우리는 누구의 집단 지식이 프로토콜을 가능하게했다 워싱턴 대학에서 전체 모러 그룹을 인정하고 싶습니다. 이 작품에 대한 자금은 정신 건강의 국립 연구소 (1R01MH085495)에 의해 제공됩니다.

1. 문양 마스터 (그림 1)의 준비 <ol><li> 센터 실리콘 스핀 - coater에서 웨이퍼와 표 1에서 두 사이클 스핀 프로그램의 초기 단계에서 아세톤과 웨이퍼를 씻어. 아세톤은 깨끗하고 마른 웨이퍼를 떠나 스핀 프로그램의 두 번째 단계에서 증발합니다. </li><li> 약 1 ML을 적용 AZ9245 표 1에서 설명한 조건을 사용하여 웨이퍼 및 스핀 - 코팅에 포토 레지스트 / 년 (직경). </li><li> 소프트 - 베이크 110 포토 레지스트 코팅 웨이퍼 ° 높은 균일도의 열판을 사용하여 2m를위한 C. </li><li> Photopattern 중 직접 쓰기 석판술 시스템 또는 마스크 aligner 시스템과 적절한 마스크를 사용하여 기판. 마스크는 상업 소스의 숫자에서 구입하실 수 있습니다. 또한, 광학 평면에 매달 자외선 흡수제 잉크, 함께 인쇄된 투명는 큰 기능으로 패턴을 제작하는 데 사용할 수 있습니다. </li><li> 부드러운 교반과 1m 45 S에 대한 반도체 등급 탈이온수 : 1시 2분 400K 개발자의 패턴 웨이퍼를 개발. 반도체 등급 탈이온수 및 질소의 흐름 (N 2) 가스로 건조와 철저히 씻어. 패턴 개발은 UV 필터와 현미경을 사용하여 확인하실 수 있습니다. 패턴이 완전히 발달되지 않은 경우, 웨이퍼는 추가 시간에 개발 솔루션에 제공될 수 있습니다. </li></ol> 참고 : 최상의 결과를 얻으려면, photopatterning는 청정실 환경에서 수행되어야합니다. 2. PDMS 스탬프의 작성 (그림 2) <ol><li> 무게 수지에 의해 10시 1분 준비 : Sylgard 182 (PDMS)의 경화제의 혼합물과 완전히 일회용 배양 접시에있는 혼합물로 마스터 (photopatterned 웨이퍼) 커버. </li><li> 데 - 가스 PDMS - 덮인 더 거품이 표시되지 않습니다과 스탬프가 1.5 H. 65 ° C에서 오븐에 치료하도록 때까지 진공 dessicator의 마스터 이전 치료, 그것은 드 가싱 단계에서 수면 위로 떠오르 수 있으므로 마스터가 접시의 맨 아래에 있는지 확인하십시오 중요합니다. </li><li> 마스터의 진압 PDMS를 잘라 적당한 크기로 잘라. 먼지와 파편으로부터 보호하기 위해 대상 컨테이너 (최대 기능 측면)에 우표를 보관합니다. </li></ol> 3. 문양 골드 기판의 준비 (그림 3) <ol><li> 아무 25mm를 준비하지 않습니다. 10 M.에 대한 산소 플라즈마와 함께 그들을 치료하여 금속 증착 1 라운드 유리 coverslips 각 단계 사이에 N 2 가스의 흐름과 함께 건조, 두 에탄올과 함께 다음 18.2 MΩ 탈이온수로 두 번 씻어. </li><li> 멀티 포켓 전자 - 빔 증착 시스템을 이용하여 예금 50 티타늄은 150 골드가옵니다. 티타늄 레이어와 황금 층의 증착 사이의 증발기를 환기하지 마십시오. 또는, 골드 코팅 coverslips가 공급 업체의 다양한 구입하실 수 있습니다, 그러나, 그것은 금속 층이 전자 - 빔 증발 및 열하지 증발 준비하는 것이 중요합니다. 사용하기 전에 11 : 외부 소스에서 구입한 경우, 골드 기판은 플라즈마 산화 또는 &quot;피라 냐는 물고 기지 너한테 &#39;(30 % H 2 O 2. 7시 3분 콩크 H 2 SO 4)으로 세척 수 있습니다. </li></ol> 참고 : &quot;피라 냐가&quot;솔루션은 유기 화합물의 존재에 폭발합니다. <ol start="3"><li> 스탬핑 솔루션 절대 에탄올 10 MM의 hexadecanethiol 및 backfilling 솔루션 절대 에탄올 1 MM 글리콜 - 종료 thiol를 준비합니다. </li><li> 에탄올과 우표를 씻어 N 2 가스로 완전히 건조. 완전 코팅까지 PDMS 스탬프 dropwise 솔루션을 스탬프 적용합니다. N 2 가스 철저 우표를 건조시킵니다. PDMS 스탬프의 기능에 따라 적절하게 5A 또는 5B로 진행합니다. </li><li><ol class="lalpha"><li> 부드럽게 골드 기판에 도장을 눌러 monolayer가 15 양식 수 있도록 S. </li><li> 기판이 변할 수 있습니다 확보, 18.2 MΩ 탈이온수가 포함된 배양 접시에 골드 기판를 놓습니다. 부드럽게 골드 기판에 도장을 눌러 monolayer가 15 양식 수 있도록 S. </li></ol></li><li> 각 씻어 배양 접시에있는 기판을 배치 후 N 2 가스로 건조, 에탄올과 함께 두 번 스탬프 기판 린스. </li><li> 솔루션을 backfilling와 기판을 커버하고 증발을 방지하기 위해 parafilm으로 요리를 밀봉. </li><li> 배경 monolayer가 12-14 H. 동안 짙은 어둠 속에서 형성하도록 허용 </li><li> backfilling 솔루션에서 패턴 coverslip을 제거하고 각 린스 후 N 2 가스로 건조, 에탄올로 두 번 씻어. </li></ol> 4. 문양의 기판에 단백질과 세포를 적용 <ol><li> 500 μL 1 Dulbecco의 인산의 ML과 작은 페트리 접시 또는 세포 배양 챔버와 덮개의 패턴 coverslip을 장소 (DPBS) 살린 버퍼. DPBS 완전히에도 단백질 범위를 보장하기 위해 단백질 보육 동안 기판을 커버해야합니다. </li><li> DPBS에 단백질의 집중 솔루션을 추가하고 파이프로 솔루션을 혼합팅 여러 번. 37 기판과 단백질 혼합물을 품어 ° C 1 H. laminin과 fibronectin에 대한 최종 농도는 일반적으로 각각 12 μg / ML 20 μg / ML입니다. 단백질은 쉽게 패턴 시각화 수 있도록 아민 반응 형광 염료로 분류하실 수 있습니다. 그러나, 라벨 단백질은 단백질 라벨로 레이블이 지정되지 않은 단백질과 1시 1분은 생물 학적 활동에 영향을 줄 수 있습니다 혼합해야합니다. </li><li> 부화 후, 기판을 건조하거나 공기 물 인터페이스를 통해 그것을 가지고하지를 돌보는 언바운드 단백질을 제거하는 DPBS (4 배)를 철저하게 기판 린스. 처음 세 rinses 후, 젖은 기판을 유지하기 위해 전체 세포 성장 매체의 약 500 μL를 추가합니다. </li><li> 새로운 미디어와 기판을 씻어하는 데 사용되는 성장 미디어를 교체합니다. </li><li> 교제를 끊다 및 기판에 도금을위한 세포를 계산합니다. 등 등 CHO - K1 세포로 hippocampal 뉴런 또는 불후의 세포 라인 등 어느 dissociated 기본 세포는, 이용하실 수 있습니다. </li><li> 기판에 플레이트 dissociated 세포. 일반적으로 30-200 세포 / mm 2 사용됩니다. </li></ol> 5. 대표 결과 : <img src="/files/ftp_upload/3164/3164fig1.jpg" alt="그림 1"/> 그림 1. 무늬 마스터의 photolithographic 준비 일반 설계도. 