이 작품은 재단 (DML), 미국 암 학회 (DML), MGH 하워드 굿맨 원정대 (DML), 건강의 미국 국립 연구소가 부여 스탠드 알렉스의 레모네이드에 의해 지원됩니다 R24OD016761 및 1R01CA154923 (DML). CNY 유동 세포 계측법 코어 및 흐름 이미지 분석, 공유 기기 허가 번호 1S10RR023440-01A1. IMT는 과학 기술의 포르투갈어 재단 (- FCT Fundação 파라 Ciência 전자 TECNOLOGIA)에서 친교에 의해 투자된다. QT는 중국 장학위원회가 자금을 지원한다. 우리는 그녀의 도움의 의견과 조언을 안젤라 Volorio 감사합니다.

모든 동물의 절차는 프로토콜 # 2011N000127에서 연구 동물 관리에 매사추세츠 종합 병원 분과위원회에 의해 승인되었다. 성인 rag2 E450fs 동질 접합체 돌연변이 제브라 피쉬에 제 1 절 골격근 세포 이식 성인 Zebrafish의 기부자 골격근 세포의 1. 준비 <ol><li> 형광 근육을 표시 한 형질 전환 성인 제브라 피쉬를 얻습니다. 이 실험에서, 30-α 액틴 RFP 공여체 물고기 25받는 어류 당 1 × 106 세포를 이식하기 위해 이용 하였다. </li><li> 1.6 MG의 희생 기증자 제브라 피쉬는 / 10 분이나 더 아가미의 움직임이 분명하지 않을 때까지 메탄 (MS222)를 tricaine ㎖로. </li><li> 흡수 종이 타월 및 소비세에 깨끗한 면도날을 사용하여 등쪽 근육을 공여 물고기를 놓습니다. 도 1a에서 언급 된 바와 같이 절단은 조직 수집을 (최대화하기 위해 45 ° 각도로 항문 부근 이루어져야 </strong&gt;). 깨끗한 10cm 페트리 접시에 해부 조직을 놓습니다. </li><li> 해부 조직에 500 μL 현탁 완충액 (프리 냉장 0.9 인산염 완충액 식염수, 5 % 우 태아 혈청 (FBS) 보충 된 (PBS))를 추가한다. 10 기증자 제브라 피쉬까지이 책에 함께 배치 할 수 있습니다. </li><li> 세포가 균일 한 현탁액 때까지&gt; 20 회 면도날로 조직을 말하다. 전체 지느러미 근육은 피부, 뼈와 지느러미를 포함하여 균질화. 서스펜션 버퍼 2 ML을 추가합니다. 5 ㎖ 피펫을 사용하여, 세포를 해리 세포 현탁액을 ≥20 회 연화. </li><li> 얼음 상에 배치 된 50ml 원추형 튜브에 40 ㎛의 메쉬 스트레이너를 통해서 세포 현탁액을 필터. </li><li> 나머지 조직을 수집하고 5 ㎖ (10 기증자 물고기가 분리 당 사용할 수있는)의 최종 볼륨, 같은 여과기 및 원뿔 튜브를 통해 필터링 서스펜션 버퍼의 추가 2.5 ml의 페트리 접시를 씻으십시오. 참고 : 피부, 뼈와 지느러미를 여과 다음 제외됩니다. </li&gt; <li> 해당되는 경우, 같은 원뿔 튜브에 유사한 현탁액을 결합한다. </li><li> 트리 판 블루 및 혈구 염료를 사용하여 생존 세포의 총 수를 계산. </li><li> (옵션, 2 단계)를 원하는 경우, 유동 세포 계측법 500 μl를 보유합니다. </li><li> 4 ℃에서 10 분 동안 1,000 XG, 원심 분리기 세포 현탁액. </li><li> 3.33 × 10 5 세포 / μL에 뜨는에 resuspend 세포를 폐기 (0.9 PBS + 5 % FBS). 총 3 μL은 수신자 당 1 × 106 세포 (단계 3)의 총 수신자 어류 당 주입한다. 참고 : 세포 현탁액 미만 3 μL받는 사람 물고기에 이식해야한다. 세포 수는 제한되어있는 경우,받는 사람에 따라 낮은 4 ~ 10 × 5와 같은 세포는 성공적으로 생착 (표 1)을 초래할 수 있습니다. </li></ol> 기증자 골격근 세포의 제조 2. 유동 세포 계측법 분석 (선택 사항) <ol><li> 난을 설명 된대로 야생형, 비 형질 전환 어류에서 근육을 분리N 단계 1.1. 이 샘플은 음성 대조군 역할 및 유동 세포 계측법 게이트를 설정하는 데 유용합니다. </li><li> 적절한 생존 염료를 추가합니다. 예를 들어, 근육 준비의 500 μL에 스톡 DAPI 용액 (500 NG / μL)의 5 μl를 추가합니다. 분석에 약간 이전의 소용돌이. 5 × 10월 3일부터 1일까지 × 104 이벤트를 획득. 형질 전환 어류에서 분리 된 근육 세포의 분석에 의해 다음 게이트를 배치하는 최초의 야생 형 제어 샘플을 분석 할 수 있습니다. 참고 : 유동 세포 계측법 분석은 일반적으로 해부 세포가 60 % 이상 생존 (그림 2)를 유지하는 동안 근육 조직 절제 후 1 시간 내에서 수행된다. 세포는 항상 얼음에 보관해야합니다. 총 세포 생존율은 트리 판 블루 색소 및 혈구를 사용 전에 재 이식에 평가 될 수있다. </li></ol> 성인 rag2 동질 접합체 돌연변이 제브라 피쉬에 골격근 세포의 3. 근육 이식 <ol><li> 10 μ를 청소;에서 드로잉 및 70 % 에탄올 (5 배) 하였다 10 % 표백제 용액 (5 회), 추방하고 현탁 완충액 (0.9 PBS + 5 % FBS, 10 회) 하였다 의해 L 26S G 마이크로 주사기. </li><li> 아가미의 움직임 느린에게까지 시스템 물에서 물고기를 포함하는 페트리 접시에 tricaine 메탄 (MS222, 4 ㎎ / ㎖ 원액)의 한 방울을 추가하여 2-4개월 된 동형 접합 rag2 돌연변이 물고기 또는 (컨트롤 등) 야생형받는 물고기를 마취 물고기는 여전히. 참고 : tricaine 마취의 투여 량받는 사람 제브라 피쉬의 나이와 크기에 따라 달라집니다. </li><li> 왼쪽면이 위를 향하도록하여, 젖은 종이 타월이나 스폰지에 마취받는 사람 제브라 피쉬를 놓습니다. </li><li> latero - 등의 근육에 주사기 바늘을 삽입 (1A 그림 참조). 주사는 45 ° 각도로 수행되어 있는지 확인합니다. 수신자 당 1 × 106 세포의 총 어류 당 (1.12 단계에서 제조 된) 세포 현탁액 3 μl를 주입한다.</li><li> 조심스럽게 복구 플라스틱 숟가락을 사용하여 깨끗한 탱크에 주입 제브라 피쉬를 전송합니다. </li><li> 밝은 필드와 표면 형광 현미경 하에서 마취 물고기를 영상화하여 10, 20, 30 일 후 이식에서 생착 속도에 대한받는 사람 제브라 피쉬를 평가합니다. </li></ol> 성인 동형 rag2 돌연변이 제브라 피쉬에 제 2 절 배아 성 횡문근 육종 (ERMS) 이식 제브라 피쉬 배아 4. DNA 미세 주입 <ol><li> 6 시간 또는 O / N 37 ° C에서 XhoI에와 DNA의 10 μg의를 소화하여 rag2-kRASG12D 플라스미드 7 선형화. </li><li> 표준 페놀에 의한 DNA 정화 : 클로로포름 추출과 에탄올로 침전. 