Name: eye irritation test (eit) for hazard identification of eye irritating chemicals using reconstructed human cornea-like epithelial (rhce) tissue model
Uploaded: 2015-08-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 13 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model at JoVE.com

저자는 EIT 프로젝트에 최선을 다하고 자신의 과학적 지원과 시간 닥터 존 Harbell에게 감사의 말씀을 전합니다. 저자는 또한 바이어스 도르프 AG (독일), IIVS (미국), 메리 케이 코리아 (미국), 에이본 프로덕츠 코리아 (미국), 프록터 &amp; 갬블 / Cosmital (스위스)의 Laboratoire 피에르 파브르 (프랑스)에 감사드립니다 할란 연구소 (영국), 및 눈 자극 시험 (15)의 멀티 센터 국제 사전 확인 및 검증 연구에 참여 LVMH Parfume (프랑스).

<ol>
	<li>National Toxicology Program (NTP) Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM). <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Request+for+Ocular+Irritancy+Test+Data+From+Human,+Rabbit,+and+In+Vitro+Studies+Using+Standardized+Testing+Methods.">Request for Ocular Irritancy Test Data From Human, Rabbit, and In Vitro Studies Using Standardized Testing Methods.</a> Federal Register. 72 (109), 31582-31583 (2007).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+(EC)+No+1907/2006+of+the+European+Parliament+and+of+the+Council+of+18+December+2006+concerning+the+Registration,+Evaluation,+Authorisation+and+Restriction+of+Chemicals+(REACH),+establishing+a+European+Chemicals+Agency,+amending+Directive+1999/45/EC+and+repealing+Council+Regulation+(EEC)+No+793/93+and+Commission+Regulation+(EC)+No+1488/94+as+well+as+Council+Directive+76/769/EEC+and+Commission+Directives+91/155/EEC,+93/67/EEC,+93/105/EC+and+2000/21/EC.">Regulation (EC) No 1907/2006 of the European Parliament and of the Council of 18 December 2006 concerning the Registration, Evaluation, Authorisation and Restriction of Chemicals (REACH), establishing a European Chemicals Agency, amending Directive 1999/45/EC and repealing Council Regulation (EEC) No 793/93 and Commission Regulation (EC) No 1488/94 as well as Council Directive 76/769/EEC and Commission Directives 91/155/EEC, 93/67/EEC, 93/105/EC and 2000/21/EC.</a> OJ. L396 (49), 1-849 (2006).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS). , (2013).</li><li>Draize, J. H., Woodard, G., Calvery, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+the+Study+of+Irritation+and+Toxicity+of+Substances+Applied+Topically+to+the+Skin+and+Mucous+Membranes.">Methods for the Study of Irritation and Toxicity of Substances Applied Topically to the Skin and Mucous Membranes.</a> J Pharmacol Exp Ther November. 82, 377-390 (1944).</li><li>Adriaens, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrospective+analysis+of+the+Draize+test+for+serious+eye+damage/eye+irritation:+importance+of+understanding+the+in+vivo+endpoints+under+UN+GHS/EU+CLP+for+the+development+and+evaluation+of+in+vitro+test+methods.">Retrospective analysis of the Draize test for serious eye damage/eye irritation: importance of understanding the in vivo endpoints under UN GHS/EU CLP for the development and evaluation of in vitro test methods.</a> Arch tox. 88, 701-723 (2014).</li><li>Balls, M., Botham, P. A., Bruner, L. H., Spielmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+EC/HO+international+validation+study+on+alternatives+to+the+Draize+eye+irritation+test.">The EC/HO international validation study on alternatives to the Draize eye irritation test.</a> Toxicol in Vitro. 9, 871-929 (1995).</li><li>Curren, R. D., Harbell, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ocular+safety:+a+silent+(in+vitro)+success+story.">Ocular safety: a silent (in vitro) success story.</a> Altern Lab Anim. 30, 69-74 (2002).</li><li>Wilhelmus, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Draize+Eye+Test.">The Draize Eye Test.</a> Survey of Ophthalmology. 45, 493-515 (2001).</li><li>Curren, R. D., Harbell, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+alternatives+for+ocular+irritation.">In vitro alternatives for ocular irritation.</a> Environ health persp. 106, 485-492 (1998).</li><li>McCain, N. E., Binetti, R. R., Gettings, S. D., Jones, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+ocular+irritation+ranges+of+market-leading+cosmetic+and+personal-care+products+using+an+in+vitro+tissue+equivalent.">Assessment of ocular irritation ranges of market-leading cosmetic and personal-care products using an in vitro tissue equivalent.</a> Toxicologist. 66, 243 (2002).</li><li>Niranjan, P., Dang, A. H., January, B. G., Gomez, C., Harbell, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+the+EpiOcular+assay+for+preclinical+qualification+of+formulas+for+human+clinical+studies.">Use of the EpiOcular assay for preclinical qualification of formulas for human clinical studies.</a> Toxicologist. 96, 249 (2007).</li><li>Yin, X. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+of+ocular+irritation+potential+of+surfactants-based+formulations+at+different+concentrations+using+the+EpiOcular+model.">Prediction of ocular irritation potential of surfactants-based formulations at different concentrations using the EpiOcular model.</a> Toxicologist. 108, 378 (2009).</li><li>Harbell, J., Curren, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+methods+for+the+prediction+of+ocular+and+dermal+toxicity.">In vitro methods for the prediction of ocular and dermal toxicity.</a> Handbook of Toxicology. , (2001).</li><li>Kaluzhny, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+EpiOcular(TM)+eye+irritation+test+for+hazard+identification+and+labelling+of+eye+irritating+chemicals+in+response+to+the+requirements+of+the+EU+cosmetics+directive+and+REACH+legislation.">Development of the EpiOcular(TM) eye irritation test for hazard identification and labelling of eye irritating chemicals in response to the requirements of the EU cosmetics directive and REACH legislation.</a> Altern Lab Anim. 39, 339-364 (2011).</li><li>Pfannenbecker, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cosmetics+Europe+Multi-Laboratory+Pre-Validation+of+the+EpiOcular+Reconstituted+Human+Tissue+Test+Method+for+the+Prediction+of+Eye+Irritation.">Cosmetics Europe Multi-Laboratory Pre-Validation of the EpiOcular Reconstituted Human Tissue Test Method for the Prediction of Eye Irritation.</a> Toxicol in vitro. , (2013).</li><li>MatTek Corporation. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> EpiOcular™ Eye Irritation Test (OCL-200-EIT) for the prediction of acute ocular irritation of chemicals for use with Reconstructed Human EpiOcular Model (OCL-200-EIT). Protocol#MK-24-007-0055. , (2014).</li><li>Kaluzhny, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EpiOcular+Eye+Irritation+Test+(EIT)+for+Hazard+Identification+and+Labeling+of+Eye+Irritating+Chemicals:+Protocol+Optimization+for+Solid+Materials+and+Extended+Shipment+Times.">EpiOcular Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification and Labeling of Eye Irritating Chemicals: Protocol Optimization for Solid Materials and Extended Shipment Times.</a> Altern Lab Anim. 43 (2), 101-127 (2015).</li><li>Kolle, S. N., Kandarova, H., Wareing, B., van Ravenzwaay, B., Landsiedel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-house+validation+of+the+EpiOcular(TM)+eye+irritation+test+and+its+combination+with+the+bovine+corneal+opacity+and+permeability+test+for+the+assessment+of+ocular+irritation.">In-house validation of the EpiOcular(TM) eye irritation test and its combination with the bovine corneal opacity and permeability test for the assessment of ocular irritation.</a> Altern Lab Anim. 39, 365-387 (2011).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstructed+Human+Cornea-like+Epithelium+(RhCE)+Test+Method+for+Identifying+Chemicals+Not+Requiring+Classification+and+Labelling+for+Eye+Irritation+or+Serious+Eye+Damage.+Draft+proposal+for+a+new+test+guideline..">Reconstructed Human Cornea-like Epithelium (RhCE) Test Method for Identifying Chemicals Not Requiring Classification and Labelling for Eye Irritation or Serious Eye Damage. Draft proposal for a new test guideline..</a> OECD Guideline for the Testing of Chemicals. , (2014).</li><li>Blazka, M. E., Harbell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+the+ocular+irritation+potential+of+54+test+articles+using+the+EpiOcular+Human+tissue+Construct+Model.">Evaluating the ocular irritation potential of 54 test articles using the EpiOcular Human tissue Construct Model.</a> Toxicol. In Vitro. , (2003).</li><li>Kandarova, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+EpiDerm+Test+Protocol+for+the+Upcoming+ECVAM+Validation+Study+on+In+Vitro+Skin+Irritation+Tests+&#8212;+An+Assessment+of+the+Performance+of+the+Optimised+Test.">The EpiDerm Test Protocol for the Upcoming ECVAM Validation Study on In Vitro Skin Irritation Tests &#8212; An Assessment of the Performance of the Optimised Test.</a> Altern Lab Anim. 33, 351-367 (2005).</li></ol>

