NIH R01 보조금 HL085369, HL067322, HL082729, EB008999

1. 준비 <ol><li> 갓 만든 Tyrodes &#39;솔루션을 (㎜, 128.2 NaCl, 1.3 CaCl 2, 4.7 KCl, 1.19 아니 2 PO 4, 1.05 MgCl 2, 20.0 NaHCO 3, 11.1 포도당)을 준비합니다. 솔루션의 매일 준비를 신속히하기 위해 사전에 두 재고 솔루션을 준비하고 4에 그들을 저장할 ° C 냉장고 : (1) 주식 I (g/2L에서 374.6 NaCl, 9.56 CaCl 2, 17.52 KCl, 8.21 아니 2 PO 4 , 10.67 MgCl 2) 및 (2) 주식 II (g/2L에서 84.01 NaHCO 3). 한 실험이 걸릴 충분한 Tyrodes &#39;솔루션의 2L하려면 주식 I, II의 주식 80mL, 그리고 포도당의 4g의 80mL 거기에 탈이온수 및 믹스의 1840mL. </li><li> 염료 및 uncouplers의 재고 솔루션을 준비 (1) 여기 - 수축 uncoupler의 blebbistatin 주식 솔루션 (DMSO에 Tocris Bioscience, 2mg/mL 솔루션), (2) 전압에 민감한 염료 DI - 4 - ANEPPS 주식 솔루션 (Invitrogen, 1mg/mL DMSO의 용액) (3) 전압에 민감한 염료 RH 237 재고 솔루션 (Invitrogen, DMSO에 1.25mg/ml 솔루션) (4) 칼슘 표시기로드 - 오전 2시 재고 솔루션 (Invitrogen, DMSO에 1mg/ml 솔루션). 한 토끼 실험은 디 - 4 - ANEPPS 주식 솔루션 RH237 재고 솔루션을 30 μL 및로드 - 오전 2시 재고 솔루션을 200 μL의 약 30 μL가 필요합니다. 반복 동결 융해를 방지하기 위해, 우리는 -20 ° C.에 DI - 4 - ANEPPS 100 μL aliquots 저장 다른 염료는 -20 ° C.에 저장됩니다 4 ° C 냉장고에 녹아 blebbistatin를 저장합니다. </li><li> 이전 2L 병에 심장, 전송 Tyrodes &#39;솔루션을 수확하고 37 솔루션 온도를 유지 물을 욕조 (피셔 과학) ° C.에 그것을 장소 5% CO 2 - 솔루션 95% O 2 산소입니다. 산도는 7.35에서 관리하고 있습니다 ± 0.05을 산소 수준을 조정하여. 솔루션은 Langendorff 재관류 시스템의 순환이며 나일론 그물 필터 (기공 크기 : 11μm, Millipore)에 의해 필터링되는 정맥 전에 재관류 라인에 배치. </li><li> 마음을 수확하기 전에 모니터링 장비를 준비합니다. 압력 변환기 (WPI)은 실험 동안 대동맥 압력을 모니터링하는 데 사용됩니다. 압력 변환기의 기준은 심장이 재관류 시스템으로 연결하지 않을 때 mmHg를 제로로 조정됩니다. 의사 - ECG 전극은 대략 리드 I, II, 및 Einthoven 삼각형 ECG의 III에 챔버에 배치됩니다. </li></ol> 2. 토끼 하트의 수확 및 재관류 <ol><li> 토끼 restrainer의 토끼를 수정. 나트륨 pentobarbital (50 MG / ㎏) 2000 U의 헤파린의 정맥 주사하여 토끼를 안락사. 토끼 고통 반사의 부족에 의해 결정되는, 완전히 euthanized되면​​ 흉강은 빠르게 개방되고 심장과 폐가 excised 수 있습니다. </li><li> 대동맥 아치의 모든 지점 전에 대동맥을 오름차순의 위쪽 끝에 상처를 확인합니다. 오름차순 대동맥에서 공기를 제거하고 신속하게 이전 coronaries의 공기를 밖으로 유지하는 것이 매우 중요합니다 버블 사냥꾼에 첨부되어 16 게이지 정맥에 마음을 cannulate. 심장이 retrogradely 아닌 순환 Langendorff 재관류 시스템에 perfused되면 상처가 빠르게 심장막를 엽니다합니다. </li><li> 혈액이 재관류에 의해 플러시하는 동안, 폐, 기관, 지방과 결합 조직을 제거합니다. </li><li> 매우 중요하다! 실리콘 튜브는 (직경 3cm ~ 긴, 그리고 2mm) 좌심실 (LV)에 폐동맥 정맥과 승모판을 통해 삽입하여 실험을하는 동안 거기에 보관됩니다. 이 튜브는 LV에 갇혀있는 솔루션을 출시. 