이 과정에서 실리콘 웨이퍼는 아세톤과 함께 세척 관심의 패턴에 노출 포토 레지스트와 코팅, 그리고 패턴이 개발되고 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/3164/3164fig2.jpg" alt="그림 2"/> 그림 2. PDMS 스탬프 준비를위한 일반적인 설계도. 이 과정에서 패턴 마스터가 Sylgard (10시 1분 수지 : 경화제)로 덮여, 60 오븐에 치료 진공 건조기, ° C에서 드 기름과 크기로 절단. <img src="/files/ftp_upload/3164/3164fig3.jpg" alt="그림 3"/> 그림 3. 기판 patterning 일반 설계도. 이 과정에서 유리 기판은 전자빔 글리콜 종료 alkane의 thiols와 backfilled PDMS 스탬프를 사용하여 microcontact 인쇄 hexadecanethiol에 의해 패턴 증발기,, 그리고 찬란 - 표시된 단백질로 코팅을 사용하여 티타늄 (50A)과 골드 (150A)로 코팅하고 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/3164/3164fig4.jpg" alt="그림 4"/> 그림 4. 문양 마스터 (A)와 PDMS 스탬프 (B) 설명 방법을 사용하여 준비 하였다. 스케일 바는 100μm 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/3164/3164fig5.jpg" alt="그림 5"/> 그림 5. 패턴 샘스 AlexaFluor 647 - 라벨 fibronectin (A) 및 CHO - K1 세포 감금 (B)와 시각. 스케일 바는 100 μm의 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/3164/3164fig6.jpg" alt="그림 6"/> 그림 6. 체외에서 4 일 동안 마우스 E18 hippocampal 뉴런과 문양의 laminin 씨앗. AlexaFluor 350 복합 백신 laminin 항체는 패턴 시각화 (A)을 위해 사용되며 마우스 E18 hippocampal 뉴런은 MitoTracker 레드 580 (B) 물들일 수 있습니다. 스케일 바는 100 μm의 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/3164/3164fig7.jpg" alt="그림 7"/> 그림 7. 패턴 기판 준비 잠재적인 함정이 AlexaFluor fibronectin 흡착 647 - 복합하여 시각. 고르지 단백질 흡착에 (A) 부족 혼합 연결됩니다. 부분 패튼 전송 리드를 스탬프 동안의 압력 (B) 유네븐 응용 프로그램입니다. 스탬핑하는 동안 (C) 과도한 압력이 붕괴를 스탬프로 이어질 수 있습니다. (D) rinsing 동안 공기 물 인터페이스 패턴 표면의 노출은 배경 단백질 흡착이 발생할 수 있습니다. 스케일 바는 100 μm의 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/3164/3164fig8.jpg" alt="그림 8"/> 그림 8. 빠져들 patterning 공기에서 종래의 microcontact 인쇄로 인쇄하기가 어렵습니다 작은 기능과 패턴을 생성할 수 있습니다. 이미지 (A)와 (B) 공기 같은 PDMS 스탬프 (A) 또는 탈이온수 (B)로 인쇄 같은 패턴의 다른 지역을 보여줍니다. 패턴을 (스탬프 붕괴를 방지하기 위해 추가) 서라운드 10μm 전체 지원 라인 (A), 그러나로 표시된 작은 도트 기능 (B) 볼 수없는 모습입니다. 이것은 공기에 인쇄가 큰 기능 잘 작동하지만, 물속에 인쇄 기능이있는 작은 패턴 필요할 수 있습니다 보여줍니다. 스케일 바는 20 μm의 수 있습니다. <table border="1"><tbody><tr><td> 주기 </td><td> 가속 속도 (RPM / S) </td><td> 최종 속도 (RPM) </td><td> 시간 (s) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 500 </td><td> 1000 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 3800 </td><td> 3800 </td><td> 30 </td></tr></tbody></table> 표 1.투 - 사이클 스핀 프로그램은 실리콘 웨이퍼에 AZ9245의 4.5 μm의 두꺼운 코팅을 만드는 데 사용. 패턴 기판, 포토 레지스트의 마스터의 형성을위한 PDMS 스탬프를 준비하려면 것은 첫 번째 (그림 1 및 4A​​) 가공입니다. 주인은 우표의 역수이며 중 직접 쓰기 리소그래피 시스템 또는 마스크 aligner를 사용하여 만들어집니다. 같은 AZ9245 같은 긍정적인 포토 레지스트는, 마스터 생산에 사용되는 경우, 저항 - 코팅 웨이퍼는 최종 기판에 나타납니다 동일한 패턴으로 빛에 노출됩니다. 항상 가능하지 않다지만, 그것은 PDMS 스탬프 마스터를위한 이상적인 비율 (두께에 저항하는 기능 크기) 1시 2분 것을보고되었습니다. 13 우리는 자연에 따라 1시 40분의 가로 세로 비율이 가능하다는 사실을 발견했습니다 패턴. 조건 하에서 AZ9245 코팅된 실리콘 웨이퍼 4.5 μm의의 호칭 두께와 포토 레지스트를 제공 여기에서 설명한. 우리는 AZ9245의 두께가에서&gt; 100 μm의 2 μm의에 이르기까지 다양한 기능을 PDMS 마스터를 생산하는 데 사용할 수있는 것으로 나타났습니다. PDMS 스탬프는 포토 레지스트 (그림 2)에서 조작 마스터를 사용하여 Sylgard 182 (또는 Sylgard 184)에서 주조하고 있습니다. 포토 레지스트 마스터는 동일한 스탬프의 여러 복사본을 만들려면 여러 번 사용할 수 있습니다. 경화 PDMS 후, 우표은 면도날과 결과 스탬프가 유리 coverslip (그림 4B)에 우표 기능 측면을 배치하여 현미경 시각 수를 사용하여 마스터에서 제거됩니다 찬란 표시된 단백질 (그림 3과 5)의 응용 프로그램에 의해 시각 수있는 날카로운, 명확한 단백질 패턴에 적절한 스탬핑 결과. 또는, immunohistochemistry는 셀 고정 후 단백질 패턴 (그림 6)을 시각화하는 데 사용할 수 있습니다. 세포 성장이 잘 불후의 세포 라인과 기본 셀 (그림 5, 6) 모두에 대한 단백질 패턴에 국한됩니다. 이 기술은 쉽게 마스터 있지만, 몇 가지 일반적인 문제가 발생할 수 있습니다. DPBS에 집중 단백질 솔루션의 충분한 혼합하지 않고 단백질의 응용 프로그램이 고르지 단백질 패턴 (그림 7A)을 초래할 수 있습니다. 부적 절한 스탬핑 부분 패턴 전송 또는 도장의 붕괴 (그림 7B - C)을 초래할 수 있습니다. 또한, 공기 adsorbed 단백질을 포함하는 배경으로 감소 저항 (그림 7D)을 일으키는 monolayer를 중단 수있는 패턴 기판을 알아가는 겁니다. 매우 작은 기능 (&lt;5 μm의)와 높은 가로 세로 비율로 구성된 패턴은 종종 변할 microcontact 인쇄의 사용을 필요로합니다. 이 프로 시저 (3.5b) 물 (그림 8) 패턴 이외의 기판에 입금 hexadecanethiol 방지하는 장벽으로 사용됩니다. 14