탈 이온수 20 μL에 재현 탁 (대안 적으로, 상업적 DNA 단편 정화 컬럼이 사용될 수있다). </li><li> 1 % 아가 로즈 겔상에서 DNA 소화 및 소화를 실행하고 DNA (B)의 농도를 결정Y 분광계 읽기. 1, 1 : 1, 또는 실행에서 샘플을 5, 1 % 아가 로스 겔상에서 1시 10분 희석 및 DNA 래더와 비교 재배 적. </li><li> 0.1 M의 KCl과 0.5 배 트리스 EDTA 15 NG 소화 rag2-kRASG12D DNA의 / μL의 최종 농도로 주입 믹스를 준비합니다. 주입 부피의 주입이 NL 최종 DNA 량은 30 PG 것이다. 참고 : 세 가지 DNA 구조까지 효율적으로 공동 주입 배아 당 DNA의 60 페이지의 최대에있을 수 있습니다. 가이 유전자는 게놈에 통합 개발 종양 (26) 내에서 공동 발현. </li><li> 관심 제브라 피쉬의 변형 (그림 1B)로 27 설명한 바와 같이 본질적으로 하나의 세포 단계의 배아로 선형화 rag2-kRASG12D을 주입한다. 주사는 높은 효율의 노른자에 셀이 아닌 수행해야합니다. 이 실험, 이중 형질 전환 AB-변형에서, myf5-GFP, mylpfa-mCherry 사용 하였다. 표준 양육 페이지를 사용하여 제브라 피쉬를 올립니다28 rotocols. 참고 : 사출 생존 자주 사용하는 제브라 피쉬의 변형에 따라 달라집니다. 평균적으로, 주입 된 배아의 30 %는 ERMS를 개발합니다. 300-600 배아 그 GFP 양성 및 충분한 차 mCherry 양성 종양 이식 및 분석을 위해 생성되도록하기 위해 실험 당 주입한다. </li></ol> Zebrafish의 유충에 차 ERMS 5. 심사 <ol><li> 10 ~ 30 일이 외부에서 볼 수있는 기본 ERMS의 출현을 위해 주사를 게시로부터 분사 된 제브라 피쉬를 관찰합니다. </li><li> 30 일 포스트 분사시 아가미 움직임 느리고 물고기가 아직까지 물고기 시스템 물을 함유하는 페트리 접시로 tricaine 메탄 (MS222 4 ㎎ / ㎖ 원액)의 단일 방울을 추가하여받는 지브라​​ 피쉬 마취. 참고 : tricaine 마취의 투여 량받는 사람 제브라 피쉬의 나이와 크기에 따라 달라집니다. 차 종양 베어링 제브라 피쉬는 tricaine의 낮은 용량을 필요로한다. </li><li> 차 ERMS 베어링을 선택표면 형광 현미경을 이용하여, myf5-GFP 양성 및 mylpfa-mCherry가 양성이다 물고기. </li></ol> 6. ERMS 종양 준비 <ol><li> 10 분이나 더 아가미의 움직임이 분명하지 않을 때까지 1.6 ㎎ / ㎖ tricaine 메탄 (MS222)에서 선택한 기본 ERMS 베어링 제브라 피쉬를 희생. </li><li> 개별적으로 각각의 종양 베어링 제브라 피쉬를 처리합니다. 깨끗한 페트리 접시에 생선을 놓고 면도날 및 미세 집게 (그림 1B에서와 같이)를 사용하여 종양 주위 해부. 깨끗한 페트리 접시에 해부 종양 조직을 전송합니다. </li><li> 5 % 태아 소 혈청 (FBS)와 보충 미리 냉장 0.9 인산 버퍼 식염수 (PBS)의 100 μl를 추가합니다. 깨끗한 면도날 말하다 조직&gt; 셀 때까지 20 시간은 균일 한 현탁액에 있습니다. </li><li> 피펫 팁 필터링 1000 μl를 사용하여 세포를 해리 위아래로 여러 번 같은 버퍼 900 μL (0.9 PBS + 5 % FBS), 피펫을 추가합니다. 40을 통해 필터# 956; 해당하는 50 ML 원뿔 튜브에 m 메쉬 여과기입니다. 얼음에 보관하십시오. </li><li> 버퍼의 추가 2-4 ml의 페트리 접시를 씻으, 같은 메쉬 스트레이너를 통해 해당 원뿔 튜브로 전달합니다. </li><li> 4 ° C에서 10 분 동안 1,000 XG, 원심 분리기,. </li><li> 버퍼 100 ㎕에 뜨는에 resuspend 폐기하십시오. </li><li> 트리 판 블루 및 혈구 염료를 사용하여 생존 세포의 총 수를 계산. </li><li> 동일한 완충액에 원하는 세포 농도로 희석 (0.9 PBS + 5 % FBS). 세포를받는 당 2.5 × 104 세포, 총 수신자 제브라 피쉬 당 5 μl를 이앙 / μL를 5 × 103 세포로 희석한다. </li><li> 유동 세포 계측법 분석은 샘플 내에서 형광 세포의 상대적인 비율을 양자화하는 단계 6.5에서 현탁액의 소량을 행할 수있다. 참고 : 옆 (단계 3.5 필터링 다음) 세포 현탁액 100 ㎕ 설정하고 400 μL로 희석유동 세포 계측법 분석을위한 0.9 PBS + 5 % FBS 서스펜션 버퍼의. 적절한 게이팅을 보장하기 위해, 성인 야생형, myf5-GFP 및 mylpfa-mCherry 물고기에서 고립 된 단일 유전자 변형 종양 조직 또는 근육을 사용하여 추가 분석을 수행합니다. 제 1의 2 단계에 설명 된대로 본질적으로 유동 세포 계측법을 수행합니다. </li></ol> 성인 rag2 동질 접합체 돌연변이 제브라 피쉬에 ERMS 7. 이식 <ol><li> (5 회)에서 드로잉 10 % 70 % 에탄올 이어 표백 용액 (5 회), 추방함으로써 10 μL 26S G 마이크로 주사기를 청소 한 후 현탁 완충액 (0.9 PBS + 5 % FBS, 10 배 이어 ). </li><li> 아가미 움직임 느리다 물고기가 계속 될 때까지 시스템을 물에 물고기를 포함하는 페트리 접시로 tricaine 메탄 (MS222 4 ㎎ / ㎖ 원액)의 단일 방울을 추가하여 수신자 동형 접합성 rag2 돌연변이 물고기 마취. </li><li> 젖은 종이 타월 또는 SPO에 마취받는 사람 제브라 피쉬를 배치NGE, 복부면이 위를 향. </li><li> 복강 (받는 당 2.5 × 104 세포)에 세포 현탁액의 5 μL를 주입한다. 주 : 단계 4.1에 기재된 바와 같이 주입 바늘이 다른 종양의 주사를 청소한다. 5 내지 10 μL 효율적받는 물고기 크기에 따라 복강 내 이식 할 수있다. 종양 생착을받는 어류 당 1 × 104 5 × 5 × 정렬되지 않은 세포 (표 1)을 주입함으로써 달성 될 수있다. </li><li> 조심스럽게 플라스틱 스푼으로 깨끗한 탱크에받는 사람 제브라 피쉬를 배치합니다. </li><li> 밝은 필드와 표면 형광 현미경 하에서 마취 물고기를 영상화하여 10, 20, 30 일 후 이식에서 생착 속도에 대한받는 사람 제브라 피쉬를 평가합니다. </li><li> 분화 상태 (그림 3H), 표준 조직 학적 analy을 평가하기 위해 형광 활성화 된 셀 정렬 (FACS)를 포함하여 다운 스트림 애플리케이션에 접목 물고기를 활용SIS (도 3f), 촬상 요법 응답 (15), 및 / 또는 직렬 이식 희석 분석 (11)을 포함하여 제한에 접근한다. </li></ol>