기계식 고정 마음에 Langedorff - 재관류 실험 기간 동안 시간 동안 순환이 없다면, 그것은 LV에 고인 심각한 국소 빈혈을 일으킬하고 부정맥을 생산 가능성이 높습니다. </li><li> 광학 매핑 장치로 재순환 Langendorff - 재관류 시스템에 정맥으로 마음을 이동합니다. </li></ol> 3. 파노라마 광학 매핑 시스템을 사용하여 실험을 실시 <ol><li> 사용자 정의 - 만든 육각 챔버에 마음을 놓고 살수 시스템에 정맥을 연결합니다. 재관류 펌프의 유량을 조정하여 60 대동맥 압력 ± 5 mmHg를 유지합니다. 나는 의사 - ECG를 이끌어 모니터링합니다. 주변에 산도 7.35 ± 0.05를 유지합니다. </li><li> blebbistatin는 스펙트럼의 보이는 부분의 자외선과 낮은 엔드 (450-490 nm의) 17에 의해 photoinactivated 때문에 방의 조명을 해제합니다. 천천히 정맥 위에있는 공기 거품 사냥꾼의 사출 포트를 통해 blebbistatin 재고 솔루션을 주입. 천천히 모든 bolus 주입에 대한 0.1ml blebbistatin를 삽입. 다음 주사하기 전에 안정화에 압력을 기다립니다. </li><li> 너의 기치를 실험 디자인에 특정 위치에 서성 거려 전극을 배치. </li><li> 거미의 각 사진 - 다이오드 배열의 이미지 비행기 (PDA)에있는 프로스트 유리의 중심부의 이미지를 초점골고루 마음을 주변 각도 간격. 세 PDA의 뷰 필드의 중심부에 맞게하기 위해 정맥 각 PDA와 심장 사이의 거리의 위치를​​ 조정합니다. 프로스트 유리의 각 초점을 맞춘 이미지의 사진을 가져가라. </li><li> 천천히 10을 삽입 ~ 재관류 솔루션에 공기 거품 트랩에 주입 포트를 통해 20μL DI - 4 - ANEPPS 주식 솔루션입니다. 광학 녹음을 복용하기 전에 1 ~ 3 분 동안 기다리십시오. </li><li> 첫 녹화, 녹색 LED 조명 (NO 여기 필터, LED 홍수, LUMILEDS)에 설정 사용자 정의 - 만든 데이터 수집 시스템과 관련된 세 PDA를 5에서 동시에 광학 녹음을하고 LED 조명을 끄십시오. 세 PDA의 다른 픽셀에서 신호의 품질을 확인합니다. 광학 작업 잠재력에 모션 아티팩트가 주목하는 경우 0.1 ~ 0.2mL blebbistatin 주식 솔루션을 추가합니다. 신호 대 잡음 비율이 낮으면 앞으로 5 μL DI - 4 - ANEPPS 주식 솔루션을 추가합니다. </li><li> 기능 연구에 대한 설계 실험 프로토콜을 마침. 신호가 photobleaching 또는 유실로 인해 실험 기간 동안 일이요 경우 추가 5μL DI - 4 - ANEPPS 주식 솔루션으로 마음을 다시 얼룩. </li><li> 기능 연구의 완료 후 객실 라이트를 켭니다. 36 균등하게 게재 각도에서 마음의 사진을 가져가라. 이것은 하나 PDA의 위치에 고정 디지털 카메라와 10 °의 단계에서 마음을 회전하여 이루어진다. </li><li> 챔버 밖으로 마음을 가져가라. 모든 솔루션을 드레인. DI 물, 70 % 시약 알코올, 다시 DI 물의 순서에 재관류 시스템을 씻으십시오. </li><li> 데이터 분석 36 디지털 사진, 복원된 도형의 표면에 광학 신호의 등록 및 행동 잠재력 기간 (APD)의 부량, 전도 속도 (CV), 위상 등 6 심장 기하학의 재건을 포함 </li></ol> 4. 듀얼 매핑 시스템을 사용하여 실험을 실시 <ol><li> (2 부 이후 계속)는 유리 챔버 (Radnoti)의 cannulated 마음을 놓고 살수 시스템에 정맥을 연결합니다. 심실과 심방 꼭대기에있는 챔버의 실리콘 하단에 마음을 아래로 핀. </li><li> 방 조명을 해제합니다. 천천히 마음을 고정하기 위해 재관류의 정맥하기 전에 사출 포트를 통해 (10μM에 도달하는 15 ~ 20 분) blebbistatin 재고 솔루션을 주입. </li><li> 솔루션 표면의 움직임을 줄이기 위해 epicardial 표면 위에 플라스틱 페트리 접시, 또는 다른 유리 창문 커버를 넣어. </li><li> 보기의 동일한 필드에 매핑 듀얼 시스템 (울티마 - L, SciMedia)에서 두 CMOS 카메라를 중점을두고 있습니다. 