우리는 도움이 토론 전체 Koshy 실험실 감사합니다. 우리는 패티 Jansma과 조언을 애리조나 신경 과학학과의 대학 감사 및 이미징에 도움이됩니다. 우리는 또한 자신에 vibratome의 사용을 Porreca 실험실 감사합니다. 이 연구는 미국 국립 보건 연구소 (NIH NS065116, AAK)에 의해 지원되었다.

참고 : 마우스는 아리조나 대학에서 음식과 물을 사용할 수 임의로 빛 / 어둠주기를 반전 사육 12 시간과 온도 및 습도 조절 실에서 유지되었다. 실험 지침과 아리조나 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회의 승인하에 실시 하였다. 모든 노력은 고통을 최소화하기 위해 만들어졌다. Cre 호텔 - 기자 마우스 C57BL / 6 배경 (11)에 있으며 상업적으로 사용할 수 있습니다. 1. 마우스 감염 참고 : - (12) 아래에 설명 톡소 포자충와 마우스 감염의 방법은 이전에 10 발표 된 연구에 사용되어왔다. <ol style="margin-left: 40px;"><li> 섬유 아세포 (HFFS) 인간 포피 톡소에서 균주를 성장 둘 베코 고혈당 배양 이글스 중간 (DMEM)를 10 % FBS가 보충 된 수정, 100 U / ㎖ 페니실린, 100 ㎎ / ㎖ strept5 % CO 2 인큐베이터 안에서 T-25 플라스크에서 omycin, 및 2 mM L- 글루타민 (cDMEM)는 기생충 큰 parasitophorous 액포가 형성 될 때까지. </li><li> 다음, 27 게이지 바늘에 연결된 5 ㎖ 주사기 경우에 모든 용액을 전송 플라스크 내부의 2 배를 플라스크의 바닥으로부터 세포를 긁어 및 3 ㎖ 주사기에 연결된 25 게이지 바늘을 통해 생성 된 용액을 통과시킴으로써 주사기 용출 기생충 그 거꾸로 15 ML 원뿔 관 내부에 배치되었습니다. 주사기 플런저를 연결하고 원뿔 튜브에 기생충 솔루션을 전달합니다. </li><li> 원심 분리기 (300)의 X g에서 10 분 동안 튜브. 그리고 나서 상등액을 4-6 ml의 멸균 USP 등급 1X 인산염 완충 식염수 (PBS)의 pH 7.4 (원액)에 펠렛을 재현 탁 대기음. </li><li> 기생충 가운데 큰 사각형의 네 모서리와 중앙 광장에 기생충의 수를 다음 정착 계산하는 원액 10 μL와 혈구를 넣고 5 ~ 10 분을 기다립니다. </li><li> 파라 희석100K / 200 μL의 적절한 접종량에 사이트 후 PBS 200 ㎕의 총 부피로 복강 내 (IP) 주입 된 마우스 배일. 참고 :이 절차를 들어, 마우스는 100K 유형 III (CEP) PBS 1X 200 μL 13 tachyzoites에 접종 하였다. 톡소 플라스마의 다른 균주와 마우스를 감염되면 접종의 농도는 독성의 수준을 고려하여 조정해야 할 수도 있습니다. </li></ol> 2. 관류 및 뇌 수확 주 :이 낭종 피크 번호 마우스의 뇌에서 발견되는 시점을 나타내는 바와 같이이 프로토콜은 이십일일 감염 후의 수 (dpi)에서 수행되었지만, 다른 시점이 사용될 수있다. 17 - 낭종 크기, 개수, 위치 및 유무 마우스 균주, 균주 기생충 타입뿐만 아니라 접종량 7,14를 포함하는 다양한 인자에 의존한다. 수사관들은 개별적으로 마우스와 Toxoplas에 대한 적절한 접종을 결정해야합니다엄마의 변형은 그 / 그녀는 사용합니다. <ol style="margin-left: 40px;"><li> 설치 모든 수술 수확 도구 (그림 1). </li><li> 각 마우스의 경우, 준비하고 얼음에 보관 : 0.9 % 염화 나트륨 (NaCl을) 가득 20ml의 주사기를 + 10 U / ㎖ 헤파린 1X 멸균 USP 등급 PBS (헤파린 / 식염수)에; 20 ML의 주사기는 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA) 가득; 15 ml의 4 % PFA와 섬광 유리 병. 여러 쥐를 들어, 각 관류 솔루션의 전체 신선한 주사기를 그리는 모든 마우스에 필요한 각 솔루션의 전체 양 가득 비커를 준비합니다. </li><li> 200 μL / 케타민 / 크 실라 칵테일의 체중 25g (24 ㎎ / ㎖ 및 4.8 ㎎ / 각각 ml)에 관심이있는 날에 함께 마우스 IP를 마취. 발가락 핀치 반사를 확인하여 마취의 수준에 대한 마우스를 모니터합니다. 마우스가 회사 발가락 핀치에 대한 응답을 보여줍니다 만하면 프로토콜을 계속합니다. 주 : 마취 적절한 레벨에 도달하기 전에 마취로하는 다른 방법은 한 사용될 수있다프로토콜을 진행. </li><li> 적용 대상 거품 플랫폼에서 앙와위에서 마우스를 놓습니다. 다음 70 % 에탄올 (EtOH로) (그림 2A)와 함께 가슴과 복부를 스프레이 발 사지를 핀입니다. 무균 마우스하에 여러 종이 타월 첨가 관류 액의 오버 플로우를 흡수하는 데 도움이 될 수있다. </li><li> 단지 집게로 흉골 아래 리프트 피부는 절개를 만들기 위해 가위를 사용합니다. 가슴 (그림 2B)을 노출 다시 피부를 당겨. </li><li> 과정을 칼 모양의 올리고 퉁명스럽게 멀리 다이어프램에서 해부 간을 노출, 횡격막 바로 아래 복부 절개를합니다. 두 절개, 왼쪽에 하나, 다이어프램을 통해 오른쪽 갈비뼈 아래에 하나를 확인합니다. 약 1 / 2-2 / 3의 방식으로 다음 흉강 (그림 2C)를 열고 다시 반사되어 흉곽을 좌우 절개를 확장 할 수 있습니다. 참고 : 관리법은 장기를 잘라하지 않거나 주요 혈관 뒤관류의 품질을 손상 그럴 경우로이 절차를 반지. </li><li> 10 ~ 20 ml의 4 % PFA 다음 10 ~ 20 ml의 헤파린 / 식염수로 transcardially 관류. 참고 : 관류가 제대로 수행 할 경우, 간 (그림 2D)를 황갈색 빨간색에서 켜집니다. 올바르게 수행되지 않으면 혈관 표시 (도 2E)이 될 것이다. </li><li> 복부에 마우스를 뒤집어서 다시 핀 피트는 70 % EtOH로 머리와 목 스프레이. 목의 기지에서 피부를 들어 올려 절개를합니다. 두개골 (그림 2 층)을 노출 피부를 제거합니다. 어깨 레벨 헤드 참살. 부드럽게 뇌를 제거, 두개골을 제거하고, 4 % PFA (그림 2G-H)로 가득 섬광 유리 병에 넣습니다. 참고 : 잘 관류 경우, 뇌가 눈에 보이는 혈관 (그림 2I) 흰색 나타납니다. 뇌 관류 잘되지 않으면 혈관 표시 (도 2J) 될 것이다. </li><li> 불꽃 배치4 ° C에서 4 % PFA 뇌와 기의 유리 병 하룻밤, 빛 덮여. 냉장 1X PBS로 가득 찬 새로운 섬광 유리 병에 비 USP 등급 1X PBS의 뇌와 전송을 씻어. 