이 기사에 대한 출판 비용은 매텍 회사가 지불했다.

우리는 EpiOcular 조직 모델을 위해 개발 된 눈 자극 시험 (그림 1)을 제시 하였다. GHS 분류 사이에 차별하지 않습니다 여기에 제시된 EIT는 민감도와 특이도 (17) EIT를 높은 수준으로 표시 (GHS 없음 카테고리)를 필요로하지 않는 물질로 안구 자극 및 부식 (GHS 분류 1과 2 결합)를 분리 할 수있다 1 종류 2 화학 물질. EIT는 분류 및 화장품 및 제약 성분을 포함한 화학 물질의 넓은 범위의 눈 자극 전위 라벨링 검증 하였다. 시험 관내 시험에서 다른과 관련하여, EIT는 생체 내 토끼 눈 자극 시험에 대한 대체 될 것입니다. EIT는 노광과 노광 후 배양 기간 (도 1)의 길이에 차이가 액체 및 고체 물질에 대해 유사하지만 구별되는 두 가지 프로토콜을 사용한다. EIT에 사용 종점이전에 검증 된 인간 상피 조직 모델 (20, 21)에 사용 된 MTT 분석에 의해 결정 조직 생존력이다. 이 분석을 수행하기 위해, 표준 세포 배양 장치 외에 특별한 장비가 필요하지 않다. 때문에 높은 조직 간 조직 재현성의 수준, N = 2 조직 대신에 일반적으로 권장 N = 3이 사용됩니다. 능력 N 사용 = 그것이 개별적인 조직 (14)의 다른 처리에 따라서 발생할 수있는 분석의 변동성을 최소화 숙련 작업자가 동시에 두 조직을 처리 할 수 보낸 두 조직은, 프로토콜의 중요한 측면이다. 또한, 양성 및 음성 대조군과 함께, 테스트 문서 당 N = 2 조직, 동일한 물리적 상태 (액체 또는 고체) 10 시험 물질의 자극성을 사용하여, 하나의 키트 (24 조직)을 사용하여 평가 될 수있다. 자료의 신뢰성 분류를 보장 다른 핵심 포인트는 양성 대조군 스와의 사양입니다bstance (조직 생존 ≤50.0 %), 중복 조직 (차이 &lt;20.0 %) 및 ​​음성 대조군 OD 수치 (&gt; 0.8 &lt;2.5) 사이의 재현성. EIT 시험을 수행 할 때 배양 기간에서 프로토콜 또는 변경에서 편차가 변경된 결과를 초래할 수 있기 때문에, 상기 검증 프로토콜과 제안 된 투여 및 세척 스케줄 (표 3 및 4)을 준수하는 것이 중요하다. 마찬가지로, MTT 배양을위한 3 시간의 시간의 편차는 다른 MTT의 수치가 발생합니다 및 분석 결과에 영향을 미칠 수 있습니다. 때때로, 시험 물질은 MTT 조직 생존 분석 또는 MTT의 원인 감소 방해 할 수있는 광학 또는 다른 특성을 가질 수있다. 예를 들어, 시험 물질은 직접 청자색 반응 생성물에 MTT를 줄일 수 있거나, MTT의 포르 마잔 (~ 570 ㎚)와 동일한 범위의 광을 흡수하는 착색 물질을 포함하는 것일 수있다. 그러나 이러한 시험 화학 물질은 홍보합니다MTT 분석시에, 충분한 양의 물질이 여전히 조직에 존재하는 (또는 흡수에 의해) 인 경우에만 문제 ESENT. 이러한 간섭을 피하기 위해, 광범위한 헹굼 절차는 EIT 프로토콜로 통합된다. TA를 제거하지 않습니다 세척 및 TA는 MTT 감소를 방해하는 경우, 추가 컨트롤이 감지하는 데 사용하고 그것에 대한 정확해야합니다. 시험 물질의 직접 MTT 환원이 의심되는 경우 간단히, 해당 화학 물질의 50 μL (또는 고체 50 mg)을 SCC (NC, 멸균 증류수 50 μL에서 작업 MTT 용액으로 3 시간 동안 인큐베이션되어 있어야 ) 동시에 실행합니다. MTT 용액 청자색 바뀌면 시험품은 MTT를 환원 한 것으로 추정된다. 이 경우, 동결 조직 살해 컨트롤을 사용하여 기능 검사는 시험 물질이 조직에 결합하고 거짓 MTT 환원 신호 선도 여부를 평가하기 위해 수행되어야한다. TA-노출, 사망 조직 관리에 상당한 MTT 감소가있는 경우(미처리 살아있는 조직의 양에 대해), 시험 제품의 평균 조직 생존력 살해 제어의 평균 생존을 감산에 의해 보정되어야한다. 위음성 분류 14,15,18의 낮은 발생 빈도에 의해 입증 된 바와 같이 EIT는 안전의 측면에 잘못한다가. 중요한 것은 눈에 부식성 및 GHS 분류 한 화학 물질, 아무도, 가장 심각한 안구 위험을 나타내는 없습니다 이 분석 14,15,18,19에 비자 극적으로 분류 하였다. 마지막으로, 시험 관내 시험 법에서 RHCE의 주요 이점 중 하나는 깔끔한 액체 (2 차원 수중 세포 배양 불가능) 고체 물질을 시험 할 가능성이있다. EIT는 UN GHS의 분류 및 표시 시스템에 따라 다양한 재료의 안구 염증 가능성을 결정하는데 크게 기여할 것이다. 동물의 교체는 O 결정큘라 독성 몇 년 동안 독성 학적 연구의 목표였다. EIT 시험 방법은 2014 년 EURL ECVAM에서 지원하는 형식적인 검증 연구를 완료하고 EpiOcular EIT는 2015 년 OECD TG 492으로 OECD 테스트 가이드 라인으로 구현되었습니다.