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Am. Chem. Soc. , 9576-9577 (1995).</li><li>Mrksich, M., Dike, L., Tien, J., Ingber, D., Whitesides, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+microcontact+printing+to+pattern+the+attachment+of+mammalian+cells+to+self-assembled+monolayers+of+alkanethiolates+on+transparent+films+of+gold+and+silver.">Using microcontact printing to pattern the attachment of mammalian cells to self-assembled monolayers of alkanethiolates on transparent films of gold and silver.</a> Experimental Cell Research. , 305-313 (1997).</li><li>Prime, K. L., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adsorption+of+proteins+onto+surfaces+containing+end-attached+oligo(ethylene+oxide)+-+a+model+system+using+self-assembled+monolayers.">Adsorption of proteins onto surfaces containing end-attached oligo(ethylene oxide) - a model system using self-assembled monolayers.</a> J. Am. Chem. Soc. 115, 10714-10721 (1993).</li><li>Raghavan, S., Desai, R., Kwon, Y., Mrksich, M., Chen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micropatterned+Dynamically+Adhesive+Substrates+for+Cell+Migration.">Micropatterned Dynamically Adhesive Substrates for Cell Migration.</a> Langmuir. , 17733-17738 (2010).</li><li>Rogers, J., Bao, Z., Baldwin, K., Dodabalapur, A., Crone, B., Raju, V. R., Kuck, V., Katz, H., Amundson, K., Ewing, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paper-like+electronic+displays:+Large-area+rubber-stamped+plastic+sheets+of+electronics+and+microencapsulated+electrophoretic+inks.">Paper-like electronic displays: Large-area rubber-stamped plastic sheets of electronics and microencapsulated electrophoretic inks.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 4835-4840 (2001).</li><li>Yanker, D., Maurer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+printing+of+trichlorosilanes+on+glass+for+selective+protein+adsorption+and+cell+growth.">Direct printing of trichlorosilanes on glass for selective protein adsorption and cell growth.</a> Molecular Biosystems. 4, 502-504 (2008).</li><li>Johnson, D., Maurer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recycling+and+reusing+patterned+self-assembled+monolayers+for+cell+culture.">Recycling and reusing patterned self-assembled monolayers for cell culture.</a> Chemical Communications. , 520-522 (2011).</li><li>Herne, T., Tarlov, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+DNA+probes+immobilized+on+gold+surfaces.">Characterization of DNA probes immobilized on gold surfaces.</a> J. 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관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

