저자는 mammoplasty 사진을 제공하는 로잔 대학 병원의 M. 피시 감사, M. 워스와 실험 암 연구 스위스 연구소, 연구 분자 종양학의 경쟁력 국립 센터, 생명 과학 대학, 에콜 폴리 테크닉 대학 Fédérale 드의 A. Ayyanan 중요한 의견 맨체스터 대학의 기술 지원을위한 로잔 R. 클라크. 이러한 결과로 이어지는 연구는없는 보조금 계약에 따라 SNF3100A0-112090, Oncosuisse 531817, 그리고 혁신적인 의약품 이니셔티브 공동 된 기업의 지원을 받고있다. 유럽​​ 연합 (EU)의 일곱 번째 프레임 워크 프로그램 (FP7 / 2007년부터 2013년까지)과 현물의 제약 산업 및 연관 기업의 유럽 연맹의 재정적 기여로 구성되어 자원이있는 115,188. 혁신적인 의약품 이니셔티브의 웹 주소는 <a href="http://www.imi.europa.eu/" target="_blank">http://www.imi.europa.eu/</a> . &lt;/ P&gt;

일반적인 고려 사항 : 시간의 앞서, 윤리 프로토콜을 설정은, 환자에 대한 설문 조사를 준비하고 임상 인력을 훈련하는 방법을 참조하십시오. 감소 mammoplasty 수술의 자료를 사용하기 전에 권한을 조달하고, 환자의 동의를 확인합니다. 조직은 전염성 따라 처리 될 필요가있다. 실험 암 연구 스위스 연구소 -이 프로토콜은 ISREC의 윤리위원회에 의해 승인되었다. 1. 조직 복구, 처리 및 바이오 뱅킹 바이오 뱅킹을위한 최적의 샘플의 품질을 향상시키기 위해, 다수의 단계는 실험실로 운반하기 전에 병원에서 실시된다. 병원에서 : <ol><li> 필요한 경우, 감소 mammoplasty 수술과 혈액 샘플에서 무균 조건 하에서 인간의 유방 조직을 얻습니다. 조직은 악성 병변의 존재를 배제하는 샘플 것 병리학 자에 의해 검토 될 필요가있다. </li><li> 유방 t 배치멸균 보드에 후드를 발행하고 가위, 수술 메스 이미 증기 멸균기로 멸균 집게를 준비합니다. 엽니 다 메스를 사용하여 유방 조직의 다른 사이트에 깊은 상처를 확인합니다. 인간의 유방 조직에서 노란색 지방 조직에 포함 된 덕트 및 소엽, 구성 흰색 가닥을 찾습니다. 참고 : 노란색 지방 조직에 흰색 실질의 비율은 여성에서 다르다; 일반적으로 젊은 여성은 더 상피 조직이있다. </li><li> 다음 가위로 지방 조직에서 부드럽게 구분, 흰색 소재의 조각을 들고 집게로 개최. 혈관을 복용하지 마십시오. </li><li> 인산염 완충 식염수 (PBS)의 pH 7.2에서 조직의 린스 조각 혈액을 제거합니다. 및 1 % (5,000 유닛 / ㎖ 페니실린 및 5,000g / ㎖ 스트렙토 마이신을 포함 함) 2 % 페니실린 / 스트렙토 마이신 페놀 레드없이 F12 배지 (둘 베코 변형 이글 배지 F12)을 함유하는 250 ㎖의 플라스틱 병에 조직을 이동시켜tibiotic / 암포 테리 신 B는 (10,000 단위 / ml의 페니실린, 스트렙토 마이신 10,000 ㎍ / ml의 암포 테리 신 B 및 25 ㎍ / ㎖를 포함). 실험실에 전송을위한 매체에 보관 조직. </li><li> 감기 (드라이 아이스) 이소 펜탄과 크리오 바이알 (cryovial)에서 그들을 동결 RNA와 단백질 추출 및 플래시 5 mm 직경 - 3 개를 준비합니다. 실험실로 운송을 위해 드라이 아이스 상자로 전송합니다. </li><li> 금형에 5 mm이고 최적의 절단 온도 OCT ()의 층으로 그것을 커버하고 차가운 이소 펜탄 가득 상자의 평평한 바닥에 금형을 배치 - 3 조각을 넣어. 완전한 동결 후 드라이 아이스 박스 몰드 옮긴다. </li><li> 포름 알데히드에 파라 포름 알데히드에 5 mm 직경 (PFA) 4 %와 다른 5 개 (FA) 나중에 RT 조직 학적 분석에서 PBS에서 4 % - 3의 5 개를 수정합니다. 일부 항체 더 나은 하나 또는 두 가지의 서로 작업하는 두 개의 서로 다른 고정 제를 권장합니다. </li></ol> 실험실에서 : <ol start="8"><li> 수행감소 mammoplasty에 대한 모든 정보를 cument, 수술 및 샘플 여부 날짜는 오른쪽 가슴에 비해 왼쪽에서 파생됩니다. </li><li> -80 ° C에서 냉동 샘플을 놓고 고정의 2 시간 후 조직 학적 카세트에 고정 조직을 전송합니다. 