화장품, 세제, 가정용 청소기 등의 가전 제품은 눈에 문의 할 경우 심각한 손상을 유발시킬 수있는 화학 물질의 다양한 포함되어 있습니다. 따라서, 눈 자극에 대한 이러한 에이전트의 테스트는 소비자 안전 1을 보장하기 위해 미국과 유럽 연합 (EU) 규제 기관이 필요합니다. 혼합물 및 제제의 눈 자극 잠재력의 평가는 화학 물질의 운송에 대한 유럽 연합 (EU) 화장품 지침에서 화장품 성분의 표시에 대한 REACH (등록, 평가, 허가 및 화학 물질의 제한)과 법률을 준수 요구 사항이며, 대한 살충제 및 가정용 제품 (2)의 표시. 현재, 규제 기관은 화학 물질의 분류 및 표지 (GHS) 3의 세계 조화 시스템을 사용하여 안구 유해성 평가가 필요합니다. GHS는 주로 드레 이즈 눈 자극 테스트에 기초하고, 가장 널리 사용되는 눈 자극 분석되는 이물질 및 MIxtures는 토끼 눈 (4)의 결막 낭에 직접 도입된다. GHS 분류에 따르면, GHS 분류 1 (안구 부식)는 눈의 조직이나 노출 3,5 다음 21 일 이내 완전히 되돌릴 수 없습니다 눈과 시력에 심각한 손상이 심한 초기 부상의 원인이 화학 물질을 테스트하는 데 의미합니다. GHS 분류 2 노출 21 일 이내에 완전히 뒤집을 수있는 눈에 큰 변화를 생산 화학 물질을 테스트하는 의미. 부식 또는 자극없는 시험 화학 물질은 GHS 없음 카테고리라고합니다. 40 년 이상, 드레 이즈 토끼 눈 검사는 재현성의 부족, 인간의 응답의 과대 평가, 그리고 살아있는 동물 5-8의 사용에 대한 비판을 받아왔다. 이러한 우려는 정제, 감소, 및 생체 내 시험 (9)의 교체를위한 많은 제안을 장려하고있다. 검증이 아닌 동물에 대한 대안이 필요 더욱 강화시켰다(2009 년) 화장품 (2005 년) 화장품의 안전성 평가에서 동물의 사용을 금지 지침 및 성분에 일곱 번째 수정안의 채택에 의해 2. 1996 년 이후, 재구성 된 각막 형상 조직 모델 널리 원료, 계면 활성제 계 제제의 자극 잠재력을 평가하기 위해 화장품 산업에서 사용하고, 사용하기 위해 설계된 이들의 혼합물을 배합하거나, 눈의 근방에 한 10-13. RHCE 조직 모델의 사용은 네이티브, 희석되지 않은 형태로 직물 표면에 시험 물질을 직접 국소 적용을 허용한다. 이와 같이, 비 수용성 용매로 제형은 이들을 희석없이 테스트 될 수있다. 광범위하게 적용 할 수있는 간단하고 경제적 인 방법 요청 (대체 방법의 유효성 검사에 대한 유럽 연합 (EU) 참조 연구소 유럽 센터) EURL의 ECVAM의에 대한 응답으로 눈 자극 시험 (EIT)는 자장하게를 사용하는즉 노출 시간 및 라벨을 필요로하지 않는 물질로부터 안구 자극 및 부식을 분리 할 수있다 (그림 1) (14)를 개발 하였다. (83) 화학 (44 액체 및 39 고체)의 결과를 바탕으로, EIT는 95.5 / 68.2 / 81.8 % 민감도 / 특이도 및 정확도 (SS &amp; A) 액체, 고체에 대한 100.0 / 68.4 / 84.6 % SS &amp; A, 및 97.6을 / 달성 68.3 / 전반적인 SS &amp; A의 83.1 %. 2007 년, EURL의 ECVAM의 후원하에 화장품 유럽 (구 COLIPA)에 의해 후원 멀티 실험실 사전 검증 연구는 공식 확인 (15)에 데려의 목적으로 EIT의 관련성과 신뢰성을 평가 하였다. 본 연구에서는 298 독립적 인 시험 일곱 독립적 인 실험실에서 수행 하였다. 연구 결과는 참여하는 모든 실험실 (15)에 걸쳐 변화의 낮은 계수 예측에 99.7 % 계약을 보여 주었다. 그 결과, 2010 년 EIT 프로토콜 형식 EURL ECVAM 진입검증 프로그램입니다. 검증 연구는 생체 내 참조 데이터 (드레 이즈 눈 자극 데이터) 사용할 수 있었던하는 개별 물질 및 화학 혼합물을 포함하여 104 코딩 테스트 화학 물질을 이용했다. 이 연구의 성공에 기초하여, OECD 초안 시험 지침 그것이 EIT는 UN GHS의 분류 및 표시 시스템에 따라 다양한 재료의 눈 자극 전위의 분류에 크게 기여할 것으로 기대된다 (2014)에 제출 하였다.

eye irritation test (eit) for hazard identification of eye irritating chemicals using reconstructed human cornea-like epithelial (rhce) tissue model

유럽​​ 연합 (EU) 화장품 지침 및 EU REACH 법령에 일곱 번째 수정 조항을 준수하기 위해, 사람의 안구 독성의 안정적이고 정확한 평가를위한 검증 된 비 동물 대체 방법이 필요하다. 이러한 필요를 해결하기 위해, 우리는 눈 자극 테스트 정상적인 인간 세포에 기반 삼차원 재구성 인간 각막 상피​​ 형상 (RHCE) 조직 모델을 이용한다 (EIT)를 개발 하였다. EIT는 안구 자극 및 부식 (GHS 분류 1과 2 결합) 및 표시 (GHS 없음 카테고리)를 필요로하지 않는 사람들을 분리 할 수​​있다. 시험은 두 개의 별도의 프로토콜, 액체 화학 물질과 고체 시험 기사에 대한 두 번째, 유사한 프로토콜에 대한 설계를 사용합니다. EIT 예측 모델은 단일 노광 시간 (30 분 액체, 고체 6 HR) 및 단일 조직 생존력 컷오프 (MTT 분석에 의해 결정된 바와 같이 60.0 %)을 사용한다. EIT는 95.5 / 68.2 / 81.8 %의 달성 SENS (44 액체 및 고체 39) (83) 화학 결과에 기초itivity / 특이도 및 정확도 (SS &amp; A) 액체, 고체 용 / 68.4 100.0 / 84.6 % SS &amp; A, 및 97.6 / 68.3 / 전반적인 SS &amp; A의 83.1 %. EIT는 규제 테스트 요구 사항을 충족하기 위해 동물을 사용하지 않고 액체 및 고체 화학의 넓은 범위의 잠재적 인 안구 자극을 분류에 크게 기여할 것이다. EpiOcular EIT 방법은 TG 492으로 OECD 시험 가이드 라인으로 2015 년 구현되었습니다.

