부하다. 층류 후드에서 조심스럽게 5 ㎖ 주사기의 평평한 단부를 이용하여 조직 배양 접시에 비장을 분쇄. <ol><li> 50에 70 μm의 나일론 메쉬 삽입ML 튜브 및 나일론 메쉬로 2 ml의 세척 완충액에서 비장 샘플을 전송. 조심스럽게 주사기의 평평한 끝 부분을 사용하여 메쉬에서 비장을 방해. </li><li> 세척 버퍼의 8 mL를 주사기의 뒷면 35mm 판을 씻어 70 μm의 나일론 메쉬를 필터링 할 수 있습니다. 4 ° C에서 10 분 동안 300 XG에 원심 분리기. </li><li> 기음은 상층 액을 제거하고 ACK 용해 버퍼의 3 ㎖에 펠렛을 재현 탁합니다. 대단히 짧은 시간을 방해하고 5 분 동안 배양 아래로 간단히를 피펫. 4 ° C에서 10 분 동안 300 XG에 세척 버퍼와 원심 분리기 10 ML을 추가합니다. </li><li> 대기음 상층 액을 제거하고 세척 완충액 1 ㎖에 피펫 팅 한 후 튜브의 바닥을 터치하여 펠렛을 재현 탁하고. 항-CD43 MACS 마이크로 비즈의 50 μl를 추가하고 30 분 동안 얼음에 품어. 4 ° C에서 10 분 동안 300 XG에, 세척 버퍼의 10 ML을 추가 부드럽게 섞어 원심 분리기. 4 ° C에서 10 분 동안 300 XG에, 세척 버퍼의 10 ML을 추가 부드럽게 섞어 원심 분리기. </li><li> 설정MACS 자석에 열을 배치하여 미니-MACS 열입니다. 열 아래 표시된 15 ML 원뿔 튜브를 배치합니다. 열 세척 버퍼의 1 ML을 추가하고 15 ML 튜브를 통해 실행할 수 있습니다. </li><li> 세척 완충액 1 ㎖에 재현 탁하고 상등액을 기음. 세척 버퍼를 통해 실행 후 열에서 샘플을로드합니다. </li><li> 샘플이 칼럼을 통해 실행 된 후, 열을 씻어 1 ML 세척 버퍼를 추가합니다. 직접 15 ML 튜브에 수집 된 샘플에 세척 버퍼의 7 ML을 추가합니다. </li><li> 혈구를 사용하여 세포를 카운트. 50 ㎖의 튜브에 / 웰 5,000,000 세포에 필요한 세포의 필요한 양을 전송. 4 ° C에서 10 분 동안 300 XG에 원심 분리기. LPS 1과 부록 B 세포 배지 : 500 IL4 일 : 1000. </li><li> 상등액을 흡인하고 백만 세포 / ml의 최종 농도에 필요한 보충 된 B 세포 배지의 양을 적절한 추가. </li><li> humidifi 1,000,000 세포 / ㎖과 장소에서 세포 5 ㎖를 6 - 웰 플레이트에서 플레이트 세포37 ° C에서 에드 세포 배양 인큐베이터, 5 % CO 2. </li></ol> 2 B 세포 고정 <ol><li> 잘 (100 NG / ㎖의 최종 농도) B 세포의 5 mL를 함유하고 37 ℃에서 1 시간 배양 C에 colcemid의 50 μl를 추가합니다. 37 ° C의 물을 욕조에 Prewarm 75 밀리미터의 KCl 솔루션입니다. 레이블이 15 ML 튜브로 B 세포를 전송합니다. 4 ° C에서 10 분 동안 300 XG에 테이프와 원심 분리기와 레이블을 커버. </li><li> 튜브에 1 ㎖에 떠나는 뜨는을 기음과 피펫으로 펠렛을 재현 탁. 누르거나 소용돌이에 펄스 동안 드롭에 의해 데워진의 KCl 드롭의 5 ML을 추가합니다. </li><li> KCl을 10 ㎖를 추가하고 반전 섞는다. 15 분 동안 37 ° C의 물을 욕조에 품어. 반전 신선한 정착과 혼합 5 방울을 추가합니다. 4 ° C에서 10 분 동안 300 XG에 원심 분리기. 로 pipetting 아래로 튜브에 resuspend 펠렛 1 ML을 떠나 뜨는을 대기음. </li><li> 누르거나 보르에 펄스 동안 드롭으로 신선한 정착액 드롭의 5 ML을 추가텍스. 정착액의 추가 10 mL를 넣고 실온에서 30 분 동안 배양한다. </li><li> 4 ° C에서 10 분 동안 300 XG에 원심 분리기. 피펫 팅 튜브에 resuspend 1 ML을 떠나 뜨는을 대기음. 4 ° C에서 10 분 동안 300 XG에 신선한 정착 원심 분리기의 14 ML을 추가합니다. </li><li> 단계를 반복 2.7 두 번 더. </li><li> 신선한 정착액의 14 ML을 추가합니다. 파라 필름으로 뚜껑을 밀봉 및 -20 ° C에서 하룻밤 저장합니다. </li></ol> 중기 염색체 스프레드의 3 준비 <ol><li> 22.9 ° C 및 52 % 습도로 조절 된 환경 챔버를 설정합니다. </li><li> 원심 분리기는 4 ° C에서 10 분 동안 300 XG에서 B 세포를 고정. 대기음은 피펫 팅 튜브와에 resuspend 70 μl를 떠나 정착액. </li><li> 35 ° 각도로 습도 챔버에 표시된 슬라이드를 놓습니다. 