우리는 울름 대학에 의해, 그리고 SciMedia 회사 (도쿄, 일본)에 의해, 뉴캐슬 대학의 과학, 농업 공학 컴퓨팅 과학 학부의 학교에서 지원을 인정합니다.

1. 크랩 Stomatogastric 신경계의 준비 성인 암 pagurus L.는 (- 12 ° C 10) 로컬 소스 (뉴캐슬 대학 해양 연구소를 도브)에서 얻은 및 필터링, aerated 바닷물에 보관했다. 절개 전에 40 분 - 동물 20 얼음에서 그들을 포장하여 anesthetized되었습니다. 우리는 고립 stomatogastric 신경 시스템 (STNS 1)를 사용합니다. 냉장 호수 (10-13 ° C)와 함께 - STNS은 (12 ML / 분 7) 실리콘 엘라스토머 늘어선 (ELASTOSIL RT - 601 바커, 뮌헨, 독일) 페트리 접시에 넘어뜨린 지속 superfused되었습니다. , MgCl 2, 26, CaCl 2, 13, KCl, 11, trisma 기지, 10, maleic 산성, 5 NaCl, 440 : 생리 식염수는 (mMol * L - 1)로 구성되어. 13 ° C와 산도 7.4에서 - - 7.6 살린은 11 일정한 온도에서 보관되었다. stomatoastric 신경절 (STG)의 desheathing 포함한 STNS의 해부와 준비의 세부 단계는, Guttierez 및 Grashow 1 조브 문서에 제공됩니다. 모든 실험은 24 일 1986년 11월 (86/609/EEC)의 유럽 사회 이사회에 따라 진행되었다. 그림 1A는 STNS 및 그림 1B의 구조 다이어그램의 뉴런은 신경의 후부 부분에서 평면 반원으로 배열하는 데 일반적인 desheathed STG를 보여줍니다 보여줍니다. 모델링 점토로, STNS있는 페트리 접시는 이미징 현미경의 운영 플랫폼 (올림푸스, 일본 도쿄 BW51 WI)에 고정됩니다. 모두가 현미경 단계와 현미경은 광학 녹음하는 동안 운동 유물을 방지하기 위해 (Scientifica, 어크필드, 영국)의 진동 절연 테이블에 장착됩니다. stomatogastric 신경절 (STG)에서 생성된 모터 패턴은 세포 음반 2-4을 사용하여 모니터링할 수 있습니다. 이것은 다음 단계로 이루어집니다 : <ol><li> 석유 젤리 기반 원통형 구획은 전기 욕조 (페트리 접시는 이미징 현미경의 운영 플랫폼에 배치되기 전에 이것은 해부 무대에서 수행에서 신경을 분리하는 기본 모터 신경 (lvn)의 섹션 주위에 내장되어 있습니다 ). </li><li> 이 스테인레스 스틸 와이어 전극 중 하나가 다른 하나는 기준 전극으로 목욕에,이 구획에 있습니다. </li><li> 차동 신호는 기록 여과 및 교류 차동 증폭기 (Univ. 카이저슬라우테른, 독일)와 증폭됩니다. </li><li> 신경절의 모터 활동은 오실로 스코프를 (DL708E, 요코, 도쿄, 일본)를 사용하여 모니터링하고 추가로 데이터 수집 보드 (CED 전원, 1401, 캠브리지 전자 디자인, 캠브리지, 영국)와 스파이크 2 v6.10를 사용하여 기록됩니다 소프트웨어 (캠브리지 전자 디자인, 캠브리지, 영국). 파일 스파이크 2 v6.10 (캠브리지 전자 디자인, 캠브리지, 영국)을 사용하여 분석하고 있습니다. </li></ol> 2. 다이 솔루션의 준비 우리는 긍정적인 전류 펄스를 사용하여 microelectrodes을 통해 염료의 로딩을 용이 이중 긍정적인 요금을 가지고있는 형광 전압에 민감한 염료 디 - 8 - ANEPPQ (Bioscience 캠브리지) 5를 사용. 염료 솔루션은 가능한 한 많은 빛으로부터 보호되어야합니다. 염료 솔루션은 다음과 같은 준비가되어 있습니다 : <ol><li> 염료 5 MG는 DMSO (Invitrogen) 용액에 F - 127 Pluronic의 산 1 ML과 혼합됩니다. </li><li> 녹아 염료를 포함하는 플라스틱 약병은 회전 / 시그마 Microcentrifuge 1-14의 분 (시그마, Osterode, 독일) microelectrode을 방해할 수 있습니다 큰 염료 입자를 분리하기 위해 12,000에서 20 분 centrifuged입니다. </li><li> 염색 용액의 표면에 뜨는 (톱 200 μL)이 pipettor를 사용하여 구분하고 별도의 플라스틱 약병에 저장됩니다. 두 튜브는 빛에 노출을 방지하기 위해 알루미늄 호일에 싸여있다. </li><li> 염료 솔루션은 -20 ° C.