이 방법은 신경 과학의 주요 질문에 대답 하는 데 도움이 수 있습니다., 특히 신경 소켓 형성관련. 이 기술의 주요 장점은 연구원이 살아있는 신생아 마우스에 있는 개별 적인 뉴런의 형태학적 변화를 분석할 수 있다는 것입니다. 마취 된 산후 5 일 새끼로 시작하여 꼬리 핀치 테스트에 대한 반응이없는 경우에만 진행하십시오.
먼저 70%에탄올로 닦아 두피를 살균합니다. 그런 다음 70%에탄올로 멸균된 가위를 사용하여 두개골을 덮는 피부의 약 20 평방 밀리미터를 제거합니다. 다음으로, 멸균 집게와 피질 버퍼에 담근 깨끗한 면봉을 사용하여 두개골의 근막을 제거하십시오.
로딩 팁을 사용하여 착공할 부위를 피하면서 출혈을 막기 위해 절개 된 피부 표면에 조직 접착제를 적용합니다. 다른 가열 패드에 강아지를 놓고 섭씨 37도로 설정하고 마취에서 회복 할 수 있습니다. 조직 접착제가 건조되고 고화될 때까지 약 30분 정도 기다립니다.
조직 접착제가 건조되면, 다시 마취 마우스에 두개골 창 준비를 시작합니다. 두개골에 피질 버퍼 한 방울을 바른 다음 멸균 면도날을 사용하여 두개골직경 1mm의 영역을 조심스럽게 열어 두라를 그대로 유지합니다. 피질 버퍼를 적용하여 뇌 표면을 촉촉하게 유지합니다.
피질 버퍼에 담근 작은 젤라틴 스폰지를 사용하여 출혈을 막습니다. 신선한 조각을 사용하여 두개골 절제술의 한쪽을 압축하고 두라를 만지지 않고 두랄 표면에서 완충과 혈액을 배출하십시오. 이 단계는 명확한 창을 준비하는 가장 중요한 단계입니다.
두라는 손상되지 않아야 하며 브러시를 노출된 두라에서 제거해야 합니다. 다음으로 파이펫 팁을 사용하여 피질 완충에 용해된 1% 낮은 녹는 아가로즈의 얇은 층을 적용합니다. 아가로즈 젤 층에 둥근 3밀리미터 유리 커버 슬립을 발라주세요.
덮개 슬립과 아가로즈 젤 층 사이의 모든 거품을 제거하여 그들 사이에 아가로즈 젤을 초과하여 부어. 핀셋을 사용하여 커버 슬립 아래에서 튀어나온 과도한 젤을 제거합니다. 시멘트 분말과 시멘트 액체를 혼합합니다.
파이펫 팁을 사용하여 혼합물을 두개골에 적용한 후 고형화됩니다. 그런 다음 치과 시멘트를 사용하여 맞춤형 티타늄 바를 두개골 뼈에 부착하십시오. 티타늄 바를 정렬하고 커버가 평행하게 미끄러져 이미지를 쉽게 캡처할 수 있습니다.
노출된 두개골을 치과 시멘트로 덮습니다. 그런 다음, 피하 진통제를 주입. 치과 시멘트가 고화될 때까지 1시간 동안 섭씨 37도의 열패드에 새끼를 놓습니다.
이미징을 시작하려면 먼저 2광자 레이저 파장을 설정합니다. RFP 여기의 경우 1000 나노미터의 파장을 사용하십시오. 커버 슬립의 표면을 70%에탄올로 닦아냅니다.
티타늄 바를 사용하여 마취된 강아지를 이미징 스테이지의 티타늄 플레이트에 부착합니다. 고니오미터 스테이지를 사용하여 커버 슬립이 객관적렌즈와 평행하도록 헤드를 조절한다. 37°C로 설정된 가열 패드를 사용하여 이미징 시 강아지의 체온을 유지하고 이소플루란 농도를 0.7%에서 1%로 감소시키는 두 광자 현미경의 20배 목표 렌즈 아래에 이미징 단계를 배치한다.
뚜껑 슬립에 물 한 방울을 바하십시오. 1.4 미크론 간격으로 Z 스택 이미지를 획득하도록 소프트웨어를 설정합니다. 층 4 개의 뉴런 이미징의 경우 Z 너비를 150 에서 300 미크론으로 설정하여 전체 수지상 형태를 이미지화하십시오.
느린 스캔 및 평균을 사용하여 신경 형태학을 보여주는 선명한 이미지를 얻을 수 있습니다. 그것은 일반적으로 전체 수지상 형태를 취득하는 데 20 분 이상 걸립니다. 이 이미지는 P5 강아지의 4개의 피질 뉴런층의 대표적인 Z 스택 이미지를 나타낸다.
화살표는 분석할 뉴런을 나타냅니다. 흐리게 된 수상월이있는 뉴런은 분석에서 제거해야합니다. 이 이미지는 이전 이미지에서 표시된 뉴런의 배율 이미지가 더 높은 것을 나타낸다.
파란색 화살촉은 다음 시점에서 철회될 수지상 팁을 나타내며, 작은 흰색 화살촉은 이웃 셀의 축축을 나타냅니다. 4.5시간 후, 파란색 화살촉이 있는 수지상 팁이 철회되고 노란색 화살촉이 있는 수지상 팁이 길어지고 있습니다. 대표적인 수지상 형태 재구성은 여기에 표시되며, 여기서 볼 수 있듯이 연결이 끊어진 원더라이트를 보여주는 뉴런은 분석에서 제외되어야 합니다.
이 절차를 시도하는 동안, 프로세스 중에 듀라를 그대로 유지하는 것이 중요합니다. 이 절차를 사용하여, 추진 화상 진찰에서 와 같은 그밖 방법은 신생아 두뇌에 있는 신경 활동 패턴에 관련있는 추가 질문에 대답하기 위하여 수행될 수 있습니다.
