저자는 주식 랩의 과거 회원을 감사드립니다 : 명나라 민 리, 캐서린 Plichta, 빅토리아 미란다 - 톰슨과 샘 규 김이 프로토콜의 많은 개선에 대한 그들의 공헌. 이 작품은 SP 주식에 대한 국립 과학 재단 보조금 IOS-0840932 및 IOS-0724978에 의해 부분적으로 투자되었다

자신의 Symboitic 박테리아와 곤충 병원성 선충의 1 생체 양육 <ol><li> 100 × 15mm 플라스틱 페트리 접시 전환과 접시의 뚜껑에 종이 필터 (90mm)의 두 디스크를 넣습니다. </li><li> 균등 여과지에 (1,000-2,000 IJ / ㎖의 농도에서) IJ (감염성 유하) 현탁액 1 ㎖를 분산. 참고 : IJS 표면 살균 할 필요가 없습니다. </li><li> 접시에 큰 waxmoth의 갤러리아 mellonella의 10 마지막 령 유충을 추가합니다. 목표는 약 100-200 IJS / 유충을 제공하는 것이다. </li><li> 페트리 접시 (그림 1)의 바닥과 뚜껑을 덮고 페트리 접시 레이블을 지정합니다. 다음의 내용을 언급 : 선충 종 명 (알려진 경우); 코드 / 지정을 분리; 날짜 감염 트랩이 설치되었다. </li><li> 느슨하게 밀봉 된 비닐 백에 접시를 놓고 (수분을 보존하기 위해) 및 하나 실온 또는 20 ~ 25 ° C 사이의 배양기에서 어둠에 보관. 매일 요리를 확인 참고 :이 토양에 자연 감염 상태를 모방으로 어둠이 선충의 감염을 용이하게한다. </li><li> 3~5일 후, ​​수정 된 화이트 트랩 7 선충 감염의 징후와 함께 시체를 제거합니다. 참고 : 시체가 부패하는 냄새가있는 경우,이 배양에 성공하지 않은 및 / 또는 오염이 있다는 것을 표시 할 수있다. 선충과 곤충의 새로운 배치와 새로운 감염 챔버를 설정합니다. </li></ol> 자신의 공생 박테리아와 곤충 병원성 선충의 2 체외 양육 <ol><li> 간 - 신장 한천 방법 9,19 <ol><li> 작은 조각 (2cm 세 이하)로 간과 신장을 잘라 및 염화나트륨, 한천과 함께 믹서에 넣고 물 300 ㎖의 고기가 액체 펄프, 두꺼운 붙여 넣기 또는 퓨레가 될 때까지 혼합. 그런 다음, 1 L 삼각 플라스크에 혼합물을 전송합니다. </li><li> 블렌더 용기에 물을 최종 200 mL를 넣고에 남은 용지를 가만히 따르다삼각 플라스크. 121 ℃에서 15 분간 고압 증기 멸균한다. 수 고압 증기 멸균 후 한천 쏟아져 전에 터치 식입니다. 참고 :이 매체는 고기 덩어리를 가지고 경향이 있기 때문에 매체의 피펫은 사용하지 않는 것이 좋습니다. </li><li> 손 교반 또는 사이의 삼각 플라스크 소용돌이가 더 균일 한 미디어 쏟아지는 동안 5 (또는 6) cm 페트리 접시에 한천 ~ 20 ㎖에 붓고. 필요할 때까지 한천은 4 ° C에서 고화 및 저장 요리를 할 수 있도록 허용 참고 : 고기는 페트리 접시에 부어있는 큰 덩어리를 깨고 불꽃 살균 금속 주걱을 사용합니다. </li></ol></li><li> 지질 한천 방법 9,19 <ol><li> 영양 배지, 한천 및 효모 추출물을 함께 혼합하여 지질 한천 배지를 준비하고 2 L 삼각 플라스크에 섞어 붓는다. 121 ° C에서 15 분 동안 H 2 O 및 MgCl2를 • 6H 2 O와 오토 클레이브를 증류 추가. </li><li> 옥수수 기름, 옥수수 시럽 믹스의 무균 혼합을 추가하고 균일하게 기름 방울을 분산하는 것이 저어 또는 격렬하게 소용돌이합니다. <br/&gt; 참고 : UV 가교제에 필요한 볼륨을 배치하여 옥수수 기름과 시럽을 소독. 오일은 액체에 용해하지만 작은 물방울에 있는지 확인하지 않습니다. </li><li> 5 (또는 6) cm 페트리 접시에 ~ 20 ㎖의 한천을 붓고 필요할 때까지 한천은 4 ° C에서 고화 및 저장 요리를 할 수 있습니다. </li><li> 킬은 지질 한천 플레이트에 공생하는 박테리아를 원하는 및 24 ~ 48 시간 동안 28 ° C에서 번호판을 품어. 참고 : 하룻밤 (12-16 시간) LB의 하위 문화의 100 ~ 200 μl를 확산. </li><li> 일 후, 약 0.4 ml의 표면 살균 선충 현탁액 (계란 또는 감염성 청소년)의 추가와 어둠 속에서 또는 22 ± 3 ° C의 배양기에서 실온에서 번호판을 품어. 참고 :이 선충의 성장에 불리한 지나치게 습윤 환경을 만들 수 선충 현탁액의 이상 0.4 ML을 추가하지 마십시오. </li><li> 매일 문화를 모니터링합니다. 문화는 약 십이일 (그림 2)에 IJS의 새로운 세대를 생성해야한다.</li><li> 선충이 수정 된 화이트 트랩 접시 (그림 3A)의 측면을 크롤링 볼 때 한천로 아래 접시를 전송 IJS (그림 3B)를 수확 (로스코 외. 12 참조). 매체의 오염을 감소시키기 위해 층류 후드 하에서이 단계를 수행한다. </li><li> 등장에 수정 된 화이트 트랩에서 IJS를 수집하고 모든 매체 파편을 제거하기 위해 IJ 현탁액을 헹군다. 