그런 다음 4 ℃에서 O / N 저장을 위해, 에탄올 PBS 또는 70 % 중 하나를 넣어. 다음 날, 파라핀 삽입에 대한 조직학 시설 조직학 카세트를 전송할 수 있습니다. </li></ol> 2. 조직 소화 호르몬 자극 <ol><li> P2 세포 배양 공간에 층류 캐비닛에 조직 샘플을 함유하는 병을 전송. 살균 도마 (29 X 19cm)에 조직 조각을 놓습니다. 집게로 재료를 잡고 멀리 메스와 유방 실질 (흰 부분)에 남아있는 지방과 혈관을 긁어. 10cm 배양 접시에 PBS에 흰색 물질을 놓습니다. </li><li> 모든 조각으로부터 지방 물질을 제거하고 폐기 후에는 안전 규칙에 따라실험실들, 다시 도마에 상피 조직을 포함하는 흰색 부분을 배치합니다. 대향 메스를 사용하여 조직을 절단하고 최대 직경 2 ㎜의 조각으로 들어온다. </li><li> 적절한 크기의 튜브에 다진 재료를 놓고 : 1, 2.5 및 10 ml의 최대를 5, 15 또는 50 ㎖ 튜브에 각각. 일반적으로 5 ML 튜브 수익률 충분히 파라핀 매립 및 호르몬 자극에 대한 재료 및 형광 활성 셀에 대한 15 ML 튜브 수익률 충분한 재료 정렬 (FACS). 큰 튜브 분량 씩 냉동에 사용됩니다. </li><li> 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신 / 암포 테리 신 B와 (페놀 레드없이 DMEM / F12) 매체로 구성된 소화 마스터 믹스를 준비하고 (클로스 트리 디움 histolyticum에서 Clostridiopeptidase A)을게나. 소화 시간에 따라 콜라겐 복용량. <ol><li> 12, 24, 36 및 인큐베이션 시간 동안, 1.5 ㎎ / ㎖, 1.0 ㎎ / ㎖ 및 0.5 mg을 최종 농도의 콜라게나 제를 사용 / ml로 각각. 4 번에 소화 마스터 믹스를 추가소화 물질의 부피는 적절한 교반 및 폭기을 보장합니다. 참고 : 실험 설계 및 호르몬 자극의 지속 시간에 따라,시 또는 효소 분해 단계 및 미세 복구 이후에 호르몬을 추가합니다. </li></ol></li><li> 샘플 및 제어 차량을 테스트하는 것이 바람직 호르몬 농도 (들)를 추가한다. 17-β 에스트라 디올 및 promegestone (R5020)과 자극 20nm의 최종 농도를 사용한다. 주 : R5020 매체 천연 황체 호르몬보다 더 안정한 합성 프로게스테론 수용체 작용제이다. <ol><li> 37 ° C, 40 RPM의 O / N에서 인큐베이터 내부의 롤러 믹서에 장소 튜브. 믹서에 샘플을 배치하기 전에, 모든 물질은 원심 분리기 튜브 함께 배포하도록 잘을 재현 탁. </li></ol></li><li> 소화 미만에서 12 시간의 자극 호르몬 회 적어도 12 시간 (O / N)를 취 같이, (미세 복구 후 호르몬을 추가 드3 단계에서 꼬리). 당신이 미세을 재현 탁하고 매우 낮은 부착 판에 서스펜션을 배치 할 호르몬을 추가합니다. 조직의 미세 구조는 약 70 %의 생존 능력을 보존 성장 인자가없는 배지에서 최대 7 일 동안 초저 부착 판에 유지 될 수있다. </li><li> RNA 및 단백질 분석을 위해 원심 분리기 튜브에서 5 분 플래시 동결에 대한 400 XG에서 원심 분리하여 조직의 미세 구조를 수집합니다. </li></ol> 조직 미세 3. 복구 <ol><li> 5 분 동안 400 XG에 튜브 (들)를 원심 분리기. 원심 관의 상부에서 지방 대기음 5 분 동안 1,250 XG에 새로운 원심 분리 튜브에서 원심 분리로, 섬유 아세포에 풍부한 수성 상등액 나머지의 상등액을 전송. 참고 : 유방 조직의 미세 이후의 모든 단계에 대한 매우 끈적으로 부드럽게 튜브를 교반하여 펠렛을 재현 탁. 피펫은 물질적 손실의 위험에 사용하지 않는 것이 좋습니다. </lI&gt; <li> 미세 및 PBS, 2 % 소 태아 혈청 (FCS) 수성 상등액 유래의 섬유 아세포를 펠릿 농후 재현 탁. 그 후 5 분 동안 1,250 XG에서 모두 튜브를 회전 한 후 상층 액을 버린다. </li><li> 3 펠릿을 재현 탁 - 5 ㎖의 혈액을 적혈구 용해 완충액을 깨끗한 튜브로 전송. 