10 테스트 제품 (TA) 및 부정과 긍정적 인 컨트롤을 실시 대표 EIT 결과는 표 6과 그림 3에 제시되어있다.이 NC는 100 % 조직의 생존에 해당하는 OD = 1.31에 대한, 따라서 PC (OD 평균 = 0.41) 평균했다 31.2 %의 상대 조직의 생존. EIT 프로토콜 고체 노출 프로토콜을 사용하여, 4 실험실에서 액체 노출 프로토콜 및 8 독립적 인 유효 실험을 이용하여 7 실험실에서 15 유효한 독립적 인 실험을 수행 한 결과, 액체 프로토콜을 사용하여 PC에 대한 평균 조직 생존율은 36.4 ± 4.0이었다 %와 고체 프로토콜 32.3 ± 6.4 %. 모든 경우, 양성 대조군의 결과는 60.0 % (15)의 컷오프 값 이하이었다. 그림 3, TA1, TA2, TA4, TA7에 표시하고, TA8 조직의 생존율&gt; 60.0 %를 가지고 있었고, 따라서 &quot;NI&quot;로 분류 된 바와 같이. TA3, TA5, TA6, TA9 및 TA10은 조직 생존율의 X를했다04, 60.0 %, 따라서 &quot;I&quot;로 분류했다. 중복 된 조직과 조직의 생존 능력의 차이는 TA2의 제외한 모든 조교에 대한 &lt;20.0 %였다. 그들은 모두 EIT 허용 기준 (10.2 절)를 만난 이후 따라서, TA2의 제외한 모든 시험 기사에 대한 결과는 &quot;자격&quot;으로 간주되었다. 이 때문에, 초기 실험에서 TA2 중복 조직 사이의 높은 변동성으로, 두 번째 실험은 공인 EIT 결과를 얻을 필요가 있었다. 본원 RHCE 조직 모델을 이용하여 설명한 바와 같이 EIT 시험 방법의 EURL ECVAM / 화장품 유럽 15,17-19 의해 정식 유효성 검증 multilaboratory 포함한 여러 연구에서 안구 자극의 평가에 사용 하였다. 모든 연구에서, EIT는 재현 할 것으로 보여 올바르게 화학 물질 (물질 및 혼합물 모두) 눈의 자극이나 눈에 심한 손상 교류에 대한 분류 및 표시를 필요로하지 않는 식별 할 수였다UN GHS 15,17-19에 cording. EIT 시험 방법은 민감도, 특이도 및 전반적인 정확도 눈 자극에 대한 유효성 검사 관리 그룹 (VMG)의 허용 기준을 충족 현재는 생체 내 토끼 드레 이즈 테스트 (19)에 대한 부분 교체와 같은 형식적인 구현이 아직되지 않고 있습니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/52979/52979fig1.jpg" /> 그림 1 : 액체 및 고체 시험 기사에 대한 EIT 프로토콜의 개요 약어 사용 : 오전, 분석 매체;. SCC, 표준 배양 조건; PBS, 둘 베코 인산염 완충 식염수; RT 실온. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/52979/52979fig2.jpg" /> 그림 2. MTT 조직 생존 시험 표준 96 웰 플레이트 구성 두 200 μL 분취 량 TRA 아르미리 라벨링 된 96- 웰 플레이트의 적당한 웰에 nsferred. 약어가 사용 : NC, 음성 대조군; PC, 양성 대조군; TA1-TA20, 시험 기사 1-20; 빈, 추출 용매 솔루션입니다. 96- MTT 플레이트 구성은 RHCE 조직 생존 및 EIT 결과를 계산하도록 설계 Excel 스프레드 시트와 함께 사용된다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/52979/52979fig3.jpg" /> 그림 3 : EIT 결과는 10 시험 기사, NC 및 RHCE 조직 모델을 사용하여 PC 컨트롤에 대한 얻은 그래프는 EIT 결과를 제공하기위한 Excel 스프레드 시트에서 생성됩니다.. NC에 60.0 %의 상대 ≤ 조직의 생존을 감소 테스트 화학 물질은 &quot;자극 (&quot;I &quot;, TA3, TA5, TA6, TA9 및 TA10) 및 조직의 생존이&gt; 60.0 %가 비 자극으로 분류했다 테스트 화학 물질 (로 분류됩니다 NI &quot;, TA1, TA2, TA4, TA7 및 TA8). <table border="0" cellpadding="0" cellspaciNG = &quot;0&quot;&gt; <tbody><tr><td colspan="7"> EIT 프로토콜 작업 단계에 대한 시간 (하나의 연산자에 대한 일일의 일을) 시작 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> 각 라인은 조직 일쌍에 해당 </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 단계의 순서 : </td><td> 1 </td><td> (2) </td><td> 3 </td><td> 4 </td><td> (5) </td><td> 6 </td><td> 7 </td></tr><tr><td> 액체 : </td><td> PBS </td><td> TA 노출 </td><td> 포스트 스며 들다 </td><td> 포스트 <td> MTT 반응 </td><td> MTT 추출 </td><td> 측정 </td></tr><tr><td></td><td> 30 분 </td><td> 30 분 </td><td> 12 분 </td><td> 120 분 </td><td> 180 분 </td><td> 120 분 </td><td> 외경 </td></tr><tr><td> NC </td><td> 9시 </td><td> 9시 반 </td><td> 10시 </td><td> 10시 12분 </td><td> 12시 12분 </td><td> 15시 12분 </td><td> 후 </td></tr><tr><td> PC </td><td> 9시 1분 </td><td> 9시 31분 </td><td> 10시 1분 </td><td> 10시 13분 </td><td> 12시 13분 </td><td> 15시 13분 </td><td> 17시 반 </td></tr><tr><td> TA-1 </td><td> 9시 2분 </td><td> 9시 32분 </td><td> 10시 2분 </td><td> 10시 14분 </td><td> 12시 14분 </td><td> 15시 14분 </td><td></td></tr><tr><td> TA-2 &lt;&gt; / STRONG </td><td> 9시 3분 </td><td> 9시 33분 </td><td> 10시 3분 </td><td> 10시 15분 </td><td> 12시 15분 </td><td> 15시 15분 </td><td></td></tr><tr><td> TA-3 </td><td> 9시 4분 </td><td> 9시 34분 </td><td> 10시 4분 </td><td> 10시 16분 </td><td> 12시 16분 </td><td> 15시 16분 </td><td></td></tr><tr><td> TA-4 </td><td> 9시 5분 </td><td> 9시 35분 </td><td> 10시 5분 </td><td> 10시 17분 </td><td> 12시 17분 </td><td> 15시 17분 </td><td></td></tr><tr><td> TA-5 </td><td> 9시 6분 </td><td> 9시 36분 </td><td> 10시 6분 </td><td> 10시 18분 </td><td> 12시 18분 </td><td> 15시 18분 </td><td></td></tr><tr><td> TA-6 </td><td> 9시 7분 </td><td> 9시 37분 </td><td> 10시 7분 </td><td> 10시 19분 </td><td> 12시 19분 </td><td> 15시 19분 </td><td></td></tr><tr><td> TA-7 </td><td> 9시 8분 </td><td> 9시 38분 </td><td> 10시 8분 </td><td> 10시 20분 </td><td> 12시 20분 </td><td> 15시 20분 </td><td></td></tr><tr><td><stro<html> NG&gt; TA-8 </td><td> 9시 9분 </td><td> 9시 39분 </td><td> 10시 9분 </td><td> 10시 21분 </td><td> 12시 21분 </td><td> 15시 21분 </td><td></td></tr><tr><td> TA-9 </td><td> 9시 10분 </td><td> 9시 40분 </td><td> 10시 10분 </td><td> 10시 22분 </td><td> 12시 22분 </td><td> 15시 22분 </td><td></td></tr><tr><td> TA-10 </td><td> 9시 11분 </td><td> 9시 41분 </td><td> 10시 11분 </td><td> 10시 23분 </td><td> 12시 23분 </td><td> 15시 23분 </td><td></td></tr></tbody></table> 표 3. 액체 테스트 제품의 테스트를위한 샘플 시간표를 포함하여 프로토콜 단계를 미리 습윤 DPBS, 테스트 문서의 응용 프로그램 (TAS), 헹굼과 함께 조직을 사후 담근 후 잠복기, MTT 분석, MTT의 추출, 및 MTT OD의 측정은 열에 표시됩니다. 중복 조직을위한 시간은 행에 구성되어 있습니다. 전체 분석 테스트 (10) 조교 및 컨트롤은 하루 만에 완료 할 수 있습니다. e_content &quot;&gt; <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" height="439" width="582"><tbody><tr><td colspan="6"> (2 일 한 운전자에 대한 작업) EIT 프로토콜 단계는 시작 시간 </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> 각 라인은 조직 일쌍에 해당 </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 1 일 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td colspan="2"> 2 일 (다음날) </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 단계의 순서 : </td><td> 1 </stronG&gt; </td><td> (2) </td><td> 3 </td><td> 4 </td><td> (5) </td><td> 6 </td><td> 7 </td></tr><tr><td> 고체 : </td><td> PBS </td><td> TA 노출 </td><td> 포스트 스며 들다 </td><td> 포스트 Incubaction </td><td> MTT 반응 </td><td> MTT 추출 </td><td> 측정 </td></tr><tr><td></td><td> 30 분 </td><td> 6 시간 </td><td> 26 분 </td><td> 18 시간 </td><td> 180 분 </td><td> 120 분 </td><td> 외경 </td></tr><tr><td> NC </td><td> 9시 </td><td> 9시 반 </td><td> 15시 반 </td><td> 15시 56분 </td><td> 9시 56분 </td><td> 12시 56분 </td&gt; <td> 후 </td></tr><tr><td> PC </td><td> 9시 2분 </td><td> 9시 32분 </td><td> 15시 32분 </td><td> 15시 58분 </td><td> 9시 58분 </td><td> 12시 58분 </td><td> 15시 반 </td></tr><tr><td> TA-1 </td><td> 9시 4분 </td><td> 9시 34분 </td><td> 15시 34분 </td><td> 16시 </td><td> 10시 </td><td> 13시 </td><td></td></tr><tr><td> TA-2 </td><td> 9시 6분 </td><td> 9시 36분 </td><td> 15시 36분 </td><td> 16시 2분 </td><td> 10시 2분 </td><td> 13시 2분 </td><td></td></tr><tr><td> TA-3 </td><td> 9시 8분 </td><td> 9시 38분 </td><td> 15시 38분 </td><td> 16시 4분 </td><td> 10시 4분 </td><td> 13시 4분 </td><td></td></tr><tr><td> TA-4 </td><td> 9시 10분 </td><td> 9시 40분 </td><td> 15시 40분 </td><td> 16시 6분 </td><td> 10시 6분 </td><td> 13시 6분 </td><td></td></tr><tr><td> TA-5 </td><td> 9시 12분 </td><td> 9시 42분 </td><td> 15시 42분 </td><td> 16시 8분 </td><td> 10시 8분 &lt;/ TD&gt; <td> 13시 8분 </td><td></td></tr><tr><td> TA-6 </td><td> 9시 14분 </td><td> 9시 44분 </td><td> 15시 44분 </td><td> 16시 10분 </td><td> 10시 10분 </td><td> 13시 10분 </td><td></td></tr><tr><td> TA-7 </td><td> 9시 16분 </td><td> 9시 46분 </td><td> 15시 46분 </td><td> 16시 12분 </td><td> 10시 12분 </td><td> 13시 12분 </td><td></td></tr><tr><td> TA-8 </td><td> 9시 18분 </td><td> 9시 48분 </td><td> 15시 48분 </td><td> 16시 14분 </td><td> 10시 14분 </td><td> 13시 14분 </td><td></td></tr><tr><td> TA-9 </td><td> 9시 20분 </td><td> 9시 50분 </td><td> 15시 50분 </td><td> 16시 16분 </td><td> 10시 16분 </td><td> 13시 16분 </td><td></td></tr><tr><td> TA-10 </td><td> 9시 22분 </td><td> 9시 52분 </td><td> 15시 52분 </td><td> 16시 18분 </td><td> 10시 18분 </td><td> 13시 18분 </td><td></td></tr></tbody></table> 표 4 : 고체 테스트 제품의 테스트를위한 샘플 시간표.