저장소 (차가운 온도 인큐베이터 또는 차가운 방에) 10 ° C에서 멸균 증류수 IJ 또는 필요한 경우 즉시 사용합니다. 참고 :이 연구의 목적에 따라 하나 공생 - 식민지 또는 aposymbiotic 선충으로 판을 시드. </li></ol></li></ol> 3 시험관 Aposymbiotic의 양육 (공생 무료) 곤충 병원성 선충 <ol><li> 10 ~ 20에게 G.를 감염 원하는 선충 종의 IJS와 mellonella 유충 (섹션 1 참조). 3 ~ 4 일 후 (이 때 IJS은 성숙한다1 세대 성인) 시체를 수집합니다. 참고 : 성숙과 종에 따라 다릅니다 계란의 적절한 수를 얻기 위해 필요한 여성의 수와 시간. 더 G.를 감염 mellonella 필요한 경우 애벌레 빠르면가 오른쪽 발달 단계에 있는지 여부를 평가하기 위해 48 시간 게시물 감염 등의 해부를 시작합니다. </li><li> 생리 식염수 (M9 버퍼 18)와 페트리 접시에 각각 개별적으로 시체를 놓습니다. 좋은 팁 집게로 머리를 잡아 당겨 시신을 해부하다. </li><li> (바람직하게는 L 자형) 미세 바늘로 여성 (내부 계란) 적어도 20은 임신을 수집하고 M9 버퍼 (그림 4A) 10 ㎖를 포함하는 시계 유리에 배치합니다. </li><li> 하기 성분을 고려하여 axenizing 용액을 준비 : 증류수 6.75 ㎖, 1.25 ㎖의 5 N NaOH를, 및 2.25 ml의 시판 표백제 용액을 3 % 차아 염소산로 희석. 참고 : 수산화 나트륨은 솔루션 장갑, 고글 기본 및 보호 적절한 다른입니다옷을 착용해야합니다. 참고 : 표백제 빛으로 감소함에 따라, 신선한 axenizing 솔루션마다를 준비합니다. axenizing 솔루션의 여러 배치를 준비하고 여러 시계 안경 계란의 표면 살균 및 수확을 수행합니다. </li><li> M9 버퍼가 완충 용액으로 시계 유리를 작성하고 피펫 버퍼를 빨아과 여성에게 적어도 세 번 씻어. 여성이 시계 유리에 남아 있는지 확인합니다. 이 단계를 두 번 더 반복합니다. </li><li> 즉시 axenizing 솔루션을 추가하고, 여성은 10 ~ 15 분 이상 더 이상이 솔루션에 남아 할 수 있습니다. (axenizing 솔루션에 저항) 계란은 그대로 유지하면서 붕괴하기 시작 선충 조직을 관찰한다. </li><li> 수동 니들 또는 메스 (도 4B, C)로 절단함으로써, 처리 속도를 높이기 위해 여성의 신체를 방해. , 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브로 피펫 팅 분해되지 않은 조직을 추가 피함으로써 알을 제거합니다. 참고 : m로 사용모든 마이크로 원심 튜브는 필요에 알을 수집하고 난의 생존력이 axenizing 용액에 노출 장기간에 걸쳐 감소하는 바와 같이, 빨리 작동한다. </li><li> &quot;고속 설정&quot;을 사용하여 15 초 동안 소용돌이 튜브는 또한 계란에 부착 된 선충 조직을 제거합니다. 소용돌이를 사용할 수없는 경우 또는 최대 피펫 용액을 여러 번 다운. </li><li> 약 18,000g 2 분 동안 원심 분리하여 펠렛 계란입니다. 계란이 충분히 펠렛을하지 않으면 속도를 높입니다. axenizing 솔루션을 제거하고 1 분 동안 900 XG에 멸균 증류수와 원심 분리기를 한 번 더 microcentrifuge 관을 작성하여 두 번 헹군다. </li><li> 마지막 세척 후, 멸균 증류수 300 ~ 500 ㎕의 계란을 재현 탁하고 멸균 3cm 페트리 접시 또는 멸균 시계 유리에 배치합니다. 계란은 이제 표면 살균 것을 기억하십시오, 그래서 계란의 청결을 유지하기 위해 멸균 피펫 및 / 또는 pippetter 팁과 물을 사용합니다. </li><li>그들은 (그림 4D) 그대로 확인 해부 현미경 (30-50X 배율)에서 계란을 검사 및 간 - 신장 한천 5cm 플레이트로 전송 (2.1 절 참조) 참고 :이 한천이 과도하게 젖은 것 같은 접시에 계란 서스펜션의 400 개 이상의 μl를 추가하지 마십시오. </li><li> 해당 정보를 라벨 판과 28 ° C에서 어둠 속에서 수직으로 저장합니다. 계란의 부화하는 것은 분명 밤새도록해야한다. 참고 : 물이 접시의 뚜껑에 응축 할 수 있지만 1 ~ 2 일 후 증발됩니다. 이 때, 한천의 수분을 유지하고 그것의 건조를 방지하기 위해 비닐 봉지에 접시를 놓습니다. </li><li> 주기적으로 요리를 관찰하고 곰팡이 나 세균 오염의 흔적이 어떤 요리를 폐기합니다. IJS가 페트리 접시의 벽을 볼 이주되면, 뚜껑을 제거하여 흰색 변경됨 트랩 (12)과 하부 한천 접시 옮긴다. 로 변형 된 접시를 전송할 때 멸균 조건을 고려D 화이트 트랩 노출 매체의 오염을 방지한다. </li><li> 필요에 따라 화이트 트랩 및 수확 IJ 모니터링을 계속합니다. 참고 : Aposymbiotic 선충 많은 일, 심지어 주 동안 화이트 트랩의 물에 이주 할 것입니다. </li></ol>