에 멈춰버립니다 </li><li> 전에 염료 솔루션을 사용 10-15분에 대한 따뜻한 (25 ° C) 물 속에 폐쇄 및 포장 병을 배치하여 녹아있다. </li></ol> 3. 샤프 Microelectrodes를 사용하여 세포 주입에 의한 염료 중 우리는 염색과 뉴런을 로드할 수 날카로운 microelectrodes를 사용합니다. 우리가 MiCAM02 이미징 시스템 (SciMedia, 도쿄, 일본) 6을 사용하는 염료 로딩을 확인하려면 다음과 같이하십시오. 이미징 시스템을 두 개의 CCD 카메라를 가지고 : HR 카메라는 1.4 MS되고있는 최고의 시간적 해상도를 가진 더 나은 공간 해상도를 제공하는 큰 센서 칩 (6.4 mm X 4.8 mm)를 가지고, HS 카메라는 작은 (2.9 mm에게 X 2.1 mm)를 가지고 있지만 최선의 시간적 해상도 0.7 MS를 가지고 빠르게 영상을 허용 빠른 센서 칩. 염료 로딩의 단계는 다음과 같습니다 : <ol><li> Microelectrodes이 함께 가져온하는 P - 97 플라밍 - 브라운 (셔터 인 스트 루먼트, 노바토, CA, 미국) 길이 10cm를 사용하여 전극 풀러, 필라멘트 (GB100TF 8P, 과학 제품, Hofheim, 독일)와 1mm 외경 유리 튜브. 전극의 저항을 가지고 행진25 범위 - 3M KCl 40 MOhm (해당 당기 매개 변수 설정이 전극 풀러의 제조 업체에서 제공하는 피펫의 요리책을 따르십 경우). </li><li> 냉동 염료 솔루션은 용융하고 그것의 매우 작은 금액은 microfil 바늘 (MicroFil - 34G, 세계 정밀 계측기, 사라소타, 플로리다, 미국) -로 빨아 빨아 염료가 microfil 바늘의 2 / 3 차 주위를 채우고 . </li><li> microfil 니들의 염료 솔루션은 microelectrode의 일각에 주입합니다. microelectrode은 15 분 동안 어두운 상자에 배치됩니다. </li><li> microelectrode는 3M KCl 솔루션 backfilled입니다. 전극은 다음 microelectrode의 행동 모세관 힘의 흡입에 의한 전극의 좋은 팁을에 도달하기 위해 염료 솔루션을 수 있도록 다른 10-20분에 대한 어두운 전극 보관 상자에 다시 배치됩니다. </li><li> 준비 microelectrode는 전극 홀더에 위치하고 세포내 앰프의 headstage (IA - 251A, 워너 인 스트 루먼트 주식 회사, 햄든, CT, 미국)에 고정됩니다. </li><li> 세포 증폭기는 microelectrode로 현재 펄스를 운전하는 펄스 신호를 제공하는 데이터 수집 보드에 연결됩니다. </li><li> microelectrode는 microelectrode의 속이는 사람을 (PatchStar, Scientifica (주), 어크필드, 영국)를 사용하여 STG 신경 세포의 세포막에 부드럽게 배치됩니다. 10X 목적의 작동 거리 (UMPLFL10XW, NA 0.30, WD 3.3mm, 올림푸스 주식 회사, 도쿄, 일본) 이후 이미징 현미경은 아주 작은이고, microelectrode는 경사 위치에 위치 (30 ° 정도)과 운동해야 오른쪽 위치로 microelectrode의 현미경 목표의 다시 초점을 microelectrode 이동의 여러 단계가 필요합니다. microelectrode를 시작하려면은 그 끝은 STG 위에 그러한 위치에 이동합니다. 전극 팁 초점이 나타날 때까지 현미경 목표가가 낮아됩니다. 그렇다면 그것은 더욱 저하하지만 microelectrode을 만지는만큼 않습니다. 그것은 목표의 초점을 다시 나타날 때까지 microelectrode이 저하됩니다. 뉴런이 목표의 초점 평면에 명확하게 나타날 때까지이 단계를 반복합니다. 그것이 만지는하고 부드럽게 선택한 STG의 신경 세포의 세포막을 피어 때까지 microelectrode이 저하됩니다. 이것은 오실로 스코프를 사용하여 모니터링할 수 있습니다. </li><li> 세포내 전극은 그 활동을 프로필과 활동 및 세포 전극 2,3,7에서 기록된 STG 활동 사이의 관계를 주어진 신경 세포를 식별하기 위해 선택한 STG의 신경 세포의 활동을 기록하는 데 사용됩니다. </li><li> 세포 증폭기는 현재 분사 모드로 전환합니다 1 초 동안 마지막으로이 microelectrode로 현재는 주입과 일초 간격으로 구분되는 microelectrode에 긍정적인 현재 단계 NA 10 주입 30 분 동안 사용됩니다. 