빛 덮여 4 ° C에서 1X PBS의 뇌를 저장합니다. 노트 : 청소 및 이미징은 최대 한 달 동안 1X PBS에 저장 섹션으로 수행하지만, PFA 고정 역 것이다 PBS에서 장기간 보관으로 몇 일 이내에 뇌가 최적의 이미지 미만으로 이어질 수있는이 부분에 가장 적합한되었습니다 . 자기 형광 증가 흐림는 한 달 이상 1X PBS에 저장 한 후 몇 군데 일부 섹션에서 언급되었다. </li></ol> 3. 뇌 단면 <ol style="margin-left: 40px;"><li> 1X PBS에서 뇌를 제거하고 더 정확한 수 있도록 뇌 매트릭스 (그림 3A)에 배치, 심지어 뇌를 잘라냅니다. 존재하는 경우, 소뇌 및 후각 전구를 손질 한 다음 2 ~ 3 개의 섹션으로 coronally 뇌를 잘라. <li> 시아 노 아크릴 레이트와 시편 장착 블록 위에 각각의 뇌 부분을 붙입니다. 지원 뇌 부 (도 3b) 뒤에 5 % 아가 로즈 겔의 소 블록을 부착. 주 : 다른지지기구가 사용될 수 있지만,지지 않고, 요철 단면에 vibratome 원인 뇌 밀어있다. </li><li> 에 vibratome와 두꺼운 섹션 4의 속도와 9의 진폭으로 설정 160 μm의 (영상에 사용되는 목적의 작동 거리)로 조직을 잘라. 주 : 속도 및 진폭의 설정이 특정 시스템에 따라 조정될 수있다, 심지어 부드러운 부분을 얻기 위해 사용된다. 설정이있는 경우올바르지 않은 결과는 단차, 조직 또는 채터 마크의 인열 될 수있다. </li><li> 그들은 1 주일 이내에 삭제하려는 경우 1X PBS 차게 신선한 가득 섬광 유리 병으로 조직 섹션을 수집합니다. 섹션 1 주일 이내에 삭제하지 않을 경우, -20 ° C에서 cryopreservative 솔루션 및 저장 가득 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브에 넣 섹션. </li></ol> 뇌 조직 섹션 4. 광학 지우기 참고 :이 프로토콜은 이전에 발행 된 방식 8에서 수정되었습니다. <ol style="margin-left: 40px;"><li> 1X PBS + 2 % 트윈 -20 (GL / PBST)에서 25 %, 50 %, 75 % 및 90 % 부피 / 부피 글리세롤을 준비한다. </li><li> cryopreservative의 경우, 1X PBS로 씻어 내고, 25 % GL / PBST 10ml를 포함하는 섬광 유리 병에 전송, 1X PBS에서 섹션을 제거하거나. 12 시간 동안, 노출 빛에 덮여 4 ° C에서 진탕에 배치 유리 병. </li><li> 모든 섹션이 보에 침몰했는지 확인유리 병의 ttom. 섹션은 다음 12 시간 동안 빛에 노출 적용, 4 ° C에서 진탕에 10 ml의 50 % GL / PBST와 유리 병 및 장소를 채우기 충당하기 위해 충분한 떠나, 25 % GL / PBST를 대기음. 75 % GL / PBST 후 90 % GL / PBST에 대해이 과정을 반복합니다. 최대 청산에 도달하기 위해 24 시간 동안 90 % GL / PBST에 섹션을 남겨주세요. 삭제 절차의 과정 동안 점진적 광 소거 (도 4)를 관찰한다. 참고 : 솔루션 섹션은 유리 병의 바닥에 침몰 직후 변경된 경우이 과정이 신속 할 수있다. 75 % 및 90 %의 솔루션으로, 절은 유리 병의 바닥에 모든 방법을 침몰되지 않지만 중간에 떠. </li></ol> 5. 설치 뇌 조직 섹션 <ol style="margin-left: 40px;"><li> 스페이서를 만들기 위해 5 조각으로 제 1.5 커버 슬립을 잘라. 도 5a에 표시된 점선을 따라 커버 슬립 점수 및 휴식 통치자와 다이아몬드로 만들어진 연필을 사용합니다. 취소 t그는 창을 생성하기 위해 일반 유리 슬라이드에 4 개의 외부 조각을 마련, 조각을 중심하고 올바른 구성 (그림 5B)에서 슬라이드로 스페이서의 조각을 준수하기 위해 솔기에 투명 매니큐어를 브러시. 참고 : 스페이서 슬라이드 및 삭제 섹션을 장착 커버 슬립 사이에 필요한 공간을 만드는 데 사용됩니다. coverslip에 필요한 모든 크기의 창을 만들 수있는 다른 방법으로 절단 될 수있다. 사전 컷 거품 스페이서도 시판되고있다. 매니큐어가 완전히 건조 할 수 있도록하기 위해서는 적어도 하루 전에 설치 섹션에 스페이서 슬라이드를 만드는 것이 가장 좋습니다. </li><li> 팁 플라스틱 전송 피펫을 사용하여 슬라이드로 전송 섹션은 차단. 90 % GL / PBST로 주변 지역을 작성해야합니다. 조심스럽게 확인 모든 거품을 소개 않도록주의하면서 섹션을 통해 커버 슬립을 낮 춥니 다. 초과 GL / PBST는 보풀이없는 닦아 멀리 악인 할 수있다. </li><li> 이미지 GFP + RFP를 포함하는 신경 세포 + <em&gt; 공 초점 현미경 즉시 (그림 7A-B) 저장 한 다음 슬라이드는 평평하고 4 ℃에서 빛 덮여 톡소 포자충 낭종. 참고 : 또한, 인감 완전히 주위의 모든 모서리를 저장하고 나중에 영상화하는 슬라이드. 슬라이드를 밀봉 명확한 매니큐어의 사용은 선택 사항이고 다른 하나는 추가 처리를 위해 나중에 슬라이드에서 섹션을 제거 할 수 있다면 더욱 어렵게 커버 슬립을 제거 할 수 있습니다. </li></ol> 6. 이미징 주 : 현미경 고해상도 Z-스택을 얻는 능력을 갖고 사용할 수있다. <ol style="margin-left: 40px;"><li> 처음에 10 배에 초점면을 발견 한 후, 20 배 목표로 변경하고 GFP + 세포 내부에있는 낭종을 식별 할 섹션을 통해 스캔 할 수 있습니다. 시야에 대한 관심 (ROI)의 지역 센터입니다. </li><li> 40X 목표로 변경합니다. 있는지 확인하기 위해 전체 투자 수익 (ROI)을 통해 아래로 초점 전체 셀 및 CYST는 볼 수 있습니다. 참고 : 이미지는 40X / 1.30 오일 DIC M27의 목적으로 공 초점 현미경을 사용하여 얻을 수 있었다. </li><li> 설치된 이미징 소프트웨어를 사용하여, 낭종 셀 전체를 포함 Z 스택을 얻었다. 이미지를 획득하기 위해 보통 사용되는 설정은도 6에 도시되어있다. 참고 : 설정은 각 연구자의 조직 섹션과 현미경의 기능에 따라 조정해야 할 수도 있습니다. </li><li> 돌기 (64)의 개수를 설정하여 전체 뷰를 구하는 회전 1. 돌기의 수를 설정하여 Z-스택의 최대 투영 화상을 얻는다. 주 : 다른 소프트웨어 패키지가 이용 가능하며 최대 투영을 얻기 위해 사용될 수 있고, 회전뿐만 아니라 Z 스택의 다른 이미지보기. </li><li> 영상 분석 소프트웨어와 이미지를 분석합니다. </li></ol>

