이 연구는 우수 프로그램의 연구 센터에서 교육 싱가포르 국립 연구 재단과 교육부에 의해 지원, 스타트 업 보조금 난양 기술 대학 (M4330002.C70), 및 AcRF 계층 2 (MOE2014-T2-2-172) 교육부, 싱가포르. 저자는이 프로토콜의 데모에 참여 조이 참마 Kuok Hoong 감사합니다.

1. 바이오 필름 재배 <ol><li> 균주의 제조 <ol><li> 일일 사전 생물막 재배, 냉동 세균성 문화에서 적절한 성장 배지 2 ㎖를 접종하여 플랑크톤 세균 문화를 준비합니다. 점액 P.에 대한 루리아 - 국물 매체 (10g의 L -1의 NaCl, 10g L -1 효모 추출물 및 10g의 L -1 트립 톤)를 사용하여 녹농균과 Δ의 화소와 Δ의 PSL 결함이있는 돌연변이. 37 ° C에서 200 rpm으로 진탕 조건에서 밤새 품어. 분광 광도계를 사용하여 OD 0.40 600 밤새 배양을 희석. </li><li> 바람직하게는 분해하지 않고 플로우 셀을 이미징 현미경 실하게 될 수 이동국 또는 트롤리에 앞서 14 설명한 플로우 셀 설정을 조립한다. </li><li> 2 L 또는 각 플로우 셀에 대한 5 L 병에 무균 성장 매체를 준비합니다. 최소 배지 (M9) (48 mM의 나 2 HPO 4, 22 mM의 사용KH 2 PO 4, 19 mM의 NH 4 CL, 9 밀리미터의 NaCl, 2 mM의 황산, 그리고 피에 대한 0.04 % 포도당 (중량 / 부피)와 0.2 % (중량 / 부피) 카사 미노산) 보충 0.1 mM의 염화칼슘 2) 녹농균 세포 생물막을 흐른다. </li><li> 마이크로 원심 튜브로 나누어지는 형광 마이크로 스피어와는 9,391.2 g에서 원심 분리기에서 5 분 2 O 멸균 H에 스핀 다운. 이전에 2 L 5 L 매체 병의 성장 매체에 추가로 아 지드 화 나트륨 (소독제)를 제거하기 위해 1 ml의 성장 매체에 뜨는 및 재현 탁를 제거합니다. 참고 : 마이크로 스피어의 다른 크기가 서로 다른 농도로 와서 지침에 따라 희석되어야한다. 예를 들어, 2.18 × 106 미세 ml로 -1 각각의 입자 크기를 수득하기 위해 1.0 ㎛의 직경의 미립자의 120 μL, 0.5 μm의 직경 미립자의 15 ㎕의 성장 배지 2 L에 0.2 μm의 직경 미소 0.96 μL를 분산. </li><li> upst 중간 병에 연결흐름 셀의 묶음과 성장 매체 전체 설치를 통과 할 수 있습니다. 흐름을 중지하고 흐름 세포 챔버로 희석 하룻밤 문화를 주입. 박테리아는 약 5.5 × 10 -3 m 초 -1, 또는 연동 펌프 8 rpm의 유량으로 성장 매체의 흐름을 계속하기 전에 1 시간 동안 커버 슬립을 기질에 부착 할 수있다. 참고 : 바이오 필름은 일반적를 3-7 일 동안 실온 (25 ℃로)에서 재배되고 있습니다. </li><li> 대안으로, 정적 배양 셋업, 입자 1 ml의 성장 배지로 하룻밤 배양의 10 μl를 첨가하여 하룻밤 배양을 마이크로 원심 튜브에 100 배 희석. 유동 생물막 사용에 비해 약 500 배 정적 배양 용 성장 배지에서의 입자 농도를 증가 (예를 들어 세척 및 성장 배지 10ml에 1.0 μm의 직경 분야의 600 μl를 재현 탁) 지속적으로 보충되는 유동 셀 생물막로서 입자하지만 정적 인 문화가 아니다. <ol><li> 200 추가1 8 잘 슬라이드의 챔버에 입자로 희석 하룻밤 문화의 L. 정적 인 상태에서 37 ° C에서 품어. 바이오 필름은 일반적으로 1 일 동안 성장하고 있습니다. 바이오 필름이 하루 이상 재배하는 경우 입자 신선한 성장 매체 매일 소모 된 성장 매체를 교체합니다. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. 현미경 <ol><li> 3 일, 5 일, 연동 펌프에서 흐름을 끄고 현미경 방으로 흐름 전지 설치를 가져온다. 플로우 셀 챔버의 입구 및 출구 부근 클램프 튜브 드리프트 흐름 (환경 변화에 대한 체계적인 에러 원인)을 방지 할 수있다. 직립 현미경의 현미경 무대에 흐름 세포를 놓습니다. 참고 : 마이크로 웰의 이미징 거꾸로 현미경을 사용합니다. </li><li> 다양한 위치 (microcolonies 및 평면 미분화 층)에서 바이오 필름에 포함 된 미세 운동의 비디오와 다른 일 (3 일 및 5)에 대한 응시 40X 오일 목적으로 형광 현미경을 사용하여시간과 공간의 조사. 짧은 시간 규모 내에서 발생하는 사건을 조사하기 위해 더 높은 프레임 속도로 짧은 비디오를 찍기 (예 : 25-50 빠른 역학에 대한 초당 프레임의 프레임 속도에서 1.5-3 분 동영상), 낮은 프레임 속도와 더 이상 비디오는 긴 시간에 걸쳐 사건을 조사하기 위해 저울 (2.5-5 프레임 / 느린 역학 삼성 전자의 프레임 속도로 예를 들어 15 ~ 30 분 동영상). 참고 : 비디오는 일반적으로 5-10 입자를 포함하고, 파일 크기가 일반적으로 1.0-2.5 기가 바이트입니다. 큰 microcolonies 더 많은 입자를 보유 할 수있다. 각 범주에 대한 5-10 동영상 (다른 microcolonies의 평면 미분화 층에서 서로 다른 위치의 예를 들어 5-10 비디오를) 가져 가라. 바이오 필름은 microcolonies, 채널, 빈 공간과 평면 미분화 층으로 구성 될 수있다 이종 구조를 가지고있다. </li><li> 피지 / ImageJ에 읽을 수있는 적절한 형식의 비디오 (예를 들어 czi, TIF)를 저장합니다. </li><li> 완성 된 VID를 통해 스크롤하여 드리프트에 대한 동영상을 확인EO와 입자가 동시에 동일한 방향으로 이동하지 않는 것이 관찰. 드리프트 Z 스테이지 동작, 플로우 셀의 전류, 진동 방지 테이블, 공기 압력 또는 온도 변화의 불균형에 의해 야기 될 수있다. 올바른 마이너 보통 현미경 소프트웨어와 함께 제공되는 포스트 - 프로세싱 기술을 사용 표류. 드리프트가 해결 될 수없는 것을 특징 비디오를 폐기하십시오. 입자 추적 분석시 필요한 다음 매개 변수를 녹음 해상도 (PX / 음), 프레임 수, 시간. </li><li> 현미경 단계에서 유동 세포를 제거하고 바이오 필름을 배양 계속 연동 펌프를 다시 시작합니다. </li></ol> 3. 입자 추적 분석 <ol><li> 오픈 소스 소프트웨어 (ImageJ에)에 플러그인 TrackMate을 사용하여 입자의 궤적을 얻습니다. 피지 다운로드 <a href="http://fiji.sc/Fiji">http://fiji.sc/Fiji</a> . 피지와 플러그인 메뉴에서 비디오를 열고, 추적 및 TrackMate을 선택합니다. </li><li> 확인하거​​나 일에 설정을 조정단계 2.4에 기록 된 영상 파라미터와 일치하도록 보정 초기 설정을 제안하는 전자 창. </li><li> ImageJ에를 사용하여 TrackMate에서 입자를 감지합니다. <ol><li> (예, 000) &#39;로그 검출기&#39;, 입력 입경과 임계 값을 선택한다. 