기록된 신경 세포에 주입 전류 드라이브 적극적으로 청구 염료 분자. 장비를 사용할 경우 여러 개의 뉴런이 동시에 주입 수 있습니다. </li><li> 사출 기간에 및 사출의 종료 후 10 분 신경 세포 내에 염료의 확산을 확인합니다. 필터 큐브 MSWG2을 통해 (와,이 작업을 수행하기 위해 우리는 초저 파급 할로겐 광원 (Moritex, 도쿄, 일본 HL - 151)에 의해 10X 객관적이고 조명과 MiCAM02 이미징 시스템 (SciMedia 주, 도쿄, 일본)을 사용 480-550 nm의 여기 필터, 올림푸스 주식 회사, 도쿄, 일본). 이미징 시스템은 192 X 128 픽셀 해상도, 40 MS 이미징 시간 &#39;hbin&#39;모드, 그리고 이미지 세션 당 10 프레임으로 HR 카메라를 사용하도록 설정되어 있습니다. 염색 작성에 성공하면 영상이 microelectrode의 위치 주변의 신경 세포의 염색 패치를 표시해야하고,이 염색 패치 10 분 후 30 분 후에 촬영한 이미지 사이에 성장한다. 염료의 확산은 30 분 후에 부족한 경우 더 주입 시간이 부여됩니다. 또한, 새로운 염료 전극을 사용할 수 있습니다. </li><li> 전극이 신경 세포에서 철수되고 신경 세포는 적어도 20~30분 기분 전환을 위해서 남아 있습니다. 이 시간 이내에 다음 신경 세포가 색소를 주입 수 있습니다. </li></ol> 4. 염색 뉴런의 이미징 단일 뉴런의 활동은 염료 작성 절차 후 몇 군데 있습니다. 또는 두 개 이상의 뉴런이 이미지를 여러 STG의 뉴런의 동시 활동을 가득 수 있습니다. 원칙적으로 많은 그리고 아마도 모든 STG 뉴런은 염료로 가득 수 있습니다. 뉴런의 이미지는 HR 카메라를 사용하여 MiCAM 02 이미징 시스템으로 이루어집니다. 다음과 같이 이미지의 절차는 다음과 같습니다 <ol><li> 현미경 목표가 변경되고 높은 광 전송 효율 20x 목적 (XLUMPLFL20XW/0.95, NA 0.95, WD 2.0mm, 올림푸스 주식 회사, 도쿄, 일본)은 이미징 데이터 수집에 사용됩니다. 이 목표는 또한 10X 객관적이고이 뉴런의 상세한 이미지를 제공하는 높은 배율을 제공 것이 훨씬 더 빛을 수집합니다. 바인<html> 염료 로딩의 소량이 이미 우리가 염료에 의해 뉴런으로 인해 발생할 수 있습니다 잠재적인 사진 손상을 줄일 수 이미징에 대한 낮은 빛의 강도를 사용할 수 또한이 목표와 함께 볼 수 있다고 g 불이 더 효율적인 것을 의미합니다. </li><li> 현미경의 운영 단계는 몇 군데가 의미하는 뉴런의 목적의보기의 분야에 있고 목표가 그들에 초점을 맞추고 있습니다 그러한 위치입니다. </li><li> 세포외 녹음 데이터는 또한 아날로그 입력 채널을 통해 MiCAM 02 이미징 시스템으로 공급됩니다. 이것은 분석 단계에서 광학 신호와 대응하는 모터 패턴이나 extracellularly 기록 스파이크의 관련된 비교적 쉽게 사용할 수 있습니다. </li><li> MiCAM 02 시스템은 2.2 MS 이미징 시간 1.5 MS 이미징 시간 48 X 32 픽셀 해상도를 가진 96 X 64 픽셀 해상도를 사용하도록 설정되어 있습니다. 뉴런의 염색이 매우 강한되지 않은 경우 두 가지 경우 모두에서 &#39;hbin&#39;설정을 사용할 수 있습니다. </li><li> 가벼운 수준은 사진 변조와 기록 뉴런의 사진 손상을 방지하려면 (뉴런에있는 색소 즉, 여전히 이미징에 대한 충분한 형광을 생성한다) 가능한 한 낮게 설정되어 있습니다. </li><li> 실내 조명 및 모든 나머지 광원이 꺼져 있습니다. 또한, 검은 커튼이 외부 소스에서 빛의 노출을 방지하기 위해 녹음 장비 주위 닫힙니다 수 있습니다. </li><li> 길이 16초 - 이미지 세션 4 사이로 설정되어 있습니다. </li><li> 염색 뉴런의 자발적인 활동은 여러 이미지 세션을 통해 기록됩니다. </li></ol> 5. 광학 이미징 데이터 분석 MiCAM 02 이미징 시스템과 관련, 영상 자료를 분석하기 위해 우리는 BVAna 소프트웨어 (SciMedia 주, 도쿄, 일본 버전 10.08)을 사용합니다. 