실온에서 5 분 동안 그들을 품어. </li><li> PBS, 2 % FCS의 2 배 용량을 추가하고 5 분 동안 1,250 XG에이를 원심 분리. 5 분 동안 1,250 XG에서 PBS, 2 % FCS와 원심 분리기와 펠렛을 씻으십시오. 두 번이 단계를 반복합니다. </li></ol> 유동 세포 계측법 4. 샘플 <ol><li> 펠렛 0.25 % 트립신 2 ml의 세포를 해리 1,000 μL의 pipetman으로 2 분 동안 매우 부드럽게 아래로 피펫 팅하여 혼합 - 1을 추가합니다. </li><li> 9 ml의 PBS, 2 % FCS를 첨가함으로써 트립신의 활성을 억제한다. 5 분 450 XG에 원심 분리기 10 ml의 PBS, 2 % FCS에서 펠렛을 재현 탁. </li><li> t에 배치 40 μm의 셀 스트레이너 상에 세포 현탁액을 전송50 ㎖ 원심 분리 튜브의 이익은 단일 셀을 제조 하였다. 세포 현탁액의 몇 마이크로 리터 필터의 상부에 남아 있으면, 피펫으로 스트레이너의 다른 측으로부터 흡입하여이를 그들 필터를 통과하고 그 미세 여과에 추가. </li><li> 다음 별도의 면역 세포, 항 CD45의 칵테일 마이크로에서 섬유 아 세포와 내피 세포, 안티 FAP 및 항 CD31 항체는 각각 10 내강과 기저 세포를 분리하는 팬 상피 마커는 EpCAM과 CD10에 따라, FACS로를 정렬 . </li></ol> 조직학 5. 샘플 <ol><li> 상술 한 바와 같이 기계적 및 효소 적 분해 물질을 세척 한 후, 실온에서 30 분 동안 PBS에서 4 % PFA 1 ㎖를 1.5 ㎖의 초기 물질로부터 펠릿을 고정한다. </li><li> 5 분 1,250 XG에 원심 분리기 1로 세척 - 두 번 2 ml의 PBS. </li><li> 10 분 동안 16,000 XG에 원심 분리기. 이 시간 동안 (트리스 - 아세테이트 - EDTA 아가로 오스 1 % 다목적을 준비이 TAE) 버퍼 용액을 비등 할 때까지 마이크로 웨이브 오븐에서 용액을 가열한다. <ol><li> 전자 레인지에서 솔루션을 제거하고 솔루션을 혼합하고 나머지 아가로 오스 입자를 재현 탁 부드럽게 플라스크를 소용돌이 친다. 50 ° C로 냉각 아가로 오스 솔루션 및 파라핀베이스 금형 1 ml에 부어 31 × 23 × 13.5 mm 크기. </li></ol></li><li> 뜨는을 취소하고 고화 층의 상단에있는 알약을 배치 - 평평한 끝이 주걱을 사용하여 아가로 오스 (1 ~ 3 mm)이다. 아가로 오스의 추가 계층 (40 ° C에서)를 모두 커버. </li><li> 아가로 오스 굳은 후, 일반적으로 5 분 이내에, 파라핀 매립에 대한 조직학 카세트에 아가로 오스 블록을 넣어. 아가로 오스 샘플 연필에 작은 글씨로 쓰여진 감소 mammoplasty 번호, 실험 조건 및 날짜에 대한 모든 정보와 카세트에 흰색 사무실 용지를 배치와 함께; 이 글을 쓰는 시점 이후의 모든 처리 단계를 견딥니다. </li><li> 에 카세트를 넣어PBS O / N, 4 ° C에서 주말에 저장을 위해 70 % 에탄올,에. 우리는 두 개의 스토리지 솔루션의 차이를 발견하지 않았습니다. 그런 다음 파라핀 삽입에 대한 조직학 시설에 조직학 카세트를 전송할 수 있습니다. </li></ol> 6. 냉동 미세 (미래 배양) <ol><li> 10 % 디메틸 설폭 사이드 (DMSO)로 이루어진 배지 FCS 및 크리오 바이알 (cryovial)에 1 ml의 분취 액을 동결 동결 조직에서 재현 탁 미세. 얻어진 크리오 바이알 (cryovial)의 수는 감소 mammoplasty로부터 얻어진 기본 물질의 양에 의존한다. </li><li> -12 ℃로 온도를 감소, 12 ° C / 분의 속도 C ° -7 강온 5 분, 4 ° C에서 주거 다음 프로그램으로 조절 된 속도 냉동기를 이용하여 조직 미세 구조를 포함 크리오 바이알 (cryovial) 동결 6 ° C / 분, 10 분 주거의 속도, 6 ° C / 분의 속도로 -40 ℃로 온도를 감소와 -80 ° C에 온도 감소6 °의 C / 분의 속도. 그런 다음 C 냉동고 -80 °에 크리오 바이알 (cryovial)를 전송합니다. </li><li> 다음 날, 긴 저장을 위해 액체 질소 탱크에 -80 ° C에서 크리오 바이알 (cryovial)을 전송합니다. </li></ol>