보라색 ​​원이 비디오에 걸쳐 입자를 따르는 것이 확인 &#39;미리보기&#39;버튼을 클릭하는 동안 영상을 스크롤합니다. 필요에 따라 직경 및 임계 값 조정 : 퍼플 원이 빈 공간에 표시하는 경우의 임계 값을 증가시킨다. 충분한 입자가 검출되는 경우에 상기 임계 값을 감소시킨다. 검출을 입자를 완료하기 위해 다음 버튼을 클릭합니다. </li><li> 추가 또는 &#39;초기 임계&#39;에서 검출 된 입자를 제거, &#39;보기 선택&#39;초기 입자 검출 만족 인 경우 창 조정하지 않고 계속 &#39;필터 선택&#39;을 할 수있는 옵션이 표시되면 다음 버튼을 클릭합니다. </li><li> OPTI에서 &#39;단순 LAP 추적기&#39;를 선택입자가 거의 생물막에 초점이 이동하지 쉽게 추적으로의 줄에 창 &#39;추적 방법을 선택합니다&#39;. 제안 또는 낮은 연결과 격차 폐쇄 최대 거리 값을 사용하고 다음을 클릭합니다. </li><li> 그 입자 추적 입자가 TrackMate에 의해 그려진 트랙을 따라야하고, 원치 않는 또는 누락 된 트랙이 없는지 확인하기 위해 비디오를 스크롤하여 만족 확인합니다. 다양한 필터링 단계를 건너 뜁니다. &#39;작업 선택&#39;마지막 창으로 이동합니다. 드롭 다운 메뉴에서 &#39;XML 파일로 내보내기 트랙&#39;을 선택하고 &#39;실행&#39;을 클릭합니다. 트랙을 저장할 폴더를 선택합니다. 참고 : 입자의 궤적과 microrheology의 사용 분석을위한 공공 영역에서 사용할 수있는 다양한 프로그램이 있습니다. msdanalyzer과 TrackArt는 매트랩 환경에서 실행 입자 추적 분석 프로그램의 예입니다. </li></ol></li><li> 의 메뉴에서 선택하여 XML 파일의 입자의 궤적을 가져 matlab에 준비MATLAB 파일&gt; 설정 경로 ... 그리고는 스크립트가 피지 패키지와 함께 사용할 수 폴더를 추가 할 수 있습니다. </li><li> msdanalyzer와 입자의 궤적을 분석하기 위해, 압축 파일 또는 tar.gz 파일에 대한 링크를 다운로드 at <a href="http://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/40692-mean-square-displacement-analysis-of-particles-trajectories">http://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/40692-mean-square-displacement-analysis-of-particles-trajectories</a> . <ol><li> @msdanalyzer 폴더 (15)를 추출하고 matlab에 경로에 속하는 폴더에 드롭 (예 : C : Documents and Settings &lt;사용자 이름&gt; 내 문서 matlab에를 ). matlab에를 시작하고 입력하여 분석을 시작합니다 : 엄마 = msdanalyzer (2, &#39;음&#39;, &#39;초&#39;) UM 및 초 비디오에서 현실 공간과 시간 단위한다. <ol><li> 입력하여 입자의 궤적을 가져옵니다 [트랙, MD] =의 importTrackMateTracks ( &#39;FileName.xml&#39;, &#39;clipZ&#39;;, &#39;scaleT&#39;) 엄마 = ma.addAll (트랙); 여기서 &#39;clipZ&#39;는 Z의 2D 비디오의 차원, 그리고 &#39;scaleT&#39;을 제거합니다. </li><li> 그래프를 사용하여 위에 궤적을 그린다 : ma.plotTracks; ma.labelPlotTracks; </li><li> 사용하여 입자의 MSDS (물질 안전 보건 자료)를 계산한다 : 엄마 = ma.computeMSD; ma.msd </li><li> 각 입자의 MSDS (물질 안전 보건 자료)를 플롯 : 그림 ma.plotMSD </li><li> ) 3.5.1.4에 3.5.1.1를 반복하여 (3 일에서 야생형 microcolonies에 포함 된 예를 들어 입자) 다른 같은 categery의 비디오에서 입자의 궤적을 결합합니다. </li><li> 앙상블 평균 또는 모든 곡선의 평균 플롯 : ma.plotMeanMSD 로그 스케일로 선형에서 y 축과 x 축으로 변경합니다. 긴 지연 시간에, MSD 곡선으로 인해 더 이상 시간 척도에서의 불충분 한 통계에 잡음이된다. MSD 곡선는 또한 동적 오류로 가파르게 상승 할 수있다. 곡선의 이들 영역은 브러시 툴을 사용하여 제거 할 수있다&gt; 곡선의 끝을 선택하고 선택 &#39;칫솔질&#39;도구 메뉴에서 &#39;Unbrushed 제거&#39;. </li></ol></li><li> 에 Ezyfit 다운로드 <a href="http://www.fast.u-psud.fr/ezyfit/">http://www.fast.u-psud.fr/ezyfit/</a> 및 matlab에 경로에 속하는 폴더에 Ezyfit를 추가 (예 : C : Documents and Settings &lt;사용자 이름&gt; 내 문서 matlab에를 ). efmenu 설치 matlab에 작업 공간에 입력하여 Ezyfit 메뉴를 설치합니다. 그림 창에서 Ezyfit 메뉴를 MATLAB를 다시 시작합니다. Ezyfit 메뉴 &#39;쇼 맞추기&#39;&gt; &#39;전원&#39;&gt; &#39;* X ^ N&#39;에서 선택하여 전원 법에 MSD 곡선에 맞는 n은 추정 확산 지수 (α)입니다했다. 참고 : msdanalyzer는 MSD 곡선 피팅을위한 매트랩 도구 상자를 피팅 곡선을 필요로한다. Ezyfit 커브 피팅을 수행 할 수있는 다른 무료 소프트웨어입니다. </li><li> 지우기 현재 입자의 궤적과 근골격계 질환은 다른 지역 또는 시간에 새로운 입자 MSDS (물질 안전 보건 자료)를 계산합니다 : 맑은 </리&gt; <li> 다양한 평균 MSD 매체 (제어) 입자의 곡선, 그리고 microcolonies 다양한 균주의 미분화 지역, 복사 비교를 위해 하나의 그래프에 곡선을 붙여 계산 한 후. 샘플 강성과 낮은 MSD 값으로 가교 증가. 평면 곡선은 낮은 α를 가지고 샘플은 높은 α와 가파른 곡선보다 더 탄성이다. </li><li> 커브를 선택 및 중간 및 범위 등의 데이터 통계를보고 &quot;도구&quot;로 이동합니다. 비드 MSD는 크리프 컴플라이언스에 비례, J 비드 관계에 따라서 매립 된 물질 (t), <img alt="식 (1)" src="/files/ftp_upload/53093/53093eq1.jpg" /> 여기서 J = 크리프 준수, D = 입자 직경, 케이 B = 볼츠만 상수, T = 온도 T = 시간. </li></ol></li></ol>