소프트웨어는 이미지 데이터의 시각화를 지원하고뿐만 아니라 분석 도구의 범위를 제공합니다. 데이터 분석 및 해석의 단계는 다음과 같습니다 : <ol><li> 관심 적절한 원형 지역은 각각 기록 뉴런에서 선택됩니다. 일반적으로 우리는 2를 사용 - 48 X 32 픽셀 해상도 뉴런, 그리고 6 조사에 대한 관심을 3 픽셀 반경 지역 - 96 X 64 해상도에서 뉴런을 조사에 대한 관심의 8 픽셀 반경의 지역. </li><li> 데이터의 시간적 스무딩는 염료가 데이터에 형광 (낮은 배경 가치의 상대적으로 낮은 금액을 생성 이것을 나타냅니다 특히, 필요할 수 있습니다, 그것은 사용하는 낮은 조명 수준 또는 낮은 수준의 염색 로딩 원인일 수 있습니다, 예를 들어 기록된 신경 세포의 neurite에서). 일반적으로 이러한 경우에 우리는 3 관자놀이 케어를 사용 - 5 시간 단위. </li><li> 광학 녹음 이외에 우리는 이미징 시스템의 아날로그 입력을 표시하는 선택하여 세포 녹음을 표시합니다. </li><li> 광학 데이터와 아날로그 입력의 시각화에 대한 매개 변수는 컴퓨터 화면에 표시되는 모든 레코딩을 볼 수 있도록 적절하게 설정해야합니다. </li><li> 뉴런, lvn에서 세포외 기록, 그리고 이전 세포내 기록을 바탕으로 신경 세포의 분류 광학 녹음 고려, 이것은 신경 세포의 신원을 확인하고에서 기록된 신경 활동의 활동을 연관 수 있습니다 신경. </li><li> 이것은 광학 녹음이 명확하게 보여줄 것으로 기대하고, 여러 개의 유사한 이벤트, extracellularly 기록 스파이크와 또 다른 뉴런의 활동에 의해 발생 억제 후 시냅스 후보로 subthreshold 이벤트에 해당하는 신경 활동을 통해 평균의 필요없이. 것입니다 </li><li> BVAna 소프트웨어의 데이터 내보내기 기능은 관심이 선택한 지역과 또한 lvn에서 녹음을 포함하고있는 아날로그 입력에 대한 계산 광학 녹음을 수출하는 데 사용할 수 있습니다. 내보낸 데이터 처리 및 추가 다른 데이터 분석 소프트웨어뿐만 아니라 (가장 간단한 경우는 예를 들어 Microsoft Excel에서이 (마이크로 소프트, 레드 몬드, WA, 미국) 추가 시각화 및 데이터 처리를 위해 사용될 수있다)를 사용하여 분석하실 수 있습니다. </li></ol> 6. 대표 결과 lvn의 기록과 함께 STG 게의 pyloric 중앙 패턴 발생기에, 그림 2는 두 뉴런 (PD, pyloric 확장시키는 신경 세포 LP, 측면 pyloric 신경 세포)의 동시 녹음을 보여줍니다. 그들의 세포 기록을 바탕으로 식별 LP와 PD 뉴런의 광학 녹음이 표시되는 LP와 PD 뉴런에 해당하는 세포 레코딩 잘 실제로이 일치합니다. 신경절 및 세포외 기록 사이트 간의 axonal 전송 지연으로 인해 스파이크 봉우리의 광학 및 lvn 녹음 사이의 일관성 12 MS의 지연 (그림 2 삽입된 페이지 참조)이 있습니다. 발표 자료는 또한 기록 뉴런의 스파이크에 해당하는 소마의 신경 활동이 명확하게 감지할 수있다는 것을 보여줍니다. s/ftp_upload/2567/2567fig1.jpg &quot;고도는 =&quot;그림 1 &quot;/&gt; 그림 1. stomatogastric 신경계 (STNS)의) 도식 다이어그램. 코그, commissural 신경절, OG, 식도 신경절, STG, stomatogastric 신경절, 미역, stomatogastric 신경, lvn, 측면 심실 신경. B) 게 stomatogastric 신경절 (STG) - 이미지 STG 뉴런의 반원의 사후 배치를 보여줍니다. <img src="/files/ftp_upload/2567/2567fig2.jpg" alt="그림 2" /> 그림 2. 함께 lvn의 기록과 동시 PD의 단일 스위프 기록 및 LP 신경 세포. 데이터는 광학 및 신경 녹음 잘 일치하고 우리가 신경을 형성 기록 스파이크에 해당하는 신경 활동을 확인할 수 보여줍니다. 광학 및 전기 기록된 활동 사이의 일치를 보여주는 그들의 평균 - 모두 광학 및 전기 기록 - 삽입된 페이지는 LP 액션 잠재력 여러 감시 장치의 오버레이를 보여줍니다. 우리의 광학 녹음 방식은 우리도 PD와 LP 뉴런 14 특성 느린 막 잠재적인 변경 사항을 기록할 수있는 데이터의 낮은 주파수 구성 요소를 필터링하지 않는다는 사실 때문에.