문제 번호는 PDMS 스탬프 제작에 사용되는 마스터의 리소그래피 생산에 발생할 수 있습니다. 헤이지와 이것은 패턴과 확대하거나 누락된 기능에 저항 - 코팅 웨이퍼 결과의 노출 과도에 저항 - 코팅 웨이퍼 결과의 노출 부족. 작은 기능으로 주인이 photopatterning 및 개발 매개 변수의 광범위한 최적화 (포토 레지스트 제조 업체에서 권장하는 매개 변수를 넘어) 요구 수 있지만 일반적으로, 큰 기능 크?...

<table border="1"><tbody><tr><th> 시약의 이름 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th><th> 댓글 (옵션) </th></tr><tr><td> 실리콘 웨이퍼 </td><td> 웨이퍼 서비스를 복원 </td><td></td><td> 2 인치 </td></tr><tr><td> 스핀 coater / 핫 플레이트 </td><td> 브루어 과학 </td><td> 시 200CB 스핀 - 베이크 시스템 </td><td></td></tr><tr><td> AZ9245 포토 레지스트 </td><td> 메이스 케미컬 컴퍼니 </td><td> 105880034-1160 </td><td></td></tr><tr><td> 직접 쓰기 석판술 시스템 </td><td> Microtech SRL </td><td> LW325 LaserWriter 시스템 </td><td></td></tr><tr><td> 마스크 Aligner </td><td> HTG </td><td> 3HR </td><td></td></tr><tr><td> AZ의 400K 개발자 </td><td> 메이스 케미컬 컴퍼니 </td><td> 105880018-1160 </td><td></td></tr><tr><td> Sylgard 182 실리콘 엘라스토머 키트 </td><td> 다우 코닝 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 아무 25mm 없습니다. 1 라운드 유리 coverslips </td><td> VWR </td><td> 16004-310 </td><td></td></tr><tr><td> 플라즈마 산회제 </td><td> 디으너 </td><td> 펨토 </td><td></td></tr><tr><td> 티타늄 조각 Kamis </td><td> 통합 </td><td></td><td> 순수 99.95 % </td></tr><tr><td> 골드 알약 </td><td> Kamis 법인 </td><td></td><td> 순수 99.999 % </td></tr><tr><td> 전자 - 빔 증발기 </td><td> 커트 J. Lesker </td><td> PVD 75 박막 증착 시스템 </td><td> 전자 - 빔 액세서리와 함께 </td></tr><tr><td> Hexadecanethiol </td><td> 알파 Aesar </td><td> A11362 </td><td></td></tr><tr><td> 1 mercaptoundec - 11 - yl) 테트라 (ethyleneglycol) </td><td> 시그마 알드리치 </td><td> 674508 </td><td></td></tr><tr><td> 에탄올 </td><td> Pharmco - aaper </td><td> 111000200 </td><td> 200 증명, 절대 </td></tr><tr><td> Parafilm </td><td> VWR </td><td> 52858-000 </td><td></td></tr><tr><td> DPBS </td><td> VWR </td><td> 4500-434 </td><td> 칼슘, 마그네슘없이 </td></tr><tr><td> 마우스 Laminin I </td><td> VWR </td><td> 95036-762 </td><td></td></tr><tr><td> 인간 플라즈마 Fibronectin </td><td> Invitrogen </td><td> 33016-015 </td><td></td></tr><tr><td> AlexaFluor ® 647 카르복실산, succinimidyl 에스테르 </td><td> Invitrogen </td><td> A - 20006 </td><td></td></tr><tr><td> MitoTracker 레드 580 </td><td> Invitrogen </td><td> M22425 </td><td></td></tr><tr><td> AlexaFluor ® 350 카르복실산, succinimidyl 에스테르 </td><td> Invitrogen </td><td> A - 10168 </td><td></td></tr><tr><td> 안티 laminin 항체 </td><td> 피셔 사이 언티픽 </td><td> AB2034MI </td><td></td></tr></tbody></table>