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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+cell+transplantation+using+adult+rag2+mutant+zebrafish.">Optimized cell transplantation using adult rag2 mutant zebrafish.</a> Nature methods. 11, 821-824 (2014).</li><li>Zhou, Q., Facciponte, J., Jin, M., Shen, Q., Lin, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humanized+NOD-SCID+IL2rg&#8211;/&#8211;+mice+as+a+preclinical+model+for+cancer+research+and+its+potential+use+for+individualized+cancer+therapies.">Humanized NOD-SCID IL2rg&#8211;/&#8211; mice as a preclinical model for cancer research and its potential use for individualized cancer therapies.</a> Cancer letters. 344 (1), 13-19 (2014).</li><li>Higashijima, S., Okamoto, H., Ueno, N., Hotta, Y., Eguchi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-frequency+generation+of+transgenic+zebrafish+which+reliably+express+GFP+in+whole+muscles+or+the+whole+body+by+using+promoters+of+zebrafish+origin.">High-frequency generation of transgenic zebrafish which reliably express GFP in whole muscles or the whole body by using promoters of zebrafish origin.</a> Developmental biology. 192 (2), 289-299 (1997).</li><li>Langenau, D. M., Keefe, M. D. D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-injection+strategies+to+modify+radiation+sensitivity+and+tumor+initiation+in+transgenic+Zebrafish.">Co-injection strategies to modify radiation sensitivity and tumor initiation in transgenic Zebrafish.</a> Oncogene. 27 (30), 4242-4248 (2008).</li><li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function.">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> J Vis Exp. (25), 1-5 (2009).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).</li><li>Alexander, M. S., Kawahara, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+transcriptome+analysis+of+adult+zebrafish+cells+enriched+for+skeletal+muscle+progenitors).">Isolation and transcriptome analysis of adult zebrafish cells enriched for skeletal muscle progenitors).</a> Muscl, &amp; nerve. 43 (5), 741-750 (2011).</li><li>Motohashi, N., Asakura, Y., Asakura, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture,+and+transplantation+of+muscle+satellite+cells.">Isolation, culture, and transplantation of muscle satellite cells.</a> Journal of visualized experiments JoVE. (86), 1-7 (2014).</li><li>Gerli, M. F. M., Maffioletti, S. M., Millet, Q., Tedesco, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+induced+pluripotent+stem+cell-derived+mesoangioblast-like+myogenic+progenitors+in+mouse+models+of+muscle+regeneration.">Transplantation of induced pluripotent stem cell-derived mesoangioblast-like myogenic progenitors in mouse models of muscle regeneration.</a> J Vis Exp. (83), e50532 (2014).</li><li>Siegel, A. L., Gurevich, D. B., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+myogenic+precursor+cell+that+could+contribute+to+regeneration+in+zebrafish+and+its+similarity+to+the+satellite+cell.">A myogenic precursor cell that could contribute to regeneration in zebrafish and its similarity to the satellite cell.</a> The FEBS journal. 280 (17), 4074-4088 (2013).</li><li>Rowlerson, a., Radaelli, G., Mascarello, F., Veggetti, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+skeletal+muscle+in+two+teleost+fish:+Sparus+aurata+and+Brachydanio+rerio.">Regeneration of skeletal muscle in two teleost fish: Sparus aurata and Brachydanio rerio.</a> Cell Tissue Res. 289 (2), 311-322 (1997).</li><li>White, R. M., Sessa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transparent+adult+zebrafish+as+a+tool+for+in+vivo+transplantation+analysis.">Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis.</a> Cell stem cell. 2 (2), 183-189 (2008).</li></ol>

The authors have no competing financial interests.

성인 등의 골격근의 효율적이고 강력한 생착이 rag2 동형 접합 돌연변이 물고기의 등 근육에 세포를 주입 한 다음 아주 간단한 세포 제조 방법으로 달성했다. 몇몇 관련된 사망 즉시 10 %에서 35 %에 따라 실험에 이르기까지 주입 절차를 다음과 같이 일반적으로 근육 주사 절차가 매우 강력했다. 추가 최적화 가능성이 세포를 이식의 용이성을 용이하게 주입 및 현미경과 미세 조작기를 이용하여 고정 사출 장치의 개발을위한 작은 게이지 바늘의 사용에 중심됩니다. 우리의 접근은 또한 공여 동물에서 정렬되지 않은 근육 세포를 이용하고 약 30 %에만 근육 모세포를 함유 하였다. 가능성이받는 물고기로 증가 생착로 이어질 풍부한 세포 현탁액을 제공 할 것입니다 줄기 세포와 FACS 분리 라벨을 유전자 변형 기자 라인의 사용. 골격근 C이전 29 설명 된대로 ELL 학생은, 농축 및 이식 배양 이전 할 수있다. 놀랍게도, 우리의 결과는 또한 십일 근육 생착 및 재생을 평가하기위한 강력하고 빠른 실험 플랫폼으로이 모델을 수립, 이식을 게시하기 전에 틈새 설립 및 기증자의 근육 조직의 분화의 단계가 발생을 나타냅니다. 또한,이 실험은 굳어 cardiotoxin 또는 염화 바륨과 근육의 사전 부상 (30, 31)를 생착하기 전에 이일을 필요 마우스, 완료 것과 대조. 이는 이식 과정 중에 생성 바늘 부상받는 동물 32,33 내의 재생 환경의 생산을 자극하여 생착을 증강 가능성이있다. 또한 초기 골격근 발달에 영향을주는 유전 적 돌연변이의 평가를 허용하는, 우리의 방법은 쉽게 이하 지브라 피쉬에서 골격 근육 조직의 이식에 적응되도록 구상하지만 애벌레 단계에서 치사로 이어집니다. 우리는 또한 비 에어컨, rag2 동형 접합 돌연변이 물고기로 복강 내 주사하여 제브라 피쉬 ERMS의 생착에 대한 자세한 프로토콜을 제공하고 있습니다. 이 접근법은 동계 트랜스 제닉 라인 내의 종양을 생성하기위한 트랜스 제닉 없이도 이중 차 종양의 확장에 유용 하였다. 우리의 최근의 연구는 세포 이식 방식은 단일 종양 동물의 수천으로 확장과 성장, 자기 갱신 및 신생 혈관 (15)에 미치는 영향을 평가할 수있다 생체 내에서 ERMS 약물 민감도를 평가하기 위해 새로운 실험 모델을 제공하는 것으로 나타났습니다. 더욱이, 우리는 성공적 T 세포 급성 림프 모구 백혈병, 흑색 종, 및 23를 포함 ERMS rag2 동형 접합성 돌연변이 물고기 종양 내로의 광범위한 접목했다. 미래를 향해 찾고, 우리는이 선이 암의 중요한 기능적 특성을 평가하기위한 도움이 될 것입니다 구상내 종양 대 이질성, 침공, 전이, 혈관 신생, 및 치료에 저항을 평가를 포함하는 생체 내. 또한, 광학적으로 투명한 캐스퍼 변형 제브라 피쉬 (34)에 rag2 동형 접합 돌연변이 물고기의 발생 가능성이 암의 이러한 특징의 많은 직접 영상을 촉진 할 것이다. 총에서, 우리는 성인 rag2 동형 접합 돌연변이 면역 손상 제브라 피쉬에 정상 표시 - 형광 및 악성 골격 근육의 성공적인 생착에 대한 자세한 프로토콜을 제공합니다.