<ol>
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관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

전통적인 전기 생리학 방식 (내부 및 세포외 전극 녹음)와 함께 신경을 STG의 전압에 민감한 염료 영상 8,9 어떻게이 작은, 잘 알려진 여전히 복잡한 신경 시스템 작동의 향상된 이해를하실 수 있습니다. STG는 중앙 패턴 발생기 (CPG)의 연결을 네트워크 10, 11, 따라서 STG의 응급 기능적 특성에 대한 이해도 방법을 일반적으로 이해하기 위해 도움이 될 것입니다 (이것은 pyloric 및 위장 밀 리듬 네트워크를 포함)의 프로토 타입입니다 CPG 네트워크는 네트워크 수준의 기능을 생성합니다. CPG 네트워크 또한 높은인지 기능 13 모터 제어 12 중요한 역할을, 따라서 그들의 응급 속성의 이해는 신경 과학의 여러 분야에서 큰 영향을 미칠 수 있습니다.

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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>MiCAM02</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>SciMedia Ltd, Tokyo, Japan</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Imaging system</td>
</tr>
<tr>
<td>BVAna v.10.08</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>SciMedia, Tokyo, Japab</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Data analysis software for the MiCAM 02 imaging system</td>
</tr>
<tr>
<td>HL-151</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Moritex, Tokyo, Japan</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ultra-low ripple halogen light source</td>
</tr>
<tr>
<td>BX51 WI</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olympus, Tokyo, Japan</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Upright microscope for epifluorescence imaging</td>
</tr>
<tr>
<td>20x imaging objective </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olympus Corporation, Tokyo, Japan</td>
<td>XLUMPLFL20XW/0.95</td>
<td>NA 0.95, WD 2.0mm</td>
</tr>
<tr>
<td>10x imaging objective </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olympus Corporation, Tokyo, Japan</td>
<td>UMPLFL10XW</td>
<td>NA 0.30, WD 3.3mm</td>
</tr>
<tr>
<td>Filter cube with 480-550 nm excitation filter and 590nm emission filter </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olympus Corporation, Tokyo, Japan</td>
<td>MSWG2</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Antivibration table</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Scientifica Ltd, Uckfield, UK</td>
<td>63-534</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PatchStar electrode manipulator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Scientifica Ltd, Uckfield, UK</td>
<td>PS-7000C</td>
<td>Micro-electrode manipulator</td>
</tr>
<tr>
<td>CED Power 1401</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cambridge Electronic Design, Cambridge, UK</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Data acquisition board</td>
</tr>
<tr>
<td>DL708E Oscilloscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Yokogawa, Tokyo, Japan</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Intracellular amplifier</td>
</tr>
<tr>
<td>AC differential amplifier</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>University of Kaiserslautern, Germany</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Extracellular amplifier</td>
</tr>
<tr>
<td>P-97 Flaming &#x2013; Brown type electrode puller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sutter Instruments, Novato, CA, USA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Electrode puller</td>
</tr>
<tr>
<td>Sigma Microcentrifuge 1-14</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma, Osterode, Germany</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Centrifuge</td>
</tr>
<tr>
<td>Genex Pipettors Mline</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Scientific Laboratory Supplies, UK</td>
<td>PIP7774</td>
<td>PIP7774</td>
</tr>
<tr>
<td>Glass micropipette with filament</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Science Products, Hofheim, Germany</td>
<td>GB100TF 8P</td>
<td>Glass for microelectrodes</td>
</tr>
<tr>
<td>MicroFil &#x2013; 34G</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Microfil needle</td>
</tr>
<tr>
<td>Spike 2 v6.10</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cambridge Electronic Design, Cambridge, UK</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Electrophysiology software</td>
</tr>
<tr>
<td>Di-8-ANEPPQ</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cambridge Bioscience Ltd, Cambridge, UK</td>
<td>BT61014</td>
<td>Fluorescent voltage sensitive dye</td>
</tr>
<tr>
<td>F-127 Pluronic Acid, DMSO</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen, Paisley, UK</td>
<td>P-3000MP</td>
<td>Solvent</td>
</tr>
<tr>
<td>NaCl</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma &#x2013; Aldrich, Poole, UK</td>
<td>S9888</td>
<td>Crab saline component</td>
</tr>
<tr>
<td>CaCl2 . 2H2O</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma &#x2013; Aldrich, Poole, UK</td>
<td>C3881</td>
<td>Crab saline component</td>
</tr>
<tr>
<td>KCl</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma &#x2013; Aldrich, Poole, UK</td>
<td>P3911</td>
<td>Crab saline component, electrolyte solution</td>
</tr>
<tr>
<td>MgCl2 . 6H2O</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma &#x2013; Aldrich, Poole, UK</td>
<td>M9272</td>
<td>Crab saline component</td>
</tr>
<tr>
<td>Trizma base</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma &#x2013; Aldrich, Poole, UK</td>
<td>T1503</td>
<td>Crab saline component</td>
</tr>
<tr>
<td>Maleic acid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma &#x2013; Aldrich, Poole, UK</td>
<td>M0375</td>
<td>Crab saline component</td>
</tr>
<tr>
<td>Elastosil RT-601</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Wacker, Munich, Germany</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lining of Petri dishes</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

optical imaging of neurons in the crab stomatogastric ganglion with voltage-sensitive dyes

뉴런의 전압에 민감한 염료 영상은 네트워크의 연결을 구성하는 방법에 대한 이해를위한 주요 방법이며 어떻게 참여 뉴런의 동시 활동이 네트워크의 핵심 기능의 출현에 이르게한다. 여기서 우리는 게 stomatogastric 신경절에서 확인된 패턴 생성 뉴런이 기술의 응용 프로그램의 방법론을 제시한다. 우리는 형광 전압에 민감한 염료 디 - 8 - ANEPPQ 이러한 뉴런의 로딩을 설명하고 어떻게 이미지 MiCAM02 고속 및 고해상도 CCD 카메라 이미징 시스템을 사용하여 염색로드 뉴런의 활동를 보여줍니다. 우리는 MiCAM02 이미징 시스템과 관련된 BVAna 이미징 소프트웨어를 사용하여 기록된 이미지 데이터의 분석을 보여줍니다. 게 stomatogastric 신경절에서 여러 뉴런의 세부 활동의 동시 전압에 민감한 염료 영상은 전통적인 전기 생리학 기법 (세포내 및 세포외 레코딩)하는 방법 중앙 패턴 발생기 신경 네트워크 작업에 대한 이해를 위해 급격하게 새로운 기회를 열어 함께 적용.

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Optical Imaging of Neurons in the Crab Stomatogastric Ganglion with Voltage-sensitive Dyes

여기 게는 stomatogastric의 신경절의 뉴런에 대한 자세한 활동의​​ 신속하고 고해상도 형광 전압에 민감한 염료를 영상에 대한 방법론을 제시한다.

전압에 민감한 염료와 크랩 Stomatogastric 신경절에서 뉴런의 광학 이미징

Voltage-sensitive dye imaging of neurons is a key methodology for the understanding of how neuronal networks are organised and how the simultaneous ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

12.9K 조회수.  Ulm University. 여기 게는 stomatogastric의 신경절의 뉴런에 대한 자세한 활동의​​ 신속하고 고해상도 형광 전압에 민감한 염료를 영상에 대한 방법론을 제시한다.

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Genetic Study of Axon Regeneration with Cultured Adult Dorsal Root Ganglion Neurons

