패치 클램프 레코딩은 뉴런 활성화를 제어하는 이온 채널의 생체 물리학적 특성을 조사하는 데 매우 유용한 기술이다.

절차는 하나 이상의 이온 채널을 포함하는 막의 작은 "패치"를 격리하기 위해 세포에 대한 유리 마이크로 파이프를 누르는 것을 포함한다.

실험 용 설정은 과학자들이 세포막 전반에 걸쳐 전압을 정밀하게 제어하여 패치 된 영역의 전기 환경을 "클램핑"할 수 있게해 주며, 이온 채널에 따라 멤브레인을 통한 이온의 흐름에 영향을 미치고 이러한 채널에 대한 복잡한 연구를 허용합니다.

이 비디오에서는 패치 클램프 기술의 원리에 대한 개요, 실험을 실행하는 데 필요한 단계에 대한 설명 및 마지막으로 이 메서드의 응용 프로그램 중 일부를 제공합니다.

먼저 패치 클램프 레코딩의 원리를 살펴보겠습니다.

뉴런 내부의 양수 및 음전하 이온의 수는 외부에서 발견되는 수와 다릅니다.

이러한 불균형은 약 -70mV의 전압 차이 또는 멤브레인 전위를 생성하므로 내부가 외부보다 더 부정적입니다.

이온 채널은 본질적으로 전류인 세포막을 가로지르는 이온의 움직임을 제어하여 그라데이션을 유지하는 데 도움이 됩니다.

패치 클램프 기술을 사용하여 과학자들은 잠재력과 전류의 특성에 대해 질문합니다.

패치 클램프 리그에는 전압 및 전류 측정을 위한 이온 용액과 염소 처리된 은전극이 모두 포함된 유리 마이크로파이펫이 포함되어 있습니다.

마이크로피펫의 끝은 작은 멤브레인 영역을 둘러싸고 있는 광택이 있는 하나의 미크론 개구부를 가지고 있습니다.

목욕 용액 내의 이온에서 배경 잡음을 제거하기 위해 파이펫과 멤브레인 패치 사이에 고저항 씰이 형성됩니다. 물개 저항은 기가움 범위에 있기 때문에 기가움 씰로 알려져 있습니다.

파이펫 내의 전극은 플라즈마 멤브레인의 채널을 통해 이온의 이동의 결과인 전류 및 전압 변동을 증폭시킬 수 있는 증폭기와 연결되어 있습니다.

앰프를 사용하면 과학자들은 특정 전압에서 멤브레인 전위를 클램프하거나 인위적으로 설정할 수 있습니다.

증폭기는 전압을 일정하게 유지하기 위해 은 전극을 통해 얼마나 많은 전류를 추가해야 하는지 조절합니다.

특정 전압에서 서로 다른 전압 게이트 이온 채널이 열리기 때문에 개구부 이벤트는 측정된 전류의 프로파일의 변화로 표시됩니다.

또는 과학자들은 전극을 통해 특정 전류를 강제하고 잠재적인 변화를 기록할 수 있습니다. 이 "전류 클램프" 구성 작업 잠재력을 기록할 수 있습니다.

이제 패치 클램프 구성의 다섯 가지 주요 유형을 살펴보겠습니다.

첫 번째는 마이크로 피펫이 그대로 있는 세포의 막에 밀봉되는 세포 부착 된 구성입니다.

두 번째는 마이크로피펫 내의 멤브레인이 파열되어 셀 의 내부에 대한 액세스를 제공하는 전세포 구성입니다.

세 번째는 천포 패치 구성입니다. 여기서, 항생제와 같은 화학 물질은 세포솔에 대한 접근을 제공하는 막에 작은 구멍을 만들기 위해 마이크로 피펫에 첨가된다.

네 번째 구성은 내부 패치입니다. 이를 달성하기 위해 마이크로 피펫은 먼저 셀로 씰을 형성한 다음 신속하게 다시 당겨 멤브레인 조각을 찢어 내고 내부 표면을 목욕 용액에 노출시킵니다.

이를 통해 채널의 세포질 면이 목욕에 적용되는 다른 화학 물질에 노출될 수 있습니다.

마지막으로 내부 아웃과 마찬가지로 외부 패치는 전체 셀 구성으로 시작됩니다. 마이크로피펫은 멤브레인 조각이 끝을 가로질러 볼록한 씰을 형성할 때까지 천천히 철회됩니다.

이 설정에서, 채널의 세포 외 얼굴은 실험 적 치료에 노출 될 수있다.