슬라이드에 재현 탁 B 세포의 35 μl를 삭제하고 샘플 당이 슬라이드를 놓습니다. 30 분 후 슬라이드를 저장하기위한 슬라이드 습도 챔버에서 건조하도록 허용37 ° C에서 슬라이드 상자에. </li></ol> 4 텔로미어 (telomere) PNA의 FISH <ol><li> 프로브의 제조 <ol><li> 37 ° C에 대한 사전 따뜻한 탈 포름 아미드. 7 ㎕의 탈 미리 예열 포름 아미드와 텔로미어 (telomere)의 PNA 프로브의 2 μl를 혼합하고 1 시간 동안 진탕 37 ° C에서 배양한다. </li><li> 37 ° C에 대한 사전 따뜻한 FISH 마스터 믹스. 4.1.1 단계에서 혼합물에 7 ㎕를 미리 예열 FISH 마스터 믹스를 추가하고 1-3 시간 동안 37 ° C에서 배양한다. </li><li> 80 ° C에서 8 분 동안 프로브 혼합물을 변성. 37 ° C에서 1 시간 동안 프로브를 사전 어닐링. </li></ol></li><li> 염색체 슬라이드의 전처리 <ol><li> 수조에서 37 ° C로 0.01 M 염산 50 ㎖를 포함하는 유리 슬라이드 염색 항아리를 미리 따뜻하게. </li><li> 실온에서 5 분 동안 2X SSC를 포함하는 다른 유리 슬라이드 오염성 항아리에 도시 슬라이드. </li><li> 예열 유리 슬라이드 염색 항아리에 펩신 주식의 2 μl를 추가하고 반전 섞는다. 이 유리 SL에 슬라이드로 이동IDE-염색 항아리와 37 ° C에서 90 초를 배양. </li><li> 슬라이드 떨고, 실온에서 5 분마다 1X PBS를 포함하는 다른 유리 슬라이드 염색 항아리에 배 씻으십시오. 그런 다음 떨고, 실온에서 1X PBS / MgCl2를 5 분 동안 슬라이드를 씻으십시오. </li><li> 실온에서 10 분 동안 갓 제조 한 1 % 포름 알데히드 / PBS 1X / MgCl2를 함유 유리 슬라이드 오염성 항아리에 슬라이드를 이동. </li><li> 떨고, 실온에서 1X PBS를 포함하는 다른 유리 슬라이드 염색 항아리에 5 분 동안 슬라이드를 씻으십시오. </li><li> 70 %, 90 %, 및 100 % 에탄올을 함유하는 별도의 유리 슬라이드 염색 단지를 구비하여 탈수 에탄올 시리즈를 준비한다. </li><li> 다음, 70 % 에탄올, 90 % 에탄올을 100 % 에탄올로 시작하여 3 분 동안 각 항아리에 슬라이드를 이동. 완료되면 -20 ° C에서 에탄올 항아리를 놓습니다. </li><li> 종이 타월로 여분의 에탄올을 눌러과 35 ° 각도로 슬라이드를 지탱하여 건조 공기 슬라이드를 허용합니다. 일단 건조, mA다이아몬드 펜을 사용하여 슬라이드의 뒷면에 혼성화 18 X 18mm 영역 애먹. </li></ol></li><li> 물고기를 슬라이드의 변성 <ol><li> 24 X 60mm coverslip에 120 ㎕의 70 % 탈 포름 아미드 / 2X SSC를 적용합니다. 커버 슬립에 슬라이드를 터치합니다. 90 초 동안 핫 플레이트에서 80 ° C에서 슬라이드를 변성. </li><li> 신속하고 신중하게 커버 슬립을 밀어 넣고 3 분 동안 90 % 에탄올 다음 3 분, 100 % 에탄올 각 얼음 차가운 70 % 에탄올에 슬라이드를 배치합니다. 건조 공기 슬라이드를 허용합니다. </li><li> 꽉 뚜껑 젖은 휴지와 플라스틱 상자를 안감으로 습기 챔버를 준비합니다. 용지에 습기가 될 수 있지만 물과 포화 안된다. </li><li> 습기 챔버에서 슬라이드에 표시된 부분에 단계 4.1.3에서 사전 열처리 프로브 믹스를 적용 18 X 18mm 커버 슬립 커버와 1 시간 동안 37 ° C에서 배양한다. </li></ol></li><li> 후 배양 세척 <ol><li> 사전 따뜻한 50 % 포름 아미드 / 2X SSC, 1X SSC, 그리고 4 배 SSC / 0.1 % 트윈 20 45 °에서; C 물 목욕. </li><li> 조심스럽게 된 커버를 제거하고 어둠과 흔들림에 미리 예열 50 % 포름 아미드 / 2 배 SSC 3xfor 5 분에 각각의 슬라이드를 씻으십시오. 떨고 3xfor 5 분 미리 예열 1X SSC에 각각 슬라이드를 씻으십시오. 마지막으로, 예열 배 SSC에서 슬라이드를 씻어 / 0.1 % 트윈 20 3xfor 5 분 각을. </li><li> 빛 보호 유리 슬라이드 염색 항아리에 DAPI에서 3 분 동안 슬라이드를 얼룩. </li><li> 흔들리는 배 SSC에서 5 분 동안 슬라이드를 씻으십시오. 24 X 60mm의 커버 슬립 커버, Mowiol 장착 매체의 35 μl를 적용하고 4 ° C에서 슬라이드를 저장합니다. </li></ol></li></ol> 염색체의 5 현미경 분석 <ol><li> 표준 에피 형광 현미경을 사용하여 중기 슬라이드를 분석한다. 최상의 결과를 얻기 위해 이러한 MetaSystems Metafer 플랫폼으로 자동 스테이지 이미징 플랫폼을 사용한다. DAPI 형광이 염색체를 시각화하기 위해 각각의 중기 스프레드를 들어, 하나의 이미지를 수집하고, 텔로미어 (P)으로부터 형광 신호에 대한 하나의 이미지가운. (예를 들어, Cy3- 다른 루어를 사용할 수 있으며 잘 동일하게 작동합니다.) </li><li> 이미지 분석 프로그램과 영상을 오버레이 분석. </li></ol>