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	<li>Costerton, J. W., Lewandowski, Z., Caldwell, D. E., Korber, D. R., Lappin-Scott, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+biofilms.">Microbial biofilms.</a> Annu Rev Microbiol. 49, 711-745 (1995).</li><li>Flemming, H. C., Wingender, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biofilm+matrix.">The biofilm matrix.</a> Nat Rev Microbiol. 8, 623-633 (2010).</li><li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+roles+of+extracellular+polymeric+substances+in+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+development.">Distinct roles of extracellular polymeric substances in Pseudomonas aeruginosa biofilm development.</a> Environ Microbiol. 13, 1705-1717 (2011).</li><li>Chew, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Remodeling+of+Microbial+Biofilms+by+Functionally+Distinct+Exopolysaccharides.">Dynamic Remodeling of Microbial Biofilms by Functionally Distinct Exopolysaccharides.</a> mBio. 5 (4), (2014).</li><li>Irie, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-produced+exopolysaccharide+is+a+signal+that+stimulates+biofilm+formation+in+Pseudomonas+aeruginosa.">Self-produced exopolysaccharide is a signal that stimulates biofilm formation in Pseudomonas aeruginosa.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 20632-20636 (2012).</li><li>Zhao, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Psl+trails+guide+exploration+and+microcolony+formation+in+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms.">Psl trails guide exploration and microcolony formation in Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> Nature. 497, 388-391 (2013).</li><li>Yang, L., Nilsson, M., Gjermansen, M., Givskov, M., Tolker-Nielsen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyoverdine+and+PQS+mediated+subpopulation+interactions+involved+in+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+formation.">Pyoverdine and PQS mediated subpopulation interactions involved in Pseudomonas aeruginosa biofilm formation.</a> Mol Microbiol. 74, 1380-1392 (2009).</li><li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+differentiation+in+co-culture+biofilms+formed+by+Staphylococcus+aureus+and+Pseudomonas+aeruginosa.">Pattern differentiation in co-culture biofilms formed by Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa.</a> FEMS Immunol Med Microbiol. 62, 339-347 (2011).</li><li>Friedman, L., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+involved+in+matrix+formation+in+Pseudomonas+aeruginosa+PA14+biofilms.">Genes involved in matrix formation in Pseudomonas aeruginosa PA14 biofilms.</a> Mol Microbiol. 51, 675-690 (2004).</li><li>Bokranz, W., Wang, X., Tsch&#228;pe, H., R&#246;mling, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+cellulose+and+curli+fimbriae+by+Escherichia+coli+isolated+from+the+gastrointestinal+tract.">Expression of cellulose and curli fimbriae by Escherichia coli isolated from the gastrointestinal tract.</a> J Med Microbiol. 54, 1171-1182 (2005).</li><li>Denkhaus, E., Meisen, S., Telgheder, U., Wingender, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+and+physical+methods+for+characterisation+of+biofilms.">Chemical and physical methods for characterisation of biofilms.</a> Microchim Acta. 158, 1-27 (2007).</li><li>Waigh, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microrheology+of+complex+fluids.">Microrheology of complex fluids.</a> Rep Prog Phys. 68, 685-742 (2005).</li><li>Wirtz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle-Tracking+Microrheology+of+Living+Cells:+Principles+and+Applications.">Particle-Tracking Microrheology of Living Cells: Principles and Applications.</a> Annu Rev Biophys. 38, 301-326 (2009).</li><li>Weiss Nielsen, M., Sternberg, C., Molin, S., Regenberg, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa.+and+Saccharomyces+cerevisiae.+Biofilm+in+Flow+Cells.">Pseudomonas aeruginosa. and Saccharomyces cerevisiae. Biofilm in Flow Cells.</a> J Vis Exp. , e2383 (2011).</li><li>Tarantino, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TNF+and+IL-1+exhibit+distinct+ubiquitin+requirements+for+inducing+NEMO-IKK+supramolecular+structures.">TNF and IL-1 exhibit distinct ubiquitin requirements for inducing NEMO-IKK supramolecular structures.</a> Journal of Cell Biology. 204, 231-245 (2014).</li><li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polysaccharides+serve+as+scaffold+of+biofilms+formed+by+mucoid+Pseudomonas+aeruginosa.">Polysaccharides serve as scaffold of biofilms formed by mucoid Pseudomonas aeruginosa.</a> FEMS Immunol Med Microbiol. 65, 366-376 (2012).</li><li>Gjermansen, M., Nilsson, M., Yang, L., Tolker-Nielsen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+starvation-induced+dispersion+in+Pseudomonas+putida+biofilms:+genetic+elements+and+molecular+mechanisms.">Characterization of starvation-induced dispersion in Pseudomonas putida biofilms: genetic elements and molecular mechanisms.</a> Mol Microbiol. 75, 815-826 (2010).</li><li>Qin, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+autolysin-mediated+DNA+release+in+biofilm+formation+of+Staphylococcus+epidermidis.">Role of autolysin-mediated DNA release in biofilm formation of Staphylococcus epidermidis.</a> Microbiology. 153, 2083-2092 (2007).</li><li>Stoodley, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+fluid+shear+and+AlCl3+on+the+material+properties+of+Pseudomonas+aeruginosa.+PAO1+and+Desulfovibrio+sp.+EX265+biofilms.">The influence of fluid shear and AlCl3 on the material properties of Pseudomonas aeruginosa. PAO1 and Desulfovibrio sp. EX265 biofilms.</a> Water Science &amp; Technology. 43, 113-120 (2001).</li><li>J&#228;ger-Z&#252;rn, I., Grubert, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Podostemaceae+depend+on+sticky+biofilms+with+respect+to+attachment+to+rocks+in+waterfalls.">Podostemaceae depend on sticky biofilms with respect to attachment to rocks in waterfalls.</a> International Journal of Plant Sciences. 161, 599-607 (2000).</li><li>Matysik, A., Kraut, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TrackArt:+the+user+friendly+interface+for+single+molecule+tracking+data+analysis+and+simulation+applied+to+complex+diffusion+in+mica+supported+lipid+bilayers.">TrackArt: the user friendly interface for single molecule tracking data analysis and simulation applied to complex diffusion in mica supported lipid bilayers.</a> BMC Research Notes. 7 (1), 274-283 (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Microrheology는 미생물 바이오 필름 등의 이기종 시스템, 로컬 유변학 적 측정을위한 유용한 도구입니다. 그것은 여러 시간 지점 위에 동일한 생물학적 샘플 내의 유동 학적 변화를 실시간으로 모니터링 할 수 있도록, 비파괴 기술이다. 이 프로토콜에서, 입자 추적 microrheology 그들이 탄성 생물막 매트릭스의 가교 효과에 미치는 영향을 조사하기 위해 펠 PSL 엑소 폴리 사카 라이드 및 돌연변이에 적용 ...