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관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

적합한 호스트를 사용하여 EPN의 생체 양육의 성공을위한 핵심 요소이다. 일반적으로, 모두 steinernematids 및 heterorhabditids는 재현 할 수 성공적으로 더 큰 왁스 나방, 갤러리아 mellonella (나비목 : Pyralidae)의 유충에 자신의 라이프 사이클을 완료합니다. 그러나, 다른 가족 및 / 또는 명령에서 다른 종의 곤충이 고려 될 수있다. 현재 설명 선충 종의 몇몇은 특정 곤충 호스트에 대해 특이성을...

곤충 병원성 선충 (EPN) Steinernema와 Heterorhabditis 종. (Steinernematidae, Heterorhabditidae)과 세균의 공생, Xenorhabdus 및 Photorhabdus 종 (장내 세균)이 육상 동물 - 미생물의 공생 관계 2-4,6,10,19. Xenorhabdus 및 Photorhabdus 종의 응급 모델로 간주됩니다. 또한 감염 청소년 (IJ) 또는 제 3 단계 청소년 8,10,13 감염성로 알려져있는 선충의 유일한 자유 생활 단계의 장내 공생로 숨겨있다. 박테리아 - 선충 쌍 곤충의 광범위한 병원성이고 성공적 생물학적 해충 제어 및 통합 관리 프로그램 6,8 전세계에서 구현되었다. 여기에서 우리는 생체 내에서 자주 실험실 조건에서 EPN의 양육을 위해 행사 될 체외 기술에의 선택을 보여줍니다. 나는N 생체 방법은 선충의 양육에 대한 곤충 호스트를 찬찬히. 일반적으로, 다양한 곤충 주문 (즉 나비목, 딱정벌레 목, 파리목, 등.)의 미성숙 단계에 적합한 호스트로 간주됩니다. 방법은 일반적으로 실험실에서 선충 문화의 유지 보수를 위해 간주됩니다 생체 내. 선충의 대량 생산을 고려할 때이 방법은 적합하지 않을 수 있습니다. 곤충 호스트의 많은 양이 더 많은 시간과 곤충 사육에 관련된 추가 비용을 요구하고이 목적을 위해 요구 될 수있다. 곤충 병원성 선충은 여러 매체에 체외에서 배양 할 수있다. 연구의 목표에 따라 시험 관내 방법에하는 것은 미디어의 공생 박테리아의 통합을 고려하거나. 이 프레젠테이션에서는 EPN의 전파 널리 사용되는 두 가지 방법을 설명합니다. 미디어 성분 공생 박테리아 용 영양소 원을 제공차 선충에 대한 스테롤 소스. 체외 방법은 곤충 호스트없이 장점에게 EPN의 양육을 제공합니다. 적합한 곤충 호스트가 이용할 수없는 경우에 원래 개발 된 체외 미디어의 많은 EPN의 승산을 위해 사용되었다. 그러나 지난 몇 년 동안, 시험관 양육 방법이 널리 EPN과 공생 세균 (17, 19) 사이의 의존형 관계를 이해하는 것을 목표로 연구에 이용되고있다. 이 프레젠테이션에 자세히 기술은 증권 연구소, 애리조나 (투싼, AZ, USA)의 대학에서 다양한 저자에 의해 기술 및 정제에게 해당합니다. 이러한 기술은 해충 관리 목적을 위해 이들 유기체의 대량 생산에 사용되는 기술의 본체로부터 구별한다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1827">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:485px;">Material&#160;</td>
			<td style="width:260px;">Company</td>
			<td style="width:488px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:595px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:485px;"></td>
			<td style="width:260px;"></td>
			<td style="width:488px;"></td>
			<td style="width:595px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:485px;">For in vivo Infections</td>
			<td style="width:260px;"></td>
			<td style="width:488px;"></td>
			<td style="width:595px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:485px;">100 x 15 Petri Dishes</td>
			<td style="width:260px;">VWR</td>
			<td style="width:488px;">25384-088</td>
			<td style="width:595px;"></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:485px;">Filter Paper, 9 cm Grade 1 Cellulose</td>
			<td style="width:260px;">Whatman/VWR</td>
			<td style="width:488px;">28450-081</td>
			<td style="width:595px;">Grade 1 filter paper recommended</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;width:485px;">Insect hosts</td>
			<td style="width:260px;">Timberline</td>
			<td style="width:488px;">http://www.timberlinefisheries.com/ProductDetails.asp?ProductCode=WAXLG</td>
			<td style="width:595px;">Galleria mellonella are recommended</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:485px;"></td>
			<td style="width:260px;"></td>
			<td style="width:488px;"></td>
			<td style="width:595px;"></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:485px;">For Liver-Kidney Agar (for 500 ml)</td>
			<td style="width:260px;"></td>
			<td style="width:488px;"></td>
			<td style="width:595px;"></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:485px;">60 x 15 mm Petri Dishes</td>