<ol>
	<li>Sancar, A., Lindsey-Boltz, L. A., Unsal-Kacmaz, K., Linn, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+mammalian+DNA+repair+and+the+DNA+damage+checkpoints.">Molecular mechanisms of mammalian DNA repair and the DNA damage checkpoints.</a> Ann Rev Biochem. 73, 39-85 (2004).</li><li>Sperka, T., Wang, J., Rudolph, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+checkpoints+in+stem+cells,+ageing+and+cancer.">DNA damage checkpoints in stem cells, ageing and cancer.</a> Nature reviews Mol Cell Biol. 13 (9), 579-590 (2012).</li><li>Alexandrov, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signatures+of+mutational+processes+in+human+cancer.">Signatures of mutational processes in human cancer.</a> Nature. 500 (7463), 415-421 (2013).</li><li>Bunting, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=53BP1+inhibits+homologous+recombination+in+Brca1-deficient+cells+by+blocking+resection+of+DNA+breaks.">53BP1 inhibits homologous recombination in Brca1-deficient cells by blocking resection of DNA breaks.</a> Cell. 141 (2), 243-254 (2010).</li><li>Padilla-Nash, H. M., Barenboim-Stapleton, L., Difilippantonio, M. J., Ried, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectral+karyotyping+analysis+of+human+and+mouse+chromosomes.">Spectral karyotyping analysis of human and mouse chromosomes.</a> Nat Protoc. 1 (6), 3129-3142 (2006).</li><li>Callen, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+IgH-TCRalpha/delta+translocations+in+T+lymphocytes+mediated+by+RAG.">Chimeric IgH-TCRalpha/delta translocations in T lymphocytes mediated by RAG.</a> Cell Cycle. 8 (15), 2408-2412 (2009).</li><li>Boboila, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+end-joining+catalyzes+robust+IgH+locus+deletions+and+translocations+in+the+combined+absence+of+ligase+4+and+Ku70.">Alternative end-joining catalyzes robust IgH locus deletions and translocations in the combined absence of ligase 4 and Ku70.</a> Natl Acad Sci USA. 107 (7), 3034-3039 (2010).</li><li>Benn, P., Delach, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+lymphocyte+culture+and+chromosome+analysis.">Human lymphocyte culture and chromosome analysis.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2008, (2008).</li><li>Nguyen, H. 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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+aberrations+involving+telomeres+and+interstitial+telomeric+sequences.">Chromosomal aberrations involving telomeres and interstitial telomeric sequences.</a> Mutagenesis. 27 (1), 1-15 (2012).</li><li>Bolzan, A. D., Telomeres Bianchi, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=interstitial+telomeric+repeat+sequences+and+chromosomal+aberrations.">interstitial telomeric repeat sequences and chromosomal aberrations.</a> Mutat Res. 612 (3), 189-214 (2006).</li><li>Poon, S. S., Lansdorp, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+18.">Chapter 18.</a> Quantitative fluorescence in situ hybridization (Q-FISH). Unit 18 14, (2001).</li><li>Morales, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=53BP1+and+p53+synergize+to+suppress+genomic+instability+and+lymphomagenesis.">53BP1 and p53 synergize to suppress genomic instability and lymphomagenesis.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 103 (9), 3310-3315 (2006).</li><li>Halaby, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic+interaction+of+Rnf8+and+p53+in+the+protection+against+genomic+instability+and+tumorigenesis.">Synergistic interaction of Rnf8 and p53 in the protection against genomic instability and tumorigenesis.</a> PLoS Genet. 9 (1), e1003259 (2013).</li></ol>