대부분의 박테리아 세포는 모두 플랑크톤 (자유 생활)과 성장 (1)의 표면에 부착 (고착) 모드를 사용 할 수 있습니다. 성장면 부착 모드에서, 박테리아 세포는 분비 및 세포 외 폴리머 물질 (EPS) 바이오 필름을 형성하기 위해 다량으로 자신을 싸는. EPS는 주로 단백질, 엑소 폴리 사카 라이드, 세포 DNA로 구성되어 생물막 형성이 필수적이다. 그것은 박테리아가 공간적으로 구별하기 위해 사용하고 유해 환경 조건 및 호스트 응답에서 박테리아를 보호 할 수있는 물리적 발판 역할을한다. EPS의 다른 구성 요소는 크게 생물막 구조 4 개조 할 수 EPS 구성 요소의 표현에 biofilm 형성 (3) 변경에 별개의 역할이있다. EPS 구성 요소는 또한 5 시그널링 분자로서 기능 할 수 있으며, 최근의 연구는 이주 및 생물막 DIFF 안내하는 미생물 세포와 상호 작용하는 특정 EPS 성분을 보여 주었다erentiation 6-8. EPS에 대한 연구는 크게 EPS 9, 10의 특정 구성 요소에 결함이있는 돌연변이에 의해 생성 된 바이오 필름의 형태 학적 분석을 기반으로 고급. 또한, EPS 보통 매크로 스케일 (벌크 특성) (11)을 특징으로한다. 형태 학적는 평균 값을 반환 생물막의 이질성 내에 존재 세부 사항을 잃고 양적 세부 사항 및 벌크 특성을 결여 할 수 있지만 분석한다. 마이크로 규모 EPS의 정비사 특성의 실시간 특성을 진행하는 경향이 증가하고 지금 있습니다. 이 프로토콜은 입자 추적 microrheology는 녹농균 생물막 (4)의 탄성률과 효과적인 가교에 매트릭스 성분 펠의 시공간 효과 PSL 엑소 폴리 사카 라이드를 결정하는 방법을 설명 할 수있다. 수동 microrheology는 간단하고 저렴한 RH입니다날짜 (12, 13)에 대한 물질의 공간 microrheological 샘플링의 가장 높은 처리량을 제공 eology 방법. 패시브 microrheology에서, 프로브가 샘플 분야에 배치되어 열 에너지 (K B 형 T)에 의해 구동들은 브라운 운동을 비디오 현미경으로 이어진다. 여러 입자를 동시에 추적 될 수 있고, 입자의 시간에 따른 좌표는 종래 랜덤 워크를 따른다. 따라서, 평균 입자가 동일한 위치에 남아있다. 그러나, 변위의 표준 편차 또는 평균은 입자의 변위 (MSD)를 제곱, 0이 아니다. 점성 액체의 흐름 때문에 시간이 진행됨에 따라, 점성 유체의 입자 MSD는 선형 적으로 증가한다. 대조적으로, 중합체 가교 점탄성 검색된 또는 탄성 물질들이 유동 저항 돕고, 입자 MSD 곡선 (도 1a)의 대지에 이어지는, 그 변위에 한정된다. 이러한 관찰은 다음 관계를 MSDαt <sα는 물질의 탄성과 점성 기여 비율과 관련이 확산 지수 인 α&gt;까지. 점탄성 물질 &lt;α &lt;1, 및 탄성 물질에 α 0에 점성 유체의 이동 입자 α = 1에 대해서는 = 0으로 MSD는 또한 재료의 경향 영구적 위에 변형 인 크리프 컴플라이언스를 계산하는 데 사용될 수있다 시간이 얼마나 쉽게 재료 스프레드를 추정하고있다. 입자의 크기, 밀도 및 표면 화학 microrheological 실험 올바른 응용에 중요하다 (이 경우에 생물막의 매트릭스 폴리머는,도 1b 참조)를 조사 시스템에 대해 선택된다. 우선, 입자는 입자 자체보다 훨씬 작은 구조를 갖는 물질의 레올로지를 측정한다. 물질의 구조는 입자, 파의 움직임과 유사한 규모의 경우ticle는 개별 구조의 형상 및 방향에 의해 교란된다. 그러나 입자를 둘러싸는 구조가 매우 작은 경우,이 효과는 작고, 입자 (도 1b)에 균일 한 환경을 제시하고, 평균화. 둘째로, 입자의 밀도는 침강이 방지 및 관성력 무시할되도록 (수성 매체 1.05 g 용액 -1) 매체와 유사 할 것이다. 폴리스티렌 그릴 대부분의 입자는 위의 기준을 충족. 운동은 물질의 구조와 열 에너지와의 충돌에 의해 구동, 임의의 경우 입자 MSD의 유변학 적 해석에만 유효 이상적으로, 입자는 바이오 필름 매트릭스의 폴리머와 상호 작용하지 않습니다. 이것은 프로브 입자가 결합하거나 미리 성장한 생물막의 표면에서 반사하는 경향이 있는지 여부를 확인함으로써 관찰 될 수있다. 그러나, 바이오 필름에 인력의 부족에도 불구하고, 입자가 매트릭스에 혼입 될 수 있어야한다.또한, 바이오 필름의 물리 화학적 이질성은 다른 입자가 생물막의 다른 지역에서 프로브로서 더 적합하다 발생할 수 있습니다. 따라서, 다른 크기 및 표면 화학의 입자는 생물막에 적용되어야한다. 이와 같이, 입자는 MSD 성분 유 동학에 기여 생물막의 확산 방법에 관한 다른 유용한 정보를 제공 할 수있다. 또한, 다른 프로브의 사용은 하나의 생물막의 공간 물리 이질성에 대한 정보를 도출 할 수있다. 이 방법은 바이오 필름의 기계적 특성이 다른 종의 도입에서 변경되는 방법을 조사하기 위해 혼합 종 생물막으로 생물막의 기계적 특성에 영향 항균 처리를 테스트하는 데 사용되는, 또는 적용 할 수있다. 입자 근골격계 질환은 생물막 분산의 특성을 유용 할 수 있습니다. 이러한 연구는 잠재적으로 생물막 처리 개선, 바이오 필름에 대한 우리의 이해에 도움이 될 것입니다유용한 활동을위한 생물막의 차 엔지니어링.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Fluorspheres</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F-8821</td>
			<td>1.0 um red fluorescent (580/605) microspheres with carboxylate modification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Axio Imager M1</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Epifluorescent Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex L/S Digital Drive 07523-80</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-07523-80</td>
			<td>Peristaltic pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Cell Chambers</td>
			<td colspan="3">Technical University of Denmark</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bubble Trap</td>
			<td colspan="3">Technical University of Denmark</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone Tubing</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td></td>
			<td>3 mm outer diameter, 1 mm inner diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear polypropylene plastic connectors&#160;</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>06365-83</td>
			<td>1/16 in. (1.588 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binder Clips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To clamp tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td colspan="2">Thermo Scientific&#8482; Nunc&#8482;</td>
			<td>50 x 24 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 3 mL</td>
			<td>Terumo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27G Needle</td>
			<td>Terumo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2L Storage/Media Bottles</td>
			<td>VWR&#174;&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trolley</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To hold biofilm setup</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in situ mapping of the mechanical properties of biofilms by particle-tracking microrheology