를 포함하여 프로토콜 단계 사전 습윤 세정과, 포스트 - 흡수 후 잠복기, MTT 분석, MTT의 추출 및 MTT OD의 측정이 컬럼에 제시되어, DPBS, 시험 기사의 응용 프로그램과 함께 조직을. 중복 조직을위한 시간은 행에 구성되어 있습니다. 10 조교 및 컨트롤 테스트 전체 시험은 2 일에 걸쳐 수행된다. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> 양 </td><td> 시약 </td><td> 보관 조건 </td><td> 출처 </td><td> 기술 </td><td> 유통 기간 </td></tr><tr><td> 1 병, 2 ml의 </td><td> MTT 집중 (MTT-100-CON) </td><td> 빛으로부터 보호 (-20) </td><td> 매텍 </td><td> 냉동 MTT 집중 </td><td> 2개월 </td></tr><tr><td> 1 병, 8 ml의 </td><td> MTT의 희석제 </td><td> 2-8 &amp;# 186; C </td><td> 매텍 </td><td> MTT 농축액을 희석 종래는 MTT 분석에서 사용하는 </td><td> 2개월 </td></tr><tr><td> 1 병, 60 ml의 </td><td> 아이소 프로필 알코올 (CAS 번호 67-63-0) </td><td> RT </td><td> 알드리치 </td><td> 추출 용매 솔루션 </td><td> NA </td></tr></tbody></table> 표 5 : MTT-100 분석 키트 구성 요소. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> 코드 N ° </td><td> 조직 </td><td colspan="2"> 원시 데이터 </td><td colspan="2"> 빈 보정 데이터 </td><td rowspan="2"> 외경의 의미 </td><td rowspan="2"> 생존의 % </td></tr><tr><td></td><td> N </td><td> Aliq. 1 </td><td> Aliq. (2) </td><td> Aliq. 1 </td><td> Aliq. (2) </td></tr><tr><td> NC </td><td>1 </td><td> 1.316 </td><td> 1.352 </td><td> 1.316 </td><td> 1.352 </td><td> 1.334 </td><td> 101.6 </td></tr><tr><td></td><td> (2) </td><td> 1.277 </td><td> 1.309 </td><td> 1.277 </td><td> 1.309 </td><td> 1.293 </td><td> 98.4 </td></tr><tr><td> PC </td><td> 1 </td><td> 0.379 </td><td> 0.397 </td><td> 0.379 </td><td> 0.397 </td><td> 0.388 </td><td> 29.6 </td></tr><tr><td></td><td> (2) </td><td> 0.419 </td><td> 0.442 </td><td> 0.419 </td><td> 0.442 </td><td> 0.431 </td><td> 32.8 </td></tr><tr><td> TA1 </td><td> 1 </td><td> 1.213 </td><td> 1.244 </td><td> 1.213 </td><td> 1.244 </td><td> 1.229 </td><td> 93.5 </td></tr><tr><td></td><td> (2) </td><td> 1.355 </td><td> 1.355 </td><td> 1.355 </td><td> 1.355 </td><td> 1.355 </td><td> 103.2 </td></tr><tr><td> TA2 </td><td> 1 </td><td> 1.210 </td><td> 1.122 </td><td> 1.210 </td><td> 1.122 </td><td> 1.166 </td><td> 88.7 </td></tr><tr><td></td><td> (2) </td><td> 0.828 </td><td> 0.837 </td><td> 0.828 </td><td> 0.837 </td><td> 0.833 </td><td> 63.4 </td></tr><tr><td> TA3 </td><td> 1 </td><td> 0.167 </td><td> 0.168 </td><td> 0.167 </td><td> 0.168 </td><td> 0.167 </td><td> 12.7 </td></tr><tr><td></td><td> (2) </td><td> 0.138 </td><td> 0.136 </td><td> 0.138 </td><td> 0.136 </td><td> 0.137 </td><td> 10.4 </td></tr><tr><td> TA4 </td><td> 1 </td><td> 1.137 </td><td> 1.160 </td><td> 1.137 </td><td> 1.160 </td><td> 1.149 </td><td> 87.4 </td></tr><tr><td></td><td> (2) </td><td> 1.262 </td><td> 1.191 </td><td> 1.262 </td><td> 1.191 </td><td> 1.227 </td><td> 93.4 </td></tr><tr><td> TA5 </td><td> 1 </td><td> 0.610 </td><td> 0.621 </td><td> 0.610 </td><td> 0.621 </td><td> 0.616 </td><td> 46.​​9 </td></tr><tr><td></td><td> (2) </td><td> 0.480 </td><td> 0.484 </td><td> 0.480 </td><td> 0.484 </td><td> 0.482 </td><td> 36.7 </td></tr><tr><td> TA6 </td><td> 1 </td><td> 0.502 </td><td> 0.513 </td><td> 0.502 </td><td> 0.513 </td><td> 0.508 </td><td> 38.7 </td></tr><tr><td></td><td> (2) </td><td> 0.396 </td><td> 0.407 </td><td> 0.396 </td><td> 0.407 </td><td> 0.402 </td><td> 30.6 </td></tr><tr><td> TA7 </td><td> 1 </td><td> 1.048 </td><td> 1.050 </td><td> 1.048 </td><td> 1.050 </td><td> 1.049 </td><td> 79.9 </td></tr><tr><td></td><td> (2) </td><td> 1.149 </td><td> 1.150 </td><td> 1.149 </td><td> 1.150 </td><td> 1.150 </td><td> 87.5 </td></tr><tr><td> TA8 </td><td> 1 </td><td> 1.032 </td><td> 1.034 </td><td> 1.032 </td><td> 1.034 </td><td> 1.033 </td><td> 78.7 </td></tr><tr><td></td><td> (2) </td><td> 0.941 </td><td> 0.935 </td><td> 0.941 </td><td> 0.935 </td><td> 0.938 </td><td> 71.4 </td></tr><tr><td> TA9 </TD&gt; <td> 1 </td><td> 0.022 </td><td> 0.022 </td><td> 0.022 </td><td> 0.022 </td><td> 0.022 </td><td> 1.7 </td></tr><tr><td></td><td> (2) </td><td> 0.144 </td><td> 0.149 </td><td> 0.144 </td><td> 0.149 </td><td> 0.147 </td><td> 11.2 </td></tr><tr><td> TA10 </td><td> 1 </td><td> 0.150 </td><td> 0.150 </td><td> 0.150 </td><td> 0.150 </td><td> 0.150 </td><td> 11.4 </td></tr><tr><td></td><td> (2) </td><td> 0.254 </td><td> 0.255 </td><td> 0.254 </td><td> 0.255 </td><td> 0.255 </td><td> 19.4 </td></tr></tbody></table><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> 평균 </td><td> DIF. </td><td> 의 의미 </td><td> DIF. </td><td> DIF. / 2 </td><td colspan="2"> 분류 </td></tr><tr><td></td><td> OD의 </td><td> OD의 </td><td> 생존율 [%] </td><td> 생존율의 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> NC </td><td> 1.314 </td><td> 0.041 </td><td> 100.0 </td><td> 3.12 </td><td> 1.56 </td><td> NI </td><td> 자격있는 </td></tr><tr><td> PC </td><td> 0.410 </td><td> 0.043 </td><td> 31.2 </td><td> 3.23 </td><td> 1.62 </td><td> 나는 </td><td> 자격있는 </td></tr><tr><td> TA1 </td><td> 1.292 </td><td> 0.127 </td><td> 98.3 </td><td> 9.63 </td><td> 4.81 </td><td> NI </td><td> 자격있는 </td></tr><tr><td> TA2 </td><td> 0.999 </td><td> 0.333 </td><td> 76.1 </td><td> 25.36 </td><td> 12.68 </td><td> NI </td><td> D&gt; (20) </td></tr><tr><td> TA3 </td><td> 0.152 </td><td> 0.030 </td><td> 11.6 </td><td> 2.32 </td><td> 1.16 </td><td> 나는 </td><td> 자격있는 </td></tr><tr><td> TA4 </td><td> 1.188 </td><td> 0.078 </td><td> 90.4 </td><td> 5.94 </td><td> 2.97 </td><td> NI </td><td> 자격있는 </td></tr><tr><td> TA5 </td><td> 0.549 </td><td> 0.134 </td><td> 41.8 </td><td> 10.16 </td><td> 5.08 </td><td> 나는 </td><td> 자격있는 </td></tr><tr><td> TA6 </td><td> 0.455 </td><td> 0.106 </td><td> 34.6 </td><td> 8.07 </td><td> 4.03 </td><td> 나는 </td><td> 자격있는 </td></tr><tr><td> TA7 </td><td> 1.100 </td><td> 0.101 </td><td> 83.7 </td><td> 7.65 </td><td> 3.82 </td><td> NI </td><td> 자격있는 </td></tr><tr><td> TA8 </td><td> 0.986 </td><td> 0.095 </td><td> 75.0 </td><td> 7.23 </td><td> 3.62 </td><td> NI </td><td> 자격있는 </td></tr><tr><td> TA9 </td><td> 0.085 </td><td> 0.125 </td><td> 6.4 </td><td> 9.48 </td><td> 4.74 </td><td> 나는 </td><td> 자격있는 </td></tr><tr><td> TA10 </td><td> 0.203 </td><td> 0.105 </td><td> 15.4 </td><td> 7.95 </td><td> 3.98 </td><td> 나는 </td><td> 자격있는 </td></tr></tbody></table> 표 6 :. 10 시험 기사를 얻을 EIT 결과, NC 및 PC ​​컨트롤은 테이블 자극하다조직의 생존과 EIT 결과를 계산하기위한 Excel 스프레드 시트로 uced. NC에 60.0 %의 상대 ≤ 조직의 생존을 감소 테스트 화학 물질은 &quot;자극 (&quot;I &quot;, TA3, TA5, TA6, TA9 및 TA10) 및 조직의 생존이&gt; 60.0 %가 비 자극으로 분류했다 테스트 화학 물질 (로 분류됩니다 NI &quot;, TA1, TA2, TA4, TA7 및 TA8).

