저자는 EIT 프로젝트에 최선을 다하고 자신의 과학적 지원과 시간 닥터 존 Harbell에게 감사의 말씀을 전합니다. 저자는 또한 바이어스 도르프 AG (독일), IIVS (미국), 메리 케이 코리아 (미국), 에이본 프로덕츠 코리아 (미국), 프록터 &amp; 갬블 / Cosmital (스위스)의 Laboratoire 피에르 파브르 (프랑스)에 감사드립니다 할란 연구소 (영국), 및 눈 자극 시험 (15)의 멀티 센터 국제 사전 확인 및 검증 연구에 참여 LVMH Parfume (프랑스).

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	<li>National Toxicology Program (NTP) Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM). <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Request+for+Ocular+Irritancy+Test+Data+From+Human,+Rabbit,+and+In+Vitro+Studies+Using+Standardized+Testing+Methods.">Request for Ocular Irritancy Test Data From Human, Rabbit, and In Vitro Studies Using Standardized Testing Methods.</a> Federal Register. 72 (109), 31582-31583 (2007).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+(EC)+No+1907/2006+of+the+European+Parliament+and+of+the+Council+of+18+December+2006+concerning+the+Registration,+Evaluation,+Authorisation+and+Restriction+of+Chemicals+(REACH),+establishing+a+European+Chemicals+Agency,+amending+Directive+1999/45/EC+and+repealing+Council+Regulation+(EEC)+No+793/93+and+Commission+Regulation+(EC)+No+1488/94+as+well+as+Council+Directive+76/769/EEC+and+Commission+Directives+91/155/EEC,+93/67/EEC,+93/105/EC+and+2000/21/EC.">Regulation (EC) No 1907/2006 of the European Parliament and of the Council of 18 December 2006 concerning the Registration, Evaluation, Authorisation and Restriction of Chemicals (REACH), establishing a European Chemicals Agency, amending Directive 1999/45/EC and repealing Council Regulation (EEC) No 793/93 and Commission Regulation (EC) No 1488/94 as well as Council Directive 76/769/EEC and Commission Directives 91/155/EEC, 93/67/EEC, 93/105/EC and 2000/21/EC.</a> OJ. 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이 기사에 대한 출판 비용은 매텍 회사가 지불했다.

우리는 EpiOcular 조직 모델을 위해 개발 된 눈 자극 시험 (그림 1)을 제시 하였다. GHS 분류 사이에 차별하지 않습니다 여기에 제시된 EIT는 민감도와 특이도 (17) EIT를 높은 수준으로 표시 (GHS 없음 카테고리)를 필요로하지 않는 물질로 안구 자극 및 부식 (GHS 분류 1과 2 결합)를 분리 할 수있다 1 종류 2 화학 물질. EIT는 분류 및 화장품 및 제약 성분을 포함한 화학 물질의 넓은 범위의 눈 자극 전위 라벨링 검증 하였다. 시험 관내 시험에서 다른과 관련하여, EIT는 생체 내 토끼 눈 자극 시험에 대한 대체 될 것입니다. EIT는 노광과 노광 후 배양 기간 (도 1)의 길이에 차이가 액체 및 고체 물질에 대해 유사하지만 구별되는 두 가지 프로토콜을 사용한다. EIT에 사용 종점이전에 검증 된 인간 상피 조직 모델 (20, 21)에 사용 된 MTT 분석에 의해 결정 조직 생존력이다. 이 분석을 수행하기 위해, 표준 세포 배양 장치 외에 특별한 장비가 필요하지 않다. 때문에 높은 조직 간 조직 재현성의 수준, N = 2 조직 대신에 일반적으로 권장 N = 3이 사용됩니다. 능력 N 사용 = 그것이 개별적인 조직 (14)의 다른 처리에 따라서 발생할 수있는 분석의 변동성을 최소화 숙련 작업자가 동시에 두 조직을 처리 할 수 보낸 두 조직은, 프로토콜의 중요한 측면이다. 또한, 양성 및 음성 대조군과 함께, 테스트 문서 당 N = 2 조직, 동일한 물리적 상태 (액체 또는 고체) 10 시험 물질의 자극성을 사용하여, 하나의 키트 (24 조직)을 사용하여 평가 될 수있다. 자료의 신뢰성 분류를 보장 다른 핵심 포인트는 양성 대조군 스와의 사양입니다bstance (조직 생존 ≤50.0 %), 중복 조직 (차이 &lt;20.0 %) 및 ​​음성 대조군 OD 수치 (&gt; 0.8 &lt;2.5) 사이의 재현성. EIT 시험을 수행 할 때 배양 기간에서 프로토콜 또는 변경에서 편차가 변경된 결과를 초래할 수 있기 때문에, 상기 검증 프로토콜과 제안 된 투여 및 세척 스케줄 (표 3 및 4)을 준수하는 것이 중요하다. 마찬가지로, MTT 배양을위한 3 시간의 시간의 편차는 다른 MTT의 수치가 발생합니다 및 분석 결과에 영향을 미칠 수 있습니다. 때때로, 시험 물질은 MTT 조직 생존 분석 또는 MTT의 원인 감소 방해 할 수있는 광학 또는 다른 특성을 가질 수있다. 예를 들어, 시험 물질은 직접 청자색 반응 생성물에 MTT를 줄일 수 있거나, MTT의 포르 마잔 (~ 570 ㎚)와 동일한 범위의 광을 흡수하는 착색 물질을 포함하는 것일 수있다. 그러나 이러한 시험 화학 물질은 홍보합니다MTT 분석시에, 충분한 양의 물질이 여전히 조직에 존재하는 (또는 흡수에 의해) 인 경우에만 문제 ESENT. 이러한 간섭을 피하기 위해, 광범위한 헹굼 절차는 EIT 프로토콜로 통합된다. TA를 제거하지 않습니다 세척 및 TA는 MTT 감소를 방해하는 경우, 추가 컨트롤이 감지하는 데 사용하고 그것에 대한 정확해야합니다. 시험 물질의 직접 MTT 환원이 의심되는 경우 간단히, 해당 화학 물질의 50 μL (또는 고체 50 mg)을 SCC (NC, 멸균 증류수 50 μL에서 작업 MTT 용액으로 3 시간 동안 인큐베이션되어 있어야 ) 동시에 실행합니다. MTT 용액 청자색 바뀌면 시험품은 MTT를 환원 한 것으로 추정된다. 이 경우, 동결 조직 살해 컨트롤을 사용하여 기능 검사는 시험 물질이 조직에 결합하고 거짓 MTT 환원 신호 선도 여부를 평가하기 위해 수행되어야한다. TA-노출, 사망 조직 관리에 상당한 MTT 감소가있는 경우(미처리 살아있는 조직의 양에 대해), 시험 제품의 평균 조직 생존력 살해 제어의 평균 생존을 감산에 의해 보정되어야한다. 위음성 분류 14,15,18의 낮은 발생 빈도에 의해 입증 된 바와 같이 EIT는 안전의 측면에 잘못한다가. 중요한 것은 눈에 부식성 및 GHS 분류 한 화학 물질, 아무도, 가장 심각한 안구 위험을 나타내는 없습니다 이 분석 14,15,18,19에 비자 극적으로 분류 하였다. 마지막으로, 시험 관내 시험 법에서 RHCE의 주요 이점 중 하나는 깔끔한 액체 (2 차원 수중 세포 배양 불가능) 고체 물질을 시험 할 가능성이있다. EIT는 UN GHS의 분류 및 표시 시스템에 따라 다양한 재료의 안구 염증 가능성을 결정하는데 크게 기여할 것이다. 동물의 교체는 O 결정큘라 독성 몇 년 동안 독성 학적 연구의 목표였다. EIT 시험 방법은 2014 년 EURL ECVAM에서 지원하는 형식적인 검증 연구를 완료하고 EpiOcular EIT는 2015 년 OECD TG 492으로 OECD 테스트 가이드 라인으로 구현되었습니다.