<ol>
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저자가 공개하는 게 없다.

여기에 설명 된 생체 외 배양은 일반적으로 인간의 여성 유방 검색된 다른 세포 유형과 함께 그대로 덕트 및 소엽을 함유 유방 조직의 미세 구조를 제공한다. 일반적 환원 mammoplasties로부터 얻어진 인간 유방 조직의 처리에서는, 지방 조직, 간질 행렬의 기계적 및 효소 적 분해, 및 적혈구의 용해 제거 유관 단편과 단말 유관 소엽 단위 풍부. 우측 기간 동안 오른쪽 농도 부드러운 효소 소화, ?...

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Marie Shamseddin
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Marie Shamsheddin

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유방암 돌연변이 프리 대한 정보는 빠른 속도로 증가하고있다. 덜주의 유방암 개발 영향 전신 요인에 지불되고있다. 생식 호르몬에 노출되면 질병의 진행 1-3에 큰 영향을 미친다. 그러나, 생식 호르몬은 인간의 가슴에 충돌하는 메커니즘을 제대로 이해하고있다. 유전자 조작 마우스 모델에 대한 작업은 여러 다운 스트림 이펙터 (4)를 통해 세포 고유 및 분비 신호를 포함하는 것으로 밝혀졌다. 인간의 유방암에서 호르몬 작용에 대한 제한된 지식은 적절한 모델의 부족에 주로 기인한다. 에스트로겐 수용체 (ER) 및 프로게스테론 수용체 (PR)의 시그널링 메커니즘에 대한 대부분의 작업은 MCF-7 및 T47D와 같은 호르몬 수용체 양성 유방암 세포주, 수행되었다. 이러한 alrea했다 고급 유방암 환자에서 흉막 삼출에서 파생 된DY 여러 치료 (5)을 받았다. 인간의 유방의 단순한 체외 모델에서 연구 결과의 생물학적 관련성이 체외 모델에서 확인 된 의심과 대상 유전자 인 아르 동물 모델 (6)에서 식별 표적 유전자 다릅니다. 일차 인간 유방 상피 세포가 시험 관내에서 배양 할 때 그 호르몬 수용체 발현 따라서 호르몬 응답 7,8 잃어버린다. 이 문제는 리겔을 사용하여 정교한 3D 방식으로 circumventd 할 수 있습니다. 이러한 방식으로, C. 클라크와 동료 호르몬 수용체 발현을 유지 프로게스테론 자극 9 증식 반응을 보였다 유방 상피 세포를 확립에 성공했다. 그러나, 생체 프로게스테론 수용체 표적 유전자의 두 개의 중요한,이 Wnt-4 및 RANKL이 시스템 9 프로게스테론 자극에 유도되지 않았다. 이러한 접근 방식은 최근 시험관을 더욱 찍은 </EM&gt; 호르몬 전처리 및 RANKL 유도 10을 달성했다. 주의해야 할 점은, 리겔이 배치 의존하는 활동을 가지고 유지 비용이, 단지 작은 세포 수에 대한 쉬운 실험 설계를 요구한다. 생체 ER 및 PR 시그널링에서 주로 분비 작용 11에 의해 매개된다는 발견을 기초로, 우리는 세포 간 상호 작용이 유지 될 필요가 있다고 주장했다. 조직 손실되는 또 다른 중요한 요소는 체외 배양 한 세포 외 매트릭스와 상피 세포의 상호 작용이 해리; 아직 이러한 상피 분화에 중요한 자신의 중단은 종양 12에서 중요하다. 이를 염두에두고, 우리는 신선한 외과 폐기 물질 (13)로부터 유방 조직 미세 구조를 분리하는 방법을 확립. 내부 내강 및 외부 myoepitheli과 2 층 상피로 이루어진 유방 실질,알 세포는 지방 조직에서 절개하여 효소 및 기계적 해리를 실시한다. 세척 및 원심 분리 후, 우유 덕트의 조각이 많은 기질 세포와의 긴밀한 상호 작용을 유지하는 것을 얻을 수있다. 이러한 조직의 미세 구조는 반응 호르몬 남아있다. 이 모델은 임상 검체 (13)에서 확인되었다. 이와 같이 본 절차는 생물학적 및 임상 적 상황에서 유방 호르몬 작용을 연구하는 데 도움이 될 수 있습니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="877">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:164px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:260px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:335px;">Microlitre Centrifuge&#160;</td>
			<td style="width:164px;">Heraeus Biofuge Fresco</td>
			<td style="width:119px;">75005521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Centrifuge 5810R</td>
			<td style="width:164px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">5810 000.327</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Cryobox</td>
			<td style="width:164px;">Nalgene&#160;&#160;</td>
			<td style="width:119px;">5100-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:335px;">Controlled Rate Freezer EF600 Grant</td>
			<td style="width:164px;">Asymptote&#160;</td>
			<td style="width:119px;">EF600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:335px;">CO2 incubator</td>
			<td style="width:164px;">Hera Cell Heraeus</td>
			<td style="width:119px;">51022391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Roller Mixer SRT9D</td>
			<td style="width:164px;">Sturt</td>
			<td style="width:119px;">SRT9D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Histology Cassettes</td>
			<td style="width:164px;">Medizintechnik</td>
			<td style="width:119px;">81-0021-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Cell Strainer</td>
			<td style="width:164px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Strile Surgical Blade&#160;</td>
			<td style="width:164px;">Aesculap</td>
			<td>BB536&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Scalpel</td>
			<td style="width:164px;">Aesculap</td>
			<td style="width:119px;">BB084R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Forceps</td>
			<td style="width:164px;">Aesculap</td>
			<td style="width:119px;">BD047R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Scissors</td>
			<td style="width:164px;">Aesculap</td>
			<td style="width:119px;">BC374R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Paraffin base mold</td>
			<td style="width:164px;">SAKURA</td>
			<td style="width:119px;">4166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Optimal Cutting Temperature (OCT) Cryomatrix</td>
			<td style="width:164px;">Thermoscientific</td>
			<td style="width:119px;">6769006</td>
			<td style="width:260px;">Fetal Bovine Serum</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Penicillin/Streptomycin&#160;</td>
			<td style="width:164px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">15070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Antibiotic/Antimycotic</td>
			<td style="width:164px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">DMEM F/12</td>
			<td style="width:164px;">Life Technologies</td>
			<td>11039-021</td>
			<td>Prewarm (37&#176;C)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Collagenase</td>
			<td style="width:164px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">11 088 793 001</td>
			<td>Prewarm (37&#176;C)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:164px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">10270</td>
			<td>Can be replaced with Fetal Calf Serum</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Cell Blood Lysis Buffer</td>
			<td style="width:164px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">R7757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:335px;">Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td style="width:164px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:164px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">15400-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Agarose</td>
			<td style="width:164px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">16500-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Formaldehyde</td>
			<td style="width:164px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">F1635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:164px;">Roth</td>
			<td style="width:119px;">335</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Isopentane</td>
			<td style="width:164px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M32631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Ethanol</td>
			<td style="width:164px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">1009831000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Cryogenic vials (5.0ml)&#160;</td>
			<td style="width:164px;">VWR, International</td>
			<td style="width:119px;">479-0820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:335px;">Ultra low attachment culture dish</td>
			<td style="width:164px;">Corning, NY 14831</td>
			<td style="width:119px;">3471</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an ex vivo model to study hormone action in the human breast