<ol>
	<li>Luft, B., Remington, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasmic+encephalitis+in+AIDS.">Toxoplasmic encephalitis in AIDS.</a> Clin Infect Dis. 15 (2), 211-222 (1992).</li><li>Hill, D., Dubey, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasma+gondii:+transmission,+diagnosis+and+prevention.">Toxoplasma gondii: transmission, diagnosis and prevention.</a> Clin Microbiol Infect. 8 (10), 634-640 (2002).</li><li>Ingram, W. M., Goodrich, L. M., Robey, E., Eisen, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mice+infected+with+low-virulence+strains+of+Toxoplasma+gondii+lose+their+innate+aversion+to+cat+urine,+even+after+extensive+parasite+clearance.">Mice infected with low-virulence strains of Toxoplasma gondii lose their innate aversion to cat urine, even after extensive parasite clearance.</a> PloS one. 8 (9), 75246 (2013).</li><li>Evans, A. K., Strassmann, P. S., Lee, I. -. P., Sapolsky, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+Toxoplasma+gondii+cyst+distribution+in+the+forebrain+associate+with+individual+variation+in+predator+odor+avoidance+and+anxiety-related+behavior+in+male+Long-Evans+rats.">Patterns of Toxoplasma gondii cyst distribution in the forebrain associate with individual variation in predator odor avoidance and anxiety-related behavior in male Long-Evans rats.</a> Brain Behav Immun. 37, 122-133 (2013).</li><li>Ferguson, D. J., Hutchison, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+host-parasite+relationship+of+Toxoplasma+gondii+in+the+brains+of+chronically+infected+mice.">The host-parasite relationship of Toxoplasma gondii in the brains of chronically infected mice.</a> Virchows Arch A Pathol Anat Histopathol. 411 (1), 39-43 (1987).</li><li>Ferguson, D. J., Graham, D. I., Hutchison, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathological+changes+in+the+brains+of+mice+infected+with+Toxoplasma+gondii:+a+histological,+immunocytochemical+and+ultrastructural+study.">Pathological changes in the brains of mice infected with Toxoplasma gondii: a histological, immunocytochemical and ultrastructural study.</a> Int J Exp Pathol. 72 (4), 463-474 (1991).</li><li>Melzer, T. C., Cranston, H. J., Weiss, L. M., Halonen, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+Cell+Preference+of+Toxoplasma+gondii+Cysts+in+Murine+Brain:+A+Confocal+Study.">Host Cell Preference of Toxoplasma gondii Cysts in Murine Brain: A Confocal Study.</a> J Neuroparasitology. , (2010).</li><li>Selever, J., Kong, J. -. Q., Arenkiel, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+approach+to+high-resolution+fluorescence+imaging+in+semi-thick+brain+slices.">A rapid approach to high-resolution fluorescence imaging in semi-thick brain slices.</a> J Vis Exp. (53), (2011).</li><li>Koshy, A., Fouts, A., Lodoen, M., Alkan, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasma+secreting+Cre+recombinase+for+analysis+of+host-parasite+interactions.">Toxoplasma secreting Cre recombinase for analysis of host-parasite interactions.</a> Nat Methods. 7 (4), 307-309 (2010).</li><li>Koshy, A. a., Dietrich, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasma+co-opts+host+cells+it+does+not+invade.">Toxoplasma co-opts host cells it does not invade.</a> PLoS pathog. 8 (7), (2012).</li><li>Madisen, L., Zwingman, T. a., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+and+high-throughput+Cre+reporting+and+characterization+system+for+the+whole+mouse+brain.">A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain.</a> Nat Neurosci. 13 (1), 133-140 (2010).</li><li>Caffaro, C. E., Koshy, A. s., Liu, L., Zeiner, G. M., Hirschberg, C. B., Boothroyd, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+nucleotide+sugar+transporter+involved+in+glycosylation+of+the+Toxoplasma+tissue+cyst+wall+is+required+for+efficient+persistence+of+bradyzoites.">A nucleotide sugar transporter involved in glycosylation of the Toxoplasma tissue cyst wall is required for efficient persistence of bradyzoites.</a> PLoS pathog. 9 (5), (2013).</li><li>Saeij, J. P. J., Boyle, J. P., Boothroyd, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+among+the+three+major+strains+of+Toxoplasma+gondii+and+their+specific+interactions+with+the+infected+host.">Differences among the three major strains of Toxoplasma gondii and their specific interactions with the infected host.</a> Trends in parasitology. 21 (10), 476-481 (2005).</li><li>Dubey, J. P., Lindsay, D. S., Speer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+Structures+of+Toxoplasma+gondii+tachyzoites,+bradyzoites,+and+sporozoites+and+biology+and+development+of+tissue+cysts.">a Structures of Toxoplasma gondii tachyzoites, bradyzoites, and sporozoites and biology and development of tissue cysts.</a> Clin Microbiol Rev. 11 (2), 267-299 .</li><li>Prandota, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Possible+Link+Between+Toxoplasma+Gondii+and+the+Anosmia+Associated+With+Neurodegenerative+Diseases.">Possible Link Between Toxoplasma Gondii and the Anosmia Associated With Neurodegenerative Diseases.</a> Am J Alzheimers Dis Other Demen. 29 (3), 205-214 (2014).</li><li>Berenreiterov&#225;, M., Flegr, J., Kub&#283;na, A., N&#283;mec, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+distribution+of+Toxoplasma+gondii+cysts+in+the+brain+of+a+mouse+with+latent+toxoplasmosis:+implications+for+the+behavioral+manipulation+hypothesis.">The distribution of Toxoplasma gondii cysts in the brain of a mouse with latent toxoplasmosis: implications for the behavioral manipulation hypothesis.</a> PloS one. 6 (12), 28925 (2011).</li><li>Ferguson, D. J., Hutchison, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ultrastructural+study+of+the+early+development+and+tissue+cyst+formation+of+Toxoplasma+gondii+in+the+brains+of+mice.">An ultrastructural study of the early development and tissue cyst formation of Toxoplasma gondii in the brains of mice.</a> Parasitol Res. 73 (6), 483-491 (1987).</li><li>De Chiara, G., Marcocci, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infectious+agents+and+neurodegeneration.">Infectious agents and neurodegeneration.</a> Mol Neurobiol. 46 (3), 614-638 (2012).</li><li>Scott, C. a., Rossiter, J. P., Andrew, R. D., Jackson, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+abnormalities+in+neurons+are+sufficient+to+explain+the+clinical+disease+and+fatal+outcome+of+experimental+rabies+in+yellow+fluorescent+protein-expressing+transgenic+mice.">Structural abnormalities in neurons are sufficient to explain the clinical disease and fatal outcome of experimental rabies in yellow fluorescent protein-expressing transgenic mice.</a> J Virol. 82 (1), 513-521 (2008).</li><li>Ke, M. -. T., Fujimoto, S., Imai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SeeDB:+a+simple+and+morphology-preserving+optical+clearing+agent+for+neuronal+circuit+reconstruction.">SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction.</a> Nat Neurosci. 16 (8), 1154-1161 (2013).</li></ol>