그들은 절단 지느러미뿐만 아니라 손상된 뇌, 망막, 척수, 심장, 골격 근육과 다른 조직 하나를 다시 생성 할 수 있기 때문에 Zebrafish의 회생 연구를위한 훌륭한 모델입니다. 세포 이식에 의한 다양한 조직에서 줄기 및 전구 세포의 식별이 최근 2를 탐험하고있는 동안 성인 zebrafish의 세포 및 재생 연구는 크게 부상에 대응 재생의 특성에 초점을 맞추고있다 줄기. (10) - 제브라 피쉬는 인간의 질병 3을 모방 유전자 변형 암 모델의 생성을 통해 암 연구를위한 사용이 증가되고있다. 암의 설정에서는 세포 이식 방법이 널리 채택되고 자기 갱신 11 이질 기능성 12,13, 14 신생 혈관 증식, 암과 같은 중요 프로세스의 동적 평가를 허용되었다,치료 반응을 15, 16, 17 및 내습. 그러나 접목 세포는 종종 공격 이식 (18)를 죽이는 면역 체계를 개최 할 예정받는 생선 거부됩니다. 몇 가지 방법이 접목 세포 거부 반응을 극복하기 위해 사용되어왔다. 예를 들어, 수신자 동물의 면역 시스템은 이식 전에 일시적으로 18,19 저용량 감마선 조사에 의해 절제된다. 그러나,받는 사람의 면역 체계 20 일까지 사후 조사를 복구하고 기증자 세포 (18)을 죽일 것이다. 대안 적으로, 치료는 덱사메타손 이상 면역 억제 조절을 제공하고, 30 일까지 14 인간 종양의 광범위한 생착을 촉진, T 및 B 세포 기능을 억제하기 위해 사용되어왔다. 이 실험은 일정한 약물 투여를 필요로 고형 종양의 연구 제한됩니다. 22, 기증자 및 recipi - 장기 생착 분석은 유 전적으로 동일 동계 라인 (20)을 사용했다엔트 세포는 일치 면역 있습니다. 그러나 이러한 모델은 관심의 유전자 변형 라인이 완전히 동계 라인을 생산하기 위해 개 이상의 세대를 위해 동계 배경으로 교차 할 필요합니다. 받는 사람 물고기 면역 거부의 문제를 미연에 방지하기 위해, 우리 그룹은 최근 면역 T 및 B 세포의 기능을 감소 및 조직 (23)의 넓은 범위의 생착을 허용하는 손상 rag2 E450fs 동형 접합 돌연변이 (ZFIN 대립 지정 rag2의 fb101) 라인을 개발했다. 유사 면역 감염된 마우스 모델은 마우스 및 사람 조직 (24)의 세포 이식을 위해 광범위하게 사용되어왔다. 여기서 우리는 골격근과 배아 횡문근 육종 (ERMS), 새로 설명 rag2 동형 접합 돌연변이 제브라 피쉬으로, 골격근과 기능을 공유하는 소아 육종의 이식 방법을 제시한다. 면역 손상 성인 제브라 피쉬의 가용성직접 시각화하고 정상 및 악성 조직 내 줄기 세포는자가 재생 (self-renewal)을 평가하기 위해 대규모 세포 이식 연구를 수행 할 수있는 능력을 확장한다. 이 방법, 형광 (25) 형질 전환 제브라 피쉬가 견고 rag2에 접목 α 액틴 RFP 성인에서 근육 세포의 준비를 표시 등쪽 근육에 주입 다음 동형 접합 돌연변이 제브라 피쉬. 또한, 우리는 생착 및 기본 myf5의 -GFP의 확장을 보여; rag2 E450fs 동형 접합 돌연변이 제브라 피쉬에 복강 내 주사 다음 mylpfa- mCherry 형질 전환 ERMS를. 이러한 프로토콜의 유틸리티는 표시된 예를 뛰어 넘어 쉽게 추가 제브라 피쉬의 재생 조직 및 암에 적용 할 수 있습니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1077">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Material/ Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-EDTA buffer solution 1x</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>93283-100ML</td>
			<td>microinjection. Injection mix.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Fisher Science Education</td>
			<td>S77375-1</td>
			<td>microinjection. Injection mix.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XhoI Restriction Enzyme</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0146S</td>
			<td>microinjection. Plasmid linearization.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104 (50) or 28106 (250)</td>
			<td>Microinjection. For purification of linearized plasmid up to 10 kb.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol/Chloroform/Isoamyl Alcohol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1753I-100</td>
			<td>Microinjection. For purification of linearized plasmid.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Agarose, 500 g</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16500-500</td>
			<td>microinjection. Linearized plasmid quantification.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop 2000 Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>http://www.nanodrop.com/Productnd2000overview.aspx</td>
			<td>microinjection. Linearized plasmid quantification.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI(4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole,dihydrochloride)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>D1306</td>
			<td>flow cytometry/FACS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml polystyrene round bottom tube</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352058</td>
			<td>flow cytometry collection tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSAria II</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>Special Order Research Products (SORP) program</td>
			<td>FACS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml polypropylene round bottom tube</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352063</td>
			<td>FACS collection tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD LSR II</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>Special Order Research Products (SORP) program</td>
			<td>flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline, pH 7.4 (1X)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10010-023</td>
			<td>Transportation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Omega Scientific</td>
			<td>FB-01</td>
			<td>Transportation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine methanesulphonate (MS-222)</td>
			<td>Western Chemical Inc.</td>
			<td>http://www.wchemical.com/tricaine-s-ms-222.html</td>
			<td>Transportation. Anesthetic. Caution: Irritant. Irritating to eyes, respiratory system, and skin.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Absorbent Bench Underpads</td>
			<td>VWR</td>
			<td>56616-018</td>
			<td>Transportation. Regular paper towels or sponge can be used as an alternative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Singe Edge Industrial Razor Blades</td>
			<td>VWR</td>
			<td>55411-050</td>
			<td>Transportation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish, Polystryrene Disposable Sterile</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-302</td>
			<td>Transportation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer, 40 &#181;m Nylon</td>
			<td>Falcon-Corning Incorporated</td>
			<td>352340</td>
			<td>Transportation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Centrifuge Tube</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>430828</td>
			<td>Transportation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Stain (0.4%)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15250-061</td>
			<td>Transportation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer Set&#160;</td>
			<td>Hausser Scientific</td>
			<td>1483</td>
			<td>Transportation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe, fixed needle, volume 10 &#181;L, needle size 26s ga (bevel tip)</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>80366</td>
			<td>Transportation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Austin&#39;s A-1 Bleach, Commercial</td>
			<td>James Austin Company</td>
			<td></td>
			<td>Transportation. Any commercial&#160; solution can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 190 Proof</td>
			<td>Decon Labs, Inc.</td>
			<td>DSP-MD.43</td>
			<td>Microinjection (linearized plasmid purification) and Transportation. Any commercial&#160; solution can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Speed Microcentrifuge, 300D Digital Microcentrifuge</td>
			<td>Denville Scientific Inc.</td>
			<td>C0265-24</td>
			<td>Transportation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Legend XFR Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75004539&#160;</td>
			<td>Transportation. Catalog number for 120V, 60Hz (US)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml serological pipets</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>357529</td>
			<td>Transportation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Stripettor Plus Pipetting Controller</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>4090</td>
			<td>Transportation. Any automatic pipetting controller can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Powder free examination gloves</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>All steps. Any commercial brand can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter pipet tips and micropipettes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>All steps. Any commercial brand can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont forceps #5</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11205-20</td>
			<td>Transportation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Stereomicroscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>MVX10</td>
			<td>Scoring. Any appropriate fluorescent stereomicroscope can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus DP72 microscope digital camera</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>DP72</td>
			<td>Scoring. Multiple adequate cameras for the selected imaging system can be used.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

normal and malignant muscle cell transplantation into immune compromised adult zebrafish