creating two-dimensional patterned substrates for protein and cell confinement

microcontact 인쇄 직접 단백질, 2 DNA, 3 silanes, 4 자아의 형성을 포함하여 분자의 큰 번호를 인쇄하는 고용 수 있지만 Microcontact 인쇄. 잘 정의된 패턴 기판의 생성을위한 신속한 높은 재현성 방법을 제공 하나 - 조립 골드에 긴 사슬 alkane의 thiols에서 monolayers이 (샘스) 단백질 및 접착제와 강한 지역을 포함하는 특정 패턴을 셀 범위를 제한하는 간단한 방법을 제공합니다. 이 제한은 세포 형태를 제어하기 위해 사용되며 단백질과 세포 생물학 질문 다양한 조사하는 데 유용합니다 수 있습니다. 여기, 우리는 세포 연구를위한 잘 정의된 단백질 패턴 생성을위한 일반적인 방법을 설명하는 다섯이 프로세스는 세 단계 포함 :. 석판술를 사용하여 무늬 마스터의 생산을,의 PDMS 스탬프의 생성 및 microcontact 인쇄 골드 - 코팅 기판. 일단 패턴이 세포 배양 기판은 confining 단백질 및 / 또는 패턴 셀 (기본 셀 또는 셀 라인)의 수 있습니다. 자기 조립 monolayer 화학의 사용 패턴 단백질 / 세포 접착 지역이 아닌 지역에 접착제를 통해 정확한 컨트롤을 허용, 이것은 직접 단백질 스탬프를 사용하여 얻을 수 없습니다. Hexadecanethiol, microcontact 인쇄 단계에서 사용되는 긴 사슬 alkane의 thiol은 쉽게 솔루션에서 단백질을 adsorbs 소수성 표면을 생산하고 있습니다. 기판의 비 인쇄 영역을 backfilling에 사용되는 글리콜 - 종료 thiol는 단백질 흡착을 방지하고 성장 따라서 세포 monolayer를 만듭니다. 6이 thiol 단량체가 정확하게 지원하는 기판의 영역을 정의하는 고도로 구조화된 monolayers을 생산 단백질 흡착 및 세포 성장. 결과적으로,이 기판은 반도체 제작에 세포 행동 7 연구에서 응용 프로그램의 다양한 유용합니다. 8 monolayer 화학 다른 종류의가 직접 유리 기판에 패턴을 만들 수 trichlorosilanes를 사용하여 우리 그룹에서 작업을 포함하여 세포 배양 연구에 사용되고있는 반면, 금에 alkane thiols에서 형성 9 패턴 monolayers 준비를 스트레이트 - 앞으로하고 있습니다. 또한, monolayer 준비에 사용되는 단량체가 상업적으로 사용 가능한 안정하고, 저장 또는 불활성 분위기 하에서 처리를 요구하지 않습니다. alkane thiols의에서 준비 패턴 기판은 셀 감금을 유지, 여러 번 재활용하고 활용할 수 있습니다. 10

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Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

골드에 긴 사슬 alkane thiols의 형성에서 자기 조립 monolayers은 (샘스) 단백질 패턴 및 셀 감금의 형성을위한 잘 정의된 기판을 제공합니다. 와 backfilling 다음 polydimethylsiloxane (PDMS) 스탬프를 사용하여 hexadecanethiol의 Microcontact 인쇄 글리콜 - 종료 alkane thiol 모노머는 스탬프 hexadecanethiol 지역에 단백질과 세포 adsorb 패턴을 생산하고 있습니다.

단백질과 세포 교도소에 대한 2 차원 문양의 기판 만들기

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

12.5K 조회수.  Washington University in St. Louis. 골드에 긴 사슬 alkane thiols의 형성에서 자기 조립 monolayers은 (샘스) 단백질 패턴 및 셀 감금의 형성을위한 잘 정의된 기판을 제공합니다. 와 backfilling 다음 polydimethylsiloxane (PDMS) 스탬프를 사용하여 hexadecanethiol의 Microcontact 인쇄 글리콜 - 종료 alkane thiol 모노머는 스탬프 hexadecanethiol 지역에 단백질과 세포 adsorb 패턴을 생산하고 있습니다.

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Creating Transient Cell Membrane Pores Using a Standard Inkjet Printer