저자는 충돌하는 이해 관계가 없습니다.

활성화 된 B 림프구, 특히 유사 분열 염색체 스프레드의 제조에 적합한 반면, 다른 세포 유형 또한 사용될 수있다. T 림프구가 이들이 비장 또는 림프절로부터 정제 될 수있는, B 세포의 많은 장점을 공유 할 수 있으며, 적절한 8 분열 촉진 물질을 함유하는 배지에서의 성장에 의해 자극 될 때 높은 유사 분열 지수가 있습니다. 배아 줄기 세포 (ES 세포)도 중기 염색체 분석 구에</su...

A correction was made to: Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH.&#160;Table 1 (the list of solutions to prepare) was omitted from the Protocol section. The contents of Table 1 are as follows:
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Solution</td>
			<td>Reagents</td>
			<td>Comments</td>
			<td>Storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">B Cell Wash Buffer</td>
			<td>500 ml 1x Hanks Balanced Salt Solution</td>
			<td rowspan="3">Filter through 0.22 &#956;m stericup filtration unit</td>
			<td rowspan="3">4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml 50 &#176;C heat inactivated FCS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml 100x Pen/Strep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="8">B Cell Medium</td>
			<td>418.5 ml RPMI-1640</td>
			<td rowspan="8">Filter through 0.22 &#956;m stericup filtration unit</td>
			<td rowspan="8">4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml 50 &#176;C heat inactivated FCS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml 100x Pen/Strep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml nonessential amino acids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml sodium pyruvate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.8 ml 14.2 M 2-mercaptoethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml 1M HEPES</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixative</td>
			<td>3:1 v/v methanol/glacial acetic acid</td>
			<td></td>
			<td>Make fresh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">0.075 M KCl</td>
			<td>1.395 g KCl</td>
			<td rowspan="2"></td>
			<td rowspan="2">Room Temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 ml distilled H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">FISH Master Mix</td>
			<td>40 ml 50% Dextran sulfate</td>
			<td rowspan="3">Vortex the solution and leave in a shaking platform overnight</td>
			<td rowspan="3">Aliquot and store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 ml 20x SSC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 ml sterile distilled H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">70% Formamide/2x SSC</td>
			<td>10 ml 20x SSC</td>
			<td rowspan="3">Adjust to pH 7 with 1M HCl</td>
			<td rowspan="3">Aliquot and store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 ml distilled H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 ml deionized formamide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">0.01 M HCl</td>
			<td>1 ml 1M HCl</td>
			<td rowspan="2">Adjust to pH 2.0</td>
			<td rowspan="2">Room Temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>99 ml distilled H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">1x PBS/MgCl2</td>
			<td>50 ml 1M MgCl2</td>
			<td rowspan="2"></td>
			<td rowspan="2">Room Temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>950 ml 1x PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">50% Formamide/2x SSC</td>
			<td>20 ml 20x SSC</td>
			<td rowspan="3">Adjust to pH 7.25 
			Formamide used in this step does not have to be deionized.</td>
			<td rowspan="3">Make fresh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>80 ml distilled H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 ml formamide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">4x SSC/0.1% Tween20</td>
			<td>50 ml 20x SSC</td>
			<td rowspan="3"></td>
			<td rowspan="3">Room Temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 ml distilled H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 &#956;l Tween20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">DAPI staining solution (80 ng/ml)</td>
			<td>40 &#956;l 0.2mg/ml DAPI stock</td>
			<td rowspan="2"></td>
			<td rowspan="2">4 &#176;C in light protected staining jar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 ml 2x SSC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="5">Mowiol Mounting Medium</td>
			<td>6 g glycerol</td>
			<td rowspan="5">Incubate at 50 &#176;C with stirring for 2hrs</td>
			<td rowspan="5">Aliquot and store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.4 g Mowiol 4-88</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 ml distilled H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 ml 0.2 M TrisCl pH 8.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>230 &#956;l 1% Thimerosal (w/v in water)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Table 1. List of solutions.&#160;

A correction was made to: Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH.

Erratum: Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH

암은 정상 세포의 성장을 조절하는 유전자에 영향을 미치는 돌연변이의 축적에 의해 발생합니다. 돌연변이 DNA의 손상에 의해 야기 게놈의 구조 및 서열에 대한 변경의 결과이다. DNA 손상 등의 전리 방사선 등 외인성 제제를 포함한 프로세스의 다양한 등을 통해 발생할 수있는 등의 활성 산소 종 (1)과 접촉하여 발생하는 뉴클레오티드 염기 또는 손상의 자발적인 탈 아미 노화 정상적인 세포 대사의 부산물로서. 포유 동물 세포가 DNA 손상 또는 역방향 브레이크 사이트의 시퀀스를 복원 할 수있는 보수 활동의 범위를 갖고 있지만, 그럼에도 불구하고 돌연변이 세포의 수명에 걸쳐 축적. DNA 손상은 또한 노화 - 관련 질환과 연관된 2 개의 프로세스를 노화 및 줄기 세포의 효능의 손실에 기여할 수있다. 이 응답을 어드레스에 따라서 중앙 중요성 DNA 손상의 복구된다 이해공중 보건 ificant 문제. 증거가 증가 포유류의 DNA 복구 경로가 더욱 필수적 돌연변이 분자 수준에서의 억제에 관여하는 과정을 이해하는 데있어 암세포 3,4 게놈의 발전에 기여할 수 있음을 시사한다. 염색체 이상을 직접 시각화는 특정 세포 유형에서 게놈의 불안정성의 정도를 판정하는 강력한 양적 수단이다. 중기에서 세포로부터 연유 염색체 분리 및 광 또는 형광 현미경을 사용하여 검사 될 수있다. 이러한 유전 학적 접근은 수십 년 동안 실제로 왔고 전좌 또는 DNA 복구 활동의 손실과 관련된 염색체 이상 특정 유형의 모양을 보여주기 위해 사용될 수있다. 이 프로토콜은 몇 가지 잠재적 인 확장에 빌려 준다 : 염색체가 현장 하이브리드의 스펙트럼 핵형 (SKY) 또는 여러 가지 빛깔의 형광에 대한 프로브를 표시 할 수(mFISH)는 전좌 5,6를 식별합니다. 이러한 기술은 또한이 프로토콜 가능합니다 것 이상으로 추가 정보를 제공 염색체 전좌의 빈도와 결정 복잡한 염색체 전좌의 구조를 가능하게한다. 대안 적으로, 특정 프로브 시퀀스가 생성되고 선택된 사이트 7 게놈 DNA에서 파손의 주파수를 테스트하는데 사용될 수있다. 이 프로토콜에서는, 우리는 중기 염색체의 준비가 B 림프구에서 확산에 대해 설명합니다. 텔로미어 반복하는 형광 표지 된 펩티드 핵산 (PNA) 프로브를 효율적으로 중기 염색체에 텔로미어를 표시하는 데 사용되는이 프로토콜은 몇 가지 장점이 펼쳐집니다. B 세포는 높은 품질의 퍼짐 일관 제조 할 수 있도록 높은 유사 분열 지수 성장하도록 유도 될 수있다. 유전자 변형 마우스의 B 세포도 훨씬 덜 기여의 분석을 혼동 할 수 있습니다 차 유전 변이를 포함 할 가능성이있다게놈 무결성의 특정 유전자. PNA-FISH 방법은 하루에 완료하고, 염색체 휴식의보다 정확한 득점을 허용 할 수 있습니다. 특히 이런 프로토콜에 기재된 특정 장비와 함께,이 방법을 사용함으로써, 매우 일관된 고품질의 퍼짐을 생성하고 신속 레이트 및 게놈 불안정성의 유형을 분석 할 수있다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="679">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">Name</td>
			<td style="width:116px;">Company&#160;</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:176px;">&#160;Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50% Dextran sulfate</td>
			<td>Intergen</td>
			<td>S4030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Deionized formamide&#160;</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>9342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pepsin (5g)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P 6887&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FCS</td>
			<td>Gemini</td>
			<td>100-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LPS (100mg)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IL-4 (5&#956;g)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PNA Telomere Probe</td>
			<td>PNA Bio Inc</td>
			<td>F1002</td>
			<td>(CCCTAACCCTAACCCTAA)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Colcemid</td>
			<td>Roche</td>
			<td>295892</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mowiol 4-88</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>81381-50g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CD43 (ly-48_) micro-beads</td>
			<td>Miltenyl Biotec.&#160;</td>
			<td>130-049-801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>32670-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Eclipse E800</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AxioImager.Z2</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CDS-5 Cytogenetic Drying Chamber</td>
			<td>Thermotron</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid analysis of chromosome aberrations in mouse b lymphocytes by pna-fish

