이 기술은 자궁 외 신호 원을 이식하여 배아 발생 시 신호 분자의 기능과 범위를 연구할 수 있게 합니다. 또한 생식선 돌연변이의 효율적인 생성을 용이하게합니다. 프로토콜은 블라술라 단계 제브라피시와 메다카 배아, 그리고 아마 다른 배아 단계 및 TDO 종에도 적용될 수 있다.
이식 장치를 조립하려면 미끼 팁 25 마이크로리터 가스 타이트 주사기를 미끼 잠금 피팅을 사용하여 마이크로 파이펫 홀더에 연결합니다. 그런 다음 장치를 수동 마이크로 조작기에 직접 장착합니다. 이식 장치를 사용하려면 조립된 장치와 함께 마이크로 조작기를 스테레오 현미경 옆에 배치합니다.
그런 다음 플런저를 제거하고 이식 바늘을 삽입합니다. 바늘의 끝이 침지 될 때까지 링거의 용액으로 채워진 접시에 바늘을 낮춥다. 플런저를 중간쯤 삽입하여 링거의 용액을 플러시하고 바늘의 얇은 테이퍼 부분에 소량의 물만 남깁니다.
이식 바늘을 처음으로 사용하는 경우, 희생된 배아에서 멍에를 뽑아 멍에물질을 완전히 추방하여 바늘 안쪽을 코팅한다. 다음으로, 이식 바늘을 사용하여 기증자 배아를 부드럽게 배치한 다음 바늘 개구부 직교를 배아 표면에 배치하고 플런저를 조심스럽게 당겨 세포를 바늘로 끌어들입니다. 원하는 수의 세포가 유입되면 플런저를 부드럽게 밀어 내고 바늘을 옆으로 흔들어 짧고 신속한 움직임으로 배아에서 바늘을 제거하여 흡입을 중지합니다.
세포를 바늘의 테이퍼 끝으로 제한하여 셀 컬럼의 양쪽에 일부 링거의 용액을 둡니다. 플런저를 위아래로 천천히 움직이고 링거의 용액으로 세포를 세척하여 남은 노른자 또는 세포 이물질을 제거합니다. 다음으로, 비지배적인 손으로 이식 접시를 이동하여 바늘 직교를 숙주 배아의 표면에 배치한다.
조심스럽게 벽에 압착하여 배아에 약간의 압력을 가하십시오. 그런 다음 신속한 날카로운 움직임으로, 바늘로 노른자를 긁지 않도록주의하여 숙주 배아의 포위 층을 관통합니다. 바늘이 내부에 들어가면 플런저를 부드럽게 밀어 세포 컬럼을 배아로 돌이게 하고 바늘을 천천히 동시에 철회하십시오.
세균 세포의 이식을 위해, 링거의 용액으로 이식 접시를 채운 다음, 발권 된 구를 돔 단계 배아로 이식 접시에 옮기고 호스트및 기증자 배아를 교대로 컬럼에 배치하여 1 개의 기증자 배아에서 6 개의 다른 숙주 배아로 세포를 이식하십시오. 이식을 수행하기 위해, 이식 바늘을 향해 여백으로 배아를 지향한다. 생식선 이식의 경우, 여백에서 소스 세포를 가져 와서 숙주 배아의 동일한 위치로 보관하십시오.
이식이 완료되면 배아가 링거의 용액에서 30분에서 1시간 동안 회복되도록 하십시오. 그런 다음 형광 스테레오 현미경을 사용하여 이식 된 세포를 검사하십시오. 다음으로, 배아를 동일한 기증자로부터 동일한 배지로 그룹화하는 배아 배지를 가진 24개의 잘 아가로즈 코팅 플레이트로 배아를 동일한 기증자로부터 동일한 우물로 이송한다.
그런 다음 다음 날까지 섭씨 28도에서 배양합니다. 필요한 경우 기증자 배아를 지노티핑을 위해 표지된 PCR 스트립으로 이송하십시오. 30 시간 후 수정, 형광 스테레오 현미경에서 성공적인 생식선 이식에 대한 호스트 배아를 검사.
세균 세포는 노른자 확장 위의 홈에 존재해야합니다. 표준 축산 조건에 따라 성공적으로 이식된 유충을 성인 후드로 성장시킵니다. 성공적인 이식에서, 태아는 blastoderm에 큰 눈물 없이 이식되지 않은 태아에 모양 및 노른자 선명도에 정상및 유사한 보입니다.
대조적으로, 태아가 이식 도중 눈에 띄게 손상되는 경우에, 그것은 정상적으로 발전하지 않을 것입니다. 이식 장치는 주로 블라발툴라 단계에서 제브라피시 배아에 사용되었지만, 일본 쌀 생선 메다카의 비료 블라발라 단계 배아에서도 이식 및 세포 해출이 수행될 수 있다. 생식선 이식의 특정 경우에, 좋은 이식은 노른자 여백 의 바로 위에 세포의 긴 수평 컬럼을 가진 태아에 초래합니다.
그러나, 절차의 성공은 세균 세포가 체세포에서 그들의 형광에서 구별될 때 수정의 24 30 시간 후에만 평가될 수 있습니다. 원시 세균 세포는 노른자 확장 바로 위에 있는 홈에 있는 작은 형광구로 나타납니다. 올바른 위치에 이 세균 세포의 존재는 성공적인 생식선 이식을 나타냅니다.
실패한 이식의 예는 여기에서 보여 지킵니다. 첫 번째 예에서는, 생식 세포가 gonadal 중구에 도달했더라도, 호스트 태아가 가혹하게 변형되기 때문에, 정상적으로 발전하지 않을 것입니다. 두 번째 예에서 형광 세포는 홈 외부에서만 검출됩니다.
이 세포는 정확하게 마이그레이션하는 데 실패한 체세포 또는 세균 세포입니다. 그리고 두 세포 모형은 태아의 세균 선에 기여하지 않을 것입니다. 이식된 세포와 숙주 배아의 손상을 피하는 것이 중요합니다.
세포는 천천히 작성하여 남은 노른자를 제거하고 신중하게 삽입해야합니다. 이 방법은 제브라피시 배아에서 세포를 이식하는 쉬운 방법을 제공하며 자궁 외 원인 과 생식선 돌연변이를 생성하는 데 유용할 것입니다. 이 장치의 주요 장점은 저렴한 비용으로 많이 사용됩니다.