형광 방출은 이색성 거울 (635nm 컷오프, 오메가 광학)로 구분하고, 전압 신호 700nm longpass 필터 (Thorlabs)와 칼슘 신호 30분의 590 nm의 대역 통과 필터 (오메가 광학)에 의해 필터링됩니다. </li><li> 심지어 조명을 달성하기 위해보기의 필드 매핑을 향해, ​​2 할로겐 램프 (SciMedia, 코스타 메사, CA 뉴 포트 출창 인 스트 루먼트, 스트 랫 포드, CT)의 빛을 가이드를 목표로하고 있습니다. 여기 필터 (40분의 531 NM, SemRock)이 사용됩니다. </li><li> 사출 포트를 통해 전압에 민감한 염료 RH 237 재고 솔루션 (10 ~ 30 μL)로 마음을 얼룩. </li><li> Pluronic F - 127과 함께로드 - 오전 2시 (0.2mL) 재고 솔루션 (Invitrogen, 1시 1분 혼합)를 섞는다. 물 목욕 sonicator에서 1min에 대한 Sonicate. 거품 사냥꾼의 포트를 통해 혼합물을 주입. 로드 - 2의 드 에스테르화이 매핑 시작하기 전에 오전 수 있도록 약 20 분간 기다리십시오. </li><li> 한 기록은 솔루션의 표면에서 움직임을 피하기 위해 superfusion 펌프를 해제하고, 여기 광원 (할로겐 램프)를 설정하고, 데이터 수집 시스템 (울티마 - L, SciMedia)에 연결된 두 카메라를 사용하여 광학 녹음을 ; 여기 조명을 해제 및 superfusion 펌프를 켭니다. 광 신호의 품질을 확인합니다. 조직 필요한 경우를 다시 얼룩. </li><li> 연구 설계 실험 프로토콜의 나머지 부분을 완성. </li><li> 객실 불 켜고 볼 분야를 포함하는 심장의 사진 가져가라. 챔버 밖으로 마음을 가져가라. 모든 솔루션을 드레인. DI 물, 70 % 시약 알코올 (피셔 과학) 및 DI 물의 순서에 재관류 시스템을 씻으십시오. </li><li> 데이터 분석 APD, CV, 칼슘 과도 기간 (Ca​​TD), AP의 상승 운동 고양이의 상승, 과도 칼슘의 상승 시간 및 고양이 부패의 monoexponential 맞지의 지속 시간 사이의 지연 측정을 포함하고 있습니다. </li></ol> 대표 결과 : <img src="/files/ftp_upload/3160/3160fig1.jpg" alt="그림 1"/> 그림 1. 파노라마 광학 매핑 시스템을 사용하여 Langendorff - perfused 토끼 실험의 대표 발생합니다. 3 차원 메쉬 - 격자 표면의 형태로 토끼 심장과 복원 토끼 심장 기하학의 (A) 앞쪽에 볼 수 있습니다. (B) T그는 epicardial 표면을 풀어 색상 코드 tachyarrhythmia의 에피소드 중에 빨간색으로 표시된 파면을 나타내는 위상 (위상 비행기 분석 18 획득)에 의해. (C) 안정 들어가는 부정맥의 사이클 동안 활성화 파면 (붉은 색) 전파 패널 B. (D) 여덟 스냅샷에서 1-5로 표시된 위상 특이점 주변 5 개 지역에서 광 실천 가능성 레코딩. 파면 서클은 심장의 앞쪽에 표면에서 볼 수있는 위상 특이점 주위를 시계 방향으로. repolarization의 색상 (파란색)은 사후 파면 (예, 80ms, 100ms, 120ms에서하고) 볼 수 있도록 부분적으로 투명하게 설정됩니다. 이 들어가는 부정맥의 영화는 보충 비디오 1로 제공됩니다. 지오메 트리 재건, 신호 등록, 위상지도의 계산, 그리고 표면 unwrapping위한 방법은 다른 여섯 자세히 설명되어 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/3160/3160fig2.jpg" alt="그림 2"/> 그림 2. 이중 매핑 시스템 (일시 액션 잠재력과 칼슘을 동시에 매핑)을 사용하여 Langendorff - perfused 토끼 심장 실험에서 대표 발생합니다. 검은 점들의 적용을보기의 매핑 필드와 함께 마음의 (A) 앞쪽에 표면. 하나의 사이트에서 레코딩 (B) 클로즈업 볼 수 있습니다. (C) 샘플 작업 가능성의 흔적 (파란색)과 칼슘 모든 픽셀 녹음이 표시 및 공간적 해상도가 200μm있다는 것을 패널 A. 참고에 검은 점들로 표시 균등하게 게재 위치의 배열에서 (적색) 과도.