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability to support axon growth and a hostile environment in the mature CNS1,2. In contrast, mature neurons in the peripheral nervous system (PNS) regenerate readily after injuries3. Adult dorsal root ganglion (DRG) neurons are well known to regenerate robustly after peripheral nerve injuries. Each DRG neuron grows one axon from the cell soma, which branches into two axonal branches: a peripheral branch innervating peripheral targets and a central branch extending into the spinal cord. Injury of the DRG peripheral axons results in substantial axon regeneration, whereas central axons in the spinal cord regenerate poorly after the injury. However, if the peripheral axonal injury occurs prior to the spinal cord injury (a process called the conditioning lesion), regeneration of central axons is greatly improved4. Moreover, the central axons of DRG neurons share the same hostile environment as descending corticospinal axons in the spinal cord. Together, it is hypothesized that the molecular mechanisms controlling axon regeneration of adult DRG neurons can be harnessed to enhance CNS axon regeneration. As a result, adult DRG neurons are now widely used as a model system to study regenerative axon growth5-7.
Here we describe a method of adult DRG neuron culture that can be used for genetic study of axon regeneration in vitro. In this model adult DRG neurons are genetically manipulated via electroporation-mediated gene transfection6,8. By transfecting neurons with DNA plasmid or si/shRNA, this approach enables both gain- and loss-of-function experiments to investigate the role of any gene-of-interest in axon growth from adult DRG neurons. When neurons are transfected with si/shRNA, the targeted endogenous protein is usually depleted after 3-4 days in culture, during which time robust axon growth has already occurred, making the loss-of-function studies less effective. To solve this problem, the method described here includes a re-suspension and re-plating step after transfection, which allows axons to re-grow from neurons in the absence of the targeted protein. Finally, we provide an example of using this in vitro model to study the role of an axon regeneration-associated gene, c-Jun, in mediating axon growth from adult DRG neurons9.

An in vitro model for genetic study of axon regeneration using cultured adult mouse dorsal root ganglion neurons is described. The method includes a re-suspension/re-plating step to allow axon re-growth from neurons undergoing genetic manipulation. This approach is especially useful for loss-of-function studies of axon regeneration using RNAi-based protein knockdown.

교양 성인 지느러미 루트 신경절의 신경 세포와 축삭 재생의 유전 연구

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability ...

연구

신경과학

Voltage-sensitive Dye Recording from Axons, Dendrites and Dendritic Spines of Individual Neurons in Brain Slices

Understanding the biophysical properties and functional organization of single neurons and how they process information is fundamental for understanding how the brain works. The primary function of any nerve cell is to process electrical signals, usually from multiple sources. Electrical properties of neuronal processes are extraordinarily complex, dynamic, and, in the general case, impossible to predict in the absence of detailed measurements. To obtain such a measurement one would, ideally, like to be able to monitor, at multiple sites, subthreshold events as they travel from the sites of origin on neuronal processes and summate at particular locations to influence action potential initiation. This goal has not been achieved in any neuron due to technical limitations of measurements that employ electrodes. To overcome this drawback, it is highly desirable to complement the patch-electrode approach with imaging techniques that permit extensive parallel recordings from all parts of a neuron. Here, we describe such a technique - optical recording of membrane potential transients with organic voltage-sensitive dyes (Vm-imaging) - characterized by sub-millisecond and sub-micrometer resolution. Our method is based on pioneering work on voltage-sensitive molecular probes 2. Many aspects of the initial technology have been continuously improved over several decades 3, 5, 11. Additionally, previous work documented two essential characteristics of Vm-imaging. Firstly, fluorescence signals are linearly proportional to membrane potential over the entire physiological range (-100 mV to +100 mV; 10, 14, 16). Secondly, loading neurons with the voltage-sensitive dye used here (JPW 3028) does not have detectable pharmacological effects. The recorded broadening of the spike during dye loading is completely reversible 4, 7. Additionally, experimental evidence shows that it is possible to obtain a significant number (up to hundreds) of recordings prior to any detectable phototoxic effects 4, 6, 12, 13. At present, we take advantage of the superb brightness and stability of a laser light source at near-optimal wavelength to maximize the sensitivity of the Vm-imaging technique. The current sensitivity permits multiple site optical recordings of Vm transients from all parts of a neuron, including axons and axon collaterals, terminal dendritic branches, and individual dendritic spines. The acquired information on signal interactions can be analyzed quantitatively as well as directly visualized in the form of a movie.

An imaging technique for monitoring of membrane potential changes with sub-micrometer spatial and sub-millisecond temporal resolution is described. The technique, based on laser excitation of voltage-sensitive dyes, allows measurements of signals in axons and axon collaterals, terminal dendritic branches, and individual dendritic spines.

Axons, 수석 및 뇌 슬라이스의 개별 뉴런의 수지상 쪽의 전압에 민감한 염료 기록

Understanding the biophysical properties and functional organization of single neurons and how they process information is fundamental for understanding ...

Retrograde Labeling of Retinal Ganglion Cells in Adult Zebrafish with Fluorescent Dyes

As retrograde labeling retinal ganglion cells (RGCs) can isolate RGCs somata from dying sites, it has become the gold standard for counting RGCs in RGCs survival and regeneration experiments. Many studies have been performed in mammalian animals to research RGCs survival after optic nerve injury. However, retrograde labeling of RGCs in adult zebrafish has not yet been reported, though some alternative methods can count cell numbers in retinal ganglion cell layers (RGCL). Considering the small size of the adult zebrafish skull and the high risk of death after drilling on the skull, we open the skull with the help of acid-etching and seal the hole with a light curing bond, which could significantly improve the survival rate. After absorbing the dyes for 5 days, almost all the RGCs are labeled. As this method does not need to transect the optic nerve, it is irreplaceable in the research of RGCs survival after optic nerve crush in adult zebrafish. Here, we introduce this method step by step and provide representative results.

We introduce an efficient method to retrograde label retinal ganglion cells (RGCs) in adult zebrafish.

형광 염료와 성인 Zebrafish의 망막 신경절 세포의 퇴행성 라벨링

As retrograde labeling retinal ganglion cells (RGCs) can isolate RGCs somata from dying sites, it has become the gold standard for counting RGCs in RGCs ...