화장품, 세제, 가정용 청소기 등의 가전 제품은 눈에 문의 할 경우 심각한 손상을 유발시킬 수있는 화학 물질의 다양한 포함되어 있습니다. 따라서, 눈 자극에 대한 이러한 에이전트의 테스트는 소비자 안전 1을 보장하기 위해 미국과 유럽 연합 (EU) 규제 기관이 필요합니다. 혼합물 및 제제의 눈 자극 잠재력의 평가는 화학 물질의 운송에 대한 유럽 연합 (EU) 화장품 지침에서 화장품 성분의 표시에 대한 REACH (등록, 평가, 허가 및 화학 물질의 제한)과 법률을 준수 요구 사항이며, 대한 살충제 및 가정용 제품 (2)의 표시. 현재, 규제 기관은 화학 물질의 분류 및 표지 (GHS) 3의 세계 조화 시스템을 사용하여 안구 유해성 평가가 필요합니다. GHS는 주로 드레 이즈 눈 자극 테스트에 기초하고, 가장 널리 사용되는 눈 자극 분석되는 이물질 및 MIxtures는 토끼 눈 (4)의 결막 낭에 직접 도입된다. GHS 분류에 따르면, GHS 분류 1 (안구 부식)는 눈의 조직이나 노출 3,5 다음 21 일 이내 완전히 되돌릴 수 없습니다 눈과 시력에 심각한 손상이 심한 초기 부상의 원인이 화학 물질을 테스트하는 데 의미합니다. GHS 분류 2 노출 21 일 이내에 완전히 뒤집을 수있는 눈에 큰 변화를 생산 화학 물질을 테스트하는 의미. 부식 또는 자극없는 시험 화학 물질은 GHS 없음 카테고리라고합니다. 40 년 이상, 드레 이즈 토끼 눈 검사는 재현성의 부족, 인간의 응답의 과대 평가, 그리고 살아있는 동물 5-8의 사용에 대한 비판을 받아왔다. 이러한 우려는 정제, 감소, 및 생체 내 시험 (9)의 교체를위한 많은 제안을 장려하고있다. 검증이 아닌 동물에 대한 대안이 필요 더욱 강화시켰다(2009 년) 화장품 (2005 년) 화장품의 안전성 평가에서 동물의 사용을 금지 지침 및 성분에 일곱 번째 수정안의 채택에 의해 2. 1996 년 이후, 재구성 된 각막 형상 조직 모델 널리 원료, 계면 활성제 계 제제의 자극 잠재력을 평가하기 위해 화장품 산업에서 사용하고, 사용하기 위해 설계된 이들의 혼합물을 배합하거나, 눈의 근방에 한 10-13. RHCE 조직 모델의 사용은 네이티브, 희석되지 않은 형태로 직물 표면에 시험 물질을 직접 국소 적용을 허용한다. 이와 같이, 비 수용성 용매로 제형은 이들을 희석없이 테스트 될 수있다. 광범위하게 적용 할 수있는 간단하고 경제적 인 방법 요청 (대체 방법의 유효성 검사에 대한 유럽 연합 (EU) 참조 연구소 유럽 센터) EURL의 ECVAM의에 대한 응답으로 눈 자극 시험 (EIT)는 자장하게를 사용하는즉 노출 시간 및 라벨을 필요로하지 않는 물질로부터 안구 자극 및 부식을 분리 할 수있다 (그림 1) (14)를 개발 하였다. (83) 화학 (44 액체 및 39 고체)의 결과를 바탕으로, EIT는 95.5 / 68.2 / 81.8 % 민감도 / 특이도 및 정확도 (SS &amp; A) 액체, 고체에 대한 100.0 / 68.4 / 84.6 % SS &amp; A, 및 97.6을 / 달성 68.3 / 전반적인 SS &amp; A의 83.1 %. 2007 년, EURL의 ECVAM의 후원하에 화장품 유럽 (구 COLIPA)에 의해 후원 멀티 실험실 사전 검증 연구는 공식 확인 (15)에 데려의 목적으로 EIT의 관련성과 신뢰성을 평가 하였다. 본 연구에서는 298 독립적 인 시험 일곱 독립적 인 실험실에서 수행 하였다. 연구 결과는 참여하는 모든 실험실 (15)에 걸쳐 변화의 낮은 계수 예측에 99.7 % 계약을 보여 주었다. 그 결과, 2010 년 EIT 프로토콜 형식 EURL ECVAM 진입검증 프로그램입니다. 검증 연구는 생체 내 참조 데이터 (드레 이즈 눈 자극 데이터) 사용할 수 있었던하는 개별 물질 및 화학 혼합물을 포함하여 104 코딩 테스트 화학 물질을 이용했다. 이 연구의 성공에 기초하여, OECD 초안 시험 지침 그것이 EIT는 UN GHS의 분류 및 표시 시스템에 따라 다양한 재료의 눈 자극 전위의 분류에 크게 기여할 것으로 기대된다 (2014)에 제출 하였다.

eye irritation test (eit) for hazard identification of eye irritating chemicals using reconstructed human cornea-like epithelial (rhce) tissue model

유럽​​ 연합 (EU) 화장품 지침 및 EU REACH 법령에 일곱 번째 수정 조항을 준수하기 위해, 사람의 안구 독성의 안정적이고 정확한 평가를위한 검증 된 비 동물 대체 방법이 필요하다. 이러한 필요를 해결하기 위해, 우리는 눈 자극 테스트 정상적인 인간 세포에 기반 삼차원 재구성 인간 각막 상피​​ 형상 (RHCE) 조직 모델을 이용한다 (EIT)를 개발 하였다. EIT는 안구 자극 및 부식 (GHS 분류 1과 2 결합) 및 표시 (GHS 없음 카테고리)를 필요로하지 않는 사람들을 분리 할 수​​있다. 시험은 두 개의 별도의 프로토콜, 액체 화학 물질과 고체 시험 기사에 대한 두 번째, 유사한 프로토콜에 대한 설계를 사용합니다. EIT 예측 모델은 단일 노광 시간 (30 분 액체, 고체 6 HR) 및 단일 조직 생존력 컷오프 (MTT 분석에 의해 결정된 바와 같이 60.0 %)을 사용한다. EIT는 95.5 / 68.2 / 81.8 %의 달성 SENS (44 액체 및 고체 39) (83) 화학 결과에 기초itivity / 특이도 및 정확도 (SS &amp; A) 액체, 고체 용 / 68.4 100.0 / 84.6 % SS &amp; A, 및 97.6 / 68.3 / 전반적인 SS &amp; A의 83.1 %. EIT는 규제 테스트 요구 사항을 충족하기 위해 동물을 사용하지 않고 액체 및 고체 화학의 넓은 범위의 잠재적 인 안구 자극을 분류에 크게 기여할 것이다. EpiOcular EIT 방법은 TG 492으로 OECD 시험 가이드 라인으로 2015 년 구현되었습니다.