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관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

경험을 바탕으로 성공적인 Langendorff - perfused 토끼 심장의 실험을위한 열쇠는 잘 준비 Tyrodes &#39;솔루션의 중심 빠른 수확, 잘 유지 재관류의 압력과 재관류 시스템에서 산소 솔루션의 적절한 산도를 포함합니다. 최고의 신호 대 잡음 비율로 신호를 기록하기 위해, 우리는 광원, 광학 필터, 광학을 집중, photodetectors 등 19를 포함한 요소를 고려해야합니다. 이러한 측면의 세부 사항은 다른 19 설명합니다. 젊은 토끼는 (연령 : 4-5개월, 중량 : 7-9파운드) 광 신호의 잡음 비율로 신호를 감소 epicardial 지방을 방지하는 데 사용할 수 있습니다. 각 픽셀에 의해 기록된 신호는 조직의 볼륨에서 방출되는 빛의 가중치 통합이다. 이 조직 량의 깊이에 사용되는 염료의 여기 및 발광 파장에 따라 달라집니다. DI - 4 - ANEPPS 들어, 예를 들어, 예상 침투 깊이는 토끼 심장 20 300μm이다. 따라서 광 신호의 해석은 전기 함수의 지역 이질이 sinoatrial 노드 방실 노드에 존재하는 경우주의 완료하고, 심실 부정맥 1,21,22 동안해야합니다. 전극 기록에 비해 광학 매핑 기법 중 하나 제한 광학 행동 잠재력의 repolarization 단계가 종종 심장 수축에 의한 움직임의 유물에 의해 distored 때문입니다. 기계 제약은 유물을 줄이기 위해 사용될 수 있지만, 완전히 제거 수 없습니다. 비교에서, 약리 여기 - 수축 uncouplers는 모션 유물을 제거에 효과적입니다. 그러나 이러한 uncouplers (예 : 2,3 - Butanedione Monoxime) 상당한 electrophysiological 부작용이 없습니다. Blebbistatin은 정상적인 심장 23 심장 전기 생리학에 아무런 부정적인 부작용이 없다하는 시연하고, 따라서 광학 매핑을위한 유망한 uncoupler가되었습니다. 그것은 수축의 폐지로 인한 부종의 가속 또한 전기 생리학에 영향을 미칠 수 있다고 지적한다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 피셔 과학, 공정한 잔디, NJ </td><td> S271 - 1 </td></tr><tr><td> CaCl 2 (2 시간 2 O) </td><td> 피셔 과학, 공정한 잔디, NJ </td><td> C79 - 500 </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 피셔 과학, 공정한 잔디, NJ </td><td> S217 - 500 </td></tr><tr><td> MgCl 2 (6H 2 O) </td><td> 피셔 과학, 공정한 잔디, NJ </td><td> M33 - 500 </td></tr><tr><td> 아니 2 PO 4 (H 2 O) </td><td> 피셔 과학, 공정한 잔디, NJ </td><td> S369 - 500 </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> 피셔 과학, 공정한 잔디, NJ </td><td> S233 - 3 </td></tr><tr><td> D - 포도당 </td><td> 피셔 과학, 공정한 잔디, NJ </td><td> D16 - 1 </td></tr><tr><td> Blebbistatin </td><td> Bioscience Tocris, Ellisville, MO </td><td> 1760 </td></tr><tr><td> DI - 4 - ANEPPS </td><td> Invitrogen, Carlsbad, CA </td><td> D1199 </td></tr><tr><td> RH237 </td><td> Invitrogen, Carlsbad, CA </td><td> S1109 </td></tr><tr><td> 로드 - 오전 2시 </td><td> Invitrogen, Carlsbad, CA </td><td> R1244 </td></tr><tr><td> Pluronic F127 </td><td> Invitrogen, Carlsbad, CA </td><td> P3000MP </td></tr><tr><td> 디메틸 sulphoxide (DMSO) </td><td> 시그마, 세인트 루이스, MO </td><td> D2650 </td></tr></tbody></table>