Zebrafish의 개발, 재생, 암을 평가하기위한 강력한 도구가되었다. 최근에는 동종 세포 이식 프로토콜 조사, 동계, 면역 타협 성인 지브라 피쉬으로 정상 및 종양 세포의 생착을 허가 개발되었다. 최적화 된 세포 이식 프로토콜과 함께 이들 모델은 줄기 세포 기능, 재생 부상 다음, 암의 신속한 평가를 허용한다. 여기서 우리는 면역 손상 성인 rag2 E450fs 동형 접합 돌연변이 제브라 피쉬에 제브라 피쉬 성인 골격근과 배아 횡문근 육종 (ERMS), 배아 근육과 기능을 공유하는 소아 육종의 세포 이식을위한 방법을 제시한다. 중요한 것은, 이러한 동물은 T 세포와 관련이없는 부족한 공여 동물 조직의 넓은 범위의 생착을 촉진, B 세포 기능을 감소시켰다. 우리 최적화 프로토콜은 형광 근육 세포를 위해 준비 표지 보여rag2 동형 접합 돌연변이 물고기의 등 근육에 이식 할 때 α 액틴 RFP 형질 전환 제브라 피쉬에서 관리 포인트 견고하게 접목. 우리는 또한 형광 분화 상태에 따라 세포에 국한되어 형광 형질 전환 ERMS의 생착을 보여줍니다. 특히, ERMS는 AB-변형 myf5-GFP에서 만든, mylpfa-mCherry 이중 형질 전환 동물 및 종양은 성인 면역 손상 물고기의 복막에 주입. 이러한 프로토콜의 유틸리티는 등쪽 근육 또는 성인 지브라 피쉬의 복막 내로 주입 될 수있는 정상 및 악성 도너 세포의 광범위한 생착으로 연장된다.

면역에 준비하고 α 액틴 RFP 형질 전환 기증자 골격 근육 세포를 이식하는 과정은 동형 접합 rag2 돌연변이 제브라 피쉬를 손상 (프로토콜 제 1 절, 그림 1A 및 그림 2) 입증되었다. 골격 근육 조직은 α 액틴 RFP 형질 전환 공여자로부터 제조하고, 유동 세포 계측법 분석 (도 2b) 아래의 DAPI 배제하여 평가 결과로 단일 세포 현탁액을 84.3 % 생존 세포를 함유 하였다. RFP 양성 세포는이 단일 세포 현탁액 (도 2C)의 35.3 %를 차지. (물고기 당 주입 1 × 10 6 세포, 표 1, 그림 2D-I) 다핵 섬유로 단일 세포의 분화에 의해 평가로 rag2 동형 접합 돌연변이받는 물고기의 지느러미 골격 근육 세포의 이식은 일관되고 강력한 생착되었다. 와일드 유형받는 사람 물고기는 30 일 실험 (n은 = 13)을 통해 근육 섬유를 접목하는 데 실패했습니다. 10 일 후 이식으로 14 rag2 동형 접합 돌연변이 제브라 피쉬 중 9 주입 (64.3 %, 그림 2E, F)의 사이트 근처 RFP 양성 근육 섬유가 포함되어 있습니다. 중요한 것은, 접목 RFP 양성 근육 후 생착과 나타내는 강력하고 지속적인 근육 생착 (데이터 미기재) 1백15일 동안 추적되는 동물의 서브 세트로, 이식 후 삼십일 (도 2G-I)로 유지. 이러한 결과는 동일한 프로토콜 (표 1)를 이용하여 우리 그룹 (23)에 의해 이전에보고 된 것과 유사하다. 또한 rag2 동형 접합성 돌연변이받는 물고기 (프로토콜 부분이,도 1b 및도 3)의 복강 내로 ERMS 종양 세포의 발생, 제조 및 이식하는 방법을 제시 하였다. ERMS doubl에서 생성 된전자 형질 전환 myf5-GFP, mylpfa-mCherry 물고기 인트라 즉 종양 이종 이식 (11) 다음과 같은 종양 세포 개체군의 기능 분석의 시각화를 허용하는 것으로 나타났다. 이들이 10 내지 30 일의 생활 종양 세포의 수가 하류 애플리케이션에 한정되는 사이 ERMS를 개발할 때 물고기가 작기 때문에, 각각의 하위 집단의 상기 분자 특성화가 어렵다. 하나의 해결책은 성인받는 사람 제브라 피쉬에 ERMS를 engrafting에 의해 종양 세포 수를 확장하는 것입니다. 지금까지 유사한 실험 CG1 - 변형 동계 물고기를 사용하여 완료하고 myf5-GFP를위한 형질 전환했다 동계 라인을 개발하기 위해 교잡의 4 세대를 초과 필요한; mylpfa-mCherry. 이러한 문제를 회피하기 위해, 우리는 AB-변형 제브라 피쉬에서 차 ERMS를 접목하는 면역 손상 rag2 동형 접합 돌연변이받는 사람 제브라 피쉬의 유틸리티를 보여 주었다. 모든 차 ERMS는 라 접목G2 종양 (표 1)의 팽창을 용이 동형 접합성 돌연변이 동물. 0 ~ 7의 야생형 형제 질병 (23)을 접목하면서 유사한 결과가 최근에, 24 개의 27 rag2 동형 접합 돌연변이 제브라 피쉬의 접목 ERMS의보고되었다. 접목 ERMS의 대표적인 예는 그림 3E에 30 일 후 이식에 표시됩니다. 접목 ERMS는 일차 종양 (도 3b 및도 3F)에서 발견 된 것과 유사 배아 성 횡문근 육종, 조직 학적 특징을 공유한다. FACS 분석은 그 myf5-GFP 및 / 또는 mylpfa-mCherry을 발현하는 세포 및 분화 세포를 전파 기능적으로 뚜렷한 종양을 포함 ERMS 확인했다. 복강 내 주사 절차 후 생존율은 95 %를 초과했다. 받는 사람 제브라 피쉬는 일반적으로 30 일 이식 후 시점 후 종양 부담에서 굴복한다. (A) 정상 및 (B) rag2 동형 접합성 돌연변이로 악성 골격근 세포 이식 그림 1. 프로토콜 개략적 제브라 피쉬. 선택 단계는 (*)로 표시됩니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/52597/52597fig2highres.jpg" width="700px" /> rag2 동형 접합 돌연변이 제브라 피쉬에 그림 2. 골격 근육 생착. (A) α 액틴 RFP 형질 전환 기증자 제브라 피쉬. 절연 근육 세포 현탁액 (B) 세포 생존율 DAPI 염색에 의해 평가 제외 유세포 분석기로. 야생형 대조군에 비해 (C) α 액틴 RFP 공여체 (레드)에서 근육 세포 현탁액 내에서 발견 RFP 양성 세포의 비율(회색). (DE)는 삼십일 이식 후에서 밝은 필드와 야생형 동물 (D) 또는 rag2 동형 접합 돌연변이 물고기 (E)의 형광 이미지를 병합. 시간이 지남에 따라 (F) 생착 속도. 회색이 아닌 접목 물고기를 표시하는 동안 빨간색 접목 동물의 수를 나타낸다. 각 시점에서 분석 된 동물의 수는 표시된다. 시간 (화살촉)를 통해 차별화 된 근육 섬유의 유지를 표시 (GI) 10 (G)에 표시 패널 E의 박스 영역의 높은 배율 이미지, 20 (H) 및 30 (I) 일 이식 후. 스케일 바는 2mm 같아. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52597/52597fig2highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/52597/52597fig3highres.jpg" width="700px" /> myf5-GFP의 그림 3. 이식, rag2 동형 접합 돌연변이에 mylpfa-mCherry ERMS . AB-변형 myf5-GFP에서 발생하는 제브라 피쉬 (AD) rag2-kRASG12D 유도 주 ERMS; 생명 30 일에 mylpfa-mCherry의 제브라 피쉬. (EH) rag2 동형 접합 돌연변이 제브라 피쉬 ERMS와 접목 및 이식 후 삼십일에서 분석 하였다. (A, E)는 밝은 필드와 기본 및 이식 ERMS의 형광 이미지를 병합. 종양 영역은 설명하고 화살촉은 E에서 주사 부위를 나타냅니다. (B, F) Hematoxylin- 암과 관련된 증가 세포 수의 영역을 표시 차 (B)의 에오신 염색 파라핀 섹션과 접목 ERMS (F). (C,DAPI 염색 배제에 의해 평가 및 유동 세포 계측법으로 G) 세포 생존 능력. (D, H) 형광 종양 세포의 서브 모집단 유세포로 평가. 스케일 바는 2mm (A, E) 50 μm의 (B, F)을 동일. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52597/52597fig3highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="표 1" src="/files/ftp_upload/52597/52597table1.jpg" width="700px" /> ERMS 근육 세포 이식 생착 표 1. 결과. (*)는 이전에 동일한 기술을 사용하여 데이터 (23)를보고 나타낸다. 데이터가 자연 방법에서 허가 재판된다에게. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52597/52597table1.jpg" target="_blank">이 테이블의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오</a>.