저자가 공개하는 게 없다.

감염된 숙주 세포에서 세포 변화는 HIV, 광견병, 클라미디아 (18, 19)와 같은 다른 세포 생물과 감염 질환의 결과에 연결되어 있음을 감안할 때, 우리는 우리가 CNS 사이에 발생하는 친밀한 상호 작용을 연구 할 수 있도록 해주는 기술을 개발 세포 및 톡소 플라스마를 개최. 여기에 기재된 방법은 만성 감염 뉴런의 효율적인 이미징을 가능하게함으로써 이러한 목표를 달성한다. 이 방법?...

A correction was made to <a href="http://www.jove.com/video/52237">"3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii"</a>. The ordering of the authors was inverted. The order has been updated from:
 Anita A. Koshy, Carla M. Cabral
to:
Carla M. Cabral, Anita A. Koshy

A correction was made to <a href="http://www.jove.com/video/52237">"3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii"</a>.

Erratum: 3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii

이 방법의 전체 목표는 고해상도, 의무적 인 세포 내 기생충 톡소 포자충에 감염 개별 뉴런의 3 차원 영상을 얻는 것이다. 톡소 때문에 종종 인간과 설치류를 포함 대형 중간 숙주 범위의 가장 성공적인 기생충 중 하나를 간주됩니다. 인간과 쥐 모두에서, 오염 된 음식이나 물을 섭취를 통해 급성 감염 후, 톡소 플라스마는 양식을 그 느린 복제로의 빠른 복제 양식 (tachyzoite)에서 변환 encysting에 의해 중추 신경계의 지속적인 감염을 일으킬 수있다 (bradyzoite ). 면역 개인,이 잠재 중추 신경계 감염은 비교적 증상이없는 것으로 생각되지만, 에이즈 환자 또는 이식 환자와 같은 면역 개인에, 기생충의 재발은 치명적인 toxoplasmic 뇌염 1,2로 이어질 수 있습니다. 또한, 최근의 연구 하메커니즘은 알 수없는 남아 있지만 톡소 플라스마와 잠재 감염, 설치류 3,4의 행동 변화로 이어질 수있는 것으로 나타했습니다. 놀랍게도, CNS- 톡소 상호 작용의 중요성을 강조하는 이들 데이터에도 불구하고, 비교적 작은, 특히 세포 및 분자 수준에서,이 관계에 대해 공지되어있다. 뇌 기생충 상호 작용의도 간단한 측면을 연구하는 기능은 technologic의 제한에 의해 부분적으로 방해하고있다. 예를 들어, 대부분의 작업은 뉴런 낭종 전자 현미경 (EM) 5,6- 수행 한 지속되는 셀임을 나타내는. EM은 높은 해상도를 제공하지만, 그것은 시간이 소요, 노동 집약적, 비싸다. 면역 형광 (IF) 분석은 최근 EM (7)에 의해 수행 된 작업을 확인하기 위해 공 초점 현미경과 함께 사용되어왔다. 분석은 수행 할 기술적으로 쉽고 상대적으로 저렴하지만, 언더에 이러한 기술을 사용하는 경우TAND 낭종과 감염된 신경 세포 사이의 공간 관계는 시간, 기술적으로 어려운 소비하고, 중요한 정보의 손실을 초래할 수있는 시리얼 재건을 필요로한다. 따라서, 우리는 CNS의 톡소 플라즈마 증의 마우스 모델을 사용하고 EM 또는 면역 조직 화학 (IHC)없이 이미지에 감염된 신경 세포의 전체를 우리를 허용 할 수있는 방법을 개발했다. 이러한 기술을 개발함으로써, 우리는 상대적으로 신속하고 저렴한 방법으로 감염된 세포와 낭종 사이의 세포의 관계를 탐구하기 시작할 수 있습니다. 우리가 개발 한 방법은 기생충 단백질 9,10 주입 된 생체 세포에 표시하는 시스템과 공 초점 현미경 (8)에 의해 광학적으로 청소 및 이미징 두꺼운 뇌 섹션에 대한 새로운 기술을 결합합니다. 이 시스템에서는, 톡소와 재결합 11 치운다 매개 된 후에 만 녹색 형광 단백질 (GFP)을 발현 치운다 리포터 생쥐에 감염 </em&gt; 적색 형광 단백질 (RFP)를 표현하고 숙주 세포 (9)에 Cre 호텔 재조합 효소를 주입 계통. 이 조합은 중추 신경계 감염이 설정된 후, 감염된 마우스의 뇌를 수확 두께 뇌 부분을 잘라 빠르게 RFP + 낭종을 찾아 이미지에 관련된 영역을 식별 할 수있게 해준다. 또한 GFP의 숙주 세포 발현 GFP + 세포의 수는 10 기생충을 포함하지 않는, 기생충 감염에 의해 Cre 호텔의 주입에 전적으로 의존하지 같이 것을 주목하는 것이 중요하다. 이 프로토콜의 목적은 화상 전체의 감염된 뉴런 할 수 있도록하기 때문에, 초점은 GFP + 또한 RFP + 낭종이 포함 뉴런이지만, 프로토콜은 또한 이미지에 GFP + / RFP를 사용할 수 - 뉴런. 감염된 뇌 수확 및 절단되면, 섹션은 글리세롤 청산에 의해 투명하게 렌더링됩니다. 섹션들의 적절한 영역이어서 초점 현미경, 알을 촬상감염된 숙주 세포 및 그 전체 포낭 기생충과 같은 전례 시각화. 여기서 우리는 식별을위한 완전한 프로토콜, 광학 청소, 및 이미징 감염된 신경 세포를 제공한다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1877">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:469px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:265px;">Company</td>
			<td style="width:135px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:1008px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vibratome Series 1000 Sectioning System</td>
			<td>Technical Products International, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Other vibratomes are compatible</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP229-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tween-20</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Premium Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-544-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">#1.5 Coverslips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393 251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Diamond Scriber</td>
			<td>VWR</td>
			<td>52865-005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Zeiss LSM 510 Meta confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM 510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ketaject&#174; Ketamine HCl Inj., USP 100mg/ml</td>
			<td>Western Medical Supply, Inc.</td>
			<td>4165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AnaSed&#174; Injection Xylazine 20mg/ml</td>
			<td>Lloyd Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ZsGreen Mice</td>
			<td>Jackson Laboratories</td>
			<td>7906</td>