10 테스트 제품 (TA) 및 부정과 긍정적 인 컨트롤을 실시 대표 EIT 결과는 표 6과 그림 3에 제시되어있다.이 NC는 100 % 조직의 생존에 해당하는 OD = 1.31에 대한, 따라서 PC (OD 평균 = 0.41) 평균했다 31.2 %의 상대 조직의 생존. EIT 프로토콜 고체 노출 프로토콜을 사용하여, 4 실험실에서 액체 노출 프로토콜 및 8 독립적 인 유효 실험을 이용하여 7 실험실에서 15 유효한 독립적 인 실험을 수행 한 결과, 액체 프로토콜을 사용하여 PC에 대한 평균 조직 생존율은 36.4 ± 4.0이었다 %와 고체 프로토콜 32.3 ± 6.4 %. 모든 경우, 양성 대조군의 결과는 60.0 % (15)의 컷오프 값 이하이었다. 그림 3, TA1, TA2, TA4, TA7에 표시하고, TA8 조직의 생존율&gt; 60.0 %를 가지고 있었고, 따라서 &quot;NI&quot;로 분류 된 바와 같이. TA3, TA5, TA6, TA9 및 TA10은 조직 생존율의 X를했다04, 60.0 %, 따라서 &quot;I&quot;로 분류했다. 중복 된 조직과 조직의 생존 능력의 차이는 TA2의 제외한 모든 조교에 대한 &lt;20.0 %였다. 그들은 모두 EIT 허용 기준 (10.2 절)를 만난 이후 따라서, TA2의 제외한 모든 시험 기사에 대한 결과는 &quot;자격&quot;으로 간주되었다. 이 때문에, 초기 실험에서 TA2 중복 조직 사이의 높은 변동성으로, 두 번째 실험은 공인 EIT 결과를 얻을 필요가 있었다. 본원 RHCE 조직 모델을 이용하여 설명한 바와 같이 EIT 시험 방법의 EURL ECVAM / 화장품 유럽 15,17-19 의해 정식 유효성 검증 multilaboratory 포함한 여러 연구에서 안구 자극의 평가에 사용 하였다. 모든 연구에서, EIT는 재현 할 것으로 보여 올바르게 화학 물질 (물질 및 혼합물 모두) 눈의 자극이나 눈에 심한 손상 교류에 대한 분류 및 표시를 필요로하지 않는 식별 할 수였다UN GHS 15,17-19에 cording. EIT 시험 방법은 민감도, 특이도 및 전반적인 정확도 눈 자극에 대한 유효성 검사 관리 그룹 (VMG)의 허용 기준을 충족 현재는 생체 내 토끼 드레 이즈 테스트 (19)에 대한 부분 교체와 같은 형식적인 구현이 아직되지 않고 있습니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/52979/52979fig1.jpg" /> 그림 1 : 액체 및 고체 시험 기사에 대한 EIT 프로토콜의 개요 약어 사용 : 오전, 분석 매체;. SCC, 표준 배양 조건; PBS, 둘 베코 인산염 완충 식염수; RT 실온. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/52979/52979fig2.jpg" /> 그림 2. MTT 조직 생존 시험 표준 96 웰 플레이트 구성 두 200 μL 분취 량 TRA 아르미리 라벨링 된 96- 웰 플레이트의 적당한 웰에 nsferred. 약어가 사용 : NC, 음성 대조군; PC, 양성 대조군; TA1-TA20, 시험 기사 1-20; 빈, 추출 용매 솔루션입니다. 96- MTT 플레이트 구성은 RHCE 조직 생존 및 EIT 결과를 계산하도록 설계 Excel 스프레드 시트와 함께 사용된다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/52979/52979fig3.jpg" /> 그림 3 : EIT 결과는 10 시험 기사, NC 및 RHCE 조직 모델을 사용하여 PC 컨트롤에 대한 얻은 그래프는 EIT 결과를 제공하기위한 Excel 스프레드 시트에서 생성됩니다.. NC에 60.0 %의 상대 ≤ 조직의 생존을 감소 테스트 화학 물질은 &quot;자극 (&quot;I &quot;, TA3, TA5, TA6, TA9 및 TA10) 및 조직의 생존이&gt; 60.0 %가 비 자극으로 분류했다 테스트 화학 물질 (로 분류됩니다 NI &quot;, TA1, TA2, TA4, TA7 및 TA8). <table border="0" cellpadding="0" cellspaciNG = &quot;0&quot;&gt; <tbody><tr><td colspan="7"> EIT 프로토콜 작업 단계에 대한 시간 (하나의 연산자에 대한 일일의 일을) 시작 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> 각 라인은 조직 일쌍에 해당 </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 단계의 순서 : </td><td> 1 </td><td> (2) </td><td> 3 </td><td> 4 </td><td> (5) </td><td> 6 </td><td> 7 </td></tr><tr><td> 액체 : </td><td> PBS </td><td> TA 노출 </td><td> 포스트 스며 들다 </td><td> 포스트 <td> MTT 반응 </td><td> MTT 추출 </td><td> 측정 </td></tr><tr><td></td><td> 30 분 </td><td> 30 분 </td><td> 12 분 </td><td> 120 분 </td><td> 180 분 </td><td> 120 분 </td><td> 외경 </td></tr><tr><td> NC </td><td> 9시 </td><td> 9시 반 </td><td> 10시 </td><td> 10시 12분 </td><td> 12시 12분 </td><td> 15시 12분 </td><td> 후 </td></tr><tr><td> PC </td><td> 9시 1분 </td><td> 9시 31분 </td><td> 10시 1분 </td><td> 10시 13분 </td><td> 12시 13분 </td><td> 15시 13분 </td><td> 17시 반 </td></tr><tr><td> TA-1 </td><td> 9시 2분 </td><td> 9시 32분 </td><td> 10시 2분 </td><td> 10시 14분 </td><td> 12시 14분 </td><td> 15시 14분 </td><td></td></tr><tr><td> TA-2 &lt;&gt; / STRONG </td><td> 9시 3분 </td><td> 9시 33분 </td><td> 10시 3분 </td><td> 10시 15분 </td><td> 12시 15분 </td><td> 15시 15분 </td><td></td></tr><tr><td> TA-3 </td><td> 9시 4분 </td><td> 9시 34분 </td><td> 10시 4분 </td><td> 10시 16분 </td><td> 12시 16분 </td><td> 15시 16분 </td><td></td></tr><tr><td> TA-4 </td><td> 9시 5분 </td><td> 9시 35분 </td><td> 10시 5분 </td><td> 10시 17분 </td><td> 12시 17분 </td><td> 15시 17분 </td><td></td></tr><tr><td> TA-5 </td><td> 9시 6분 </td><td> 9시 36분 </td><td> 10시 6분 </td><td> 10시 18분 </td><td> 12시 18분 </td><td> 15시 18분 </td><td></td></tr><tr><td> TA-6 </td><td> 9시 7분 </td><td> 9시 37분 </td><td> 10시 7분 </td><td> 10시 19분 </td><td> 12시 19분 </td><td> 15시 19분 </td><td></td></tr><tr><td> TA-7 </td><td> 9시 8분 </td><td> 9시 38분 </td><td> 10시 8분 </td><td> 10시 20분 </td><td> 12시 20분 </td><td> 15시 20분 </td><td></td></tr><tr><td><stro<html> NG&gt; TA-8 </td><td> 9시 9분 </td><td> 9시 39분 </td><td> 10시 9분 </td><td> 10시 21분 </td><td> 12시 21분 </td><td> 15시 21분 </td><td></td></tr><tr><td> TA-9 </td><td> 9시 10분 </td><td> 9시 40분 </td><td> 10시 10분 </td><td> 10시 22분 </td><td> 12시 22분 </td><td> 15시 22분 </td><td></td></tr><tr><td> TA-10 </td><td> 9시 11분 </td><td> 9시 41분 </td><td> 10시 11분 </td><td> 10시 23분 </td><td> 12시 23분 </td><td> 15시 23분 </td><td></td></tr></tbody></table> 표 3. 액체 테스트 제품의 테스트를위한 샘플 시간표를 포함하여 프로토콜 단계를 미리 습윤 DPBS, 테스트 문서의 응용 프로그램 (TAS), 헹굼과 함께 조직을 사후 담근 후 잠복기, MTT 분석, MTT의 추출, 및 MTT OD의 측정은 열에 표시됩니다. 