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Normal and Malignant Muscle Cell Transplantation into Immune Compromised Adult Zebrafish

Here, we present a protocol for cell transplantation of zebrafish skeletal muscle and embryonal rhabdomyosarcoma (ERMS) into adult immune compromised rag2E450fs homozygous mutant zebrafish. This protocol allows for the efficient analysis of regeneration and malignant transformation of muscle cells.

면역이 저하 된 성인 Zebrafish의에 정상 및 악성 근육 세포 이식

Zebrafish have become a powerful tool for assessing development, regeneration, and cancer. More recently, allograft cell transplantation protocols have ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

10.8K 조회수.  Massachusetts General Hospital. Here, we present a protocol for cell transplantation of zebrafish skeletal muscle and embryonal rhabdomyosarcoma (ERMS) into adult immune compromised rag2E450fs homozygous mutant zebrafish. This protocol allows for the efficient analysis of regeneration and malignant transformation of muscle cells. 

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Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam cells, immune cells, vascular endothelial and smooth muscle cells, platelets, extracellular matrix, and a lipid-rich core with extensive necrosis and fibrosis of surrounding tissues.1 The innate and adaptive arms of the immune response are involved in the initiation, development and persistence of atherosclerosis.2, 3 There is a significant body of evidence that different subsets of the immune cells, such as macrophages, dendritic cells, T and B lymphocytes, are present within the aortas of healthy and atherosclerosis-prone mice4. Additionally, immune cells are found in the surrounding aortic adventitia which suggests an important role of this tissue in atherogenesis.2
For some time, the quantitative detection of different types of immune cells, their activation status, and the cellular composition within the aortic wall was limited by RT-PCR and immunohistochemical methods for the study of atherosclerosis. Few attempts were made to perform flow cytometry using human aortas, and a number of problems, such as a high autofluorescence, have been reported5,6. Human atherosclerotic plaques were digested with collagenase 1, and free cells were collected and stained for CD14+/CD11c+ to highlight macrophage-derived foam cells. In this study, a "mock" channel was used to avoid false-positive staining.6 Necrotic materials accumulating during the digestion process give rise in a large amount of debris that generates a high autofluorescence in aortic samples. To resolve this problem, a panel of negative and positive controls has been proposed, but only double staining could be applied in these samples. We have developed a new flow cytometry-based method7 to analyze the immune cell composition and characterize the activation, proliferation, differentiation of immune cells in healthy and atherosclerosis-prone aorta. This method allows the investigation of the immune cell composition of the aortic wall and opens possibilities to use a broad spectrum of immunological methods for investigations of immune aspects of this disease.

This paper presents a flow cytometry-based method to investigate the immune composition of aortas. The paper also illustrates an additional technique that allows examining surrounding adventitia and vessel wall separately. This method opens possibilities to perform phenotypical analyses of aortic leukocytes and apply several immunological assays for atherosclerosis studies.

Murine Aortas 이내에 면역 세포의 흐름 Cytometry 분석

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

연구

면역학 및 감염병학

Isolation of Functional Cardiac Immune Cells

Cardiac immune cells are gaining interest for the roles they play in the pathological remodeling in many cardiac diseases.1-5 These immune cells, which include mast cells, T-cells and macrophages; store and release a variety of biologically active mediators including cytokines and proteases such as tryptase.6-8 These mediators have been shown to be key players in extracellular matrix metabolism by activating matrix metalloproteinases or causing collagen accumulation by modulating the cardiac fibroblasts' function.9-11 However, available techniques for isolating cardiac immune cells have been problematic because they use bacterial collagenase to digest the myocardial tissue. This technique causes activation of the immune cells and thus a loss of function. For example, cardiac mast cells become significantly less responsive to compounds that cause degranulation.12 Therefore, we developed a technique that allows for the isolation of functional cardiac immune cells which would lead to a better understanding of the role of these cells in cardiac disease.13, 14
This method requires a familiarity with the anatomical location of the rat's xiphoid process, axilla and falciform ligament, and pericardium of the heart. These landmarks are important to increase success of the procedure and to ensure a higher yield of cardiac immune cells. These isolated cardiac immune cells can then be used for characterization of functionality, phenotype, maturity, and co-culture experiments with other cardiac cells to gain a better understanding of their interactions.

This method for isolating functional immune cells from the heart provides an alternative to the conventional methods of collagenase digestion, which causes unwanted immune cell activation, resulting in a decreased responsiveness of these cells. Our method of isolation yields functional cardiac immune cells by avoiding problems associated with enzymatic digestion.

심장 기능 면역 세포의 분리

Cardiac immune cells are gaining interest for the roles they play in the pathological remodeling in many cardiac diseases.1-5  These immune cells, which ...