Bacterial cells are able to form surface-attached biofilm communities known as biofilms by encasing themselves in extracellular polymeric substances (EPS). The EPS serves as a physical and protective scaffold that houses the bacterial cells and consists of a variety of materials that includes proteins, exopolysaccharides and DNA. The composition of the EPS may change, which remodels the mechanic properties of the biofilm to further develop or support alternative biofilm structures, such as streamers, as a response to environmental cues. Despite this, there are little quantitative descriptions on how EPS components contribute to the mechanical properties and function of biofilms. Rheology, the study of the flow of matter, is of particular relevance to biofilms as many biofilms grow in flow conditions and are constantly exposed to shear stress. It also provides measurement and insight on the spreading of the biofilm on a surface. Here, particle-tracking microrheology is used to examine the viscoelasticity and effective crosslinking roles of different matrix components in various parts of the biofilm during development. This approach allows researchers to measure mechanic properties of biofilms at the micro-scale, which might provide useful information for controlling and engineering biofilms.

보이드 (바이오 필름 ​​위의 매체), 평원 (세포의 미분화 평면 층) 및 microcolonies (그림 2A의 라벨 참조)에 포함 된 바이오 필름의 다른 지역에서 바이오 필름의 로컬 점탄성 특성을 조사 하였다. 일에서 성숙하는 동안 바이오 필름의 점탄성 특성의 시간적 변화는 3-5도를 측정 하였다. 보이드의 입자 MSD 순수한 매질 입자 MSD에 제어 및 비교로서 사용 하였다. 반면, 생물막에 갇혀 입자가...

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In Situ Mapping of the Mechanical Properties of Biofilms by Particle-tracking Microrheology

Particle-tracking microrheology investigates the viscoelasticity of materials. Here, the technique is used to determine the viscoelasticity, creep compliance and effective crosslinking roles of different matrix components of a bacterial biofilm. The matrix consists of polymeric substances secreted by the bacteria and its components determine biofilm structure and mechanical properties.