			<td style="width:260px;">VWR</td>
			<td>25384-092</td>
			<td style="width:595px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:485px;">Beef Liver, 50 g</td>
			<td style="width:260px;">Locally sourced; butcher or supermarket</td>
			<td style="width:488px;"></td>
			<td style="width:595px;">Remaining may be stored frozen and thawed for future use</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:485px;">Beef Kidney, 50 g</td>
			<td style="width:260px;">Locally sourced; butcher or supermarket</td>
			<td style="width:488px;"></td>
			<td style="width:595px;">Remaining may be stored frozen and thawed for future use</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:485px;">Sodium Chloride 2.5g ( 0.5% final concentration )</td>
			<td style="width:260px;">Acros/VWR</td>
			<td>200002-434</td>
			<td style="width:595px;">any research grade NaCl can be used</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:485px;">Agar, 7.5 g (1.5% agar, final concentration)</td>
			<td style="width:260px;">HiMedia/VWR</td>
			<td>95026-642</td>
			<td style="width:595px;">any media grade agar can be used</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">500 ml distilled H20&#160;</td>
			<td style="width:260px;"></td>
			<td style="width:488px;"></td>
			<td style="width:595px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td style="width:260px;"></td>
			<td style="width:488px;"></td>
			<td style="width:595px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:485px;">For Lipid Agar (for 1 L)</td>
			<td style="width:260px;"></td>
			<td style="width:488px;"></td>
			<td style="width:595px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:485px;">100 x 15 Petri Dishes</td>
			<td style="width:260px;">VWR</td>
			<td>25384-088</td>
			<td style="width:595px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:485px;">Nutrient Broth, 8 g</td>
			<td style="width:260px;">BD/VWR</td>
			<td>90002-660</td>
			<td style="width:595px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:485px;">Yeast Extract, 5g</td>
			<td style="width:260px;">EMD/VWR</td>
			<td>EM1.03753.0500</td>
			<td style="width:595px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:485px;">Magnesium Chloride Hexahydrate,&#160; 10 ml (0.2g/ml)</td>
			<td style="width:260px;">EMD/VWR</td>
			<td>EM-MX0045-1</td>
			<td style="width:595px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:485px;">Corn Oil, 4 ml</td>
			<td style="width:260px;">Any brand</td>
			<td style="width:488px;">Locally source; supermarket</td>
			<td style="width:595px;">Any brand of corn oil can be used</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:485px;">Corn Syrup, 96 ml combine 7 ml corn syrup in 89 ml heated H20 and swirl for homogeneity</td>
			<td style="width:260px;">Karo</td>
			<td style="width:488px;">Locally sourced; supermarket</td>
			<td style="width:595px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agar, 15 g</td>
			<td style="width:260px;">HiMedia/VWR</td>
			<td>95026-642</td>
			<td style="width:595px;">any media grade agar can be used</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Distilled H20,890 ml</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo and in vitro rearing of entomopathogenic nematodes (steinernematidae and heterorhabditidae)