multiparametric optical mapping of the langendorff-perfused rabbit heart

광학 이미징 및 형광 프로브는 다른 접근법 1 성취되지 않았을 수도 방법으로 심장 전기 생리학 분야에서 상당히 고급 연구 방법론 있습니다. 칼슘 및 전압에 민감한 염료를 사용하여, 광학 매핑은 조직과 물리적 접촉없이 높은 공간 해상도를 가진 transmembrane 액션 잠재력과 칼슘 과도 측정 수 있습니다. 이것은 전극의 사용이 불편 또는 1 불가능합니다 많은 조건에서 심장 전기 활동을 측정 할 수 있습니다. 종래의 전극 기술은 전극 분극 1 인한 자극하는 동안 및 이후 자극 유발 유물에서 고통 중에 예를 들어, 광학 녹음은 자극과 defibrillation 동안과 직후 막 잠재력을 정확하게 형태학의 변경 사항을 제공합니다. Langendorff - perfused 토끼 심장은 인간의 심장 생리학과 pathophysiology의 가장 연구 모델 중 하나입니다. 임상 관찰 arrhythmias의 많은 종류의 토끼 심장 모델 recapitulated 수 있습니다. 이것은 마음과 재입국의 파장의 효율적인 크기에 의해 결정 심실 arrhythmias 동안 토끼 심장에 웨이브 패턴이, 사람의 마음 2에서 매우 유사 표시되었다. 그것은 또한 sarcoplasmic reticulum (SR)의 상대적인 기여로, 토끼 myocardium의 결합 여기 - 수축의 중요한 측면 (EC)는 인간 EC 커플링 3 매우 유사 것으로 나타났습되었다. 여기 Langendorff 재관류 시스템 설정, 광학 매핑 시스템 설치, 심장, 재관류 및 심장, 여기 - 수축의 염료 염색법의 고립과 cannulation 포함한 Langendorff - perfused 토끼 마음에 광학 매핑 실험의 기본 절차를 제시 uncoupling, 광학 신호를 수집. 이러한 방법은 또한 유량 조정, 광학, 솔루션 등 토끼가 아닌 다른 종의 심장에 적용 될 수 두 광학 매핑 시스템이 설명되어 있습니다. 파노라마 매핑 시스템은 4-7 토끼 심장의 전체 epicardium를 매핑하는 데 사용됩니다. 이 시스템은 arrhythmogenesis 및 defibrillation 중에 들어가는 회로의 진화 글로벌 전망을 제공하고 arrhythmias 및 antiarrhythmia 치료 8,9의 메커니즘을 연구하는 데 사용되었습니다. 이중 매핑 시스템을 볼 수 10-13의 동일한 분야에서 동시에 (CAT) 과도 작업 잠재력 (AP)와 칼슘을지도하는 데 사용됩니다. 이 방법은 전기 alternans 및 부정맥 14-16의 유도에 칼슘의 중요한 역할에 대한 우리의 이해를 강화하고 있습니다.

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Multiparametric Optical Mapping of the Langendorff-perfused Rabbit Heart

이 문서는 파노라마 영상 시스템을 사용 Langendorff - perfused 토끼 마음에 광학 매핑 실험을 실시하기위한 기본 절차 및 듀얼 (전압과 칼슘) 이미징 양상을 설명합니다.

Langendorff - perfused 토끼 하트의 Multiparametric 광 매핑

Optical imaging and fluorescent probes have significantly advanced research methodology in the field of cardiac electrophysiology in ways that could not ...

multiparametric-optical-mapping-langendorff-perfused-rabbit

Research

JoVE Journal

Bioengineering

22.5K 조회수.  Washington University in St. Louis. 이 문서는 파노라마 영상 시스템을 사용 Langendorff - perfused 토끼 마음에 광학 매핑 실험을 실시하기위한 기본 절차 및 듀얼 (전압과 칼슘) 이미징 양상을 설명합니다.

비디오: Multiparametric Optical Mapping of the Langendorff-perfused Rabbit Heart

Optical Mapping of Action Potentials and Calcium Transients in the Mouse Heart

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. Cardiovascular physiological phenotyping of the mouse heart can be easily done using fluorescence imaging employing various probes for transmembrane potential (Vm), calcium transients (CaT), and other parameters. Excitation-contraction coupling is characterized by action potential and intracellular calcium dynamics; therefore, it is critically important to map both Vm and CaT simultaneously from the same location on the heart1-4. Simultaneous optical mapping from Langendorff perfused mouse hearts has the potential to elucidate mechanisms underlying heart failure, arrhythmias, metabolic disease, and other heart diseases. Visualization of activation, conduction velocity, action potential duration, and other parameters at a myriad of sites cannot be achieved from cellular level investigation but is well solved by optical mapping1,5,6. In this paper we present the instrumentation setup and experimental conditions for simultaneous optical mapping of Vm and CaT in mouse hearts with high spatio-temporal resolution using state-of-the-art CMOS imaging technology. Consistent optical recordings obtained with this method illustrate that simultaneous optical mapping of Langendorff perfused mouse hearts is both feasible and reliable.

This paper details the dissection procedure, instrumental setup, and experimental conditions during optical mapping of transmembrane potential (Vm) and intracellular calcium transient (CaT) in intact isolated Langendorff perfused mouse hearts.