입자 추적 Microrheology에 의한 바이오 필름의 기계적 성질의 제자리 매핑에서

Bacterial cells are able to form surface-attached biofilm communities known as biofilms by encasing themselves in extracellular polymeric substances ...

in-situ-mapping-mechanical-properties-biofilms-particle-tracking

Research

JoVE Journal

Bioengineering

In Situ Mapping of the Mechanical Properties of Biofilms by Particle-tracking Microrheology

9.6K 조회수.  Nanyang Technological University. Particle-tracking microrheology investigates the viscoelasticity of materials. Here, the technique is used to determine the viscoelasticity, creep compliance and effective crosslinking roles of different matrix components of a bacterial biofilm. The matrix consists of polymeric substances secreted by the bacteria and its components determine biofilm structure and mechanical properties.

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Multiparametric Optical Mapping of the Langendorff-perfused Rabbit Heart

Optical imaging and fluorescent probes have significantly advanced research methodology in the field of cardiac electrophysiology in ways that could not have been accomplished by other approaches1. With the use of the calcium- and voltage-sensitive dyes, optical mapping allows measurement of transmembrane action potentials and calcium transients with high spatial resolution without the physical contact with the tissue. This makes measurements of the cardiac electrical activity possible under many conditions where the use of electrodes is inconvenient or impossible1. For example, optical recordings provide accurate morphological changes of membrane potential during and immediately after stimulation and defibrillation, while conventional electrode techniques suffer from stimulus-induced artifacts during and after stimuli due to electrode polarization1. 
The Langendorff-perfused rabbit heart is one of the most studied models of human heart physiology and pathophysiology. Many types of arrhythmias observed clinically could be recapitulated in the rabbit heart model. It was shown that wave patterns in the rabbit heart during ventricular arrhythmias, determined by effective size of the heart and the wavelength of reentry, are very similar to that in the human heart2. It was also shown that critical aspects of excitation-contraction (EC) coupling in rabbit myocardium, such as the relative contribution of sarcoplasmic reticulum (SR), is very similar to human EC coupling3. Here we present the basic procedures of optical mapping experiments in Langendorff-perfused rabbit hearts, including the Langendorff perfusion system setup, the optical mapping systems setup, the isolation and cannulation of the heart, perfusion and dye-staining of the heart, excitation-contraction uncoupling, and collection of optical signals. These methods could be also applied to the heart from species other than rabbit with adjustments to flow rates, optics, solutions, etc.
Two optical mapping systems are described. The panoramic mapping system is used to map the entire epicardium of the rabbit heart4-7. This system provides a global view of the evolution of reentrant circuits during arrhythmogenesis and defibrillation, and has been used to study the mechanisms of arrhythmias and antiarrhythmia therapy8,9. The dual mapping system is used to map the action potential (AP) and calcium transient (CaT) simultaneously from the same field of view10-13. This approach has enhanced our understanding of the important role of calcium in the electrical alternans and the induction of arrhythmia14-16.

This article describes the basic procedures for conducting optical mapping experiments in the Langendorff-perfused rabbit heart using the panoramic imaging system, and the dual (voltage and calcium) imaging modality.

Langendorff - perfused 토끼 하트의 Multiparametric 광 매핑

Optical imaging and fluorescent probes have significantly advanced research methodology in the field of cardiac electrophysiology in ways that could not ...

연구

생체공학

Optical Mapping of Action Potentials and Calcium Transients in the Mouse Heart

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. Cardiovascular physiological phenotyping of the mouse heart can be easily done using fluorescence imaging employing various probes for transmembrane potential (Vm), calcium transients (CaT), and other parameters. Excitation-contraction coupling is characterized by action potential and intracellular calcium dynamics; therefore, it is critically important to map both Vm and CaT simultaneously from the same location on the heart1-4. Simultaneous optical mapping from Langendorff perfused mouse hearts has the potential to elucidate mechanisms underlying heart failure, arrhythmias, metabolic disease, and other heart diseases. Visualization of activation, conduction velocity, action potential duration, and other parameters at a myriad of sites cannot be achieved from cellular level investigation but is well solved by optical mapping1,5,6. In this paper we present the instrumentation setup and experimental conditions for simultaneous optical mapping of Vm and CaT in mouse hearts with high spatio-temporal resolution using state-of-the-art CMOS imaging technology. Consistent optical recordings obtained with this method illustrate that simultaneous optical mapping of Langendorff perfused mouse hearts is both feasible and reliable.

This paper details the dissection procedure, instrumental setup, and experimental conditions during optical mapping of transmembrane potential (Vm) and intracellular calcium transient (CaT) in intact isolated Langendorff perfused mouse hearts.

마우스 중심에 액션 후보와 칼슘 과도의 광학 매핑

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. ...

Quantifying the Mechanical Properties of the Endothelial Glycocalyx with Atomic Force Microscopy

Our understanding of the interaction of leukocytes and the vessel wall during leukocyte capture is limited by an incomplete understanding of the mechanical properties of the endothelial surface layer. It is known that adhesion molecules on leukocytes are distributed non-uniformly relative to surface topography 3, that topography limits adhesive bond formation with other surfaces 9, and that physiological contact forces (&asymp; 5.0 &minus; 10.0 pN per microvillus) can compress the microvilli to as little as a third of their resting length, increasing the accessibility of molecules to the opposing surface 3, 7. We consider the endothelium as a two-layered structure, the relatively rigid cell body, plus the glycocalyx, a soft protective sugar coating on the luminal surface 6. It has been shown that the glycocalyx can act as a barrier to reduce adhesion of leukocytes to the endothelial surface 4. In this report we begin to address the deformability of endothelial surfaces to understand how the endothelial mechanical stiffness might affect bond formation. Endothelial cells grown in static culture do not express a robust glycocalyx, but cells grown under physiological flow conditions begin to approximate the glycocalyx observed in vivo 2. The modulus of the endothelial cell body has been measured using atomic force microscopy (AFM) to be approximately 5 to 20 kPa 5. The thickness and structure of the glycocalyx have been studied using electron microscopy 8, and the modulus of the glycocalyx has been approximated using indirect methods, but to our knowledge, there have been no published reports of a direct measurement of the glycocalyx modulus in living cells. In this study, we present indentation experiments made with a novel AFM probe on cells that have been cultured in conditions to maximize their glycocalyx expression to make direct measurements of the modulus and thickness of the endothelial glycocalyx.