Photorhabdus가 heterorhabditids의 공생 동안 곤충 병원성 선충 (EPN) (Steinernematidae 및 Heterorhabditidae)은 장내 세균. Xenorhabdus 박테리아가 steinernematids 선충과 관련된 가족의 그람 음성 감마-Proteobacteria와 의존형 협력 관계를 가지고있다. 함께 선충 및 박테리아는 친밀하고 구체적인 협력 곤충 종의 넓은 범위를 죽이는 강력한 살충 복합체를 형성한다. 여기서, 우리는 생체 내에서 일반적 실험실 조건에서이 선충의 양육에 사용되는 체외 기법을 보여줍니다. 또한,이 기술은 EPN 문화의 성공적인 설립을위한 주요 단계를 대표하고 또한 연구에 대한 이러한 생물을 활용, 다른 생물 검정을위한 기초를 형성한다. aposymbiotic (공생 무료) 선충의 생산은 종종 공생의 연구에 대한 심층와 다각적 인 접근 방법에 대한 중요합니다. 이프로토콜은 항생 물질의 첨가를 필요로하지 않고, 표준 실험실 장비와 짧은 시간에 달성 될 수있다. 저장 영역에서의 생존율이 사용 종에 따라 다를 수 있지만,이 방법으로 제조 선충은 비교적 견고. 이 프레젠테이션에 자세히 기술은 P. 주식의 연구소, 애리조나 대학 (투싼, AZ, USA)에 의해 다양한 저자에 의해 기술과 세련된 사람들에 해당합니다. 이러한 기술은 해충 관리 목적을 위해 이들 유기체의 대량 생산에 사용되는 기술의 본체로부터 구별한다.

생체 양육 방법은 선충의 성장과 재생을위한 호스트로 살아있는 곤충을 사용합니다. 감염 챔버 곤충 IJS를 노출시키는 효율적인 방법이다. 이는 다른 하나의 곤충 호스트로부터 세균 공생을 벡터 선충의 생활주기에서 유일한 단계이다. 1 감염 챔버뿐만 아니라이 챔버를 구축하는 데 필요한 재료 설정 보여준다. 체외 사육 방법이 허용 EPN 곤충 호스트없이 성?...

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In vivo and In vitro Rearing of Entomopathogenic Nematodes Steinernematidae and Heterorhabditidae

이 프레젠테이션의 목표는 생체 내에서와 곤충 병원성 선충의 양육을위한 체외 기술에 증명하는 것입니다. 체외 방법이 풍부한 한천 미디어를 활용하는 반면, 생체 내 방법, 곤충 호스트와이 선충의 양육을 고려하십시오.

생체 내에서와 곤충 병원성 선충의 체외 양육 (Steinernematidae 및 Heterorhabditidae)

Entomopathogenic nematodes (EPN) (Steinernematidae and Heterorhabditidae) have a mutualistic partnership with Gram-negative Gamma-Proteobacteria in the ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

In vivo and In vitro Rearing of Entomopathogenic Nematodes (Steinernematidae and Heterorhabditidae)

20.4K 조회수.  University of Arizona.  이 프레젠테이션의 목표는 생체 내에서와 곤충 병원성 선충의 양육을위한 체외 기술에 증명하는 것입니다. 체외 방법이 풍부한 한천 미디어를 활용하는 반면, 생체 내 방법, 곤충 호스트와이 선충의 양육을 고려하십시오. 

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Decellularization and Recellularization of Whole Livers

The liver is a complex organ which requires constant perfusion for delivery of nutrients and oxygen and removal of waste in order to survive1. Efforts to recreate or mimic the liver microstructure with grounds up approach using tissue engineering and microfabrication techniques have not been successful so far due to this design challenge. In addition, synthetic biomaterials used to create scaffolds for liver tissue engineering applications have been limited in inducing tissue regeneration and repair in large part due to the lack of specific cell binding motifs that would induce the proper cell functions2. Decellularized native tissues such blood vessels3and skin4on the other hand have found many applications in tissue engineering, and have provided a practical solution to some of the challenges. The advantage of decellularized native matrix is that it retains, to an extent, the original composition, and the microstructure, hence enhancing cell attachment and reorganization5.
In this work we describe the methods to perform perfusion-decellularization of the liver, such that an intact liver bioscaffold that retains the structure of major blood vessels is obtained. Further, we describe methods to recellularize these bioscaffolds with adult primary hepatocytes, creating a liver graft that is functional in vitro, and has the vessel access necessary for transplantation in vivo.

Perfusion decellularization is a novel technique to produce whole liver scaffolds that retains the organ's extracellular matrix composition and microarchitecture. Herein, the method of preparing whole organ scaffolds using perfusion decellularization and subsequent repopulation with hepatocytes is described. Functional and transplantable liver grafts can be generated using this technique.

전체 간은의 Decellularization 및 Recellularization

The liver is a complex organ which requires constant perfusion for delivery of nutrients and oxygen and removal of waste in order to survive1. Efforts to ...