마우스 중심에 액션 후보와 칼슘 과도의 광학 매핑

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. ...

연구

생체공학

High-Resolution Endocardial and Epicardial Optical Mapping in a Sheep Model of Stretch-Induced Atrial Fibrillation

Atrial fibrillation (AF) is a complex cardiac arrhythmia with high morbidity and mortality.1,2 It is the most common sustained cardiac rhythm disturbance seen in clinical practice and its prevalence is expected to increase in the coming years.3 Increased intra-atrial pressure and dilatation have been long recognized to lead to AF,1,4 which highlights the relevance of using animal models and stretch to study AF dynamics. Understanding the mechanisms underlying AF requires visualization of the cardiac electrical waves with high spatial and temporal resolution. While high-temporal resolution can be achieved by conventional electrical mapping traditionally used in human electrophysiological studies, the small number of intra-atrial electrodes that can be used simultaneously limits the spatial resolution and precludes any detailed tracking of the electrical waves during the arrhythmia. The introduction of optical mapping in the early 90's enabled wide-field characterization of fibrillatory activity together with sub-millimeter spatial resolution in animal models5,6 and led to the identification of rapidly spinning electrical wave patterns (rotors) as the sources of the fibrillatory activity that may occur in the ventricles or the atria.7-9 Using combined time- and frequency-domain analyses of optical mapping it is possible to demonstrate discrete sites of high frequency periodic activity during AF, along with frequency gradients between left and right atrium. The region with fastest rotors activates at the highest frequency and drives the overall arrhythmia.10,11 The waves emanating from such rotor interact with either functional or anatomic obstacles in their path, resulting in the phenomenon of fibrillatory conduction.12 Mapping the endocardial surface of the posterior left atrium (PLA) allows the tracking of AF wave dynamics in the region with the highest rotor frequency. Importantly, the PLA is the region where intracavitary catheter-based ablative procedures are most successful terminating AF in patients,13 which underscores the relevance of studying AF dynamics from the interior of the left atrium. Here we describe a sheep model of acute stretch-induced AF, which resembles some of the characteristics of human paroxysmal AF. Epicardial mapping on the left atrium is complemented with endocardial mapping of the PLA using a dual-channel rigid borescope c-mounted to a CCD camera, which represents the most direct approach to visualize the patterns of activation in the most relevant region for AF maintenance.

This report provides a detailed description of the methodology and results of simultaneous endocardial and epicardial optical mapping of electrical excitation in the intact left atrium of a Langendorff-perfused sheep heart during stretch-induced atrial fibrillation.

스트레치 유도 심방세동 세동의 쉽 모델에서 고해상도 Endocardial 및 Epicardial 광학 매핑

 Atrial fibrillation (AF) is a complex cardiac arrhythmia with high morbidity and mortality.1,2 It is the most common sustained cardiac rhythm disturbance ...

의학

Optical Mapping of Langendorff-perfused Rat Hearts

Optical mapping of the cardiac surface with voltage-sensitive fluorescent dyes has become an important tool to investigate electrical excitation in experimental models that range in scale from cell cultures to whole-organs[1, 2]. Using state-of-the-art optical imaging systems, generation and propagation of action potentials during normal cardiac rhythm or throughout initiation and maintenance of arrhythmias can be visualized almost instantly[1]. The latest commercially-available systems can provide information at exceedingly high spatiotemporal resolutions and were based on custom-built equipment initially developed to overcome the obstacles imposed by more conventional electrophysiological methods[1]. Advancements in high-resolution and high-speed complementary metal-oxide-semiconductor (CMOS) cameras and intensely-bright, light-emitting diodes (LEDs) as well as voltage-sensitive dyes, optics, and filters have begun to make electrical signal acquisition practical for cardiovascular cell biologists who are more accustomed to working with microscopes. Although the newest generation of CMOS cameras can acquire 10,000 frames per second on a 16,384 pixel array, depending on the type of sample preparation, long-established fluorescence acquisition technologies such as photodiode arrays, laser scanning systems, and cooled charged-coupled device (CCD) cameras still have some distinct advantages with respect to dynamic range, signal-to-noise ratio, and quantum efficiency[1, 3]. In the present study, Lewis rat hearts were perfused ex vivo with a crystalloid perfusate (Krebs-Henseleit solution) at 37&deg;C on a modified Langendorff apparatus. After a 20 minute stabilization period, the hearts were intermittently perfused with 11 mMol/L 2,3-butanedione monoxime to eliminate contraction-associated motion during image acquisition. For optical mapping, we loaded hearts with the fast-response potentiometric probe di-8-ANEPPS[4] (5 &mu;Mol/L) and briefly illuminated the preparation with 475&plusmn;15 nm excitation light. During a typical 2 second period of illumination, &gt;605 nm light emitted from the cardiac preparation was imaged with a high-speed CMOS camera connected to a horizontal macroscope. For this demonstration, hearts were paced at 300 beats per minute with a coaxial electrode connected to an isolated electrical stimulation unit. Simultaneous bipolar electrographic recordings were acquired and analyzed along with the voltage signals using readily-available software. In this manner, action potentials on the surface of Langendorff-perfused rat hearts can be visualized and registered with electrographic signals.