The mechanical characteristics of endothelial glycocalyx were measured by indentation using micron sized spheres on AFM cantilevers. Endothelial cells were cultured in a custom chamber under physiological flow conditions to induce glycocalyx expression. Data were analyzed using a thin film model to determine the glycocalyx thickness and modulus.

원자 힘 현미경과 내피 Glycocalyx의 기계적 성질을 정량화

Our  understanding of the interaction of leukocytes and the vessel wall during  leukocyte capture is limited by an incomplete understanding of the ...

Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

Mechanical properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many biological processes including stem cell differentiation, tumor formation, and wound healing. Changes in stiffness of cells and ECM are often signs of changes in cell physiology or diseases in tissues. Hence, cell stiffness is an index to evaluate the status of cell cultures. Among the multitude of methods applied to measure the stiffness of cells and tissues, micro-indentation using an Atomic Force Microscope (AFM) provides a way to reliably measure the stiffness of living cells. This method has been widely applied to characterize the micro-scale stiffness for a variety of materials ranging from metal surfaces to soft biological tissues and cells. The basic principle of this method is to indent a cell with an AFM tip of selected geometry and measure the applied force from the bending of the AFM cantilever. Fitting the force-indentation curve to the Hertz model for the corresponding tip geometry can give quantitative measurements of material stiffness. This paper demonstrates the procedure to characterize the stiffness of living cells using AFM. Key steps including the process of AFM calibration, force-curve acquisition, and data analysis using a MATLAB routine are demonstrated. Limitations of this method are also discussed.

This paper demonstrates a protocol to characterize the mechanical properties of living cells by means of microindentation using an Atomic Force Microscope (AFM).

원자 힘 현미경을 사용하여 살아있는 세포의 기계적 특성을 측정

Mechanical  properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many  biological processes including stem cell differentiation, ...

Remote Magnetic Actuation of Micrometric Probes for in situ 3D Mapping of Bacterial Biofilm Physical Properties

Bacterial adhesion and growth on interfaces lead to the formation of three-dimensional heterogeneous structures so-called biofilms. The cells dwelling in these structures are held together by physical interactions mediated by a network of extracellular polymeric substances. Bacterial biofilms impact many human activities and the understanding of their properties is crucial for a better control of their development &#8212; maintenance or eradication &#8212; depending on their adverse or beneficial outcome. This paper describes a novel methodology aiming to measure in situ the local physical properties of the biofilm that had been, until now, examined only from a macroscopic and homogeneous material perspective. The experiment described here&#160;involves introducing magnetic particles into a growing biofilm to seed local probes that can be remotely actuated without disturbing the structural properties of the biofilm. Dedicated magnetic tweezers were developed to exert a defined force on each particle embedded in the biofilm. The setup is mounted on the stage of a microscope to enable the&#160;recording of time-lapse images of the particle-pulling period. The particle trajectories are then extracted from the pulling sequence and the local viscoelastic parameters are derived from each particle displacement curve, thereby providing the 3D-spatial distribution of the parameters. Gaining insights into the biofilm mechanical profile is essential from an engineer&#39;s point of view for biofilm control purposes but also from a fundamental perspective to clarify the relationship between the architectural properties and the specific biology of these structures.

Remote Magnetic Actuation of Micrometric Probes for in situ 3D Mapping of Bacterial Biofilm Physical Properties

This paper shows an original methodology based on the remote actuation of magnetic particles seeded in a bacterial biofilm and the development of dedicated magnetic tweezers to measure in situ the local mechanical properties of the complex living material built by micro-organisms at interfaces.

에 대한 마이크로 미터 프로브의 원격 자기 발동<em&gt; 현장에서</em세균 바이오 필름 물성&gt; 3D 매핑

Bacterial adhesion and growth on interfaces lead to the formation of three-dimensional heterogeneous structures so-called biofilms. The cells dwelling in ...

Investigating the Three-dimensional Flow Separation Induced by a Model Vocal Fold Polyp

The fluid-structure energy exchange process for normal speech has been studied extensively, but it is not well understood for pathological conditions. Polyps and nodules, which are geometric abnormalities that form on the medial surface of the vocal folds, can disrupt vocal fold dynamics and thus can have devastating consequences on a patient&#39;s ability to communicate. Our laboratory has reported particle image velocimetry (PIV) measurements, within an investigation of a model polyp located on the medial surface of an in&#160;vitro driven vocal fold model, which show that such a geometric abnormality considerably disrupts the glottal jet behavior. This flow field adjustment is a likely reason for the severe degradation of the vocal quality in patients with polyps. A more complete understanding of the formation and propagation of vortical structures from a geometric protuberance, such as a vocal fold polyp, and the resulting influence on the aerodynamic loadings that drive the vocal fold dynamics, is necessary for advancing the treatment of this pathological condition. The present investigation concerns the three-dimensional flow separation induced by a wall-mounted prolate hemispheroid with a 2:1 aspect ratio in cross flow, i.e. a model vocal fold polyp, using an oil-film visualization technique. Unsteady, three-dimensional flow separation and its impact of the wall pressure loading are examined using skin friction line visualization and wall pressure measurements.

Vocal fold polyps can disrupt vocal fold dynamics and thus can have devastating consequences on a patient&#39;s ability to communicate. Three-dimensional flow separation induced by a wall-mounted model polyp and its impact on the wall pressure loading are examined using particle image velocimetry, skin friction line visualization, and wall pressure measurements.

모델 보컬 폴드 폴립에 의해 유도된 3차원 유동 분리 조사

The fluid-structure energy exchange process for normal speech has been studied extensively, but it is not well understood for pathological conditions. ...