이제 원칙을 검토한 후 패치 클램프 레코딩을 수행하는 데 필요한 단계를 살펴보겠습니다.

먼저 피펫 풀러를 사용하여 보로실리케이트 유리 튜브를 마이크로파이펫으로 끌어들이는 것으로 시작합니다.

다음으로, 화재는 적절한 직경과 저항을 얻기 위해 팁을 연마.

연마 후 마이크로파이프를 이온 용액으로 채우고 부드럽게 움직여 기포를 빼냅니다.

그런 다음 마이크로 피펫을 홀더에 부착된 전극 위로 밀어 붙입니다.

부착되면 주사기를 사용하여 파이펫에 양압을 적용하여 다른 솔루션이 팁에 들어가지 못하게 합니다.

지금, 현미경 단계에 관심있는 세포 또는 조직을 놓고 세포쪽으로 마이크로 파이펫을 이동합니다.

증폭기가 테스트 전압 펄스를 생성하면 저항을 기록하여 팁이 셀에 닿으면 증가합니다.

기가옴 씰을 형성하려면 주사기를 사용하여 양수에서 음압으로 부드럽게 전환하십시오. 물개 형성은 1기가 옴보다 큰 저항의 급속한 증가를 초래할 것이다.

이제 셀 부착 된 구성이 설정되었으므로 전체 셀 구성으로 변환하고 실험을 수행합시다!

전체 세포 구성은 멤브레인이 파열 될 때입니다.

파열은 마이크로 피펫에 음의 압력을 추가하여 수행됩니다.

멤브레인이 파손되면, 세포막이 이제 검사 펄스에 의해 충전되는 커패시터역할을 하기 때문에 테스트 펄스 모양은 큰 전류 과도를 갖게 됩니다.

주어진 뉴런에서 단일 이온 채널 유형의 특성은 약리학적으로 다른 채널 유형의 활동을 차단하여 조사 될 수있다.

전압 단계 프로토콜은 전압을 일련의 다른 보유 잠재력으로 스테핑하여 불러온 이온 채널 전류를 검사하는 데 사용됩니다.

전류 전압 또는 IV 곡선은 이온 채널을 통해 흐르는 전류의 전압 의존성을 표시하고 채널이 열리거나 닫혀 있는 전압에 대한 통찰력을 제공합니다.

이제 신경 과학자들이이 기술로 무엇을 할 수 있는지 탐구하기 위해 몇 가지 응용 프로그램을 살펴 보겠습니다.

때때로, 뉴런에서 찾아낸 이온 채널은 비 세포 환경에서 공부될 수 있습니다.

여기에서 과학자는 고립된 그 채널을 공부하기 위하여 인공 지질 막에 이온 채널 단백질을 추가했습니다.

이러한 채널은 다음 실험 분자에 노출 될 수 있습니다., 고추 파생 capsaicin 같은, 채널 활동에 미치는 영향을 공부 하기 위해.

세포 외 환경에 노출되어 세포 기능에 크게 영향을 미치기 때문에 이온 채널은 우수한 약물 표적을 만듭니다. 시험 화합물이 마이크로 피펫 또는 목욕 용액에 추가될 때 패치 클램프 레코딩을 사용하여 니코틴과 같은 약물의 효과를 신경 활동에 직접 테스트할 수 있습니다. 높은 저항 씰을 형성하기 위해 음압을 적용하는 원리도 약물 선별 응용 프로그램에 대한 수많은 세포에서 동시에 기록 할 수있는 높은 처리량 장치를 구성하기 위해 적용되었습니다.

전세포 패치 클램프는 단일 세포의 자극반응을 측정하는 데 중요한 도구이다.

또한, 페어링 된 기록은 근육과 같은 흥분 가능한 대상 세포에 대한 신경 발사의 영향을 조사하는 데 사용할 수 있습니다. 이 예에서, 전세포 패치 클램프는 모터 뉴런의 발사를 자극하는 데 사용되며, 기록은 동시에 제어되는 근육 섬유에서 채취된다. 신경 흥분과 근육 활동 사이의 명확한 관계가 관찰됩니다.

실험 실행의 기술과 단계를 검토한 패치 클램프 레코딩에 대한 JoVE의 소개를 방금 시청했습니다.

전압과 전류의 변화에 대한 절묘한 시간적 감도로 패치 클램프 레코딩은 채널과 뉴런의 생물 물리학을 이해하는 데 계속 도움이 될 것입니다.

시청해 주셔서 감사합니다!