열등한 올리브는 수질의 가장 복부 부분이므로 살아있는 동물에게 도달하기가 매우 어렵습니다. 여기서는 복부 측에서 성인용 마우스 뇌줄기를 노출시키고 GRIN 렌즈를 사용하여 칼슘 센서를 표현하는 열등한 올리브 뉴런에서 뉴런 활성을 기록하는 프로토콜을 소개합니다. 이 방법은 생명에 중요한 뇌 줄기의 손상을 방지하고, 열등한 올리브의 공간 측두활동 패턴 및 입력 통합에 대한 조사를 가능하게 한다.
수술은 많은 중요한 구조와 복잡한 인후 영역에서 수행되기 때문에, 높은 수준의 수술 능력을 가진 연구원에 의해 수행되는 것이 필수적이다. 20 게이지 카테터 끝에서 길이 5~6mm, 너비 0.8mm를 절단하여 관착 튜브를 준비합니다. 팁을 잘라 무딘 곡선 바늘을 준비하고 골절 표면을 모래로 구부리고 펜치로 구부립니다.
이것은 기관 절제술 도중 기관체를 지원하기 위하여 이용될 것입니다. 희석 15 밀리 리터 케타민 당 식염수 15%에 수술 도구와 소모품을 조립. 가열 패드를 섭씨 38도까지 설정합니다.
입체 프레임에서 노세콘 180도 수평으로 돌립니다. 열등한 올리브가 이전에 바이러스 운반 GCaMP6s에 의해 감염된 마우스를 계량하고 주입을 위해 희석 케타민의 양을 계산합니다. 5%의 이소플루란으로 유도 상자를 미리 채우고 마우스를 마취시합니다.
마우스를 스테레오테틱 프레임에 장착하고 복부 쪽을 위로 올려다보실 수 있습니다. 마우스 목과 허벅지 부위를 면도합니다. 제모 크림으로 잔류 모발을 제거합니다.
목 피부에 실로카인 젤리를 토폴로서 발라주세요. 직장 열 센서로 마우스 온도를 모니터링합니다. 1 밀리 리터 미리 데워진 식염수 에 주사하십시오.
뒷다리 발가락에 강한 핀치에 의해 마취의 깊이를 평가합니다. 탐지 가능한 응답을 불러서는 안 됩니다. 중간선을 따라 목 구멍 피부에 수직 절개를합니다.
무딘 해부 방법을 사용하여 그 아래에 내장에서 목 피부를 분리하고 피부를 잘라. 결합 조직에서 무료 타액 땀샘, 그리고 스테르노 갑상선 근육 으로 덮인 기관을 노출 하기 위해 측면으로 그들을 플립. 내분비질은 동물 무게의 킬로그램 당 5 밀리리터에서 희석 케타민의 첫 번째 복용량을 주입.
조심스럽게 기관을 노출 미세 집게의 끝으로 미드 라인을 따라 스테인장 근육을 분할. 무딘 해부 방법을 사용하여 포셉으로 혈관과 식도에서 기관체를 분리합니다. 동물 무게의 킬로그램 당 2.5 밀리리터에서 희석 케타민의 두 번째 복용량을 주입.
기관 아래에 무딘 바늘을 교차 삽입합니다. 무딘 바늘로 기관치를 들어 올립니다. 봉합사실이 세 번째 기관고리를 돌아다니게 하고, 갑상선으로 반원 바늘을 채우게 한다.
이 링에 4 개의 악기 넥타이를 만듭니다. 같은 반원 바늘로 가슴 피부를 관통하고 피부를 통해 스레드를 리드. 기관차를 실로 부드럽게 들어 올리고 기관장 코떼를 갑상선으로 자릅니다.
기관지를 가슴 피부쪽으로 당깁니다. 그 아래에 수술 스폰지의 작은 조각을 추가하여 기관의 개구부를 올립니다. 얇은 청소 조직 스트립으로 기관의 개구부 끝 내부에 남아있는 액체를 제거하십시오.
스테레오탁스 누콘에서 관관으로 이소플루란 의 흐름을 전환합니다. 관착튜브를 기관체에 삽입합니다. 튜브의 슬릿 부분이 호흡을 허용하기 위해 기관 외부에 남아 있는지 확인하십시오.
3~4개의 악기 넥타이를 만들어 마우스 가슴 피부에 기관진을 고정합니다. 기관지를 봉합실과 묶어 관관을 고정합니다. 미세 한 집게와 근육 섬유를 따라 스테르노 갑 상선 근육을 슬릿.
스프링 가위로 고립된 부분을 잘라냅니다. 근육의 혈관 손상을 최소화하기 위해 근육에서 조심스럽게 남은 기관및 후두를 무료로 사용합니다. 남은 기관지와 후두를 제거합니다.
집게가 부착 된 조직에서 식도를 무료로 하고 스프링 가위로 잘라냅니다. 뇌간과 아틀라스의 복부 아치를 덮고 있는 세로 근육을 제거하십시오. 아틀라스 복부 아치와 전방 결핵을 덮는 근육을 제거합니다.
아틀라스의 복부 아치를 롱거로 자른다. 아틀라스의 전방 결핵을 제거합니다. 포라멘 매그넘과 뇌줄기를 보기 위해 혈액과 액체를 제거합니다.
강수기와 목두골을 제거하여 포멘 매그넘을 확장합니다. 연골을 제거하고, 조심스럽게 복부 뇌종의 명확한 보기를 가지고 미세 집게와 듀라 마터의 periosteal 층을 껍질. 마우스 허벅지에 SpO2 센서를 고정하여 심박수, 산소 포화도 및 호흡속도와 같은 활력 징후를 모니터링합니다.
이식 봉에 GRIN 렌즈를 장착합니다. 70%에탄올에 담근 세정 조직으로 렌즈를 정성스럽게 청소하십시오. 입체 프레임에 이식 막대를 고정하고 이식 막대에 소형 현미경을 장착합니다.
GRIN 렌즈를 침지 위해 뇌간 부위에 여러 방울의 식염수를 추가합니다. GRIN 렌즈로 뇌간에 접근하십시오. 피상 적 영역에서 열등한 올리브 뉴런을 발현하는 GCaMP6s는 직사각형 모양의 영역에서, 나머지 아틀라스에 약 0.5 ~ 1.7 밀리미터 의 로스트랄, 그리고 중간선까지 약 2.6 ~1.1 밀리미터의 측량에서 찾을 수 있다.
GCaMP6s 를 찾기 위해 소형 현미경에서 여기 블루 LED를 켭니다 열등한 올리브 뉴런을 찾습니다. 뉴런은 다양한 GCaMP6s 발현 수준으로 인해 다른 기준선 형광 강도를 보여줍니다. 왼쪽 에 비디오에서 동그라미 올리브 뉴런 소마타의 칼슘 수준의 변화는 우리에게 오른쪽에 F 흔적으로 분할 델타 F를 보여줍니다.
마우스는 따뜻하고 수분을 유지하지만, 그것은 필연적으로 장기간 마취와 수술에 의해 약화될 것입니다. 그것은 짧은 수술의 기간을 유지 하는 것이 필수적 이다 그래서 마우스 신체 조건 기록에 대 한 좋은 것입니다. 숙련 된 연구원은 70 분 안에 수술을 완료 할 수 있습니다.
이 방법은 수정과 함께 복부 뇌의 다른 인접 영역을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.