This article describes a high temporal and spatial resolution technique to optically image action potential movement on the surface of Langendorff-perfused rat hearts using a potentiometric dye (di-8-ANEPPS).

Langendorff - perfused 랫 하트의 광학 매핑

Optical mapping of the cardiac surface with voltage-sensitive fluorescent dyes has become an important tool to investigate electrical excitation in ...

생물학

Intra-cardiac Side-Firing Light Catheter for Monitoring Cellular Metabolism using Transmural Absorbance Spectroscopy of Perfused Mammalian Hearts

Absorbance spectroscopy of cardiac muscle provides non-destructive assessment of cytosolic and mitochondrial oxygenation via myoglobin and cytochrome absorbance respectively. In addition, numerous aspects of the mitochondrial metabolic status such as membrane potential and substrate entry can also be estimated. To perform cardiac wall transmission optical spectroscopy, a commercially available side-firing optical fiber catheter is placed in the left ventricle of the isolated perfused heart as a light source. Light passing through the heart wall is collected with an external optical fiber to perform optical spectroscopy of the heart in near real- time. The transmission approach avoids numerous surface scattering interference occurring in widely used reflection approaches. Changes in transmural absorbance spectra were deconvolved using a library of chromophore reference spectra, providing quantitative measures of all the known cardiac chromophores simultaneously. This spectral deconvolution approach eliminated intrinsic errors that may result from using common dual wavelength methods applied to overlapping absorbance spectra, as well as provided a quantitative evaluation of the goodness of fit. A custom program was designed for data acquisition and analysis, which permitted the investigator to monitor the metabolic state of the preparation during the experiment. These relatively simple additions to the standard heart perfusion system provide a unique insight into the metabolic state of the heart wall in addition to conventional measures of contraction, perfusion, and substrate/oxygen extraction.

Here we introduce a method for using an intra-ventricle optical catheter in perfused hearts to perform absorbance spectroscopy across the heart wall. The data obtained provides robust information on tissue oxygen tension as well as substrate utilization and membrane potential simultaneously with cardiac performance measures in this ubiquitous preparation.

교란 성 포유류 심장의 경부 흡광도 분광학을 사용하여 세포 대사를 모니터링하기위한 심장 내 측 발사 라이트 카테터

Absorbance spectroscopy of cardiac muscle provides non-destructive assessment of cytosolic and mitochondrial oxygenation via myoglobin and cytochrome ...

Electrophysiological Assessment of Murine Atria with High-Resolution Optical Mapping

Recent genome-wide association studies targeting atrial fibrillation (AF) have indicated a strong association between the genotype and electrophysiological phenotype in the atria. That encourages us to utilize a genetically-engineered mouse model to elucidate the mechanism of AF. However, it is difficult to evaluate the electrophysiological properties in murine atria due to their small size. This protocol describes the electrophysiological evaluation of atria using an optical mapping system with a high temporal and spatial resolution in Langendorff perfused murine hearts. The optical mapping system is assembled with dual high-speed complementary metal oxide semiconductor cameras and high magnification objective lenses, to detect the fluorescence of a voltage-sensitive dye and Ca2+ indicator. To focus on the assessment of murine atria, optical mapping is performed with an area of 2 mm &#215; 2 mm or 10 mm x 10 mm, with a 100 &#215; 100 resolution (20 &#181;m/pixel or 100 &#181;m/pixel) and sampling rate of up to 10 kHz (0.1 ms) at maximum. A 1-French size quadripolar electrode pacing catheter is placed into the right atrium through the superior vena cava avoiding any mechanical damage to the atrium, and pacing stimulation is delivered through the catheter. An electrophysiological study is performed with programmed stimulation including constant pacing, burst pacing, and up to triple extrastimuli pacing. Under a spontaneous or pacing rhythm, the optical mapping recorded the action potential duration, activation map, conduction velocity, and Ca2+ transient individually in the right and left atria. In addition, the programmed stimulation also determines the inducibility of atrial tachyarrhythmias. Precise activation mapping is performed to identify the propagation of the excitation in the atrium during an induced atrial tachyarrhythmia. Optical mapping with a specialized setting enables a thorough electrophysiological evaluation of the atrium in murine pathological models.