Bioprinting has a wide range of applications and significance, including tissue engineering, direct cell application therapies, and biosensor microfabrication.1-10 Recently, thermal inkjet printing has also been used for gene transfection.8,9 The thermal inkjet printing process was shown to temporarily disrupt the cell membranes without affecting cell viability. The transient pores in the membrane can be used to introduce molecules, which would otherwise be too large to pass through the membrane, into the cell cytoplasm.8,9,11
The application being demonstrated here is the use of thermal inkjet printing for the incorporation of fluorescently labeled g-actin monomers into cells. The advantage of using thermal ink-jet printing to inject molecules into cells is that the technique is relatively benign to cells.8, 12 Cell viability after printing has been shown to be similar to standard cell plating methods1,8. In addition, inkjet printing can process thousands of cells in minutes, which is much faster than manual microinjection. The pores created by printing have been shown to close within about two hours. However, there is a limit to the size of the pore created (~10 nm) with this printing technique, which limits the technique to injecting cells with small proteins and/or particles. 8,9,11
A standard HP DeskJet 500 printer was modified to allow for cell printing.3, 5, 8 The cover of the printer was removed and the paper feed mechanism was bypassed using a mechanical lever. A stage was created to allow for placement of microscope slides and coverslips directly under the print head. Ink cartridges were opened, the ink was removed and they were cleaned prior to use with cells. The printing pattern was created using standard drawing software, which then controlled the printer through a simple print command. 3T3 fibroblasts were grown to confluence, trypsinized, and then resuspended into phosphate buffered saline with soluble fluorescently labeled g-actin monomers. The cell suspension was pipetted into the ink cartridge and lines of cells were printed onto glass microscope cover slips. The live cells were imaged using fluorescence microscopy and actin was found throughout the cytoplasm. Incorporation of fluorescent actin into the cell allows for imaging of short-time cytoskeletal dynamics and is useful for a wide range of applications.13-15

A description of the methods used to convert an HP DeskJet 500 printer into a bioprinter. The printer is capable of processing living cells, which causes transient pores in the membrane. These pores can be utilized to incorporate small molecules, including fluorescent G-actin, into the printed cells.

일반 잉크젯 프린터를 사용하여 과도 세포막의 세공 만들기

Bioprinting has a wide range of applications and significance, including tissue engineering, direct cell application therapies, and biosensor ...

연구

생체공학

Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as growth factors. Here, we outline a method to create opposing gradients of adhesive and soluble cues in a microfluidic chamber, which is compatible with live cell imaging. A copolymer of poly-L-lysine and polyethylene glycol (PLL-PEG) is employed to passivate glass coverslips and prevent non-specific adsorption of biomolecules and cells. Next, microcontact printing or dip pen lithography are used to create tracks of streptavidin on the passivated surfaces to serve as anchoring points for the biotinylated peptide arginine-glycine-aspartic acid (RGD) as the adhesive cue. A microfluidic device is placed onto the modified surface and used to create the gradient of adhesive cues (100% RGD to 0% RGD) on the streptavidin tracks. Finally, the same microfluidic device is used to create a gradient of a chemoattractant such as fetal bovine serum (FBS), as the soluble cue in the opposite direction of the gradient of adhesive cues.

A method for the assembly of adhesive and soluble gradients in a microscopy chamber for live cell migration studies is described. The engineered environment combines antifouling surfaces and adhesive tracks with solution gradients and therefore allows one to determine the relative importance of guidance cues.

형광 현미경과 영상 셀 마이그레이션을위한 접착제 및 가용성식이 그라디언트를 만들기

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as ...

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

Cell patterning platforms support broad research goals, such as construction of predefined in vitro neuronal networks and the exploration of certain central aspects of cellular physiology. To easily combine cell patterning with Multi-Electrode Arrays (MEAs) and silicon-based &#8216;lab on a chip&#8217; technologies, a microfabrication-compatible protocol is required. We describe a method that utilizes deposition of the polymer parylene-C on SiO2&#160;wafers. Photolithography enables accurate and reliable patterning of parylene-C at micron-level resolution. Subsequent activation by immersion in fetal bovine serum (or another specific activation solution) results in a substrate in which cultured cells adhere to, or are repulsed by, parylene or SiO2 regions respectively. This technique has allowed patterning of a broad range of cell types (including primary murine hippocampal cells, HEK 293 cell line, human neuron-like teratocarcinoma cell line, primary murine cerebellar granule cells, and primary human glioma-derived stem-like cells). Interestingly, however, the platform is not universal; reflecting the importance of cell-specific adhesion molecules. This cell patterning process is cost effective, reliable, and importantly can be incorporated into standard microfabrication (chip manufacturing) protocols, paving the way for integration of microelectronic technology.

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

This protocol describes a microfabrication-compatible method for cell patterning on SiO2. A predefined parylene-C design is photolithographically printed on SiO2 wafers. Following incubation with serum (or other activation solution) cells adhere specifically to (and grow according to the conformity of) underlying parylene-C, whilst being repulsed by SiO2 regions.

포토 리소그래피 정의 파릴 렌-C에 대한 세포 패터닝 : 그런가<sub&gt; 2</sub&gt; 기판

Cell patterning platforms support broad research goals, such as construction of predefined in vitro neuronal networks and the exploration of certain ...

Ordering Single Cells and Single Embryos in 3D Confinement: A New Device for High Content Screening