인간의 유방암에서 호르몬 작용의 연구는 적절한 모델 시스템의 부족에 의해 방해되었다. 체외 배양시, 일차 유방 상피 세포는 호르몬 수용체 발현을 잃어버린다. 널리 사용되는 호르몬 수용체 양성 유방암 세포주는 생체 내 상황에 한정 관련이있다. 여기서 우리는 인간의 유방암에서 호르몬 작용을 연구하는 생체 모델을 설명합니다. 이러한 환원 mammoplasties mammectomies 같은 수술 또는 폐기 물질로부터 신선한 인간 유방 조직 표본 기계적 및 효소 적 덕트 및 소엽 복수 간질 세포 유형을 함유 조직편을 수득 소화된다. 성장 인자없이 기본 배지에서 유지 이러한 미세 조직은 세포 간 접촉, 조직 구조를 보존하고, 며칠 동안 반응 호르몬 남아있다. 그들은 쉽게 RNA 및 단백질 추출, 조직 학적 분석을 위해 처리 또는 중간 동결에 저장됩니다. 형광활성화 된 세포 분류 (FACS)는 특정 세포 집단을 위해 농축하는데 사용될 수있다. 이 프로토콜은 매우 복잡, 다양한 인간의 표본과 번역 연구에 대한 간단한 표준 접근 방식을 제공합니다.

에스트로겐과 프로게스테론의 역할을 연구하기 위해 더 나은 인간의 가슴에 자신의 분자 기능을 이해하기 위해, 우리는 그들의 동의를 얻은 후 감소 mammoplasties (그림 1)을받은 환자에서 신선한 인간의 유방 조직 표본을 수집합니다. 또한 환자의 의료 이력 및 생식뿐만 아니라 수술시의 혈청 프로게스테론 수준을 결정하기 위해 혈액 샘플을 얻었다. 신선한 감소 mammoplasties에서 조직 기...

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An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

우리는 인간의 유방암에서 호르몬 작용을 연구하기위한 새로운 생체 모델을 개발했다. 이 조직 구조, 세포 간 상호 작용 및 분비 신호를 보존 수술 유방 조직 표본으로부터 분리 미세 조직에 기초한다.

<em&gt; 생체 내</em&gt; 모델은 인간의 유방암에서 호르몬 행동을 연구하기 위해

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

11.3K 조회수.  Ecole polytechnique fédérale de Lausanne.  우리는 인간의 유방암에서 호르몬 작용을 연구하기위한 새로운 생체 모델을 개발했다. 이 조직 구조, 세포 간 상호 작용 및 분비 신호를 보존 수술 유방 조직 표본으로부터 분리 미세 조직에 기초한다. 

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Biomarkers in an Animal Model for Revealing Neural, Hematologic, and Behavioral Correlates of PTSD

Identification of biomarkers representing the evolution of the pathophysiology of Post Traumatic Stress Disorder (PTSD) is vitally important, not only for objective diagnosis but also for the evaluation of therapeutic efficacy and resilience to trauma. Ongoing research is directed at identifying molecular biomarkers for PTSD, including traumatic stress induced proteins, transcriptomes, genomic variances and genetic modulators, using biologic samples from subjects' blood, saliva, urine, and postmortem brain tissues. However, the correlation of these biomarker molecules in peripheral or postmortem samples to altered brain functions associated with psychiatric symptoms in PTSD remains unresolved. Here, we present an animal model of PTSD in which both peripheral blood and central brain biomarkers, as well as behavioral phenotype, can be collected and measured, thus providing the needed correlation of the central biomarkers of PTSD, which are mechanistic and pathognomonic but cannot be collected from people, with the peripheral biomarkers and behavioral phenotypes, which can.
Our animal model of PTSD employs restraint and tail shocks repeated for three continuous days - the inescapable tail-shock model (ITS) in rats. This ITS model mimics the pathophysiology of PTSD 17, 7, 4, 10. We and others have verified that the ITS model induces behavioral and neurobiological alterations similar to those found in PTSD subjects 17, 7, 10, 9. Specifically, these stressed rats exhibit (1) a delayed and exaggerated startle response appearing several days after stressor cessation, which given the compressed time scale of the rat's life compared to a humans, corresponds to the one to three months delay of symptoms in PTSD patients (DSM-IV-TR PTSD Criterian D/E 13), (2) enhanced plasma corticosterone (CORT) for several days, indicating compromise of the hypothalamopituitary axis (HPA), and (3) retarded body weight gain after stressor cessation, indicating dysfunction of metabolic regulation.
The experimental paradigms employed for this model are: (1) a learned helplessness paradigm in the rat assayed by measurement of acoustic startle response (ASR) and a charting of body mass; (2) microdissection of the rat brain into regions and nuclei; (3) enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for blood levels of CORT; (4) a gene expression microarray plus related bioinformatics tools 18. This microarray, dubbed rMNChip, focuses on mitochondrial and mitochondria-related nuclear genes in the rat so as to specifically address the neuronal bioenergetics hypothesized to be involved in PTSD.

We describe a rat model of post traumatic stress disorder (PTSD) that reveals the persistent alterations in neuroendocrine function and the delayed long-term, exaggerated fear response, characteristic of PTSD patients. The animal model and methods described here are useful for correlating biomarkers in brain nuclei, which are mechanistic but cannot be measured in patients, with biomarkers in peripheral white blood cells, which can.