			<td>B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm6(CAG-ZsGreen1)Hze/J</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Surgical equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Thumb forceps; Fine scissors-angled to side, sharp-sharp; Sharp-sharp scissors; Kelly hemostats; Mayo scissors; Micro spatula.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Human Foreskin Fibroblasts (HFF) cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>These are primary cells from human foreskins.&#160; We make these in-house but they may be purchased from outside vendors.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#39;s High Glucose Modified Eagles Medium (DMEM)</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30081.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:469px;">Penicillin Streptomycin Solution, 100X</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-002-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:469px;">200mM L-alanyl-L-glutamine</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-015-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:469px;">25cm2 Canted neck flask</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1012639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate-Buffered Saline, 1X Without Calcium and Magnesium</td>
			<td>VWR</td>
			<td>45000-446</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate-Buffered Saline, 10X, USP Sterile Ultra Pure Grade</td>
			<td>amresco</td>
			<td>K813-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:469px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:265px;">Gibco</td>
			<td style="width:135px;">26140-079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:469px;">Bright-Line Hemocytometer</td>
			<td style="width:265px;">Sigma-aldrich</td>
			<td>Z359629-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse Brain Slicer Matrix</td>
			<td>Zivic Instruments</td>
			<td>BSMAS005-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:469px;">Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:135px;">BP358-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:469px;">Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa</td>
			<td style="width:265px;">Sigma-aldrich</td>
			<td style="width:135px;">H3393-100KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:469px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:265px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:135px;">O4042-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:469px;">20ml Disposable Scintillation Vials</td>
			<td style="width:265px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:135px;">FS74500-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alcohol, Ethyl, 95%, 190 Proof</td>
			<td style="width:265px;">In-house</td>
			<td>17212945</td>
			<td>This product is purchased from an in-house stockroom.&#160; Other companies are compatible.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:469px;">Imaris Software</td>
			<td style="width:265px;">Bitplane</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:469px;">Clear nail polish</td>
			<td style="width:265px;"></td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td>Other brands are compatible</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:469px;">10ml Syringe with Luer-Lok</td>
			<td style="width:265px;">VWR</td>
			<td>BD309604</td>
			<td>Other syringes are compatible</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:469px;">Three-way Stopcock</td>
			<td style="width:265px;"></td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td>Any brand is compatible</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:469px;">Hypodermic needle</td>
			<td style="width:265px;"></td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td>Any brand is compatible - used to pin down mouse.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:469px;">Cell Scraper</td>
			<td style="width:265px;"></td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td>Any brand is compatible</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">25G x 12&#34; Tubing, Safety Blood Collection Set, with Luer Adapter</td>
			<td style="width:265px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:135px;">450099</td>
			<td>Other brands are compatible</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

3-d imaging and analysis of neurons infected in vivo with toxoplasma gondii

톡소 포자충은 인간과 설치류를 포함한 광범위한 호스트 범위와 의무적 인, 세포 내 기생충이다. 모두 인간과 설치류에서, 톡소 플라스마는 뇌의 평생 지속적인 감염을 설정합니다. 이 뇌 감염이 태아 또는 뇌의 후천성 면역 결핍 증후군 (AIDS) 환자에 대한이 편애 및 지속성 등의 면역 개인, 대부분의 면역 사람들 무증상이지만 파괴적인 신경 학적 질환으로 이어질 수 있습니다. 따라서, 뇌 - 톡소 상호 작용에 의해 생성 톡소 질병 증상에 중요하다, 그러나 우리는 중추 신경계 (CNS) 및 기생충 세포 간의 세포 또는 분자 상호 작용의 이해가 작은 것은 분명하다. CNS의 마우스 모델에서이 신경 기생충가 지속되는 세포 인 30 년 이상 알려져있다 톡소 플라스마 증,하지만 약간의 정보는 약 사용 가능신경 세포의 일부는 일반적으로 (소마, 수상 돌기, 축색 돌기를) 감염이 세포 관계는 긴장 사이에서 변경하는 경우. 부분에서는 부족은 촬상의 어려움과 이차 전체 감염된 동물로부터 신경 세포를 시각화한다. 이러한 이미지는 통상적으로 직렬 절편 및 전자 현미경 또는 면역 염색 후 공 초점 현미경에 의해 촬상 조직 봉합을 필요로한다. 몇 가지 기술을 조합하여, 여기에 기재된 방법은 면역의 필요없이 입체 시각화 및 개별 만성적 감염 뉴런의 분석을 가능하게 식별하고 낭종이 포함 된 이미지 전체 셀에 두꺼운 부분의 사용 (160 μm의) 사용, 전자 현미경 , 또는 직렬 절편과 바느​​질. 이 기술을 사용하여, 우리는 기생충 감염 및 신경 세포 사이의 관계를 이해하기 시작할 수있다.