Biological cells are usually observed on flat (2D) surfaces. This condition is not physiological, and phenotypes and shapes are highly variable. Screening based on cells in such environments have therefore serious limitations: cell organelles show extreme phenotypes, cell morphologies and sizes are heterogeneous and/or specific cell organelles cannot be properly visualized. In addition, cells in vivo are located in a 3D environment; in this situation, cells show different phenotypes mainly because of their interaction with the surrounding extracellular matrix of the tissue. In order to standardize and generate order of single cells in a physiologically-relevant 3D environment for cell-based assays, we report here the microfabrication and applications of a device for in vitro 3D cell culture. This device consists of a 2D array of microcavities (typically 105 cavities/cm2), each filled with single cells or embryos. Cell position, shape, polarity and internal cell organization become then normalized showing a 3D architecture. We used replica molding to pattern an array of microcavities, &#8216;eggcups&#8217;, onto a thin polydimethylsiloxane (PDMS) layer adhered on a coverslip. Cavities were covered with fibronectin to facilitate adhesion. Cells were inserted by centrifugation. Filling percentage was optimized for each system allowing up to 80%. Cells and embryos viability was confirmed. We applied this methodology for the visualization of cellular organelles, such as nucleus and Golgi apparatus, and to study active processes, such as the closure of the cytokinetic ring during cell mitosis. This device allowed the identification of new features, such as periodic accumulations and inhomogeneities of myosin and actin during the cytokinetic ring closure and compacted phenotypes for Golgi and nucleus alignment. We characterized the method for mammalian cells, fission yeast, budding yeast, C. elegans with specific adaptation in each case. Finally, the characteristics of this device make it particularly interesting for drug screening assays and personalized medicine.

We report a device and a new method to study cells and embryos. Single cells are precisely ordered in microcavity arrays. Their 3D confinement is a step towards 3D environments encountered in physiological conditions and allows organelle orientation. By controlling cell shape, this setup minimizes variability reported in standard assays.

단일 세포 및 3D 감금 단일 배아 주문 : 하이 콘텐츠 스크리닝을위한 새로운 장치

Biological cells are usually observed on flat (2D) surfaces. This condition is not physiological, and phenotypes and shapes are highly variable. Screening ...

Fluorescence Recovery after Merging a Droplet to Measure the Two-dimensional Diffusion of a Phospholipid Monolayer

We introduce a new method to measure the lateral diffusivity of a surfactant monolayer at the fluid-fluid interface, called fluorescence recovery after merging (FRAM). FRAM adopts the same principles as the fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) technique, especially for measuring fluorescence recovery after bleaching a specific area, but FRAM uses a drop coalescence instead of photobleaching dye molecules to induce a chemical potential gradient of dye molecules. Our technique has several advantages over FRAP: it only requires a fluorescence microscope rather than a confocal microscope equipped with high power lasers; it is essentially free from the selection of fluorescence dyes; and it has far more freedom to define the measured diffusion area. Furthermore, FRAM potentially provides a route for studying the mixing or inter-diffusion of two different surfactants, when the monolayers at a surface of droplet and at a flat air/water interface are prepared with different species, independently.

We present a new technique to measure the lateral diffusion of a surface active species at the fluid-fluid interface by merging a droplet monolayer onto a flat monolayer.

액적 병합 후 형광 복구 인지질 단분자막 이차원 확산을 측정하도록

We introduce a new method to measure the lateral diffusivity of a surfactant monolayer at the fluid-fluid interface, called fluorescence recovery after ...

Expanding Nanopatterned Substrates Using Stitch Technique for Nanotopographical Modulation of Cell Behavior

Substrate nanotopography has been shown to be a potent modulator of cell phenotype and function. To dissect nanotopography modulation of cell behavior, a large area of nanopatterned substrate is desirable so that enough cells can be cultured on the nanotopography for subsequent biochemical and molecular biology analyses. However, current nanofabrication techniques have limitations to generate highly defined nanopatterns over a large area. Herein, we present a method to expand nanopatterned substrates from a small, highly defined nanopattern to a large area using stitch technique. The method combines multiple techniques, involving soft lithography to replicate poly(dimethylsiloxane) (PDMS) molds from a well-defined mold, stitch technique to assemble multiple PDMS molds to a single large mold, and nanoimprinting to generate a master mold on polystyrene (PS) substrates. With the PS master mold, we produce PDMS working substrates and demonstrate nanotopographical modulation of cell spreading. This method provides a simple, affordable yet versatile avenue to generate well-defined nanopatterns over large areas, and is potentially extended to create micro-/nanoscale devices with hybrid components.

A protocol for producing a large area of nanopatterned substrate from small nanopatterned molds for study of nanotopographical modulation of cell behavior is presented.

셀 동작의 Nanotopographical 변조를위한 나노 패턴 기판 사용 스티치 기법을 확장

Substrate nanotopography has been shown to be a potent modulator of cell phenotype and function. To dissect nanotopography modulation of cell behavior, a ...

Evaluation of Keratinocyte Proliferation on Two- and Three-dimensional Type I Collagen Substrates

Type I collagen, useful as a substrate for cell culture, exists in two forms: the two-dimensional, non-fibrous form and three-dimensional, fibril form. Both forms can be prepared with the same type I collagen. In general, the non-fibrous form promotes cell adhesion and proliferation. The fibril form (gels) provides more physiological conditions in many types of cells; therefore, gel culture is useful for examining physiological behaviors of cells, such as drug efficacy.
Researchers can select the appropriate form according to the purpose of its use. For example, in the case of keratinocytes, on-gel culture has been used as a wound healing model. FEPE1L-8, a keratinocyte cell line cultured on the non-fibrous form of type I collagen, promote cell adhesion. Notably, keratinocyte proliferation is slower on the fibril form than the non-fibrous form. Protocols for the preparation of type I collagen for cell culture are simple and have wide applications depending on the experimental needs.

Here, we present a protocol for the preparation of two different forms of culture substrates utilizing type I collagen. Depending on how collagen is handled, collagen molecules either maintain two-dimensional, non-fibrous form or reassemble into three-dimensional, fibril form. Cell proliferation on type I collagen is drastically affected by fibril formation.