PTSD의, 신경 Hematologic, 그리고 행동 상관 관계를 누설하는 행위에 대해서는 동물 모델에서 생체

Identification of biomarkers representing the evolution of the pathophysiology of Post Traumatic Stress Disorder (PTSD) is vitally important, not only for ...

연구

의학

Human Neuroendocrine Tumor Cell Lines as a Three-Dimensional Model for the Study of Human Neuroendocrine Tumor Therapy

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human malignancies.1 Other than surgery for the minority of patients who present with localized disease, there is little or no survival benefit of systemic therapy. Therefore, there is a great need to better understand the biology of NETs, and in particular define new therapeutic targets for patients with nonresectable or metastatic neuroendocrine tumors. 3D cell culture is becoming a popular method for drug screening due to its relevance in modeling the in vivo tumor tissue organization and microenvironment.2,3 The 3D multicellular spheroids could provide valuable information in a more timely and less expensive manner than directly proceeding from 2D cell culture experiments to animal (murine) models.
To facilitate the discovery of new therapeutics for NET patients, we have developed an in vitro 3D multicellular spheroids model using the human NET cell lines. The NET cells are plated in a non-adhesive agarose-coated 24-well plate and incubated under physiological conditions (5% CO2, 37 &deg;C) with a very slow agitation for 16-24 hr after plating. The cells form multicellular spheroids starting on the 3rd or 4th day. The spheroids become more spherical by the 6th day, at which point the drug treatments are initiated. The efficacy of the drug treatments on the NET spheroids is monitored based on the morphology, shape and size of the spheroids with a phase-contrast light microscope. The size of the spheroids is estimated automatically using a custom-developed MATLAB program based on an active contour algorithm. Further, we demonstrate a simple method to process the HistoGel embedding on these 3D spheroids, allowing the use of standard histological and immunohistochemical techniques. 
This is the first report on generating 3D spheroids using NET cell lines to examine the effect of therapeutic drugs. We have also performed histology on these 3D spheroids, and displayed an example of a single drug's effect on growth and proliferation of the NET spheroids. Our results support that the NET spheroids are valuable for further studies of NET biology and drug development.

We present a simple agarose overlay platform to grow 3D multicellular spheroids using neuroendocrine cancer cell lines. This method provides a very convenient way to examine the effect of therapeutic drugs on the neuroendocrine tumor cells. It could also help us establish human neuroendocrine tumor spheroids for cancer therapy.

인간 Neuroendocrine 종양 치료의 연구를위한 3 차원 모델로 인간 Neuroendocrine 종양 세포 라인

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human ...

A Human Ex Vivo Atherosclerotic Plaque Model to Study Lesion Biology

Atherosclerosis is a chronic inflammatory disease of the vasculature. There are various methods to study the inflammatory compound in atherosclerotic lesions. Mouse models are an important tool to investigate inflammatory processes in atherogenesis, but these models suffer from the phenotypic and functional differences between the murine and human immune system. In vitro cell experiments are used to specifically evaluate cell type-dependent changes caused by a substance of interest, but culture-dependent variations and the inability to analyze the influence of specific molecules in the context of the inflammatory compound in atherosclerotic lesions limit the impact of the results. In addition, measuring levels of a molecule of interest in human blood helps to further investigate its clinical relevance, but this represents systemic and not local inflammation. Therefore, we here describe a plaque culture model to study human atherosclerotic lesion biology ex vivo. In short, fresh plaques are obtained from patients undergoing endarterectomy or coronary artery bypass grafting and stored in RPMI medium on ice until usage. The specimens are cut into small pieces followed by random distribution into a 48-well plate, containing RPMI medium in addition to a substance of interest such as cytokines or chemokines alone or in combination for defined periods of time. After incubation, the plaque pieces can be shock frozen for mRNA isolation, embedded in Paraffin or OCT for immunohistochemistry staining or smashed and lysed for western blotting. Furthermore, cells may be isolated from the plaque for flow cytometry analysis. In addition, supernatants can be collected for protein measurement by ELISA. In conclusion, the presented ex vivo model opens the possibility to further study inflammatory lesional biology, which may result in identification of novel disease mechanisms and therapeutic targets.

A Human Ex Vivo Atherosclerotic Plaque Model to Study Lesion Biology

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process. This manuscript illustrates an easy to use ex vivo model to investigate fresh carotid or coronary artery plaques. The ex vivo model allows for the investigation of potential substances on the inflammatory milieu in human atherosclerotic lesions and results can be analyzed by various methods.

인간의<em&gt; 전의 VIVO</em&gt; 죽상 경화 모델 병변 생물학을 연구하는

Atherosclerosis is a chronic inflammatory disease of the vasculature. There are various methods to study the inflammatory compound in atherosclerotic ...

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As such, primary or &#39;neuronal-like&#39; cell culture systems are commonly utilized. While&#160;these systems are relatively easy to work with, and are useful model systems in which various functional outcomes (such as cell death) can be readily quantified, the examined outcomes and pathways in cultured immature neurons (such as excitotoxicity-mediated cell death pathways) are not necessarily the same as those observed in mature brain, or in intact tissue. Therefore, there is the need to develop models in which cellular mechanisms in mature neural tissue can be examined. We have developed an in vitro technique that can be used to investigate a variety of molecular pathways in intact nervous tissue. The technique described herein utilizes rat cortical tissue, but this technique can be adapted to use tissue from a variety of species (such as mouse, rabbit, guinea pig, and chicken) or brain regions (for example, hippocampus, striatum, etc.). Additionally, a variety of stimulations/treatments can be used (for example, excitotoxic, administration of inhibitors, etc.). In conclusion, the brain slice model described herein can be used to examine a variety of molecular mechanisms involved in excitotoxicity-mediated brain injury.