Watch this Scientific Journal Video about Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model at JoVE.com

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

우리는 세 가지 차원 재구성 된 인간의 각막과 같은 상피 (RHCE) 조직 모델을 활용하여 눈 자극 테스트를 개발했습니다. 시험은 안구 자극과 부식성 물질 (GHS 분류 1과 결합 2) 및 표시 (GHS 없음 카테고리)를 필요로하지 않는 사람들을 구별 할 수있다.

복원 된 인간의 각막 모양의 상피 (RHCE) 조직 모델을 사용하여 눈에 자극성 화학 물질의 위험 식별을위한 눈 자극 시험 (EIT)

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

eye-irritation-test-eit-for-hazard-identification-eye-irritating

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

37.5K 조회수.  MatTek Corporation.  우리는 세 가지 차원 재구성 된 인간의 각막과 같은 상피 (RHCE) 조직 모델을 활용하여 눈 자극 테스트를 개발했습니다. 시험은 안구 자극과 부식성 물질 (GHS 분류 1과 결합 2) 및 표시 (GHS 없음 카테고리)를 필요로하지 않는 사람들을 구별 할 수있다. 

비디오: Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

An In Vitro Skin Irritation Test (SIT) using the EpiDerm Reconstructed Human Epidermal (RHE) Model

The EpiDerm Skin Irritation test (EpiDerm SIT) was developed (1,2,3) and validated (4,5) for in vitro skin irritation testing of chemicals, including cosmetic and pharmaceutical ingredients. The EpiDerm SIT utilizes the 3D in vitro reconstructed human epidermal (RHE) model EpiDerm. The procedure described in this protocol allows for discrimination between irritants of GHS category 2 and non-irritants (6). The test is performed over the course of a 4 day time period, consisting of pre-incubation, 60 minute exposure, 42 hour post-incubation and MTT viability assay. After tissue receipt and overnight pre-incubation (Day 0), tissues are topically exposed to the test chemicals (Day 1), which can be liquid, semi-solids, solid or wax. Three tissues are used for each test chemical, as well as for the positive control (5% aq. SDS solution), and a negative control (DPBS). Chemical exposure lasts for 60 minutes, 35 min of which the tissues are kept in an incubator at 37&deg;C. The test substances are then removed from the tissue surface by an extensive washing procedure. The tissue inserts are blotted and transferred to fresh medium. After a 24 hr incubation period (Day 2), the medium is exchanged. The medium can be saved for further analysis of cytokines or other endpoints of interest. After the medium exchange, tissues are incubated for an additional 18 hours. At the end of the entire 42h post-incubation (day 3), the tissues are transferred into yellow MTT solution and incubated for 3 hours. The resultant purple-blue formazan salt, formed mainly by mitochondrial metabolism, is extracted for 2 hours using isopropanol. The optical density of the extracted formazan is determined using a spectrophotometer. A chemical is classified as an irritant if the tissue viability relative to the negative control treated tissues is reduced below 50%. This procedure can be used as full replacement of the in vivo rabbit skin irritation test for hazard identification and labeling of chemicals in line with EU regulations (7).