결함 DNA 수리 종양 이어질 돌연변이의 근본 원인 인 게놈 불안정성을 증가하도록 이끈다. 상이한 세포 유형에서 주파수 및 염색체 이상 유형의 분석은 DNA 복구 경로의 결함은 해명 할 수있다. 이해 포유 동물 DNA 수리 생물학이 크게 특정 유전자 녹아웃 생쥐의 생산에 도움이되고있다. 이 프로토콜의 목적은 마우스 B 림프구에서 게놈의 불안정성을 정량화하는 것이다. PNA-FISH 프로브 (펩티드 핵산 - 시츄 혼성화 형광)을 사용 텔로미어의 레이블링은 중기 염색체 스프레드 게놈 불안정성의 신속한 분석을 용이하게한다. 그들은 정상 배수성과 높은 유사 분열 인덱스를 가지고 있기 때문에 B 세포는 섬유 아세포에 비해 특정 장점을 가지고있다. B 세포의 단기 문화 따라서 적은 보조 유전자 변이를 가질 가능성이 차 세포​​ 인구에 게놈 불안정성의 정확한 측정을 가능하게일반적으로 형질 전환 된 섬유 아세포 또는 환자의 세포 라인에있는 것보다의.

하나의 셀로부터 유도 중기 염색체 (도 1a)를 (마우스의 세포를 사용하는 경우)를 함유하는 염색체 40 이산 클러스터를 형성한다. 각각의 염색체는 밝은 파란색 영역으로 표시 한 끝에서 중심 소체가 있습니다. 보통 염색체에서 텔로미어이 신호는 각 동원체 의해 염색 분체와 두 신호의 끝에서 볼 수있다. 간기 핵뿐만 아니라 슬라이드에 존재합니다. 다음은 빨간색 텔로미어 (telomere)의 ...

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Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH

DNA 수리 경로는 게놈 무결성의 유지 보수 및 예방 돌연변이 및 암 필수적이다. 이 프로토콜의 목적은 중기는 텔로미어 DNA 반복위한 원위치 혼성화 (FISH)에 형광체를 사용하여 마우스 B 세포로부터 확산에 염색체 이상을 직접 관찰하여 게놈 불안정성을 정량화하는 것이다.

PNA-FISH에 의해 마우스 B 림프구에서 염색체 이상을 신속하게 분석

Defective DNA repair leads to increased genomic instability, which is the root cause of mutations that lead to tumorigenesis. Analysis of the frequency ...

rapid-analysis-chromosome-aberrations-mouse-b-lymphocytes-pna

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

16.8K 조회수.  Rutgers, the State University of New Jersey.  DNA 수리 경로는 게놈 무결성의 유지 보수 및 예방 돌연변이 및 암 필수적이다. 이 프로토콜의 목적은 중기는 텔로미어 DNA 반복위한 원위치 혼성화 (FISH)에 형광체를 사용하여 마우스 B 세포로부터 확산에 염색체 이상을 직접 관찰하여 게놈 불안정성을 정량화하는 것이다. 

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Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in situ hybridization (FISH) for rapid culture-independent detection of Salmonella spp. Cell-charged tapes can also be placed face-down on selective agar for solid-phase enrichment prior to detection. Alternatively, low-volume liquid enrichments (liquid surface miniculture) can be performed on the surface of the tape in non-selective broth, followed by FISH and analysis via flow cytometry. To begin, sterile adhesive tape is brought into contact with fresh produce, gentle pressure is applied, and the tape is removed, physically extracting microbes present on these surfaces. Tapes are mounted sticky-side up onto glass microscope slides and the sampled cells are fixed with 10% formalin (30 min) and dehydrated using a graded ethanol series (50, 80, and 95%; 3 min each concentration). Next, cell-charged tapes are spotted with buffer containing a Salmonella-targeted DNA probe cocktail and hybridized for 15 - 30 min at 55&deg;C, followed by a brief rinse in a washing buffer to remove unbound probe. Adherent, FISH-labeled cells are then counterstained with the DNA dye 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) and results are viewed using fluorescence microscopy. For solid-phase enrichment, cell-charged tapes are placed face-down on a suitable selective agar surface and incubated to allow in situ growth of Salmonella microcolonies, followed by FISH and microscopy as described above. For liquid surface miniculture, cell-charged tapes are placed sticky side up and a silicone perfusion chamber is applied so that the tape and microscope slide form the bottom of a water-tight chamber into which a small volume (&le; 500 &mu;L) of Trypticase Soy Broth (TSB) is introduced. The inlet ports are sealed and the chambers are incubated at 35 - 37&deg;C, allowing growth-based amplification of tape-extracted microbes. Following incubation, inlet ports are unsealed, cells are detached and mixed with vigorous back and forth pipetting, harvested via centrifugation and fixed in 10% neutral buffered formalin. Finally, samples are hybridized and examined via flow cytometry to reveal the presence of Salmonella spp. As described here, our "tape-FISH" approach can provide simple and rapid sampling and detection of Salmonella on tomato surfaces. We have also used this approach for sampling other types of fresh produce, including spinach and jalape&ntilde;o peppers.