도 7은 A와 B가이 새로운 것을 낭종 함유 개의 상이한 160 μm의 두께 부분뿐만 아니라,도 7b에 대한 낭종 간 세포 몸으로부터의 거리의 대표적인 측정. 도면으로부터 GFP + 뉴런을 도시 7 개의 대표 화상을 포함 프로토콜은 그 전체가 감염된 신경 세포의 가시화를 허용.도 7c는이 영상 법으로는 낭종 세포체 (Imaris 7.7) 사이의 거리?...

Watch this Scientific Journal Video about 3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii at JoVE.com

3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii

이 프로토콜을 사용하여, 우리는 시각화 및 encysting 기생충 감염된 신경 세포 사이의 공간 관계의 분석을 가능하게 기생충 톡소 포자충, 감염된 마우스의 이미지를 160 μm의 두께 뇌 부분에 수 있었다.

신경 세포의 3 차원 이미징 및 분석 감염<em&gt; 생체</em&gt;와<em&gt; 톡소 포자충</em

Toxoplasma gondii is an obligate, intracellular parasite with a broad host range, including humans and rodents. In both humans and rodents, Toxoplasma ...

3-d-imaging-analysis-neurons-infected-vivo-with-toxoplasma

Research

JoVE Journal

Neuroscience

3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii

11.4K 조회수.  University of Arizona.  이 프로토콜을 사용하여, 우리는 시각화 및 encysting 기생충 감염된 신경 세포 사이의 공간 관계의 분석을 가능하게 기생충 톡소 포자충, 감염된 마우스의 이미지를 160 μm의 두께 뇌 부분에 수 있었다. 

비디오: 3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii

Scalable Fluidic Injector Arrays for Viral Targeting of Intact 3-D Brain Circuits

Our understanding of neural circuits--how they mediate the computations that subserve sensation, thought, emotion, and action, and how they are corrupted in neurological and psychiatric disorders--would be greatly facilitated by a technology for rapidly targeting genes to complex 3-dimensional neural circuits, enabling fast creation of "circuit-level transgenics." We have recently developed methods in which viruses encoding for light-sensitive proteins can sensitize specific cell types to millisecond-timescale activation and silencing in the intact brain. We here present the design and implementation of an injector array capable of delivering viruses (or other fluids) to dozens of defined points within the 3-dimensional structure of the brain (Figure. 1A, 1B). The injector array comprises one or more displacement pumps that each drive a set of syringes, each of which feeds into a polyimide/fused-silica capillary via a high-pressure-tolerant connector. The capillaries are sized, and then inserted into, desired locations specified by custom-milling a stereotactic positioning board, thus allowing viruses or other reagents to be delivered to the desired set of brain regions. To use the device, the surgeon first fills the fluidic subsystem entirely with oil, backfills the capillaries with the virus, inserts the device into the brain, and infuses reagents slowly (&lt;0.1 microliters/min). The parallel nature of the injector array facilitates rapid, accurate, and robust labeling of entire neural circuits with viral payloads such as optical sensitizers to enable light-activation and silencing of defined brain circuits. Along with other technologies, such as optical fiber arrays for light delivery to desired sets of brain regions, we hope to create a toolbox that enables the systematic probing of causal neural functions in the intact brain. This technology may not only open up such systematic approaches to circuit-focused neuroscience in mammals, and facilitate labeling of brain regions in large animals such as non-human primates, but may also open up a clinical translational path for cell-specific optical control prosthetics, whose precision may enable improved treatment of intractable brain disorders. Finally, such devices as described here may facilitate precisely-timed fluidic delivery of other payloads, such as stem cells and pharmacological agents, to 3-dimensional structures, in an easily user-customizable fashion.

Controlling and analyzing neural circuits in vivo would be facilitated by a technology for delivery of viruses and other reagents to desired 3-dimensional sets of brain regions. We demonstrate customized fluidic injector array fabrication, and delivery of virally-encoded optical sensitizers, enabling optical manipulation of complex brain circuits.

손상 3 - D 뇌 회로의 타겟팅 바이러스성을위한 확장 가능한 유체 인젝터 배열

Our understanding of neural circuits--how they mediate the computations that subserve sensation, thought, emotion, and action, and how they are corrupted ...

연구

신경과학

Optical Imaging of Neurons in the Crab Stomatogastric Ganglion with Voltage-sensitive Dyes

Voltage-sensitive dye imaging of neurons is a key methodology for the understanding of how neuronal networks are organised and how the simultaneous activity of participating neurons leads to the emergence of the integral functionality of the network. Here we present the methodology of application of this technique to identified pattern generating neurons in the crab stomatogastric ganglion. We demonstrate the loading of these neurons with the fluorescent voltage-sensitive dye Di-8-ANEPPQ and we show how to image the activity of dye loaded neurons using the MiCAM02 high speed and high resolution CCD camera imaging system. We demonstrate the analysis of the recorded imaging data using the BVAna imaging software associated with the MiCAM02 imaging system. The simultaneous voltage-sensitive dye imaging of the detailed activity of multiple neurons in the crab stomatogastric ganglion applied together with traditional electrophysiology techniques (intracellular and extracellular recordings) opens radically new opportunities for the understanding of how central pattern generator neural networks work.

Here we present the methodology for fast and high resolution fluorescent voltage-sensitive dye imaging of detailed activity of neurons in the crab stomatogastric ganglion.

전압에 민감한 염료와 크랩 Stomatogastric 신경절에서 뉴런의 광학 이미징

Voltage-sensitive dye imaging of neurons is a key methodology for the understanding of how neuronal networks are organised and how the simultaneous ...

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from individual neurons are critical for understanding how neural circuits function under natural conditions. Traditionally, these recordings have been performed 'blind', meaning the identity of the recorded cell is unknown at the start of the recording. Cellular identity can be subsequently determined via intracellular1, juxtacellular2 or loose-patch3 iontophoresis of dye, but these recordings cannot be pre-targeted to specific neurons in regions with functionally heterogeneous cell types. Fluorescent proteins can be expressed in a cell-type specific manner permitting visually-guided single-cell electrophysiology4-6. However, there are many model systems for which these genetic tools are not available. Even in genetically accessible model systems, the desired promoter may be unknown or genetically homogenous neurons may have varying projection patterns. Similarly, viral vectors have been used to label specific subgroups of projection neurons7, but use of this method is limited by toxicity and lack of trans-synaptic specificity. Thus, additional techniques that offer specific pre-visualization to record from identified single neurons in vivo are needed. Pre-visualization of the target neuron is particularly useful for challenging recording conditions, for which classical single-cell recordings are often prohibitively difficult8-11. The novel technique described in this paper uses retrograde transport of a fluorescent dye applied using tungsten needles to rapidly and selectively label a specific subset of cells within a particular brain region based on their unique axonal projections, thereby providing a visual cue to obtain targeted electrophysiological recordings from identified neurons in an intact circuit within a vertebrate CNS.
The most significant novel advancement of our method is the use of fluorescent labeling to target specific cell types in a non-genetically accessible model system. Weakly electric fish are an excellent model system for studying neural circuits in awake, behaving animals12. We utilized this technique to study sensory processing by "small cells" in the anterior exterolateral nucleus (ELa) of weakly electric mormyrid fish. "Small cells" are hypothesized to be time comparator neurons important for detecting submillisecond differences in the arrival times of presynaptic spikes13. However, anatomical features such as dense myelin, engulfing synapses, and small cell bodies have made it extremely difficult to record from these cells using traditional methods11, 14. Here we demonstrate that our novel method selectively labels these cells in 28% of preparations, allowing for reliable, robust recordings and characterization of responses to electrosensory stimulation.