An In Vitro Skin Irritation Test SIT using the EpiDerm Reconstructed Human Epidermal RHE Model

In this video, we demonstrate the EpiDerm Skin Irritation test (EpiDerm SIT) developed and validated for in vitro skin irritation testing of chemicals, including cosmetic and pharmaceutical ingredients.

체외에서</emEpiDerm를 사용하여> 피부 자극 시험 (SIT)는 인간 표피 (RHE) 모델 재구성

The EpiDerm Skin Irritation test (EpiDerm SIT) was developed (1,2,3) and validated (4,5) for in vitro skin irritation testing of chemicals, including ...

연구

생물학

Development of an In Vitro Ocular Platform to Test Contact Lenses

Currently, in vitro evaluations of contact lenses (CLs) for drug delivery are typically performed in large volume vials,1-6 which fail to mimic physiological tear volumes.7 The traditional model also lacks the natural tear flow component and the blinking reflex, both of which are defining factors of the ocular environment. The development of a novel model is described in this study, which consists of a unique 2-piece design, eyeball and eyelid piece, capable of mimicking physiological tear volume. The models are created from 3-D printed molds (Polytetrafluoroethylene or Teflon molds), which can be used to generate eye models from various polymers, such as polydimethylsiloxane (PDMS) and agar. Further modifications to the eye pieces, such as the integration of an explanted human or animal cornea or human corneal construct, will permit for more complex in vitro ocular studies. A commercial microfluidic syringe pump is integrated with the platform to emulate physiological tear secretion. Air exposure and mechanical wear are achieved using two mechanical actuators, of which one moves the eyelid piece laterally, and the other moves the eyeballeyepiece circularly. The model has been used to evaluate CLs for drug delivery and deposition of tear components on CLs.

Development of an In Vitro Ocular Platform to Test Contact Lenses

Current in vitro models for evaluating contact lenses (CLs) and other eye-related applications are severely limited. The presented ocular platform simulates physiological tear flow, tear volume, air exposure and mechanical wear. This system is highly versatile and can be applied to various in vitro analyses with CLs.

개발<em&gt; 체외</em&gt; 안구 플랫폼은 콘택트 렌즈를 테스트하는

Currently, in vitro evaluations of contact lenses (CLs) for drug delivery are typically performed in large volume vials,1-6 which fail to mimic ...

생체공학

Cultivating a Three-dimensional Reconstructed Human Epidermis at a Large Scale

A three-dimensional human epidermis model reconstructed from neonatal primary keratinocytes is presented. Herein, a protocol for the cultivation process and the characterization of the model is described. Neonatal primary keratinocytes are grown submerged on permeable polycarbonate inserts and lifted to the air-liquid interface three days after seeding. After fourteen days of stimulation with defined growth factors and ascorbic acid in high calcium culture medium, the model is fully differentiated. Histological analysis revealed a completely stratified epidermis, mimicking the morphology of native human skin. To characterize the model and its barrier functions, protein levels and localization specific for early-stage keratinocyte differentiation (i.e., keratin 10), late-stage differentiation (i.e., involucrin, loricrin, and filaggrin) and tissue adhesion (i.e., desmoglein 1), were assessed by immunofluorescence. The tissue barrier integrity was further evaluated by measuring transepithelial electrical resistance. Reconstructed human epidermis was responsive to proinflammatory stimuli (i.e., lipopolysaccharide and tumor necrosis factor alpha), leading to increased cytokine release (i.e., interleukin 1 alpha and interleukin 8). This protocol represents a straightforward and reproducible in vitro method to cultivate reconstructed human epidermis as a tool to assess environmental effects and a broad range of skin-related studies.

This protocol describes a straightforward method to cultivate three-dimensional reconstituted human epidermis in a reproducible and robust manner. Additionally, it characterizes the structure-function relationship of the epidermal barrier model. The biological responses of the reconstituted human epidermis upon proinflammatory stimuli are also presented.

대규모로 3차원 재건 된 인간 표피 를 육성

A three-dimensional human epidermis model reconstructed from neonatal primary keratinocytes is presented. Herein, a protocol for the cultivation process ...

Corneal Epithelial Abrasion with Ocular Burr As a Model for Cornea Wound Healing

The murine cornea provides an excellent model to study wound healing. The cornea is the outermost layer of the eye, and thus is the first defense to injury. In fact, the most common type of eye injury found in clinic is a corneal abrasion. Here, we utilize an ocular burr to induce an abrasion resulting in removal of the corneal epithelium in vivo on anesthetized mice. This method allows for targeted and reproducible epithelial disruption, leaving other areas intact. In addition, we describe the visualization of the abraded epithelium with fluorescein staining and provide concrete advice on how to visualize the abraded cornea. Then, we follow the timeline of wound healing 0, 18, and 72 h after abrasion, until the wound is re-epithelialized. The epithelial abrasion model of corneal injury is ideal for studies on epithelial cell proliferation, migration and re-epithelialization of the corneal layers. However, this method is not optimal to study stromal activation during wound healing, because the ocular burr does not penetrate to the stromal cell layers. This method is also suitable for clinical applications, for example, pre-clinical test of drug effectiveness.

This protocol describes a method to inflict an abrasion to the ocular surface of the mouse, and to follow the wound healing process thereafter. The protocol takes advantage of an ocular burr to partially remove the surface epithelium of the eye in anaesthetized mice.

각 막에 대 한 모델로 눈 버와 각 막 상피 마모 상처 치유

The murine cornea provides an excellent model to study wound healing. The cornea is the outermost layer of the eye, and thus is the first defense to ...

의학

Effect of Artificial Tear Formulations on the Metabolic Activity of Human Corneal Epithelial Cells after Exposure to Desiccation

Artificial lipid-containing tear formulations are developed to reduce tear evaporation by the restoration of a deficient tear lipid layer. Artificial tear formulations that prevent cell desiccation will result in ocular surface protection and the maintenance of cell metabolic activity. During dehydration, cells undergo the process of loss of metabolic activity and subsequently cell death. This work describes a method for assessing the efficacy of artificial tear formulations. The metabolic dye (i.e., alamarBlue) changes from a low fluorescent molecule resazurin to a fluorescent molecule resorufin in viable cells. The biological performance of an artificial tear formulation is measured as the ability of the formulation to (a) maintain cell viability and (b) provide cell protection from desiccation. Growth media and saline are used as controls for the cell viability/desiccation tests. Cells are incubated with test solutions for 30 min and then desiccated for 0 or 5 min at 37 &#176;C and 45% relative humidity. Cell metabolic activity after initial exposure and after cell desiccation is then determined. The results show the comparative effects of eye drop formulations on cell metabolic activity and desiccation protection. This method can be used to test dry eye formulations that are designed to treat individuals with evaporative dry eye.

The purpose of this protocol is to evaluate if different artificial tear formulations can protect human corneal epithelial cells from desiccation using an in vitro model. After exposure to artificial tear formulations and desiccation, human corneal epithelial cells are assessed for metabolic activity.

건조에 노출 된 후 인간 각막 상피 세포의 대사 활동에 인공 눈물 제형의 효과

Artificial lipid-containing tear formulations are developed to reduce tear evaporation by the restoration of a deficient tear lipid layer. Artificial tear ...