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple adhesive-tape-based approach for sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by rapid whole cell detection of Salmonella using fluorescence in situ hybridization (FISH).

접착제 테이프 기반의 샘플링 및 형광의 조합 현장에서</em의 신속한 감지를 위해> 하이브 리다이 제이션 살모넬라균 신선한 농산물에 대한

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in ...

연구

면역학 및 감염병학

Methods to Assess Beta Cell Death Mediated by Cytotoxic T Lymphocytes

Type 1 diabetes (T1D) is a T cell mediated autoimmune disease. During the pathogenesis, patients become progressively more insulinopenic as 
insulin production is lost, presumably this results from the destruction of pancreatic beta cells by T cells. Understanding the mechanisms of beta cell death during 
the development of T1D will provide insights to generate an effective cure for this disease. Cell-mediated lymphocytotoxicity (CML) assays have historically used the 
radionuclide Chromium 51 (51Cr) to label target cells. These targets are then exposed to effector cells and the release of 51Cr from target 
cells is read as an indication of lymphocyte-mediated cell death. Inhibitors of cell death result in decreased release of 51Cr.
 As effector cells, we used an activated autoreactive clonal population of CD8+ Cytotoxic T lymphocytes (CTL) isolated from a mouse stock transgenic for both the alpha and beta chains of the AI4 T cell receptor (TCR). Activated AI4 T cells were co-cultured with 51Cr labeled target NIT cells for 16 hours, release of 51Cr was recorded to calculate specific lysis 
Mitochondria participate in many important physiological events, such as energy production, regulation of signaling transduction, and apoptosis. The study of beta cell mitochondrial functional changes during the development of T1D is a novel area of research. Using the mitochondrial membrane potential dye Tetramethyl Rhodamine Methyl Ester (TMRM) and confocal microscopic live cell imaging, we monitored mitochondrial membrane potential over time in the beta cell line NIT-1. For imaging studies, effector AI4 T cells were labeled with the fluorescent nuclear staining dye Picogreen. NIT-1 cells and T cells were co-cultured in chambered coverglass and mounted on the microscope stage equipped with a live cell chamber, controlled at 37&deg;C, with 5% CO2, and humidified. During these experiments images were taken of each cluster every 3 minutes for 400 minutes.
Over a course of 400 minutes, we observed the dissipation of mitochondrial membrane potential in NIT-1 cell clusters where AI4 T cells were attached. In the simultaneous control experiment where NIT-1 cells were co-cultured with MHC mis-matched human lymphocyte Jurkat cells, mitochondrial membrane potential remained intact. This technique can be used to observe real-time changes in mitochondrial membrane potential in cells under attack of cytotoxic lymphocytes, cytokines, or other cytotoxic reagents.

Cell-mediated lymphocytotoxicity (CML) assays can be used to test autoreactive responses and study mechanisms of cell death in vitro. However, using live-cell confocal microscopic imaging techniques with fluorescent dyes, the type and kinetics of cell death as well as the pathways utilized can be studied in greater detail.

세포 독성 T Lymphocytes에 의해 베타 세포 죽음의 중재를 평가하는 방법

Type 1 diabetes (T1D) is a T cell mediated autoimmune disease.  During the pathogenesis, patients become progressively more insulinopenic as 
insulin ...

Isolation of Lymphocytes from Mouse Genital Tract Mucosa

Mucosal surfaces, including in the gastrointestinal, urogenital, and respiratory tracts, provide portals of entry for pathogens, such as viruses and bacteria 1. Mucosae are also inductive sites in the host to generate immunity against pathogens, such as the Peyers patches in the intestinal tract and the nasal-associated lymphoreticular tissue in the respiratory tract. This unique feature brings mucosal immunity as a crucial player of the host defense system. Many studies have been focused on gastrointestinal and respiratory mucosal sites. However, there has been little investigation of reproductive mucosal sites. The genital tract mucosa is the primary infection site for sexually transmitted diseases (STD), including bacterial and viral infections. STDs are one of the most critical health challenges facing the world today. Centers for Disease Control and Prevention estimates that there are 19 million new infectious every year in the United States. STDs cost the U.S. health care system $17 billion every year 2, and cost individuals even more in immediate and life-long health consequences. In order to confront this challenge, a greater understanding of reproductive mucosal immunity is needed and isolating lymphocytes is an essential component of these studies. Here, we present a method to reproducibly isolate lymphocytes from murine female genital tracts for immunological studies that can be modified for adaption to other species. The method described below is based on one mouse.&#x2003;

An efficient way to isolate lymphocytes from mouse genital tract is described. This method takes advantage of enzyme digestion and Percoll gradient separation to allow efficient isolation. This technique is also adaptable to for use in other species

마우스 성기 요로 점막에서 림프구의 분리

Mucosal surfaces, including in the gastrointestinal, urogenital, and respiratory tracts, provide portals of entry for pathogens, such as viruses and ...