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

We have developed a brain slice model which can be used to examine molecular mechanisms involved in excitotoxicity-mediated brain injury.&#160;This technique generates viable mature brain tissue and reduces animal numbers required for experimentation, whilst keeping the neuronal circuitry, cellular interactions, and postsynaptic compartments partly intact.

같은 뇌 Microslices의 흥분 독성 자극<em&gt; 체외</em&gt; 스트로크의 모델

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As ...

Human Dupuytren's Ex Vivo Culture for the Study of Myofibroblasts and Extracellular Matrix Interactions

Organ fibrosis or &#8220;scarring&#8221; is known to account for a high death toll due to the extensive amount of disorders and organs affected (from cirrhosis to cardiovascular diseases). There is no effective treatment and the in vitro tools available do not mimic the in vivo situation rendering the progress of the out of control wound healing process still enigmatic.
To date, 2D and 3D cultures of fibroblasts derived from DD patients are the main experimental models available. Primary cell cultures have many limitations; the fibroblasts derived from DD are altered by the culture conditions, lack cellular context and interactions, which are crucial for the development of fibrosis and weakly represent the derived tissue. Real-time PCR analysis of fibroblasts derived from control and DD samples show that little difference is detectable. 3D cultures of fibroblasts include addition of extracellular matrix that alters the native conditions of these cells. 
As a way to characterize the fibrotic, proliferative properties of these resection specimens we have developed a 3D culture system, using intact human resections of the nodule part of the cord. The system is based on transwell plates with an attached nitrocellulose membrane that allows contact of the tissue with the medium but not with the plastic, thus, preventing the alteration of the tissue. No collagen gel or other extracellular matrix protein substrate is required. The tissue resection specimens maintain their viability and proliferative properties for 7 days. This is the first &#8220;organ&#8221; culture system that allows human resection specimens from DD patients to be grown ex vivo and functionally tested, recapitulating the in vivo situation.

Human Dupuytren&#039;s Ex Vivo Culture for the Study of Myofibroblasts and Extracellular Matrix Interactions

Dupuytren&#8217;s disease (DD) is a fibroproliferative disease of the palm of the hand. Here, we present a protocol to culture resection specimens from DD in a three-dimensional (3D) culture system. Such short-term culture system allows preservation of the 3D structure and molecular properties of the fibrotic tissue.

인간의 Dupuytren의<em&gt; 전의 VIVO</em&gt; 근섬유 아세포의 연구와 세포 외 기질 상호 작용에 대한 문화

Organ fibrosis or &#8220;scarring&#8221; is known to account for a high death toll due to the extensive amount of disorders and organs affected (from ...

Methods for Culturing Human Femur Tissue Explants to Study Breast Cancer Cell Colonization of the Metastatic Niche

Bone is the most common site of breast cancer metastasis. Although it is widely accepted that the microenvironment influences cancer cell behavior, little is known about breast cancer cell properties and behaviors within the native microenvironment of human bone tissue.We have developed approaches to track, quantify and modulate human breast cancer cells within the microenvironment of cultured human bone tissue fragments isolated from discarded femoral heads following total hip replacement surgeries. Using breast cancer cells engineered for luciferase and enhanced green fluorescent protein (EGFP) expression, we are able to reproducibly quantitate migration and proliferation patterns using bioluminescence imaging (BLI), track cell interactions within the bone fragments using fluorescence microscopy, and evaluate breast cells after colonization with flow cytometry. The key advantages of this model include: 1) a native, architecturally intact tissue microenvironment that includes relevant human cell types, and 2) direct access to the microenvironment, which facilitates rapid quantitative and qualitative monitoring and perturbation of breast and bone cell properties, behaviors and interactions. A primary limitation, at present, is the finite viability of the tissue fragments, which confines the window of study to short-term culture. Applications of the model system include studying the basic biology of&#160;breast cancer and other bone-seeking malignancies within the metastatic niche, and developing therapeutic strategies to effectively target breast cancer cells in bone tissues.

Protocols are described for studying breast cancer cell migration, proliferation and colonization in a human bone tissue explant model system.

배양 인간의 대퇴골 조직 외식하는 방법은 전이성 틈새의 유방암 세포 집락을 연구하기 위해

Bone is the most common site of breast cancer metastasis. Although it is widely accepted that the microenvironment influences cancer cell behavior, little ...

In Vivo and Ex Vivo Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose

High-grade serous ovarian cancer (HGSC), the cause of widespread peritoneal metastases, continues to have an extremely poor prognosis; fewer than 30% of women are alive 5 years after diagnosis. The omentum is a preferred site of HGSC metastasis formation. Despite the clinical importance of this microenvironment, the contribution of omental adipose tissue to ovarian cancer progression remains understudied. Omental adipose is unusual in that it contains structures known as milky spots, which are comprised of B, T, and NK cells, macrophages, and progenitor cells surrounding dense nests of vasculature. Milky spots play a key role in the physiologic functions of the omentum, which are required for peritoneal homeostasis. We have shown that milky spots also promote ovarian cancer metastatic colonization of peritoneal adipose, a key step in the development of peritoneal metastases. Here we describe the approaches we developed to evaluate and quantify milky spots in peritoneal adipose and study their functional contribution to ovarian cancer cell metastatic colonization of omental tissues both in vivo and ex vivo. These approaches are generalizable to additional mouse models and cell lines, thus enabling the study of ovarian cancer metastasis formation from initial localization of cells to milky spot structures to the development of widespread peritoneal metastases.