중복 조직을위한 시간은 행에 구성되어 있습니다. 전체 분석 테스트 (10) 조교 및 컨트롤은 하루 만에 완료 할 수 있습니다. e_content &quot;&gt; <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" height="439" width="582"><tbody><tr><td colspan="6"> (2 일 한 운전자에 대한 작업) EIT 프로토콜 단계는 시작 시간 </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> 각 라인은 조직 일쌍에 해당 </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 1 일 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td colspan="2"> 2 일 (다음날) </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 단계의 순서 : </td><td> 1 </stronG&gt; </td><td> (2) </td><td> 3 </td><td> 4 </td><td> (5) </td><td> 6 </td><td> 7 </td></tr><tr><td> 고체 : </td><td> PBS </td><td> TA 노출 </td><td> 포스트 스며 들다 </td><td> 포스트 Incubaction </td><td> MTT 반응 </td><td> MTT 추출 </td><td> 측정 </td></tr><tr><td></td><td> 30 분 </td><td> 6 시간 </td><td> 26 분 </td><td> 18 시간 </td><td> 180 분 </td><td> 120 분 </td><td> 외경 </td></tr><tr><td> NC </td><td> 9시 </td><td> 9시 반 </td><td> 15시 반 </td><td> 15시 56분 </td><td> 9시 56분 </td><td> 12시 56분 </td&gt; <td> 후 </td></tr><tr><td> PC </td><td> 9시 2분 </td><td> 9시 32분 </td><td> 15시 32분 </td><td> 15시 58분 </td><td> 9시 58분 </td><td> 12시 58분 </td><td> 15시 반 </td></tr><tr><td> TA-1 </td><td> 9시 4분 </td><td> 9시 34분 </td><td> 15시 34분 </td><td> 16시 </td><td> 10시 </td><td> 13시 </td><td></td></tr><tr><td> TA-2 </td><td> 9시 6분 </td><td> 9시 36분 </td><td> 15시 36분 </td><td> 16시 2분 </td><td> 10시 2분 </td><td> 13시 2분 </td><td></td></tr><tr><td> TA-3 </td><td> 9시 8분 </td><td> 9시 38분 </td><td> 15시 38분 </td><td> 16시 4분 </td><td> 10시 4분 </td><td> 13시 4분 </td><td></td></tr><tr><td> TA-4 </td><td> 9시 10분 </td><td> 9시 40분 </td><td> 15시 40분 </td><td> 16시 6분 </td><td> 10시 6분 </td><td> 13시 6분 </td><td></td></tr><tr><td> TA-5 </td><td> 9시 12분 </td><td> 9시 42분 </td><td> 15시 42분 </td><td> 16시 8분 </td><td> 10시 8분 &lt;/ TD&gt; <td> 13시 8분 </td><td></td></tr><tr><td> TA-6 </td><td> 9시 14분 </td><td> 9시 44분 </td><td> 15시 44분 </td><td> 16시 10분 </td><td> 10시 10분 </td><td> 13시 10분 </td><td></td></tr><tr><td> TA-7 </td><td> 9시 16분 </td><td> 9시 46분 </td><td> 15시 46분 </td><td> 16시 12분 </td><td> 10시 12분 </td><td> 13시 12분 </td><td></td></tr><tr><td> TA-8 </td><td> 9시 18분 </td><td> 9시 48분 </td><td> 15시 48분 </td><td> 16시 14분 </td><td> 10시 14분 </td><td> 13시 14분 </td><td></td></tr><tr><td> TA-9 </td><td> 9시 20분 </td><td> 9시 50분 </td><td> 15시 50분 </td><td> 16시 16분 </td><td> 10시 16분 </td><td> 13시 16분 </td><td></td></tr><tr><td> TA-10 </td><td> 9시 22분 </td><td> 9시 52분 </td><td> 15시 52분 </td><td> 16시 18분 </td><td> 10시 18분 </td><td> 13시 18분 </td><td></td></tr></tbody></table> 표 4 : 고체 테스트 제품의 테스트를위한 샘플 시간표.를 포함하여 프로토콜 단계 사전 습윤 세정과, 포스트 - 흡수 후 잠복기, MTT 분석, MTT의 추출 및 MTT OD의 측정이 컬럼에 제시되어, DPBS, 시험 기사의 응용 프로그램과 함께 조직을. 중복 조직을위한 시간은 행에 구성되어 있습니다. 10 조교 및 컨트롤 테스트 전체 시험은 2 일에 걸쳐 수행된다. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> 양 </td><td> 시약 </td><td> 보관 조건 </td><td> 출처 </td><td> 기술 </td><td> 유통 기간 </td></tr><tr><td> 1 병, 2 ml의 </td><td> MTT 집중 (MTT-100-CON) </td><td> 빛으로부터 보호 (-20) </td><td> 매텍 </td><td> 냉동 MTT 집중 </td><td> 2개월 </td></tr><tr><td> 1 병, 8 ml의 </td><td> MTT의 희석제 </td><td> 2-8 &amp;# 186; C </td><td> 매텍 </td><td> MTT 농축액을 희석 종래는 MTT 분석에서 사용하는 </td><td> 2개월 </td></tr><tr><td> 1 병, 60 ml의 </td><td> 아이소 프로필 알코올 (CAS 번호 67-63-0) </td><td> RT </td><td> 알드리치 </td><td> 추출 용매 솔루션 </td><td> NA </td></tr></tbody></table> 표 5 : MTT-100 분석 키트 구성 요소. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> 코드 N ° </td><td> 조직 </td><td colspan="2"> 원시 데이터 </td><td colspan="2"> 빈 보정 데이터 </td><td rowspan="2"> 외경의 의미 </td><td rowspan="2"> 생존의 % </td></tr><tr><td></td><td> N </td><td> Aliq. 1 </td><td> Aliq. (2) </td><td> Aliq. 1 </td><td> Aliq. (2) </td></tr><tr><td> NC </td><td>1 </td><td> 1.316 </td><td> 1.352 </td><td> 1.316 </td><td> 1.352 </td><td> 1.334 </td><td> 101.6 </td></tr><tr><td></td><td> (2) </td><td> 1.277 </td><td> 1.309 </td><td> 1.277 </td><td> 1.309 </td><td> 1.293 </td><td> 98.4 </td></tr><tr><td> PC </td><td> 1 </td><td> 0.379 </td><td> 0.397 </td><td> 0.379 </td><td> 0.397 </td><td> 0.388 </td><td> 29.6 </td></tr><tr><td></td><td> (2) </td><td> 0.419 </td><td> 0.442 </td><td> 0.419 </td><td> 0.442 </td><td> 0.431 </td><td> 32.8 </td></tr><tr><td> TA1 </td><td> 1 </td><td> 1.213 </td><td> 1.244 </td><td> 1.213 </td><td> 1.244 </td><td> 1.229 </td><td> 93.5 </td></tr><tr><td></td><td> (2) </td><td> 1.355 </td><td> 1.355 </td><td> 1.355 </td><td> 1.355 </td><td> 1.355 </td><td> 103.2 </td></tr><tr><td> TA2 </td><td> 1 </td><td> 1.210 </td><td> 1.122 </td><td> 1.210 </td><td> 1.122 </td><td> 1.166 </td><td> 88.7 </td></tr><tr><td></td><td> (2) </td><td> 0.828 </td><td> 0.837 </td><td> 0.828 </td><td> 0.837 </td><td> 0.833 </td><td> 63.4 </td></tr><tr><td> TA3 </td><td> 1 </td><td> 0.167 </td><td> 0.168 </td><td> 0.167 </td><td> 0.168 </td><td> 0.167 </td><td> 12.7 </td></tr><tr><td></td><td> (2) </td><td> 0.138 </td><td> 0.136 </td><td> 0.138 </td><td> 0.136 </td><td> 0.137 </td><td> 10.4 </td></tr><tr><td> TA4 </td><td> 1 </td><td> 1.137 </td><td> 1.160 </td><td> 1.137 </td><td> 1.160 </td><td> 1.149 </td><td> 87.4 </td></tr><tr><td></td><td> (2) </td><td> 1.262 </td><td> 1.191 </td><td> 1.262 </td><td> 1.191 </td><td> 1.227 </td><td> 93.4 </td></tr><tr><td> TA5 </td><td> 1 </td><td> 0.610 </td><td> 0.621 </td><td> 0.610 </td><td> 0.621 </td><td> 0.616 </td><td> 46.​​9 </td></tr><tr><td></td><td> (2) </td><td> 0.480 </td><td> 0.484 </td><td> 0.480 </td><td> 0.484 </td><td> 0.482 </td><td> 36.7 </td></tr><tr><td> TA6 </td><td> 1 </td><td> 0.502 </td><td> 0.513 </td><td> 0.502 </td><td> 0.513 </td><td> 0.508 </td><td> 38.7 </td></tr><tr><td></td><td> (2) </td><td> 0.396 </td><td> 0.407 </td><td> 0.396 </td><td> 0.407 </td><td> 0.402 </td><td> 30.6 </td></tr><tr><td> TA7 </td><td> 1 </td><td> 1.048 </td><td> 1.050 </td><td> 1.048 </td><td> 1.050 </td><td> 1.049 </td><td> 79.9 </td></tr><tr><td></td><td> (2) </td><td> 1.149 </td><td> 1.150 </td><td> 1.149 </td><td> 1.150 </td><td> 1.150 </td><td> 87.5 </td></tr><tr><td> TA8 </td><td> 1 </td><td> 1.032 </td><td> 1.034 </td><td> 1.032 </td><td> 1.034 </td><td> 1.033 </td><td> 78.7 </td></tr><tr><td></td><td> (2) </td><td> 0.941 </td><td> 0.935 </td><td> 0.941 </td><td> 0.935 </td><td> 0.938 </td><td> 71.4 </td></tr><tr><td> TA9 </TD&gt; <td> 1 </td><td> 0.022 </td><td> 0.022 </td><td> 0.022 </td><td> 0.022 </td><td> 0.022 </td><td> 1.7 </td></tr><tr><td></td><td> (2) </td><td> 0.144 </td><td> 0.149 </td><td> 0.144 </td><td> 0.149 </td><td> 0.147 </td><td> 11.2 </td></tr><tr><td> TA10 </td><td> 1 </td><td> 0.150 </td><td> 0.150 </td><td> 0.150 </td><td> 0.150 </td><td> 0.150 </td><td> 11.4 </td></tr><tr><td></td><td> (2) </td><td> 0.254 </td><td> 0.255 </td><td> 0.254 </td><td> 0.255 </td><td> 0.255 </td><td> 19.4 </td></tr></tbody></table><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> 평균 </td><td> DIF. </td><td> 의 의미 </td><td> DIF. </td><td> DIF. / 2 </td><td colspan="2"> 분류 </td></tr><tr><td></td><td> OD의 </td><td> OD의 </td><td> 생존율 [%] </td><td> 생존율의 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> NC </td><td> 1.314 </td><td> 0.041 </td><td> 100.0 </td><td> 3.12 </td><td> 1.56 </td><td> NI </td><td> 자격있는 </td></tr><tr><td> PC </td><td> 0.410 </td><td> 0.043 </td><td> 31.2 </td><td> 3.23 </td><td> 1.62 </td><td> 나는 </td><td> 자격있는 </td></tr><tr><td> TA1 </td><td> 1.292 </td><td> 0.127 </td><td> 98.3 </td><td> 9.63 </td><td> 4.81 </td><td> NI </td><td> 자격있는 </td></tr><tr><td> TA2 </td><td> 0.999 </td><td> 0.333 </td><td> 76.1 </td><td> 25.36 </td><td> 12.68 </td><td> NI </td><td> D&gt; (20) </td></tr><tr><td> TA3 </td><td> 0.152 </td><td> 0.030 </td><td> 11.6 </td><td> 2.32 </td><td> 1.16 </td><td> 나는 </td><td> 자격있는 </td></tr><tr><td> TA4 </td><td> 1.188 </td><td> 0.078 </td><td> 90.4 </td><td> 5.94 </td><td> 2.97 </td><td> NI </td><td> 자격있는 </td></tr><tr><td> TA5 </td><td> 0.549 </td><td> 0.134 </td><td> 41.8 </td><td> 10.16 </td><td> 5.08 </td><td> 나는 </td><td> 자격있는 </td></tr><tr><td> TA6 </td><td> 0.455 </td><td> 0.106 </td><td> 34.6 </td><td> 8.07 </td><td> 4.03 </td><td> 나는 </td><td> 자격있는 </td></tr><tr><td> TA7 </td><td> 1.100 </td><td> 0.101 </td><td> 83.7 </td><td> 7.65 </td><td> 3.82 </td><td> NI </td><td> 자격있는 </td></tr><tr><td> TA8 </td><td> 0.986 </td><td> 0.095 </td><td> 75.0 </td><td> 7.23 </td><td> 3.62 </td><td> NI </td><td> 자격있는 </td></tr><tr><td> TA9 </td><td> 0.085 </td><td> 0.125 </td><td> 6.4 </td><td> 9.48 </td><td> 4.74 </td><td> 나는 </td><td> 자격있는 </td></tr><tr><td> TA10 </td><td> 0.203 </td><td> 0.105 </td><td> 15.4 </td><td> 7.95 </td><td> 3.98 </td><td> 나는 </td><td> 자격있는 </td></tr></tbody></table> 표 6 :. 10 시험 기사를 얻을 EIT 결과, NC 및 PC ​​컨트롤은 테이블 자극하다조직의 생존과 EIT 결과를 계산하기위한 Excel 스프레드 시트로 uced. NC에 60.0 %의 상대 ≤ 조직의 생존을 감소 테스트 화학 물질은 &quot;자극 (&quot;I &quot;, TA3, TA5, TA6, TA9 및 TA10) 및 조직의 생존이&gt; 60.0 %가 비 자극으로 분류했다 테스트 화학 물질 (로 분류됩니다 NI &quot;, TA1, TA2, TA4, TA7 및 TA8).