연구

생체공학

Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1 While microcontact printing can be employed to directly print a large number of molecules, including proteins,2 DNA,3 and silanes,4 the formation of self-assembled monolayers (SAMs) from long chain alkane thiols on gold provides a simple way to confine proteins and cells to specific patterns containing adhesive and resistant regions. This confinement can be used to control cell morphology and is useful for examining a variety of questions in protein and cell biology. Here, we describe a general method for the creation of well-defined protein patterns for cellular studies.5 This process involves three steps: the production of a patterned master using photolithography, the creation of a PDMS stamp, and microcontact printing of a gold-coated substrate. Once patterned, these cell culture substrates are capable of confining proteins and/or cells (primary cells or cell lines) to the pattern.
The use of self-assembled monolayer chemistry allows for precise control over the patterned protein/cell adhesive regions and non-adhesive regions; this cannot be achieved using direct protein stamping. Hexadecanethiol, the long chain alkane thiol used in the microcontact printing step, produces a hydrophobic surface that readily adsorbs protein from solution. The glycol-terminated thiol, used for backfilling the non-printed regions of the substrate, creates a monolayer that is resistant to protein adsorption and therefore cell growth.6 These thiol monomers produce highly structured monolayers that precisely define regions of the substrate that can support protein adsorption and cell growth. As a result, these substrates are useful for a wide variety of applications from the study of intercellular behavior7 to the creation of microelectronics.8
While other types of monolayer chemistry have been used for cell culture studies, including work from our group using trichlorosilanes to create patterns directly on glass substrates,9 patterned monolayers formed from alkane thiols on gold are straight-forward to prepare. Moreover, the monomers used for monolayer preparation are commercially available, stable, and do not require storage or handling under inert atmosphere. Patterned substrates prepared from alkane thiols can also be recycled and reused several times, maintaining cell confinement.10

Self-assembled monolayers (SAMs) formed from long chain alkane thiols on gold provide well-defined substrates for the formation of protein patterns and cell confinement. Microcontact printing of hexadecanethiol using a polydimethylsiloxane (PDMS) stamp followed by backfilling with a glycol-terminated alkane thiol monomer produces a pattern where protein and cells adsorb only to the stamped hexadecanethiol region.

단백질과 세포 교도소에 대한 2 차원 문양의 기판 만들기

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

Optical Mapping of Action Potentials and Calcium Transients in the Mouse Heart

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. Cardiovascular physiological phenotyping of the mouse heart can be easily done using fluorescence imaging employing various probes for transmembrane potential (Vm), calcium transients (CaT), and other parameters. Excitation-contraction coupling is characterized by action potential and intracellular calcium dynamics; therefore, it is critically important to map both Vm and CaT simultaneously from the same location on the heart1-4. Simultaneous optical mapping from Langendorff perfused mouse hearts has the potential to elucidate mechanisms underlying heart failure, arrhythmias, metabolic disease, and other heart diseases. Visualization of activation, conduction velocity, action potential duration, and other parameters at a myriad of sites cannot be achieved from cellular level investigation but is well solved by optical mapping1,5,6. In this paper we present the instrumentation setup and experimental conditions for simultaneous optical mapping of Vm and CaT in mouse hearts with high spatio-temporal resolution using state-of-the-art CMOS imaging technology. Consistent optical recordings obtained with this method illustrate that simultaneous optical mapping of Langendorff perfused mouse hearts is both feasible and reliable.

This paper details the dissection procedure, instrumental setup, and experimental conditions during optical mapping of transmembrane potential (Vm) and intracellular calcium transient (CaT) in intact isolated Langendorff perfused mouse hearts.

마우스 중심에 액션 후보와 칼슘 과도의 광학 매핑

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. ...

Quantification of Global Diastolic Function by Kinematic Modeling-based Analysis of Transmitral Flow via the Parametrized Diastolic Filling Formalism

Quantitative cardiac function assessment remains a challenge for physiologists and clinicians.&#160;Although historically invasive methods have comprised the only means available, the development of noninvasive imaging modalities (echocardiography, MRI, CT) having high temporal and spatial resolution provide a new window for quantitative diastolic function assessment. Echocardiography is the agreed upon standard for diastolic function assessment, but indexes in current clinical use merely utilize selected features of chamber dimension (M-mode) or blood/tissue motion (Doppler) waveforms without incorporating the physiologic causal determinants of the motion itself.&#160;The recognition that all left ventricles (LV) initiate filling by serving as mechanical suction pumps allows global diastolic function to be assessed based on laws of motion that apply to all chambers. What differentiates one heart from another are the parameters of the equation of motion that governs filling. Accordingly, development of the Parametrized Diastolic Filling (PDF) formalism&#160;has shown that the entire range of clinically observed early transmitral flow (Doppler E-wave) patterns are extremely well fit by the laws of damped oscillatory motion.&#160;This permits analysis of individual E-waves in accordance with a causal mechanism (recoil-initiated suction) that yields three (numerically) unique lumped parameters whose physiologic analogues are chamber stiffness (k), viscoelasticity/relaxation (c), and load (xo).&#160;The recording of transmitral flow (Doppler E-waves) is standard practice in clinical cardiology and, therefore, the echocardiographic recording method is only briefly reviewed. Our focus is on determination of the PDF parameters from routinely recorded E-wave data.&#160;As the highlighted results indicate, once the PDF parameters have been obtained from a suitable number of load varying E-waves, the investigator is free to use the parameters or construct indexes from the parameters (such as stored energy 1/2kxo2, maximum A-V pressure gradient kxo, load independent index of diastolic function, etc.) and select the aspect of physiology or pathophysiology to be quantified.

Accurate, causality-based quantification of global diastolic function has been achieved by kinematic modeling-based analysis of transmitral flow via the Parametrized Diastolic Filling (PDF) formalism. PDF generates unique stiffness, relaxation,&#160;and load parameters and elucidates &#39;new&#39; physiology while providing sensitive and specific indexes of dysfunction.