Longitudinal Measurement of Extracellular Matrix Rigidity in 3D Tumor Models Using Particle-tracking Microrheology

The mechanical microenvironment has been shown to act as a crucial regulator of tumor growth behavior and signaling, which is itself remodeled and modified as part of a set of complex, two-way mechanosensitive interactions. While the development of biologically-relevant 3D tumor models have facilitated mechanistic studies on the impact of matrix rheology on tumor growth, the inverse problem of mapping changes in the mechanical environment induced by tumors remains challenging. Here, we describe the implementation of particle-tracking microrheology (PTM) in conjunction with 3D models of pancreatic cancer as part of a robust and viable approach for longitudinally monitoring physical changes in the tumor microenvironment, in situ. The methodology described here integrates a system of preparing in vitro 3D models embedded in a model extracellular matrix (ECM) scaffold of Type I collagen with fluorescently labeled probes uniformly distributed for position- and time-dependent microrheology measurements throughout the specimen. In vitro tumors are plated and probed in parallel conditions using multiwell imaging plates. Drawing on established methods, videos of tracer probe movements are transformed via the Generalized Stokes Einstein Relation (GSER) to report the complex frequency-dependent viscoelastic shear modulus, G*(&#969;). Because this approach is imaging-based, mechanical characterization is also mapped onto large transmitted-light spatial fields to simultaneously report qualitative changes in 3D tumor size and phenotype. Representative results showing contrasting mechanical response in sub-regions associated with localized invasion-induced matrix degradation as well as system calibration, validation data are presented. Undesirable outcomes from common experimental errors and troubleshooting of these issues are also presented. The 96-well 3D culture plating format implemented in this protocol is conducive to correlation of microrheology measurements with therapeutic screening assays or molecular imaging to gain new insights into impact of treatments or biochemical stimuli on the mechanical microenvironment.

Particle-tracking microrheology can be used to non-destructively quantify and spatially map changes in extracellular matrix mechanical properties in 3D tumor models.

입자 추적 microrheology은을 사용하여 3D 종양 모델에서 세포 외 매트릭스 강성의 경도 측정

The mechanical microenvironment has been shown to act as a crucial regulator of tumor growth behavior and signaling, which is itself remodeled and ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and dampen loads in the spine. The IVD consists of a proteoglycan-rich nucleus pulposus (NP) and a collagen-rich annulus fibrosis (AF) sandwiched by cartilaginous end-plates. Together with the adjacent vertebrae, the vertebrae-IVD structure forms a functional spine unit (FSU). These microstructures contain unique cell types as well as unique extracellular matrices. Whole organ culture of the FSU preserves the native extracellular matrix, cell differentiation phenotypes, and cellular-matrix interactions. Thus, organ culture techniques are particularly useful for investigating the complex biological mechanisms of the IVD. Here, we describe a high-throughput approach for culturing whole lumbar mouse FSUs that provides an ideal platform for studying disease mechanisms and therapies for the IVD. Furthermore, we describe several applications that utilize this organ culture method to conduct further studies including contrast-enhanced microCT imaging and three-dimensional high-resolution finite element modeling of the IVD.

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

Whole organ culture of the intervertebral disc (IVD) preserves the native extracellular matrix, cell phenotypes, and cellular-matrix interactions. Here we describe an IVD culture system using mouse lumbar and caudal IVDs in their functional spinal units and several applications utilizing this system.

<em&gt; 체외</em쥐의 추간판의&gt; 장기 문화 모델

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

A Millimeter Scale Flexural Testing System for Measuring the Mechanical Properties of Marine Sponge Spicules

Many load bearing biological structures (LBBSs)&#8212;such as feather rachises and spicules&#8212;are small (&#60;1 mm) but not microscopic. Measuring the flexural behavior of these LBBSs is important for understanding the origins of their remarkable mechanical functions.
We describe a protocol for performing three-point bending tests using a custom-built mechanical testing device that can measure forces ranging from 10-5 to 101 N and displacements ranging from 10-7 to 10-2 m. The primary advantage of this mechanical testing device is that the force and displacement capacities can be easily adjusted for different LBBSs. The device&#39;s operating principle is similar to that of an atomic force microscope. Namely, force is applied to the LBBS by a load point that is attached to the end of a cantilever. The load point displacement is measured by a fiber optic displacement sensor and converted into a force using the measured cantilever stiffness. The device&#39;s force range can be adjusted by using cantilevers of different stiffnesses.
The device&#39;s capabilities are demonstrated by performing three-point bending tests on the skeletal elements of the marine sponge Euplectella aspergillum. The skeletal elements&#8212;known as spicules&#8212;are silica fibers that are approximately 50 &#181;m in diameter. We describe the procedures for calibrating the mechanical testing device, mounting the spicules on a three-point bending fixture with a &#8776;1.3 mm span, and performing a bending test. The force applied to the spicule and its deflection at the location of the applied force are measured.

We present a protocol for performing three-point bending tests on sub-millimeter scale fibers using a custom-built mechanical testing device. The device can measure forces ranging from 20 &#181;N up to 10 N and can therefore accommodate a variety of fiber sizes.

Many load bearing biological structures (LBBSs)&#8212;such as feather rachises and spicules&#8212;are small (&#60;1 mm) but not microscopic. Measuring the ...

A Protocol for Real-time 3D Single Particle Tracking

Real-time three-dimensional single particle tracking (RT-3D-SPT) has the potential to shed light on fast, 3D processes in cellular systems. Although various RT-3D-SPT methods have been put forward in recent years, tracking high speed 3D diffusing particles at low photon count rates remains a challenge. Moreover, RT-3D-SPT setups are generally complex and difficult to implement, limiting their widespread application to biological problems. This protocol presents a RT-3D-SPT system named 3D Dynamic Photon Localization Tracking (3D-DyPLoT), which can track particles with high diffusive speed (up to 20 &#181;m2/s) at low photon count rates (down to 10 kHz). 3D-DyPLoT employs a 2D electro-optic deflector (2D-EOD) and a tunable acoustic gradient (TAG) lens to drive a single focused laser spot dynamically in 3D. Combined with an optimized position estimation algorithm, 3D-DyPLoT can lock onto single particles with high tracking speed and high localization precision. Owing to the single excitation and single detection path layout, 3D-DyPLoT is robust and easy to set up. This protocol discusses how to build 3D-DyPLoT step by step. First, the optical layout is described. Next, the system is calibrated and optimized by raster scanning a 190 nm fluorescent bead with the piezoelectric nanopositioner. Finally, to demonstrate real-time 3D tracking ability, 110 nm fluorescent beads are tracked in water.

This protocol details the construction and operation of a real-time 3D single particle tracking microscope capable of tracking nanoscale fluorescent probes at high diffusive speeds and low photon count rates.

실시간 3D 단일 입자 추적에 대 한 프로토콜

Real-time three-dimensional single particle tracking (RT-3D-SPT) has the potential to shed light on fast, 3D processes in cellular systems. Although ...