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Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

우리는 세 가지 차원 재구성 된 인간의 각막과 같은 상피 (RHCE) 조직 모델을 활용하여 눈 자극 테스트를 개발했습니다. 시험은 안구 자극과 부식성 물질 (GHS 분류 1과 결합 2) 및 표시 (GHS 없음 카테고리)를 필요로하지 않는 사람들을 구별 할 수있다.

복원 된 인간의 각막 모양의 상피 (RHCE) 조직 모델을 사용하여 눈에 자극성 화학 물질의 위험 식별을위한 눈 자극 시험 (EIT)

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

eye-irritation-test-eit-for-hazard-identification-eye-irritating

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

37.2K 조회수.  MatTek Corporation.  우리는 세 가지 차원 재구성 된 인간의 각막과 같은 상피 (RHCE) 조직 모델을 활용하여 눈 자극 테스트를 개발했습니다. 시험은 안구 자극과 부식성 물질 (GHS 분류 1과 결합 2) 및 표시 (GHS 없음 카테고리)를 필요로하지 않는 사람들을 구별 할 수있다. 

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Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a technology for regenerative medicine2. Unlike viruses, which have significant safety issues, polymeric nanoparticles can be designed to be non-toxic, non-immunogenic, non-mutagenic, easier to synthesize, chemically versatile, capable of carrying larger nucleic acid cargo and biodegradable and/or environmentally responsive. Cationic polymers self-assemble with negatively charged DNA via electrostatic interaction to form complexes on the order of 100 nm that are commonly termed polymeric nanoparticles. Examples of biomaterials used to form nanoscale polycationic gene delivery nanoparticles include polylysine, polyphosphoesters, poly(amidoamines)s and polyethylenimine (PEI), which is a non-degradable off-the-shelf cationic polymer commonly used for nucleic acid delivery1,3 . Poly(beta-amino ester)s (PBAEs) are a newer class of cationic polymers4 that are hydrolytically degradable5,6 and have been shown to be effective at gene delivery to hard-to-transfect cell types such as human retinal endothelial cells (HRECs)7, mouse mammary epithelial cells8, human brain cancer cells9 and macrovascular (human umbilical vein, HUVECs) endothelial cells10.
A new protocol to characterize polymeric nanoparticles utilizing nanoparticle tracking analysis (NTA) is described. In this approach, both the particle size distribution and the distribution of the number of plasmids per particle are obtained11. In addition, a high-throughput 96-well plate transfection assay for rapid screening of the transfection efficacy of polymeric nanoparticles is presented. In this protocol, poly(beta-amino ester)s (PBAEs) are used as model polymers and human retinal endothelial cells (HRECs) are used as model human cells. This protocol can be easily adapted to evaluate any polymeric nanoparticle and any cell type of interest in a multi-well plate format.

A protocol for nanoparticle tracking analysis (NTA) and high-throughput flow cytometry to evaluate polymeric gene delivery nanoparticles is described. NTA is utilized to characterize the nanoparticle particle size distribution and the plasmid per particle distribution. High-throughput flow cytometry enables quantitative transfection efficacy evaluation for a library of gene delivery biomaterials.

고분자 유전자 배달에 대한 평가는 Nanoparticle 추적 분석 및 높은 처리량 유동 세포 계측법에 의해 나노 입자

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

연구

생체공학

Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System

Cancer is one of the leading causes of death worldwide. Current therapeutic strategies are predominantly developed in 2D culture systems, which inadequately reflect physiological conditions in vivo. Biological 3D matrices provide cells an environment in which cells can self-organize, allowing the study of tissue organization and cell differentiation. Such scaffolds can be seeded with a mixture of different cell types to study direct 3D cell-cell-interactions. To mimic the 3D complexity of cancer tumors, our group has developed a 3D in vitro tumor test system.	
	Our 3D tissue test system models the in vivo situation of malignant peripheral nerve sheath tumors (MPNSTs), which we established with our decellularized porcine jejunal segment derived biological vascularized scaffold (BioVaSc). In our model, we reseeded a modified BioVaSc matrix with primary fibroblasts, microvascular endothelial cells (mvECs) and the S462 tumor cell line. For static culture, the vascular structure of the BioVaSc is removed and the remaining scaffold is cut open on one side (Small Intestinal Submucosa SIS-Muc). The resulting matrix is then fixed between two metal rings (cell crowns).	
	Another option is to culture the cell-seeded SIS-Muc in a flow bioreactor system that exposes the cells to shear stress. Here, the bioreactor is connected to a peristaltic pump in a self-constructed incubator. A computer regulates the arterial oxygen and nutrient supply via parameters such as blood pressure, temperature, and flow rate. This setup allows for a dynamic culture with either pressure-regulated pulsatile or constant flow.	
	In this study, we could successfully establish both a static and dynamic 3D culture system for MPNSTs. The ability to model cancer tumors in a more natural 3D environment will enable the discovery, testing, and validation of future pharmaceuticals in a human-like model.

Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System

Methods to create human 3D tumor tissues as test systems are described. These technologies are based on a decellularized Biological Vascularized Scaffold (BioVaSc), primary human cells and a tumor cell line, which can be cultured under static as well as under dynamic conditions in a flow bioreactor.

인간의 3 차원의 조직 공학<em&gt; 시험관</em&gt; 종양 테스트 시스템

Cancer is one of the leading causes of death worldwide.  Current therapeutic strategies are predominantly developed in 2D culture  systems, which ...

Combination of Microstereolithography and Electrospinning to Produce Membranes Equipped with Niches for Corneal Regeneration

Corneal problems affect millions of people worldwide reducing their quality of life significantly. Corneal disease can be caused by illnesses such as Aniridia or Steven Johnson Syndrome as well as by external factors such as chemical burns or radiation. Current treatments are (i) the use of corneal grafts and (ii) the use of stem cell expanded in the laboratory and delivered on carriers (e.g., amniotic membrane); these treatments are relatively successful but unfortunately they can fail after 3-5 years. There is a need to design and manufacture new corneal biomaterial devices able to mimic in detail the physiological environment where stem cells reside in the cornea. Limbal stem cells are located in the limbus (circular area between cornea and sclera) in specific niches known as the Palisades of Vogt. In this work we have developed a new platform technology which combines two cutting-edge manufacturing techniques (microstereolithography and electrospinning) for the fabrication of corneal membranes that mimic to a certain extent the limbus. Our membranes contain artificial micropockets which aim to provide cells with protection as the Palisades of Vogt do in the eye.

We report a technique for the fabrication of micropockets within electrospun membranes in which to study cell behavior. Specifically, we describe a combination of microstereolithography and electrospinning for the production of PLGA (Poly(lactide-co-glycolide)) corneal biomaterial devices equipped with microfeatures.

마이크로 광 및 전기 방사의 조합은 각막 재생을위한 틈새를 장착 멤브레인을 생산하는

Corneal problems affect millions of people worldwide reducing their quality of life significantly. Corneal disease can be caused by illnesses such as ...

Assessing Leukocyte-endothelial Interactions Under Flow Conditions in an Ex Vivo Autoperfused Microflow Chamber Assay

Leukocyte-endothelial interactions are early and critical events in acute and chronic inflammation and can, when dysregulated, mediate tissue injury leading to permanent pathological damage. Existing conventional assays allow the analysis of leukocyte adhesion molecules only after the extraction of leukocytes from the blood. This requires the blood to undergo several steps before peripheral blood leukocytes (PBLs) can be ready for analysis, which in turn can stimulate PBLs influencing the research findings. The autoperfused micro flow chamber assay, however, allows scientists to study early leukocytes functional dysregulation using the systemic flow of a live mouse while having the freedom of manipulating a coated chamber. Through a disease model, the functional expression of leukocyte adhesion molecules can be assessed and quantified in a micro-glass chamber coated with immobilized endothelial adhesion molecules ex vivo. In this model, the blood flows between the right common carotid artery and left external jugular vein of a live mouse under anesthesia, allowing the interaction of native PBLs in the chamber. Real-time experimental analysis is achieved with the assistance of an intravital microscope as well as a Harvard Apparatus pressure device. The application of a flow regulator at the input point of the glass chamber allows comparable physiological flow conditions amongst the experiments. Leukocyte rolling velocity is the main outcome and is measured using the National Institutes of Health open-access software ImageJ. In summary, the autoperfused micro flow chamber assay provides an optimal physiological environment to study leukocytes endothelial interaction and allows researchers to draw accurate conclusions when studying inflammation.

Assessing Leukocyte-endothelial Interactions Under Flow Conditions in an Ex Vivo Autoperfused Microflow Chamber Assay

Here, we present a protocol that allows the investigator to assess leukocyte recruitment dynamics ex vivo by connecting a chamber coated with endothelial-derived adhesion molecules to the circulatory system of a mouse. This method offers significant advantages since it allows for leukocyte assessment under relative biological conditions.

의 흐름 조건에서 백혈구 - 내피 상호 작용을 평가<em&gt; 전의 VIVO</em&gt; Autoperfused 미세 흐름 (microflow) 상공 회의소의 분석

Leukocyte-endothelial interactions are early and critical events in acute and chronic inflammation and can, when dysregulated, mediate tissue injury ...

Encapsulated Cell Technology for the Delivery of Biologics to the Mouse Eye

Many current therapeutics under development for diseases of the posterior pole of the eye are biologics. These drugs need to be administered frequently, typically via intravitreal injections. Encapsulated cells expressing the biologic of choice are becoming a tool for local protein production and release (e.g., via long-term drug delivery). In addition, encapsulation systems utilize permeable materials that allow diffusion of nutrients, waste, and therapeutic factors into and out of cells. This occurs while masking the cells from the host immune response, avoiding the need for suppression of the host immune system. This protocol describes the use of alginate as a polymer in microencapsulation coupled with the electrospray method as a microencapsulation technique. ARPE-19 cells, a spontaneously arising human RPE cell line, has been used in long-term cell therapy experiments due to its lifetime functionality, and it is used here for encapsulation and delivery of the capsules to mouse eyes. The manuscript summarizes the steps for cell microencapsulation, quality control, and ocular delivery.

Presented here is a protocol for the use of alginate as a polymer in microencapsulation of immortalized cells for long-term delivery of biologics to rodent eyes.

마우스 아이에 생물학적 제제의 전달을 위한 캡슐화된 세포 기술

Many current therapeutics under development for diseases of the posterior pole of the eye are biologics. These drugs need to be administered frequently, ...

Growth of Human and Sheep Corneal Endothelial Cell Layers on Biomaterial Membranes

Corneal endothelial cell cultures have a tendency to undergo epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) after loss of cell-to-cell contact. EMT is deleterious for the cells as it reduces their ability to form a mature and functional layer. Here, we present a method for establishing and subculturing human and sheep corneal endothelial cell cultures that minimizes the loss of cell-to-cell contact. Explants of corneal endothelium/Descemet&#39;s membrane are taken from donor corneas and placed into tissue culture under conditions that allow the cells to collectively migrate onto the culture surface. Once a culture has been established, the explants are transferred to fresh plates to initiate new cultures. Dispase II is used to gently lift clumps of cells off tissue culture plates for subculturing. Corneal endothelial cell cultures that have been established using this protocol are suitable for transferring to biomaterial membranes to produce tissue-engineered cell layers for transplantation in animal trials. A custom-made device for supporting biomaterial membranes during tissue culture is described and an example of a tissue-engineered graft composed of a layer of corneal endothelial cells and a layer of corneal stromal cells on either side of a collagen type I membrane is presented.

This protocol describes the critical steps required to establish and grow corneal endothelial cell cultures from explants of human or sheep tissue. A method for subculturing corneal endothelial cells on membranous biomaterials is also presented.

생체 재료 멤브레인에 인간과 양 각막 내피 세포 층의 성장

Corneal endothelial cell cultures have a tendency to undergo epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) after loss of cell-to-cell contact. EMT is ...