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograde transport of fluorescent dye labels a sub-population of neurons based on anatomical projection. Labeled axons can be visually targeted in vivo, permitting extracellular recording from identified axons. This technique facilitates recording when neurons cannot be labeled through genetic manipulation or are difficult to isolate using 'blind' in vivo approaches.

역행 형광 라벨이 확인 된 신경 세포의 표적 세포 외 단일 단위 기록을 허용<em&gt; 생체 내</em

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains technically challenging. One approach, Activation-Induced Manganese-enhanced MRI (AIM MRI), has been used successfully to map neuronal activity in rodents 1-5. In AIM MRI, Mn2+ acts a calcium analog and accumulates in depolarized neurons 6,7. Because Mn2+ shortens the T1 tissue property, regions of elevated neuronal activity will enhance in MRI. Furthermore, Mn2+ clears slowly from the activated regions; therefore, stimulation can be performed outside the magnet prior to imaging, enabling greater experimental flexibility. However, because Mn2+ does not readily cross the blood-brain barrier (BBB), the need to open the BBB has limited the use of AIM MRI, especially in mice.
One tool for opening the BBB is ultrasound. Though potentially damaging, if ultrasound is administered in combination with gas-filled microbubbles (i.e., ultrasound contrast agents), the acoustic pressure required for BBB opening is considerably lower. This combination of ultrasound and microbubbles can be used to reliably open the BBB without causing tissue damage 8-11.
Here, a method is presented for performing AIM MRI by using microbubbles and ultrasound to open the BBB. After an intravenous injection of perflutren microbubbles, an unfocused pulsed ultrasound beam is applied to the shaved mouse head for 3 minutes. For simplicity, we refer to this technique of BBB Opening with Microbubbles and UltraSound as BOMUS 12. Using BOMUS to open the BBB throughout both cerebral hemispheres, manganese is administered to the whole mouse brain. After experimental stimulation of the lightly sedated mice, AIM MRI is used to map the neuronal response.
To demonstrate this approach, herein BOMUS and AIM MRI are used to map unilateral mechanical stimulation of the vibrissae in lightly sedated mice 13. Because BOMUS can open the BBB throughout both hemispheres, the unstimulated side of the brain is used to control for nonspecific background stimulation. The resultant 3D activation map agrees well with published representations of the vibrissae regions of the barrel field cortex 14. The ultrasonic opening of the BBB is fast, noninvasive, and reversible; and thus this approach is suitable for high-throughput and/or longitudinal studies in awake mice.

A technique is described for broadly opening the blood-brain barrier in the mouse using microbubbles and ultrasound. Using this technique, manganese can be administered to the mouse brain. Because manganese is an MRI contrast agent that accumulates in depolarized neurons, this approach enables imaging of neuronal activity.

초음파 혈액 - 뇌 장벽 파괴 및 망간 향상된 MRI를 사용하여 기능성 Neuroimaging

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety of brain disorders1,2. To better understand the mechanisms by which brain circuits react to an animal's experience requires the ability to monitor the experience-dependent molecular changes in a given set of neurons, over a prolonged period of time, in the live animal. While experience and associated neural activity is known to trigger gene expression changes in neurons1,2, most of the methods to detect such changes do not allow repeated observation of the same neurons over multiple days or do not have sufficient resolution to observe individual neurons3,4. Here, we describe a method that combines in vivo two-photon microscopy with a genetically encoded fluorescent reporter to track experience-dependent gene expression changes in individual cortical neurons over the course of day-to-day experience. 
One of the well-established experience-dependent genes is Activity-regulated cytoskeletal associated protein (Arc)5,6. The transcription of Arc is rapidly and highly induced by intensified neuronal activity3, and its protein product regulates the endocytosis of glutamate receptors and long-term synaptic plasticity7. The expression of Arc has been widely used as a molecular marker to map neuronal circuits involved in specific behaviors3. In most of those studies, Arc expression was detected by in situ hybridization or immunohistochemistry in fixed brain sections. Although those methods revealed that the expression of Arc was localized to a subset of excitatory neurons after behavioral experience, how the cellular patterns of Arc expression might change with multiple episodes of repeated or distinctive experiences over days was not investigated. 
In vivo two-photon microscopy offers a powerful way to examine experience-dependent cellular changes in the living brain8,9. To enable the examination of Arc expression in live neurons by two-photon microscopy, we previously generated a knock-in mouse line in which a GFP reporter is placed under the control of the endogenous Arc promoter10. This protocol describes the surgical preparations and imaging procedures for tracking experience-dependent Arc-GFP expression patterns in neuronal ensembles in the live animal. In this method, chronic cranial windows were first implanted in Arc-GFP mice over the cortical regions of interest. Those animals were then repeatedly imaged by two-photon microscopy after desired behavioral paradigms over the course of several days. This method may be generally applicable to animals carrying other fluorescent reporters of experience-dependent molecular changes4.

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

Experience-dependent molecular changes in neurons are essential for the brain's ability to adapt in response to behavioral challenges. An in vivo two-photon imaging method is described here that allows the tracking of such molecular changes in individual cortical neurons through genetically encoded reporters.

두피 뉴런에서 생체 내 두 - 광자의 영상은 경험에 의존 분자 변경

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

Modification of a Colliculo-thalamocortical Mouse Brain Slice, Incorporating 3-D printing of Chamber Components and Multi-scale Optical Imaging

The ability of the brain to process sensory information relies on both ascending and descending sets of projections. Until recently, the only way to study these two systems and how they interact has been with the use of in vivo preparations. Major advances have been made with acute brain slices containing the thalamocortical and cortico-thalamic pathways in the somatosensory, visual, and auditory systems. With key refinements to our recent modification of the auditory thalamocortical slice1, we are able to more reliably capture the projections between most of the major auditory midbrain and forebrain structures: the inferior colliculus (IC), medial geniculate body (MGB), thalamic reticular nucleus (TRN), and the auditory cortex (AC). With portions of all these connections retained, we are able to answer detailed questions that complement the questions that can be answered with in vivo preparations. The use of flavoprotein autofluorescence imaging enables us to rapidly assess connectivity in any given slice and guide the ensuing experiment. Using this slice in conjunction with recording and imaging techniques, we are now better equipped to understand how information processing occurs at each point in the auditory forebrain as information ascends to the cortex, and the impact of descending cortical modulation. 3-D printing to build slice chamber components permits double-sided perfusion and broad access to networks within the slice and maintains the widespread connections key to fully utilizing this preparation.