3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii

Toxoplasma gondii is an obligate, intracellular parasite with a broad host range, including humans and rodents. In both humans and rodents, Toxoplasma establishes a lifelong persistent infection in the brain. While this brain infection is asymptomatic in most immunocompetent people, in the developing fetus or immunocompromised individuals such as acquired immune deficiency syndrome (AIDS) patients, this predilection for and persistence in the brain can lead to devastating neurologic disease. Thus, it is clear that the brain-Toxoplasma interaction is critical to the symptomatic disease produced by Toxoplasma, yet we have little understanding of the cellular or molecular interaction between cells of the central nervous system (CNS) and the parasite. In the mouse model of CNS toxoplasmosis it has been known for over 30 years that neurons are the cells in which the parasite persists, but little information is available about which part of the neuron is generally infected (soma, dendrite, axon) and if this cellular relationship changes between strains. In part, this lack is secondary to the difficulty of imaging and visualizing whole infected neurons from an animal. Such images would typically require serial sectioning and stitching of tissue imaged by electron microscopy or confocal microscopy after immunostaining. By combining several techniques, the method described here enables the use of thick sections (160 &#181;m) to identify and image whole cells that contain cysts, allowing three-dimensional visualization and analysis of individual, chronically infected neurons without the need for immunostaining, electron microscopy, or serial sectioning and stitching. Using this technique, we can begin to understand the cellular relationship between the parasite and the infected neuron.

3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii

Using this protocol, we were able to image 160 &#181;m thick brain sections from mice infected with the parasite Toxoplasma gondii, which enables visualization and analysis of the spatial relationship between the encysting parasite and the infected neuron.

신경 세포의 3 차원 이미징 및 분석 감염<em&gt; 생체</em&gt;와<em&gt; 톡소 포자충</em

Toxoplasma gondii is an obligate, intracellular parasite with a broad host range, including humans and rodents. In both humans and rodents, Toxoplasma ...

Optical Control of a Neuronal Protein Using a Genetically Encoded Unnatural Amino Acid in Neurons

Photostimulation is a noninvasive way to control biological events with excellent spatial and temporal resolution. New methods are desired to photo-regulate endogenous proteins expressed in their native environment. Here, we present an approach to optically control the function of a neuronal protein directly in neurons using a genetically encoded unnatural amino acid (Uaa). By using an orthogonal tRNA/aminoacyl-tRNA synthetase pair to suppress the amber codon, a photo-reactive Uaa 4,5-dimethoxy-2-nitrobenzyl-cysteine (Cmn) is site-specifically incorporated in the pore of a neuronal protein Kir2.1, an inwardly rectifying potassium channel. The bulky Cmn physically blocks the channel pore, rendering Kir2.1 non-conducting. Light illumination instantaneously converts Cmn into a smaller natural amino acid Cys, activating Kir2.1 channel function. We express these photo-inducible inwardly rectifying potassium (PIRK) channels in rat hippocampal primary neurons, and demonstrate that light-activation of PIRK ceases the neuronal firing due to the outflux of K+ current through the activated Kir2.1 channels. Using in utero electroporation, we also express PIRK in the embryonic mouse neocortex in vivo, showing the light-activation of PIRK in neocortical neurons. Genetically encoding Uaa imposes no restrictions on target protein type or cellular location, and a family of photoreactive Uaas is available for modulating different natural amino acid residues. This technique thus has the potential to be generally applied to many neuronal proteins to achieve optical regulation of different processes in brains. The current protocol presents an accessible procedure for intricate Uaa incorporation in neurons in vitro and in vivo to achieve photo control of neuronal protein activity on the molecular level.

Here, a procedure to selectively activate a neuronal protein with a short pulse of light by genetically encoding a photo-reactive unnatural amino acid into a target neuronal protein expressed in neurons in culture or in vivo is presented.

뉴런의 유전자 인코딩 된 부 자연스러운 아미노산을 사용하여 신경 세포 단백질의 광 제어

Photostimulation is a noninvasive way to control biological events with excellent spatial and temporal resolution. New methods are desired to ...

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

Structural changes in the retina are common manifestations of ophthalmic diseases. Optical coherence tomography (OCT) enables their identification in vivo&#8212;rapidly, repetitively, and at a high resolution. This protocol describes OCT imaging in the mouse retina as a powerful tool to study optic neuropathies (OPN). The OCT system is an interferometry-based, non-invasive alternative to common post mortem histological assays. It provides a fast and accurate assessment of retinal thickness, allowing the possibility to track changes, such as retinal thinning or thickening. We present the imaging process and analysis with the example of the Opa1delTTAG mouse line. Three types of scans are proposed, with two quantification methods: standard and homemade calipers. The latter is best for use on the peripapillary retina during radial scans; being more precise, is preferable for analyzing thinner structures. All approaches described here are designed for retinal ganglion cells (RGC) but are easily adaptable to other cell populations. In conclusion, OCT is efficient in mouse model phenotyping and has the potential to be used for the reliable evaluation of therapeutic interventions.

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

This manuscript describes a protocol for the in vivo imaging of the mouse retina with high-resolution spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT). It focuses on retinal ganglion cells (RGC) in the peripapillary region, with several scanning and quantifying approaches described.

광학 일관성 단층 촬영: 마우스 망막 신경 절 세포에서 Vivo에서 화상 진 찰

Structural changes in the retina are common manifestations of ophthalmic diseases. Optical coherence tomography (OCT) enables their identification in ...