Rapid and Robust Analysis of Cellular and Molecular Polarization Induced by Chemokine Signaling

Cells respond to chemokine stimulation by losing their round shape in a process called polarization, and by altering the subcellular localization of many proteins. Classic imaging techniques have been used to study these phenomena. However, they required the manual acquisition of many cells followed by time consuming quantification of the morphology and the co-localization of the staining of tens of cells. Here, a rapid and powerful method is described to study these phenomena on samples consisting of several thousands of cells using an imaging flow cytometry technology that combines the advantages of a microscope with those of a cytometer. Using T lymphocytes stimulated with CCL19 and staining for MHC Class I molecules and filamentous actin, a gating strategy is presented to measure simultaneously the degree of shape alterations and the extent of co-localization of markers that are affected by CCL19 signaling. Moreover, this gating strategy allowed us to observe the segregation of filamentous actin (at the front) and phosphorylated Ezrin-Radixin-Moesin (phospho-ERM) proteins (at the rear) in polarized T cells after CXCL12 stimulation. This technique was also useful to observe the blocking effect on polarization of two different elements: inhibition of actin polymerization by a pharmacological inhibitor and expression of mutants of the Par6/atypical PKC signaling pathway. Thus, evidence is shown that this technique is useful to analyze both morphological alterations and protein redistributions.

Chemokine signaling elicits marked alterations of cellular morphology and some important redistributions of intracellular proteins. Here, a rapid and detailed protocol is provided to study these events.

케모카인 시그널링에 의해 유도 된 세포 및 분자 양극화의 신속하고 강력한 분석

Cells respond to chemokine stimulation by losing their round shape in a process called polarization, and by altering the subcellular localization of many ...

Detection of True IgE-expressing Mouse B Lineage Cells

B lymphocyte immunoglobulin heavy chain (IgH) class switch recombination (CSR) is a process wherein initially expressed IgM switches to other IgH isotypes, such as IgA, IgE and IgG. Measurement of IgH CSR in vitro is a key method for the study of a number of biologic processes ranging from DNA recombination and repair to aspects of molecular and cellular immunology. In vitro CSR assay involves the flow cytometric measurement surface Ig expression on activated B cells. While measurement of IgA and IgG subclasses is straightforward, measurement of IgE by this method is problematic due to soluble IgE binding to Fc&#949;RII/CD23 expressed on the surface of activated B cells. Here we describe a unique procedure for accurate measurement of IgE-producing mouse B cells that have undergone CSR in culture. The method is based on trypsin-mediated cleavage of IgE-CD23 complexes on cell surfaces, allowing for detection of IgE-producing B lineage cells by cytoplasmic staining. This procedure offers a convenient solution for flow cytometric analysis of CSR to IgE.

In vitro analysis of class switch recombination in mice is challenging due to cytophilic IgE molecules bound to Fc receptors on the surface of B cells. We describe a method for IgE detection using trypsin-mediated cleavage of surface-bound IgE prior to fixation and permeabilization for cytoplasmic fluorescence staining.

진정한 검출 마우스 B 리니지 세포를 IgE 항체가 발현

B lymphocyte immunoglobulin heavy chain (IgH) class switch recombination (CSR) is a process wherein initially expressed IgM switches to other IgH ...

A Simple and Rapid Protocol to Non-enzymatically Dissociate Fresh Human Tissues for the Analysis of Infiltrating Lymphocytes

The ability of malignant cells to evade the immune system, characterized by tumor escape from both innate and adaptive immune responses, is now accepted as an important hallmark of cancer. Our research on breast cancer focuses on the active role that tumor infiltrating lymphocytes play in tumor progression and patient outcome. Toward this goal, we developed a methodology for the rapid isolation of intact lymphoid cells from normal and abnormal tissues in an effort to evaluate them proximate to their native state. Homogenates prepared using a mechanical dissociator show both increased viability and cell recovery while preserving surface receptor expression compared to enzyme-digested tissues. Furthermore, enzymatic digestion of the remaining insoluble material did not recover additional CD45+ cells indicating that quantitative and qualitative measurements in the primary homogenate likely genuinely reflect infiltrating subpopulations in the tissue fragment. The lymphoid cells in these homogenates can be easily characterized using immunological (phenotype, proliferation, etc.) or molecular (DNA, RNA and/or protein) approaches. CD45+ cells can also be used for subpopulation purification, in vitro expansion or cryopreservation. An additional benefit of this approach is that the primary tissue supernatant from the homogenates can be used to characterize and compare cytokines, chemokines, immunoglobulins and antigens present in normal and malignant tissues. This protocol functions extremely well for human breast tissues and should be applicable to a wide variety of normal and abnormal tissues.

This protocol describes the rapid non-enzymatic dissociation of fresh human tissue fragments for qualitative and quantitative assessment of CD45+ cells (lymphocytes/leukocytes) present in various normal and malignant human tissues. Additionally, the supernatant obtained from the primary tissue homogenate can be collected and stored for further analysis or experimentation.

침투 림프구의 분석을위한 비 효소 해리 신선한 인간의 조직에 대한 간단하고 빠른 프로토콜

The ability of malignant cells to evade the immune system, characterized by tumor escape from both innate and adaptive immune responses, is now accepted ...

Efficient Isolation Protocol for B and T Lymphocytes from Human Palatine Tonsils

Tonsils form a part of the immune system providing the first line of defense against inhaled pathogens. Usually the term &#8220;tonsils&#8221; refers to the palatine tonsils situated at the lateral walls of the oral part of the pharynx. Surgically removed palatine tonsils provide a convenient accessible source of B and T lymphocytes to study the interplay between foreign pathogens and the host immune system. This video protocol describes the dissection and processing of surgically removed human palatine tonsils, followed by the isolation of the individual B and T cell populations from the same tissue sample. We present a method, which efficiently separates tonsillar B and T lymphocytes using an antibody-dependent affinity protocol. Further, we use the method to demonstrate that human adenovirus infects specifically the tonsillar T cell fraction. The established protocol is generally applicable to efficiently and rapidly isolate tonsillar B and T cell populations to study the role of different types of pathogens in tonsillar immune responses.