Differentiating Functional Roles of Gene Expression from Immune and Non-immune Cells in Mouse Colitis by Bone Marrow Transplantation

To understand the role of a gene in the development of colitis, we compared the responses of wild-type mice and gene-of-interest deficient knockout mice to colitis. If the gene-of-interest is expressed in both bone marrow derived cells and non-bone marrow derived cells of the host; however, it is possible to differentiate the role of a gene of interest in bone marrow derived cells and non- bone marrow derived cells by bone marrow transplantation technique. To change the bone marrow derived cell genotype of mice, the original bone marrow of recipient mice were destroyed by irradiation and then replaced by new donor bone marrow of different genotype. When wild-type mice donor bone marrow was transplanted to knockout mice, we could generate knockout mice with wild-type gene expression in bone marrow derived cells. Alternatively, when knockout mice donor bone marrow was transplanted to wild-type recipient mice, wild-type mice without gene-of-interest expressing from bone marrow derived cells were produced. However, bone marrow transplantation may not be 100% complete. Therefore, we utilized cluster of differentiation (CD) molecules (CD45.1 and CD45.2) as markers of donor and recipient cells to track the proportion of donor bone marrow derived cells in recipient mice and success of bone marrow transplantation. Wild-type mice with CD45.1 genotype and knockout mice with CD45.2 genotype were used. After irradiation of recipient mice, the donor bone marrow cells of different genotypes were infused into the recipient mice. When the new bone marrow regenerated to take over its immunity, the mice were challenged by chemical agent (dextran sodium sulfate, DSS 5%) to induce colitis. Here we also showed the method to induce colitis in mice and evaluate the role of the gene of interest expressed from bone-marrow derived cells. If the gene-of-interest from the bone derived cells plays an important role in the development of the disease (such as colitis), the phenotype of the recipient mice with bone marrow transplantation can be significantly altered. At the end of colitis experiments, the bone marrow derived cells in blood and bone marrow were labeled with antibodies against CD45.1 and CD45.2 and their quantitative ratio of existence could be used to evaluate the success of bone marrow transplantation by flow cytometry. Successful bone marrow transplantation should show a vast majority of donor genotype (in term of CD molecule marker) over recipient genotype in both the bone marrow and blood of recipient mice.

Bone marrow transplantation provides a way to change the genotype of the bone marrow derived cells. If the gene of interest is expressed in both bone marrow derived cells and non-bone marrow derived cells, bone marrow transplantation can change the bone marrow derived cells to a different genotype without changing the non-bone marrow derived cell genotype.

골수 이식으로 마우스 대장염에서 면역 및 비 면역 세포에서 유전자 발현의 기능 역할을 차별화

To understand the role of a gene in the development of colitis, we compared the responses of wild-type mice and gene-of-interest deficient knockout mice ...

Quantification of the Respiratory Burst Response as an Indicator of Innate Immune Health in Zebrafish

The phagocyte respiratory burst is part of the innate immune response to pathogen infection and involves the production of reactive oxygen species (ROS). ROS are toxic and function to kill phagocytized microorganisms. In vivo quantification of phagocyte-derived ROS provides information regarding an organism's ability to mount a robust innate immune response. Here we describe a protocol to quantify and compare ROS in whole zebrafish embryos upon chemical induction of the phagocyte respiratory burst. This method makes use of a non-fluorescent compound that becomes fluorescent upon oxidation by ROS. Individual zebrafish embryos are pipetted into the wells of a microplate and incubated in this fluorogenic substrate with or without a chemical inducer of the respiratory burst. Fluorescence in each well is quantified at desired time points using a microplate reader. Fluorescence readings are adjusted to eliminate background fluorescence and then compared using an unpaired t-test. This method allows for comparison of the respiratory burst potential of zebrafish embryos at different developmental stages and in response to experimental manipulations such as protein knockdown, overexpression, or treatment with pharmacological agents. This method can also be used to monitor the respiratory burst response in whole dissected kidneys or cell preparations from kidneys of adult zebrafish and some other fish species. We believe that the relative simplicity and adaptability of this protocol will complement existing protocols and will be of interest to researchers who seek to better understand the innate immune response.

The innate immune response protects organisms against pathogen infection. A critical component of the innate immune response, the phagocyte respiratory burst, generates reactive oxygen species that kill invading microorganisms. We describe a respiratory burst assay that quantifies reactive oxygen species produced when the innate immune response is chemically induced.

제브라 피쉬의 선천성 면역 건강의 지표로 호흡 버스트 응답의 정량화

The phagocyte respiratory burst is part of the innate immune response to  pathogen infection and involves the production of reactive oxygen species (ROS). ...

Generation of Lymph Node-fat Pad Chimeras for the Study of Lymph Node Stromal Cell Origin

The stroma is a key component of the lymph node structure and function. However, little is known about its origin, exact cellular composition and the mechanisms governing its formation. Lymph nodes are always encapsulated in adipose tissue and we recently demonstrated the importance of this relation for the formation of lymph node stroma. Adipocyte precursor cells migrate into the lymph node during its development and upon engagement of the Lymphotoxin-b receptor switch off adipogenesis and differentiate into lymphoid stromal cells (B&#233;n&#233;zech&#160;et al.14). Based on the lymphoid stroma potential of adipose tissue, we present a method using a lymph node/fat pad chimera that allows the lineage tracing of lymph node stromal cell precursors. We show how to isolate newborn lymph nodes and EYFP+ embryonic adipose tissue and make a LN/ EYFP+ fat pad chimera. After transfer under the kidney capsule of a host mouse, the lymph node incorporates local adipose tissue precursor cells and finishes its formation. Progeny analysis of EYFP+ fat pad cells in the resulting lymph nodes can be performed by flow-cytometric analysis of enzymatically digested lymph nodes or by immunofluorescence analysis of lymph nodes cryosections. By using fat pads from different knockout mouse models, this method will provide an efficient way of analyzing the origin of the different lymph node stromal cell populations.

Generation of lymph node/fat pad chimeras for the study of lymph node stromal cell origin is described. The method involves the isolation of lymph nodes from newborn mice and embryonic fat pads, the generation of chimeric lymph node-fat pads, and their transfer under the kidney capsule of a host mouse.

The stroma is a key component of the lymph node structure and function. However, little is known about its origin, exact cellular composition and the ...

Using Zebrafish Models of Human Influenza A Virus Infections to Screen Antiviral Drugs and Characterize Host Immune Cell Responses

Each year, seasonal influenza outbreaks profoundly affect societies worldwide. In spite of global efforts, influenza remains an intractable healthcare burden. The principle strategy to curtail infections is yearly vaccination. In individuals who have contracted influenza, antiviral drugs can mitigate symptoms. There is a clear and unmet need to develop alternative strategies to combat influenza. Several animal models have been created to model host-influenza interactions. Here, protocols for generating zebrafish models for systemic and localized human influenza A virus (IAV) infection are described. Using a systemic IAV infection model, small molecules with potential antiviral activity can be screened. As a proof-of-principle, a protocol that demonstrates the efficacy of the antiviral drug Zanamivir in IAV-infected zebrafish is described. It shows how disease phenotypes can be quantified to score the relative efficacy of potential antivirals in IAV-infected zebrafish. In recent years, there has been increased appreciation for the critical role neutrophils play in the human host response to influenza infection. The zebrafish has proven to be an indispensable model for the study of neutrophil biology, with direct impacts on human medicine. A protocol to generate a localized IAV infection in the Tg(mpx:mCherry) zebrafish line to study neutrophil biology in the context of a localized viral infection is described. Neutrophil recruitment to localized infection sites provides an additional quantifiable phenotype for assessing experimental manipulations that may have therapeutic applications. Both zebrafish protocols described faithfully recapitulate aspects of human IAV infection. The zebrafish model possesses numerous inherent advantages, including high fecundity, optical clarity, amenability to drug screening, and availability of transgenic lines, including those in which immune cells such as neutrophils are labeled with fluorescent proteins. The protocols detailed here exploit these advantages and have the potential to reveal critical insights into host-IAV interactions that may ultimately translate into the clinic.

Systemic and localized zebrafish infection models for human influenza A virus are demonstrated. Using a systemic infection model, zebrafish can be used to screen antiviral drugs. Using a localized infection model, zebrafish can be used to characterize host immune cell responses.