Ex Vivo and In Vivo Animal Models for Mechanical and Chemical Injuries of Corneal Epithelium

Corneal injury to the ocular surface, including chemical burn and trauma, may cause severe scarring, symblepharon, corneal limbal stem cells deficiency, and result in a large, persistent corneal epithelial defect. Epithelial defect with the following corneal opacity and peripheral neovascularization result in irreversible visual impairment and hinder future management, especially keratoplasty. Since the animal model can be used as an effective drug development platform, models of corneal injury to the mouse and alkali burn to rabbit corneal epithelium are developed here. New Zealand white rabbit is used in the alkali burn model. Different concentrations of sodium hydroxide can be applied onto the central circular area of the cornea for 30 s under intramuscular and topical anesthesia. After copious isotonic normal saline irrigation, residual loose corneal epithelium was removed with corneal burr deep down to the Bowman's layer within this circular area. Wound healing was documented by fluorescein staining under Cobalt blue light. C57BL/6 mice were used in the traumatic model of murine corneal epithelium. The murine central cornea was marked using a skin punch, 2 mm in diameter, and then debrided by a corneal rust ring remover with a 0.5 mm burr under a stereomicroscope. These models can be prospectively used to validate the therapeutic effect of eye drops or mixed agents such as stem cells, which potentially facilitate corneal epithelial regeneration. By observing corneal opacity, peripheral neovascularization, and conjunctival congestion with stereomicroscope and imaging software, therapeutic effects in these animal models can be monitored.

Ex Vivo and In Vivo Animal Models for Mechanical and Chemical Injuries of Corneal Epithelium

Here, animal models based on mouse and rabbit are developed for mechanical and chemical injury of corneal epithelium to screen new therapeutics and the underlying mechanism.

각막 상피의 기계적 및 화학적 손상에 대한 Ex Vivo 및 In Vivo 동물 모델

Corneal injury to the ocular surface, including chemical burn and trauma, may cause severe scarring, symblepharon, corneal limbal stem cells deficiency, ...

High Throughput SiRNA Screening for Chloropicrin and Hydrogen Fluoride-Induced Cornea Epithelial Cell Injury

Toxicant-induced ocular injury is a true ocular emergency because chemicals have the potential to rapidly inflict significant tissue damage. Treatments for toxicant-induced corneal injury are generally supportive as no specific therapeutics exist to treat these injuries. In the efforts to develop treatments and therapeutics to care for exposure, it can be important to understand the molecular and cellular mechanisms of these injuries. We propose that utilization of high throughput small inhibitory RNA (siRNA) screening can be an important tool that could help to more rapidly elucidate the molecular mechanisms of chemical cornea epithelial injury. siRNA are double stranded RNA molecules that are 19-25 nucleotides long and utilize the post-transcriptional gene silencing pathway to degrade mRNA which have homology to the siRNA. The resulting reduction of expression of the specific gene can then be studied in toxicant exposed cells to ascertain the function of that gene in the cellular response to the toxicant. The development and validation of in vitro exposure models and methods for the high throughput screening (HTS) of hydrogen fluoride- (HF) and chloropicrin- (CP) induced ocular injury are presented in this article. Although we selected these two toxicants, our methods are applicable to the study of other toxicants with minor modifications to the toxicant exposure protocol. The SV40 large T antigen immortalized human corneal epithelial cell line SV40-HCEC was selected for study. Cell viability and IL-8 production were selected as endpoints in the screening protocol. Several challenges associated with the development of toxicant exposure and cell culture methods suitable for HTS studies are presented. The establishment of HTS models for these toxicants allows for further studies to better understand the mechanism of injury and to screen for potential therapeutics for chemical ocular injury.

High throughput small inhibitory RNA screening is an important tool that could help to more rapidly elucidate the molecular mechanisms of chemical cornea epithelial injury. Herein, we present the development and validation of exposure models and methods for the high throughput screening of hydrogen fluoride- and chloropicrin-induced cornea epithelial injury.

Chloropicrin 및 수소 불 화물 유발 각 막 상피 세포 상해에 대 한 높은 처리량 SiRNA 심사

Toxicant-induced ocular injury is a true ocular emergency because chemicals have the potential to rapidly inflict significant tissue damage. Treatments ...

생쥐의 정확한 알칼리 연소를 위한 수정된 생검 펀치 방법

Corneal and Limbal Alkali Injury Induction Using a Punch-Trephine Technique in a Mouse Model

The cornea is critical for vision, and corneal healing after trauma is fundamental in maintaining its transparency and function. Through the study of corneal injury models, researchers aim to enhance their understanding of how the cornea heals and develop strategies to prevent and manage corneal opacities. Chemical injury is one of the most popular injury models that has extensively been studied on mice. Most previous investigators have used a flat paper soaked in sodium hydroxide to induce corneal injury. However, inducing corneal and limbal injury using flat filter paper is unreliable, since the mouse cornea is highly curved. Here, we present a new instrument, a modified biopsy punch, that enables the researchers to create a well-circumscribed, localized, and evenly distributed alkali injury to the murine cornea and limbus. This punch-trephine method enables researchers to induce an accurate and reproducible chemical burn to the entire murine cornea and limbus while leaving other structures, such as the eyelids, unaffected by the chemical. Moreover, this study introduces an enucleation technique that preserves the medial caruncle as a landmark for identifying the nasal side of the globe. The bulbar and palpebral conjunctiva, and lacrimal gland are also kept intact using this technique. Ophthalmologic examinations were performed via slit lamp biomicroscope and fluorescein staining on days 0, 1, 2, 6, 8, and 14 post-injury. Clinical, histological, and immunohistochemical findings confirmed limbal stem cell deficiency and ocular surface regeneration failure in all experimental mice. The presented alkali corneal injury model is ideal for studying limbal stem cell deficiency, corneal inflammation, and fibrosis. This method is also suitable for investigating pre-clinical and clinical efficacies of topical ophthalmologic medications on the murine corneal surface.

저자 스포트라이트: 각막 혼탁 치료 및 재생에 대한 연구 발전 

This protocol describes a method to induce an accurate and reproducible corneal and limbal alkali injury in a mouse model. The protocol is advantageous as it allows for an evenly distributed injury to the highly curved mouse cornea and limbus.

마우스 모델에서 펀치-트레핀 기술을 사용한 각막 및 변막 알칼리 손상 유도

The cornea is critical for vision, and corneal healing after trauma is fundamental in maintaining its transparency and function. Through the study of ...

복원 된 인간의 각막 모양의 상피 (RHCE) 조직 모델을 사용하여 눈에 자극성 화학 물질의 위험 식별을위한 눈 자극 시험 (EIT)

요약

더 많은 비디오 탐색

이 비디오의 챕터

체외에서 피부 자극 시험 (SIT)는 인간 표피 (RHE) 모델 재구성

개발

대규모로 3차원 재건 된 인간 표피 를 육성

각 막에 대 한 모델로 눈 버와 각 막 상피 마모 상처 치유

건조에 노출 된 후 인간 각막 상피 세포의 대사 활동에 인공 눈물 제형의 효과

각막 상피의 기계적 및 화학적 손상에 대한 Ex Vivo 및 In Vivo 동물 모델

Chloropicrin 및 수소 불 화물 유발 각 막 상피 세포 상해에 대 한 높은 처리량 SiRNA 심사

마우스 모델에서 펀치-트레핀 기술을 사용한 각막 및 변막 알칼리 손상 유도

마우스 모델에서 펀치-트레핀 기술을 사용한 각막 및 변막 알칼리 손상 유도

마우스 모델에서 펀치-트레핀 기술을 사용한 각막 및 변막 알칼리 손상 유도