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging methods exist for examining the brain tissue of live newborn mammals. Herein we summarize a protocol for imaging individual cortical neurons in living neonatal mice. This protocol includes the following two methodologies: (1) the Supernova system for sparse and bright labeling of cortical neurons in the developing brain, and (2) a surgical procedure for the fragile neonatal skull. This protocol allows the observation of temporal changes of individual cortical neurites during neonatal stages with a high signal-to-noise ratio. Labeled cell-specific gene silencing and knockout can also be achieved by combining the Supernova with RNA interference and CRISPR/Cas9 gene editing systems. This protocol can, thus, be used for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and changes in neuronal dynamics in disease models.

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

We present an in vivo two-photon imaging protocol for imaging the cerebral cortex of neonatal mice. This method is suitable for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, the molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and the changes in neuronal dynamics in disease models.

Vivo에서 신생아 쥐에 있는 대뇌 피 질의 뉴런의 두 광자 영상

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...

Wide-field Single-photon Optical Recording in Brain Slices Using Voltage-sensitive Dye

Wide-field single photon voltage-sensitive dye (VSD) imaging of brain slice preparations is a useful tool to assess the functional connectivity in neural circuits. Due to the fractional change in the light signal, it has been difficult to use this method as a quantitative assay. This article describes special optics and slice handling systems, which render this technique stable and reliable. The present article demonstrates the slice handling, staining, and recording of the VSD-stained hippocampal slices in detail. The system maintains physiological conditions for a long time, with good staining, and prevents mechanical movements of the slice during the recordings. Moreover, it enables staining of slices with a small amount of the dye. The optics achieve high numerical aperture at low magnification, which allows recording of the VSD signal at the maximum frame rate of 10 kHz, with 100 pixel x 100-pixel spatial resolution. Due to the high frame rate and spatial resolution, this technique allows application of the post-recording filters that provide sufficient signal-to-noise ratio to assess the changes in neural circuits.

We introduce a reproducible and stable optical recording method for brain slices using voltage-sensitive dye. The article describes voltage-sensitive dye staining and recording of optical signals using conventional hippocampal slice preparations.

전압에 민감한 염료를 사용하여 뇌 슬라이스의 광자 광자 광기록

Wide-field single photon voltage-sensitive dye (VSD) imaging of brain slice preparations is a useful tool to assess the functional connectivity in neural ...

Isolation and Culture of Chick Ciliary Ganglion Neurons

Chick ciliary ganglia (CG) are part of the parasympathetic nervous system and are responsible for the innervation of the muscle tissues present in the eye. This ganglion is constituted by a homogenous population of ciliary and choroidal neurons that innervate striated and smooth muscle fibers, respectively. Each of these neuronal types regulate specific eye structures and functions. Over the years, neuronal cultures of the chick ciliary ganglia were shown to be effective cell models in the study of muscle-nervous system interactions, which communicate through cholinergic synapses. Ciliary ganglion neurons are, in its majority, cholinergic. This cell model has been shown to be useful comparatively to previously used heterogeneous cell models that comprise several neuronal types, besides cholinergic. Anatomically, the ciliary ganglion is localized between the optic nerve (ON) and the choroid fissure (CF). Here, we describe a detailed procedure for the dissection, dissociation and in vitro culture of ciliary ganglia neurons from chick embryos. We provide a step-by-step protocol in order to obtain highly pure and stable cellular cultures of CG neurons, highlighting key steps of the process. These cultures can be maintained in vitro for 15 days and, hereby, we show the normal development of CG cultures. The results also show that these neurons can interact with muscle fibers through neuro-muscular cholinergic synapses.

Chick ciliary ganglia (CG) are part of the parasympathetic nervous system. Neuronal cultures of chick CG neurons were shown to be effective cell models in the study of nerve muscle interactions. We describe a detailed protocol for the dissection, dissociation and in vitro culture of CG neurons from chick embryos.

독실성 신경절 뉴런의 고립과 문화

Chick ciliary ganglia (CG) are part of the parasympathetic nervous system and are responsible for the innervation of the muscle tissues present in the ...

Coculture of Axotomized Rat Retinal Ganglion Neurons with Olfactory Ensheathing Glia, as an In Vitro Model of Adult Axonal Regeneration

Olfactory ensheathing glia (OEG) cells are localized all the way from the olfactory mucosa to and into the olfactory nerve layer (ONL) of the olfactory bulb. Throughout adult life, they are key for axonal growing of newly generated olfactory neurons, from the lamina propria to the ONL. Due to their pro-regenerative properties, these cells have been used to foster axonal regeneration in spinal cord or optic nerve injury models.
We present an in vitro model to assay and measure OEG neuroregenerative capacity after neural injury. In this model, reversibly immortalized human OEG (ihOEG) is cultured as a monolayer, retinas are extracted from adult rats and retinal ganglion neurons (RGN) are cocultured onto the OEG monolayer. After 96 h, axonal and somatodendritic markers in RGNs are analyzed by immunofluorescence and the number of RGNs with axon and the mean axonal length/neuron are quantified.
This protocol has the advantage over other in vitro assays that rely on embryonic or postnatal neurons, that it evaluates OEG neuroregenerative properties in adult tissue. Also, it is not only useful for assessing the neuroregenerative potential of ihOEG but can be extended to different sources of OEG or other glial cells.

We present an in vitro model to assess olfactory ensheathing glia (OEG) neuroregenerative capacity, after neural injury. It is based on a coculture of axotomized adult retinal ganglion neurons (RGN) on OEG monolayers and subsequent study of axonal regeneration, by analyzing RGN axonal and somatodendritic markers.

축 축 하 재생의 시험관 내 모델로, 후각 천시 글리아와 축 축 절 망막 신경의 공동 문화

Olfactory ensheathing glia (OEG) cells are localized all the way from the olfactory mucosa to and into the olfactory nerve layer (ONL) of the olfactory ...