Keratinocyte 확산에 2-및 3 차원의 평가 유형 I 교원 질 기판

Type I collagen, useful as a substrate for cell culture, exists in two forms: the two-dimensional, non-fibrous form and three-dimensional, fibril form. ...

Patterning the Geometry of Human Embryonic Stem Cell Colonies on Compliant Substrates to Control Tissue-Level Mechanics

Human embryonic stem cells demonstrate a unique ability to respond to morphogens in vitro by self-organizing patterns of cell fate specification that correspond to primary germ layer formation during embryogenesis. Thus, these cells represent a powerful tool with which to examine the mechanisms that drive early human development. We have developed a method to culture human embryonic stem cells in confined colonies on compliant substrates that provides control over both the geometry of the colonies and their mechanical environment in order to recapitulate the physical parameters that underlie embryogenesis. The key feature of this method is the ability to generate polyacrylamide hydrogels with defined patterns of extracellular matrix ligand at the surface to promote cell attachment. This is achieved by fabricating stencils with the desired geometric patterns, using these stencils to create patterns of extracellular matrix ligand on glass coverslips, and transferring these patterns to polyacrylamide hydrogels during polymerization. This method is also compatible with traction force microscopy, allowing the user to measure and map the distribution of cell-generated forces within the confined colonies. In combination with standard biochemical assays, these measurements can be used to examine the role mechanical cues play in fate specification and morphogenesis during early human development.

Extracellular matrix ligands can be patterned onto polyacrylamide hydrogels to enable the culture of human embryonic stem cells in confined colonies on compliant substrates. This method can be combined with traction force microscopy and biochemical assays to examine the interplay between tissue geometry, cell-generated forces, and fate specification.

조직 수준 역학을 제어하기 위해 준수 기판에 인간 배아 줄기 세포 식민지의 기하학적 패터닝

Human embryonic stem cells demonstrate a unique ability to respond to morphogens in vitro by self-organizing patterns of cell fate specification that ...

Automated Two-dimensional Spatiotemporal Analysis of Mobile Single-molecule FRET Probes

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) is a versatile technique reporting on distances in the sub-nanometer to nanometer range. It has been used in a wide range of biophysical and molecular biological experiments, including the measurement of molecular forces, characterization of conformational dynamics of biomolecules, observation of intracellular colocalization of proteins, and determination of receptor-ligand interaction times. In a widefield microscopy configuration, experiments are typically performed using surface-immobilized probes. Here, a method combining single-molecule tracking with alternating excitation (ALEX) smFRET experiments is presented, permitting the acquisition of smFRET time traces of surface-bound, yet mobile probes in plasma membranes or glass-supported lipid bilayers. For the analysis of recorded data, an automated, open-source software collection was developed supporting (i) the localization of fluorescent signals, (ii) single-particle tracking, (iii) determination of FRET-related quantities including correction factors, (iv) stringent verification of smFRET traces, and (v) intuitive presentation of the results. The generated data can conveniently be used as input for further exploration via specialized software, e.g., for the assessment of the diffusional behavior of probes or the investigation of FRET transitions.

This article presents a method for spatiotemporal analysis of mobile, single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET)-based probes using widefield fluorescence microscopy. The newly developed software toolkit allows the determination of smFRET time traces of moving probes, including the correct FRET efficiency and the molecular positions, as functions of time.

모바일 단일 분자 FRET 프로브의 자동화된 2차원 스파티오 측량 분석

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) is a versatile technique reporting on distances in the sub-nanometer to nanometer range. ...

Generation of Multicue Cellular Microenvironments by UV-Photopatterning of Three-Dimensional Cell Culture Substrates

The extracellular matrix is an important regulator of cell function. Environmental cues existing in the cellular microenvironment, such as ligand distribution and tissue geometry, have been increasingly shown to play critical roles in governing cell phenotype and behavior. However, these environmental cues and their effects on cells are often studied separately using in vitro platforms that isolate individual cues, a strategy that heavily oversimplifies the complex in vivo situation of multiple cues. Engineering approaches can be particularly useful to bridge this gap, by developing experimental setups that capture the complexity of the in vivo microenvironment, yet retain the degree of precision and manipulability of in vitro systems.
This study highlights an approach combining ultraviolet (UV)-based protein patterning and lithography-based substrate microfabrication, which together enable high-throughput investigation into cell behaviors in multicue environments. By means of maskless UV-photopatterning, it is possible to create complex, adhesive protein distributions on three-dimensional (3D) cell culture substrates on chips that contain a variety of well-defined geometrical cues. The proposed technique can be employed for culture substrates made from different polymeric materials and combined with adhesive patterned areas of a broad range of proteins. With this approach, single cells, as well as monolayers, can be subjected to combinations of geometrical cues and contact guidance cues presented by the patterned substrates. Systematic research using combinations of chip materials, protein patterns, and cell types can thus provide fundamental insights into cellular responses to multicue environments.

Traditionally, cell culture is performed on planar substrates that poorly mimic the natural environment of cells in vivo. Here we describe a method to produce cell culture substrates with physiologically relevant curved geometries and micropatterned extracellular proteins, allowing systematic investigations into cellular sensing of these extracellular cues.

Methods Article

단백질과 세포 교도소에 대한 2 차원 문양의 기판 만들기