매개 변수화 이완기 충전 형식주의를 통해 Transmitral 흐름의 운동 학적 모델링 기반의 분석에 의하여 세계적인 이완기 기능의 정량화

Quantitative cardiac function assessment remains a challenge for physiologists and clinicians.&#160;Although historically invasive methods have comprised ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and accurate assessment of ocular toxicity in man are needed. To address this need, we have developed an eye irritation test (EIT) which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model that is based on normal human cells. The EIT is able to separate ocular&#160;irritants and corrosives (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category). The test utilizes two separate protocols, one designed for liquid chemicals and a second, similar protocol for solid test articles. The EIT prediction model uses a single exposure period (30 min for liquids, 6 hr for solids) and a single tissue viability cut-off (60.0% as determined by the MTT assay). Based on the results for 83 chemicals (44 liquids and 39 solids) EIT achieved 95.5/68.2/ and 81.8% sensitivity/specificity and accuracy (SS&#38;A) for liquids, 100.0/68.4/ and 84.6% SS&#38;A for solids, and 97.6/68.3/ and 83.1% for overall SS&#38;A. The EIT will contribute significantly to classifying the ocular irritation potential of a wide range of liquid and solid chemicals without the use of animals to meet regulatory testing requirements. The EpiOcular EIT method was implemented in 2015 into the OECD Test Guidelines as TG 492.

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

We have developed an eye irritation test which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model. The test is able to discriminate between ocular irritant and corrosive materials (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category).

복원 된 인간의 각막 모양의 상피 (RHCE) 조직 모델을 사용하여 눈에 자극성 화학 물질의 위험 식별을위한 눈 자극 시험 (EIT)

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and dampen loads in the spine. The IVD consists of a proteoglycan-rich nucleus pulposus (NP) and a collagen-rich annulus fibrosis (AF) sandwiched by cartilaginous end-plates. Together with the adjacent vertebrae, the vertebrae-IVD structure forms a functional spine unit (FSU). These microstructures contain unique cell types as well as unique extracellular matrices. Whole organ culture of the FSU preserves the native extracellular matrix, cell differentiation phenotypes, and cellular-matrix interactions. Thus, organ culture techniques are particularly useful for investigating the complex biological mechanisms of the IVD. Here, we describe a high-throughput approach for culturing whole lumbar mouse FSUs that provides an ideal platform for studying disease mechanisms and therapies for the IVD. Furthermore, we describe several applications that utilize this organ culture method to conduct further studies including contrast-enhanced microCT imaging and three-dimensional high-resolution finite element modeling of the IVD.

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

Whole organ culture of the intervertebral disc (IVD) preserves the native extracellular matrix, cell phenotypes, and cellular-matrix interactions. Here we describe an IVD culture system using mouse lumbar and caudal IVDs in their functional spinal units and several applications utilizing this system.

<em&gt; 체외</em쥐의 추간판의&gt; 장기 문화 모델

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

In the central nervous system, numerous acute injuries and neurodegenerative disorders, as well as implanted devices or biomaterials engineered to enhance function result in the same outcome: excess inflammation leads to gliosis, cytotoxicity, and/or formation of a glial scar that collectively exacerbate injury or prevent healthy recovery. With the intent of creating a system to model glial scar formation and study inflammatory processes, we have generated a 3D cell scaffold capable of housing primary cultured glial cells: microglia that regulate the foreign body response and initiate the inflammatory event, astrocytes that respond to form a fibrous scar, and oligodendrocytes that are typically vulnerable to inflammatory injury. The present work provides a detailed step-by-step method for the fabrication, culture, and microscopic characterization of a hyaluronic acid-based 3D hydrogel scaffold with encapsulated rat brain-derived glial cells. Further, protocols for characterization of cell encapsulation and the hydrogel scaffold by confocal immunofluorescence and scanning electron microscopy are demonstrated, as well as the capacity to modify the scaffold with bioactive substrates, with incorporation of a commercial basal lamina mixture to improved cell integration.

Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

Herein, we present a protocol for the 3D culture of rat brain-derived glia cells, including astrocytes, microglia, and oligodendrocytes. We demonstrate primary cell culture, methacrylated hyaluronic acid (HAMA) hydrogel synthesis, HAMAphoto-polymerization and cell encapsulation, and sample processing for confocal and scanning electron microscopic imaging.

생체 외에서 Neuroinflammation의 모델링에 대 한 기본 Glial 세포의 3 차원 하이드로 겔 문화 개선

In the central nervous system, numerous acute injuries and neurodegenerative disorders, as well as implanted devices or biomaterials engineered to enhance ...