In Vivo and Ex Vivo Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose

We outline a protocol that implements both in vivo and ex vivo approaches to study ovarian cancer colonization of peritoneal adipose tissues, particularly the omentum. Furthermore, we present a protocol to quantitate and analyze immune cell-structures in the omentum known as milky spots, which promote metastases of peritoneal adipose.

생체 내 및 생체 외 복막 지방이에 밀키 스팟 구조의 난소 암 전이성 식민지를 연구하는 접근 방식

High-grade serous ovarian cancer (HGSC), the cause of widespread peritoneal metastases, continues to have an extremely poor prognosis; fewer than 30% of ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic patient tumors in different assays1. Human tumor xenografts represent the gold standard with respect to tumor biology, drug discovery, and metastasis research 2-4. Tumor xenografts can be derived from different types of material like tumor cell lines, tumor tissue from primary patient tumors4 or serially transplanted tumors. When propagated in vivo, xenografted tissue is infiltrated and vascularized by cells of mouse origin. Multiple factors such as the tumor entity, the origin of xenografted material, growth rate and region of transplantation influence the composition and the amount of mouse cells present in tumor xenografts. However, even when these factors are kept constant, the degree of mouse cell contamination is highly variable.
Contaminating mouse cells significantly impair downstream analyses of human tumor xenografts. As mouse fibroblasts show high plating efficacies and proliferation rates, they tend to overgrow cultures of human tumor cells, especially slowly proliferating subpopulations. Mouse cell derived DNA, mRNA, and protein components can bias downstream gene expression analysis, next-generation sequencing, as well as proteome analysis 5. To overcome these limitations, we have developed a fast and easy method to isolate untouched human tumor cells from xenografted tumor tissue. This procedure is based on the comprehensive depletion of cells of mouse origin by combining automated tissue dissociation with the benchtop tissue dissociator and magnetic cell sorting. Here, we demonstrate that human target cells can be can be obtained with purities higher than 96% within less than 20 min independent of the tumor type.

Human tumor xenografts are vascularized and infiltrated by cells of mouse origin during the growth phase in vivo. To circumvent the bias caused by these contaminating cells during downstream analysis, we developed a method allowing for comprehensive depletion of all mouse cells by magnetic cell sorting.

인간 종양 이종 이식에서 마우스 세포의 고갈은 크게 대상 세포의 다운 스트림 분석을 향상

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...

Breast Milk Enhances Growth of Enteroids: An Ex Vivo Model of Cell Proliferation

Human small intestinal enteroids are derived from the crypts and when grown in a stem cell niche contain all of the epithelial cell types. The ability to establish human enteroid ex vivo culture systems are important to model intestinal pathophysiology and to study the particular cellular responses involved. In recent years, enteroids from mice and humans are being cultured, passaged, and banked away for future use in several laboratories across the world. This enteroid platform can be used to test the effects of various treatments and drugs and what effects are exerted on different cell types in the intestine. Here, a protocol for establishing primary stem cell-derived small intestinal enteroids derived from neonatal mice and premature human intestine is provided. Moreover, this enteroid culture system was utilized to test the effects of species-specific breast milk. Mouse breast milk can be obtained efficiently using a modified human breast pump and expressed mouse milk can then be used for further research experiments. We now demonstrate the effects of expressed mouse, human, and donor breast milk on the growth and proliferation of enteroids derived from neonatal mice or premature human small intestine.

Breast Milk Enhances Growth of Enteroids: An Ex Vivo Model of Cell Proliferation

This protocol describes how to establish an enteroid culture system from neonatal mouse or premature human intestine as well as an efficient method to collect milk from mice.

유 방 우유 Enteroids의 성장을 강화: 세포 증식의 Ex Vivo 모델

Human small intestinal enteroids are derived from the crypts and when grown in a stem cell niche contain all of the epithelial cell types. The ability to ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and drugs. It is widely used in many studies on the physiological functions of vascular smooth muscle, the pathogenesis of vascular diseases such as hypertension, and the development of smooth muscle relaxant drugs. The mouse is a widely used model animal with a large pool of disease models and genetically modified strains. We introduced this method to measure the isometric contraction of mouse mesenteric artery in detail. A 1.4-mm segment of mouse mesenteric resistance artery was isolated and mounted on a myograph chamber by passing two steel wires through its lumen. After equilibration and normalization steps, the vessel segment was potentiated by a high-K+ solution twice prior to the contraction assay. As an example of the application of this method in drug development, we measured the relaxant effect of a novel natural substance, neoliensinine, isolated from a Chinese herb, embryos of the lotus seed (Nelumbo nucifera Gaertn.) on mouse mesenteric arteries. The vessel segments mounted on the myograph chamber were stimulated with a high-K+ solution. When the force tension reached a stable sustained phase, cumulative doses of neoliensinine were added to the chamber. We found that neoliensinine had a dose-dependent relaxant effect on smooth muscle contraction, thus suggesting that it bears potential activity against hypertension. In addition, as the vessel segment can survive at least 4 hours after mounting and maintain contractility induced by the high-K+ solution for many times, we suggest that the wire myograph system may be used for the time-consuming process of drug screening.

The wire myograph technique is used to investigate vascular smooth muscle functions and screen new drugs. We report a detailed protocol for measuring the isometric contractility of the mouse mesenteric artery and for screening new relaxants of vascular smooth muscle.

Myography 와이어를 사용 하 여 마우스 Mesenteric 동맥의 isometric 수축 측정

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...