인간 인플루엔자 바이러스 감염의 Zebrafish의 모델을 사용하여 항 바이러스 약품을 화면 및 호스트 면역 세포 반응의 특성을

Each year, seasonal influenza outbreaks profoundly affect societies worldwide. In spite of global efforts, influenza remains an intractable healthcare ...

Quantifying Vibrio cholerae Colonization and Diarrhea in the Adult Zebrafish Model

Vibrio cholerae is best known as the infectious agent that causes the human disease cholera. Outside the human host, V. cholerae primarily exists in the aquatic environment, where it interacts with a variety of higher aquatic species. Vertebrate fish are known to be an environmental host and are a potential V. cholerae reservoir in nature. Both V. cholerae and the teleost fish species Danio rerio, commonly known as zebrafish, originate from the Indian subcontinent, suggesting a long-standing interaction in aquatic environments. Zebrafish are an ideal model organism for studying many aspects of biology, including infectious diseases. Zebrafish can be easily and rapidly colonized by V. cholerae after exposure in water. Intestinal colonization by V. cholerae leads to the production of diarrhea and the excretion of replicated V. cholerae. These excreted bacteria can then go on to colonize new fish hosts. Here, we demonstrate how to assess V. cholerae-intestinal colonization in zebrafish and how to quantify V. cholerae-induced zebrafish diarrhea. The colonization model should be useful to researchers who are studying whether genes of interest may be important for host colonization and/or for environmental survival. The quantification of zebrafish diarrhea should be useful to researchers studying any intestinal pathogen who are interested in exploring zebrafish as a model system.

Quantifying Vibrio cholerae Colonization and Diarrhea in the Adult Zebrafish Model

Zebrafish are a natural Vibrio cholerae host and can be used to recapitulate and study the entire infectious cycle from colonization to transmission. Here, we demonstrate how to assess V. cholerae colonization levels and quantify diarrhea in zebrafish.

비 브리 오 cholerae 식민과 설사 성인 Zebrafish 모델에서 측정

Vibrio cholerae is best known as the infectious agent that causes the human disease cholera. Outside the human host, V. cholerae primarily exists in the ...

Modeling Tuberculosis in Mycobacterium marinum Infected Adult Zebrafish

Mycobacterium tuberculosis is currently the deadliest human pathogen causing 1.7 million deaths and 10.4 million infections every year. Exposure to this bacterium causes a wide disease spectrum in humans ranging from a sterilized infection to an actively progressing deadly disease. The most common form is the latent tuberculosis, which is asymptomatic, but has the potential to reactivate into a fulminant disease. Adult zebrafish and its natural pathogen Mycobacterium marinum have recently proven to be an applicable model to study the wide disease spectrum of tuberculosis. Importantly, spontaneous latency and reactivation as well as adaptive immune responses in the context of mycobacterial infection can be studied in this model. In this article, we describe methods for the experimental infection of adult zebrafish, the collection of internal organs for the extraction of nucleic acids for the measurement of mycobacterial loads and host immune responses by quantitative PCR. The in-house-developed, M. marinum-specific qPCR assay is more sensitive than the traditional plating methods as it also detects DNA from non-dividing, dormant or recently dead mycobacteria. As both DNA and RNA are extracted from the same individual, it is possible to study the relationships between the diseased state, and the host and pathogen gene-expression. The adult zebrafish model for tuberculosis thus presents itself as a highly applicable, non-mammalian in vivo system to study host-pathogen interactions.

Modeling Tuberculosis in Mycobacterium marinum Infected Adult Zebrafish

Here, we present a protocol to model human tuberculosis in an adult zebrafish using its natural pathogen Mycobacterium marinum. Extracted DNA and RNA from the internal organs of infected zebrafish can be used to reveal the total mycobacterial loads in the fish and the host&#39;s immune responses with qPCR.

진 균 marinum 감염 성인 Zebrafish에 모델링 결핵

Mycobacterium tuberculosis is currently the deadliest human pathogen causing 1.7 million deaths and 10.4 million infections every year. Exposure to this ...

Oral Intubation of Adult Zebrafish: A Model for Evaluating Intestinal Uptake of Bioactive Compounds

Most pathogens invade organisms through their mucosa. This is particularly true in fish as they are continuously exposed to a microbial-rich water environment. Developing effective methods for oral delivery of immunostimulants or vaccines, which activate the immune system against infectious diseases, is highly desirable. In devising prophylactic tools, good experimental models are needed to test their performance. Here, we show a method for oral intubation of adult zebrafish and a set of procedures to dissect and prepare the intestine for cytometry, confocal microscopy and quantitative polymerase chain reaction (qPCR) analysis. With this protocol, we can precisely administer volumes up to 50 &#181;L to fish weighing approximately 1 g simply and quickly, without harming the animals. This method allows us to explore the direct in vivo uptake of fluorescently labelled compounds by the intestinal mucosa and the immunomodulatory capacity of such biologics at the local site after intubation. By combining downstream methods such as flow cytometry, histology, qPCR and confocal microscopy of the intestinal tissue, we can understand how immunostimulants or vaccines are able to cross the intestinal mucosal barriers, pass through the lamina propria, and reach the muscle, exerting an effect on the intestinal mucosal immune system. The model could be used to test candidate oral prophylactics and delivery systems or the local effect of any orally administered bioactive compound.

The protocol describes intubating adult zebrafish with a biologic; then dissecting and preparing the intestine for cytometry, confocal microscopy and qPCR. This method allows administration of bioactive compounds to monitor intestinal uptake and the local immune stimulus evoked. It&#160;is relevant for testing the intestinal dynamics of oral prophylactics.

성인 Zebrafish의 구강 삽 관 법: 생리 활성 화합물의 장의 이해를 평가 하기 위한 모델

Most pathogens invade organisms through their mucosa. This is particularly true in fish as they are continuously exposed to a microbial-rich water ...

Immunization of Adult Zebrafish for the Preclinical Screening of DNA-based Vaccines

The interest in DNA-based vaccination has increased during the past two decades. DNA vaccination is based on the cloning of a sequence of a selected antigen or a combination of antigens into a plasmid, which enables a tailor-made and safe design. The administration of DNA vaccines into host cells leads to the expression of antigens that stimulate both humoral and cell-mediated immune responses. This report describes a protocol for the cloning of antigen sequences into the pCMV-EGFP plasmid, the immunization of adult zebrafish with the vaccine candidates by intramuscular microinjection, and the subsequent electroporation to improve intake. The vaccine antigens are expressed as green fluorescent protein (GFP)-fusion proteins, which allows the confirmation of the antigen expression under UV light from live fish and the quantification of expression levels of the fusion protein with ELISA, as well as their detection with a western blot analysis. The protective effect of the vaccine candidates is tested by infecting the fish with Mycobacterium marinum five weeks postvaccination, followed by the quantification of the bacteria with qPCR four weeks later. Compared to mammalian preclinical screening models, this method provides a cost-effective method for the preliminary screening of novel DNA-based vaccine candidates against a mycobacterial infection. The method can be further applied to screening DNA-based vaccines against various bacterial and viral diseases.

Here we describe a protocol for the immunization of the adult zebrafish (Danio rerio) with a DNA-based vaccine and demonstrate the validation of a successful vaccination event. This method is suitable for the preclinical screening of vaccine candidates in various infection models.

DNA 기반 백신의 임상 검사에 대 한 성인 Zebrafish의 예방접종

The interest in DNA-based vaccination has increased during the past two decades. DNA vaccination is based on the cloning of a sequence of a selected ...