Cultivating a Three-dimensional Reconstructed Human Epidermis at a Large Scale

A three-dimensional human epidermis model reconstructed from neonatal primary keratinocytes is presented. Herein, a protocol for the cultivation process and the characterization of the model is described. Neonatal primary keratinocytes are grown submerged on permeable polycarbonate inserts and lifted to the air-liquid interface three days after seeding. After fourteen days of stimulation with defined growth factors and ascorbic acid in high calcium culture medium, the model is fully differentiated. Histological analysis revealed a completely stratified epidermis, mimicking the morphology of native human skin. To characterize the model and its barrier functions, protein levels and localization specific for early-stage keratinocyte differentiation (i.e., keratin 10), late-stage differentiation (i.e., involucrin, loricrin, and filaggrin) and tissue adhesion (i.e., desmoglein 1), were assessed by immunofluorescence. The tissue barrier integrity was further evaluated by measuring transepithelial electrical resistance. Reconstructed human epidermis was responsive to proinflammatory stimuli (i.e., lipopolysaccharide and tumor necrosis factor alpha), leading to increased cytokine release (i.e., interleukin 1 alpha and interleukin 8). This protocol represents a straightforward and reproducible in vitro method to cultivate reconstructed human epidermis as a tool to assess environmental effects and a broad range of skin-related studies.

This protocol describes a straightforward method to cultivate three-dimensional reconstituted human epidermis in a reproducible and robust manner. Additionally, it characterizes the structure-function relationship of the epidermal barrier model. The biological responses of the reconstituted human epidermis upon proinflammatory stimuli are also presented.

대규모로 3차원 재건 된 인간 표피 를 육성

A three-dimensional human epidermis model reconstructed from neonatal primary keratinocytes is presented. Herein, a protocol for the cultivation process ...

Quantifying Fibrillar Collagen Organization with Curvelet Transform-Based Tools

Fibrillar collagens are prominent extracellular matrix (ECM) components, and their topology changes have been shown to be associated with the progression of a wide range of diseases including breast, ovarian, kidney, and pancreatic cancers. Freely available fiber quantification software tools are mainly focused on the calculation of fiber alignment or orientation, and they are subject to limitations such as the requirement of manual steps, inaccuracy in detection of the fiber edge in noisy background, or lack of localized feature characterization. The collagen fiber quantitation tool described in this protocol is characterized by using an optimal multiscale image representation enabled by curvelet transform (CT). This algorithmic approach allows for the removal of noise from fibrillar collagen images and the enhancement of fiber edges to provide location and orientation information directly from a fiber, rather than using the indirect pixel-wise or window-wise information obtained from other tools. This CT-based framework contains two separate, but linked, packages named &#8220;CT-FIRE&#8221; and &#8220;CurveAlign&#8221; that can quantify fiber organization on a global, region of interest (ROI), or individual fiber basis. This quantification framework has been developed for more than ten years and has now evolved into a comprehensive and user-driven collagen quantification platform. Using this platform, one can measure up to about thirty fiber features including individual fiber properties such as length, angle, width, and straightness, as well as bulk measurements such as density and alignment. Additionally, the user can measure fiber angle relative to manually or automatically segmented boundaries. This platform also provides several additional modules including ones for ROI analysis, automatic boundary creation, and post-processing. Using this platform does not require prior experience of programming or image processing, and it can handle large datasets including hundreds or thousands of images, enabling efficient quantification of collagen fiber organization for biological or biomedical applications.

Here, we present a protocol to use a curvelet transform-based, open-source MATLAB software tool for quantifying fibrillar collagen organization in the extracellular matrix of both normal and diseased tissues. This tool can be applied to images with collagen fibers or other types of line-like structures.

곡선 변환 기반 도구를 사용하여 피브릴라 콜라겐 조직을 정량화

Fibrillar collagens are prominent extracellular matrix (ECM) components, and their topology changes have been shown to be associated with the progression ...

Spatio-Temporal In Vivo Imaging of Ocular Drug Delivery Systems using Fiberoptic Confocal Laser Microendoscopy

Subconjunctival injection is an attractive route to administer ocular drugs due to easy trans-scleral access that bypasses anterior ocular barriers, such as the cornea and conjunctiva. While therapeutic effects and pharmacokinetics of the drugs upon subconjunctival injection have been described in some studies, very few assess the ocular distribution of drugs or drug delivery systems (DDS). The latter is critical for the optimization of intraocular DDS design and drug bioavailability to achieve the desired ocular localization and duration of action (e.g., acute versus. prolonged). This study establishes the use of fiberoptic confocal laser microendoscopy (CLM) to qualitatively study the ocular distribution of fluorescent liposomes in real-time in live mice after sub-conjunctival injection. Being designed for in vivo visual inspection of tissues at the microscopic level, this is also the first full description of the CLM imaging method to study spatio-temporal distribution of injectables in the eye after subconjunctival injection.

Spatio-Temporal In Vivo Imaging of Ocular Drug Delivery Systems using Fiberoptic Confocal Laser Microendoscopy

We present a protocol for the use of fiberoptic confocal laser microendoscopy (CLM) to non-invasively study the spatio-temporal distribution of liposomes in the eye after subconjunctival injection.

광섬유 공초점 레이저 미세 내시경 검사를 사용하여 안구 약물 전달 시스템의 생체 내 측두 체 이미징

Subconjunctival injection is an attractive route to administer ocular drugs due to easy trans-scleral access that bypasses anterior ocular barriers, such ...

Isolation and Culture of Primary Human Gingival Epithelial Cells using Y-27632

The gingival tissue is the first structure that protects periodontal tissues and plays meaningful roles in many oral functions. The gingival epithelium is an important structure of gingival tissue, especially in the repair and regeneration of periodontal tissue. Studying the functions of gingival epithelial cells has crucial scientific value, such as repairing oral defects and detecting the compatibility of biomaterials. As human gingival epithelial cells are highly differentiated keratinized cells, their lifespan is short, and they are difficult to passage. So far, there are only two ways to isolate and culture gingival epithelial cells, a direct explant method and an enzymatic method. However, the time required to obtain epithelial cells using the direct explant method is longer, and the cell survival rate of the enzymatic method is lower. Clinically, the acquisition of gingival tissue is limited, so a stable, efficient, and simple in vitro isolation and culture system is needed. We improved the traditional enzymatic method by adding Y-27632, a Rho-associated kinase (ROCK) inhibitor, which can selectively promote the growth of epithelial cells. Our modified enzymatic method simplifies the steps of the traditional enzymatic method and increases the efficiency of culturing epithelial cells, which has significant advantages over the direct explant method and the enzymatic method.

Here we present a modified method for the isolation and culture of human gingival epithelial cells by adding the Rock inhibitor, Y-27632, to the traditional method. This method is easier, less time-consuming, enhances stem cell properties, and produces larger numbers of high-potential epithelial cells both for the laboratory and for clinical applications.

Y-27632를 사용하여 1차 인간 칭기발 상피 세포의 격리 및 배양

The gingival tissue is the first structure that protects periodontal tissues and plays meaningful roles in many oral functions. The gingival epithelium is ...