Using multiple angles to cut the mouse pup brain, we improve upon a previously-described acute brain slice which captures the connections between most of the major auditory midbrain and forebrain structures.

Colliculo-thalamocortical 마우스 뇌 조각의 변경, 3 차원 챔버 구성 요소의 인쇄 및 멀티 스케일 광학 이미징을 통합

The ability of the brain to process sensory information relies on both ascending and descending sets of projections. Until recently, the only way to study ...

In Vivo Multimodal Imaging and Analysis of Mouse Laser-Induced Choroidal Neovascularization Model

Laser-induced choroidal neovascularization (CNV) is a well-established model to mimic the wet form of age-related macular degeneration (AMD). In this protocol, we aim to guide the reader not simply through the technical considerations of generating laser-induced lesions to trigger neovascular processes, but rather focus on the powerful information that can be obtained from multimodal longitudinal in vivo imaging throughout the follow-up period.
The laser-induced mouse CNV model was generated by a diode laser administration. Multimodal in vivo imaging techniques were used to monitor CNV induction, progression and regression. First, spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT) was performed immediately after the lasering to verify a break of Bruch&#39;s membrane. Subsequent in vivo imaging using fluorescein angiography (FA) confirmed successful damage of Bruch&#39;s membrane from serial images acquired at the choroidal level. Longitudinal follow-up of CNV proliferation and regression on days 5, 10, and 14 after the lasering was performed using both SD-OCT and FA. Simple and reliable grading of leaky CNV leasions from FA images is&#160;presented. Automated segmentation for measurement of total retinal thickness, combined with manual caliber application for measurement of retinal thickness at CNV sites, allow unbiased evaluation of the presence of edema. Finally, histological verification of CNV is performed using isolectin GS-IB4 staining on choroidal flatmounts. The staining is thresholded, and the isolectin-positive area is calculated with ImageJ.
This protocol is especially useful in therapeutics studies requiring high-throughput-like screening of CNV pathology as it allows fast, multimodal, and reliable classification of CNV pathology and retinal edema. In addition, high resolution SD-OCT enables the recording of other pathological hallmarks, such as the accumulation of subretinal or intraretinal fluid. However, this method does not provide a possibility to automate CNV volume analysis from SD-OCT images, which has to be performed manually.

In Vivo Multimodal Imaging and Analysis of Mouse Laser-Induced Choroidal Neovascularization Model

Here, we present the usefulness of longitudinal in vivo imaging in the follow-up of morphological changes of laser-induced choroidal neovascularization in mice.

Vivo에서 복합 이미징 및 마우스 레이저 유도 안 Neovascularization 모델의 분석

Laser-induced choroidal neovascularization (CNV) is a well-established model to mimic the wet form of age-related macular degeneration (AMD). In this ...

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging methods exist for examining the brain tissue of live newborn mammals. Herein we summarize a protocol for imaging individual cortical neurons in living neonatal mice. This protocol includes the following two methodologies: (1) the Supernova system for sparse and bright labeling of cortical neurons in the developing brain, and (2) a surgical procedure for the fragile neonatal skull. This protocol allows the observation of temporal changes of individual cortical neurites during neonatal stages with a high signal-to-noise ratio. Labeled cell-specific gene silencing and knockout can also be achieved by combining the Supernova with RNA interference and CRISPR/Cas9 gene editing systems. This protocol can, thus, be used for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and changes in neuronal dynamics in disease models.

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

We present an in vivo two-photon imaging protocol for imaging the cerebral cortex of neonatal mice. This method is suitable for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, the molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and the changes in neuronal dynamics in disease models.

Vivo에서 신생아 쥐에 있는 대뇌 피 질의 뉴런의 두 광자 영상

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...

Generation of 3-D Collagen-based Hydrogels to Analyze Axonal Growth and Behavior During Nervous System Development

This protocol uses natural type I collagen to generate three-dimensional (3-D) hydrogel for monitoring and analyzing the axonal growth. The protocol is centered on culturing small pieces of embryonic or early postnatal rodent brains inside a 3-D hydrogel formed by the rat tail tendon-derived type I collagen with specific porosity. Tissue pieces are cultured inside the hydrogel and confronted to specific brain fragments or genetically-modified cell aggregates to produce and secrete molecules suitable for creating a gradient inside the porous matrix. The steps of this protocol are simple and reproducible but include critical steps to be considered carefully during its development. Moreover, the behavior of growing axons can be monitored and analyzed directly using a phase-contrast microscope or mono/multiphoton fluorescence microscope after fixation by immunocytochemical methods.

Here, we provide a method for analyzing the behavior of growing axons in 3D matrices, mimicking their natural development.

신경계 발달 중 축산 성장과 행동을 분석하는 3-D 콜라겐 기반 하이드로겔 생성

This protocol uses natural type I collagen to generate three-dimensional (3-D) hydrogel for monitoring and analyzing the axonal growth. The protocol is ...

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the cerebellum. IO has long been proposed to be crucial for motor control and its activity is currently considered to be at the center of many hypotheses of both motor and cognitive functions of the cerebellum. While its physiology and function have been relatively well studied on single-cell level in vitro, presently there are no reports on the organization of the IO network activity in living animals. This is largely due to the extremely challenging anatomical location of the IO, making it difficult to subject to conventional fluorescent imaging methods, where an optic path must be created through the entire brain located dorsally to the region of interest.
Here we describe an alternative method for obtaining state-of-the-art -level calcium imaging data from the IO network. The method takes advantage of the extreme ventral location of the IO and involves a surgical procedure for inserting a gradient-refractive index (GRIN) lens through the neck viscera to come into contact with the ventral surface of the calcium sensor GCaMP6s-expressing IO in anesthetized mice. A representative calcium imaging recording is shown to demonstrate the feasibility to record IO neuron activity after the surgery. While this is a non-survival surgery and the recordings must be conducted under anesthesia, it avoids damage to life-critical brainstem nuclei and allows conducting large variety of experiments investigating spatiotemporal activity patterns and input integration in the IO. This procedure with modifications could be used for recordings in other, adjacent regions of the ventral brainstem.

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

We present a protocol to expose the brainstem of adult mouse from the ventral side. By using a gradient-refractive index lens with a miniature microscope, calcium imaging can be used to examine the activity of inferior olive neural somata in vivo.