Palatine tonsils are a rich source of B and T lymphocytes. Here we provide an easy, efficient and rapid protocol to isolate B and T lymphocytes from human palatine tonsils. The method described has been specifically adapted for studies of the viral etiology of tonsil inflammation known as tonsillitis.

인간 팔라티노 편도선에서 B와 T 림프구에 대한 효율적인 분리 프로토콜

Tonsils form a part of the immune system providing the first line of defense against inhaled pathogens. Usually the term &#8220;tonsils&#8221; refers to ...

Rapid Molecular Detection and Differentiation of Influenza Viruses A and B

Influenza is a contagious respiratory illness caused by influenza viruses A and B in humans and causes a significant amount of morbidity and mortality every year. The Influenza A and B assay was the first CLIA-waived molecular rapid flu test available. The Influenza A and B test works by employing isothermal amplification with influenza-specific primers followed by target detection with molecular beacon probes. Here, the performance of the Influenza A and B assay on frozen, archived nasopharyngeal swab (NPS) specimens stored in viral transport medium (VTM) were compared to a respiratory panel assay.
The performance of the Influenza A and B assay was evaluated by comparing the results to the respiratory panel reference method. The sensitivity for total influenza virus A was 67.5% (95% CI (CI), 56.6-78.5) and the specificity was 86.9% (CI, 71.0-100). For influenza virus B testing, the sensitivity and specificity were 90.2% (CI, 68.5-100) and 98.8% (CI, 68.5-100), respectively.
This system has the advantage of a significantly shorter test time than any other currently available molecular assay and the simple, pipette-free procedure runs on a fully integrated, closed, small-footprint system. Overall, the Influenza A and B assay evaluated in this study has the potential to serve as a point-of-care rapid influenza diagnostic test.

We describe a rapid, molecular-based Influenza A and B assay. The Influenza assay detects each target within 15 min by employing isothermal amplification with influenza-specific primers followed by target detection with molecular beacon probes. The Influenza A and B assay is user-friendly and required minimal hands-on time to perform.

빠른 분자 탐지 및 인플루엔자 바이러스 A와 B의 차별화

Influenza is a contagious respiratory illness caused by influenza viruses A and B in humans and causes a significant amount of morbidity and mortality ...

Molecular Diffusion in Plasma Membranes of Primary Lymphocytes Measured by Fluorescence Correlation Spectroscopy

Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is a powerful technique for studying the diffusion of molecules within biological membranes with high spatial and temporal resolution. FCS can quantify the molecular concentration and diffusion coefficient of fluorescently labeled molecules in the cell membrane. This technique has the ability to explore the molecular diffusion characteristics of molecules in the plasma membrane of immune cells in steady state (i.e., without processes affecting the result during the actual measurement time). FCS is suitable for studying the diffusion of proteins that are expressed at levels typical for most endogenous proteins. Here, a straightforward and robust method to determine the diffusion rate of cell membrane proteins on primary lymphocytes is demonstrated. An effective way to perform measurements on antibody-stained live cells and commonly occurring observations after acquisition are described. The recent advancements in the development of photo-stable fluorescent dyes can be utilized by conjugating the antibodies of interest to appropriate dyes that do not bleach extensively during the measurements. Additionally, this allows for the detection of slowly diffusing entities, which is a common feature of proteins expressed in cell membranes. The analysis procedure to extract molecular concentration and diffusion parameters from the generated autocorrelation curves is highlighted. In summary, a basic protocol for FCS measurements is provided; it can be followed by immunologists with an understanding of confocal microscopy but with no other previous experience of techniques for measuring dynamic parameters, such as molecular diffusion rates.

A method to measure protein diffusion in membranes of primary immune cells using fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is described. In this paper, the use of antibodies for fluorescent labeling is illustrated.

형광 상관 분광학에 의해 측정 된 차 림프구의 플라즈마 막 분자 확산

Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is a powerful technique for studying the diffusion of molecules within biological membranes with high spatial ...

Rapid Quantification of Mitogen-induced Blastogenesis in T Lymphocytes for Identifying Immunomodulatory Drugs

Lymphocyte proliferation in response to antigenic or mitogenic stimulation is a readily quantifiable phenomenon useful for testing immunomodulatory (i.e., immunosuppressive or immunostimulatory) chemical compounds and biologics. One of the earliest steps during mitogenesis is cell enlargement or blastogenic transformation, whereupon the cell volume increases before division. It is usually detectable in the first several hours of T-lymphocyte stimulation. Here, we describe a rapid method to quantify blastogenesis in T lymphocytes isolated from mouse spleens and human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) using an automated cell counter. Various commonly used proliferation assays for the most part are laborious and only reflect the overall population effect rather than individual cellular effects within a population. In contrast, the presented automated cell counter assay provides rapid, direct, and precise measurements of cell diameters that can be used for assessing the effectiveness of various mitogens and immunomodulatory drugs in vitro.

T-lymphocyte mitogenesis is accompanied by blastogenic transformation, whereupon the cell volume enlarges before cell division. Here, we describe a method to quantify blastogenesis in T lymphocytes using an automated cell counter with the capability of measuring cell diameters.

면역 마약 식별을위한 T 림프구에서 미토 겐 유도 블라스의 신속한 정량

Lymphocyte proliferation in response to antigenic or mitogenic stimulation is a readily quantifiable phenomenon useful for testing immunomodulatory (i.e., ...