Rigid Embedding of Fixed and Stained, Whole, Millimeter-Scale Specimens for Section-free 3D Histology by Micro-Computed Tomography

For over a hundred years, the histological study of tissues has been the gold standard for medical diagnosis because histology allows all cell types in every tissue to be identified and characterized. Our laboratory is actively working to make technological advances in X-ray micro-computed tomography (micro-CT) that will bring the diagnostic power of histology to the study of full tissue volumes at cellular resolution (i.e., an X-ray Histo-tomography modality). Toward this end, we have made targeted improvements to the sample preparation pipeline. One key optimization, and the focus of the present work, is a straightforward method for rigid embedding of fixed and stained millimeter-scale samples. Many of the published methods for sample immobilization and correlative micro-CT imaging rely on placing the samples in paraffin wax, agarose, or liquids such as alcohol. Our approach extends this work with custom procedures and the design of a 3-dimensional printable apparatus to embed the samples in an acrylic resin directly into polyimide tubing, which is relatively transparent to X-rays. Herein, sample preparation procedures are described for the samples from 0.5 to 10 mm in diameter, which would be suitable for whole zebrafish larvae and juveniles, or other animals and tissue samples of similar dimensions. As proof of concept, we have embedded the specimens from Danio, Drosophila, Daphnia, and a mouse embryo; representative images from 3-dimensional scans for three of these samples are shown. Importantly, our methodology leads to multiple benefits including rigid immobilization, long-term preservation of laboriously-created resources, and the ability to re-interrogate samples.

We developed protocols and designed a custom apparatus to enable embedding of millimeter-scale specimens. We present sample preparation procedures with an emphasis on embedding in acrylic resin and polyimide tubing to achieve rigid immobilization and long-term storage of specimens for the interrogation of tissue architecture and cell morphology by micro-CT.

엄밀한 포함의 고정 및 스테인드, 전체, 마이크로 단층에 의해 섹션-무료 3D 조직학에 대 한 밀리미터 단위 표본

For over a hundred years, the histological study of tissues has been the gold standard for medical diagnosis because histology allows all cell types in ...

Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure

Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of robust, predictive in vitro test systems is essential. Hepatic toxicology is key when considering ENM exposure, as the liver serves a vital role in metabolic homeostasis and detoxification as well as being a major site of ENM accumulation post exposure. Based upon this and the accepted understanding that 2D hepatocyte models do not accurately mimic the complexities of intricate multi-cellular interactions and metabolic activity observed in vivo, there is a greater focus on the development of physiologically relevant 3D liver models tailored for ENM hazard assessment purposes in vitro. In line with the principles of the 3Rs to replace, reduce and refine animal experimentation, a 3D HepG2 cell-line based liver model has been developed, which is a user friendly, cost effective system that can support both extended and repeated ENM exposure regimes (&#8804;14 days). These spheroid models (&#8805;500 &#181;m in diameter) retain their proliferative capacity (i.e., dividing cell models) allowing them to be coupled with the &#8216;gold standard&#8217; micronucleus assay to effectively assess genotoxicity in vitro. Their ability to report on a range of toxicological endpoints (e.g., liver function, (pro-)inflammatory response, cytotoxicity and genotoxicity) has been characterized using several ENMs across both acute (24 h) and long-term (120 h) exposure regimes. This 3D in vitro hepatic model has the capacity to be utilized for evaluating more realistic ENM exposures, thereby providing a future in vitro approach to better support ENM hazard assessment in a routine and easily accessible manner.

This procedure was established to be used for developing advanced 3D hepatic cultures in vitro, which can provide a more physiologically relevant assessment of the genotoxic hazards associated with nanomaterial exposures over both an acute or long-term, repeated dose regimes.

장기 나노 물질 노출 다음 체외 물질 독성 테스트를 위한 고급 3D 간 모델

Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of ...

An In vitro System to Gauge the Thrombolytic Efficacy of Histotripsy and a Lytic Drug

Deep vein thrombosis (DVT) is a global health concern. The primary approach to achieve vessel recanalization for critical obstructions is catheter-directed thrombolytics (CDT). To mitigate caustic side effects and the long treatment time associated with CDT, adjuvant and alternative approaches are under development. One such approach is histotripsy, a focused ultrasound therapy to ablate tissue via bubble cloud nucleation. Pre-clinical studies have demonstrated strong synergy between histotripsy and thrombolytics for clot degradation. This report outlines a benchtop method to assess the efficacy of histotripsy-aided thrombolytic therapy, or lysotripsy.
Clots manufactured from fresh human venous blood were introduced into a flow channel whose dimensions and acousto-mechanical properties mimic an iliofemoral vein. The channel was perfused with plasma and the lytic&#160;recombinant tissue-type plasminogen activator. Bubble clouds were generated in the clot with a focused ultrasound source designed for the treatment of femoral venous clots. Motorized positioners were used to translate the source focus along the clot length. At each insonation location, acoustic emissions from the bubble cloud were passively recorded, and beamformed to generate passive cavitation images. Metrics to gauge treatment efficacy included clot mass loss (overall treatment efficacy), and the concentrations of D-dimer (fibrinolysis) and hemoglobin (hemolysis) in the perfusate. There are limitations to this in vitro design, including lack of means to assess in vivo side effects or dynamic changes in flow rate as the clot lyses. Overall, the setup provides an effective method to assess the efficacy of histotripsy-based strategies to treat DVT.

Histotripsy-aided lytic delivery or lysotripsy is under development for the treatment of deep vein thrombosis. An in vitro procedure is presented here to assess the efficacy of this combination therapy. Key protocols for the clot model, image guidance, and assessment of treatment efficacy are discussed.