This protocol describes the electrophysiological evaluation of murine atria utilizing an optical mapping system with a high temporal and spatial resolution, including dual recordings of the membrane voltage and Ca2+ transient under programmed stimulation through a specialized electrode catheter.

고해상도 광학 매핑 Murine Atria electrophysiological 평가

Recent genome-wide association studies targeting atrial fibrillation (AF) have indicated a strong association between the genotype and ...

High-Throughput Analysis of Optical Mapping Data Using ElectroMap

Optical mapping is an established technique for high spatio-temporal resolution study of cardiac electrophysiology in multi-cellular preparations. Here we present, in a step-by-step guide, the use of ElectroMap for analysis, quantification, and mapping of high-resolution voltage and calcium datasets acquired by optical mapping. ElectroMap analysis options cover a wide variety of key electrophysiological parameters, and the graphical user interface allows straightforward modification of pre-processing and parameter definitions, making ElectroMap applicable to a wide range of experimental models. We show how built-in pacing frequency detection and signal segmentation allows high-throughput analysis of entire experimental recordings, acute responses, and single beat-to-beat variability. Additionally, ElectroMap incorporates automated multi-beat averaging to improve signal quality of noisy datasets, and here we demonstrate how this feature can help elucidate electrophysiological changes that might otherwise go undetected when using single beat analysis. Custom modules are included within the software for detailed investigation of conduction, single file analysis, and alternans, as demonstrated here. This software platform can be used to enable and accelerate the processing, analysis, and mapping of complex cardiac electrophysiology.

This protocol describes the setup and use of ElectroMap, a MATLAB-based open-source software platform for analysis of cardiac optical mapping data. ElectroMap provides a versatile high-throughput tool for analysis of optical mapping voltage and calcium datasets across a wide range of cardiac experimental models.

ElectroMap을 사용한 광학 매핑 데이터의 높은 처리량 분석

Optical mapping is an established technique for high spatio-temporal resolution study of cardiac electrophysiology in multi-cellular preparations. Here we ...

Optocardiography and Electrophysiology Studies of Ex Vivo Langendorff-perfused Hearts

Small animal models are most commonly used in cardiovascular research due to the availability of genetically modified species and lower cost compared to larger animals. Yet, larger mammals are better suited for translational research questions related to normal cardiac physiology, pathophysiology, and preclinical testing of therapeutic agents. To overcome the technical barriers associated with employing a larger animal model in cardiac research, we describe an approach to measure physiological parameters in an isolated, Langendorff-perfused piglet heart. This approach combines two powerful experimental tools to evaluate the state of the heart: electrophysiology (EP) study and simultaneous optical mapping of transmembrane voltage and intracellular calcium using parameter sensitive dyes (RH237, Rhod2-AM). The described methodologies are well suited for translational studies investigating the cardiac conduction system, alterations in action potential morphology, calcium handling, excitation-contraction coupling and the incidence of cardiac alternans or arrhythmias.

The objective of this study was to establish a method for investigating cardiac dynamics using a translational animal model. The described experimental approach incorporates dual-emission optocardiography in conjunction with an electrophysiological study to assess electrical activity in an isolated, intact porcine heart model.

전 비보 랑엔도르프-퍼블릭 하트의 검문 및 전기생리학 연구

Small animal models are most commonly used in cardiovascular research due to the availability of genetically modified species and lower cost compared to ...

Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart

Sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ handling plays a key role in normal excitation-contraction coupling and aberrant SR Ca2+ handling is known to play a significant role in certain types of arrhythmia. Because arrhythmias are spatially distinct, emergent phenomena, they must be investigated at the tissue level. However, methods for directly probing SR Ca2+ in the intact heart remain limited. This article describes the protocol for dual optical mapping of transmembrane potential (Vm) and free intra-SR [Ca2+] ([Ca2+]SR) in the Langendorff-perfused rabbit heart. This approach takes advantage of the low-affinity Ca2+ indicator Fluo-5N, which has minimal fluorescence in the cytosol where intracellular [Ca2+] ([Ca2+]i) is relatively low but exhibits significant fluorescence in the SR lumen where [Ca2+]SR is in the millimolar range. In addition to revealing SR Ca2+ characteristics spatially across the epicardial surface of the heart, this approach has the distinct advantage of simultaneous monitoring of Vm, allowing for investigations into the bidirectional relationship between Vm and SR Ca2+ and the role of SR Ca2+ in arrhythmogenic phenomena.

Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart

This article describes the detailed protocol and equipment necessary for dual optical mapping of transmembrane potential (Vm) and free intra-sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ in the Langendorff-perfused rabbit heart. This method allows for direct observation and quantification of Vm and SR Ca2+ dynamics in the intact heart.

인트라 근질 그물 자리 칼슘의 광학 매핑<sup&gt; 2 +</sup&gt;와 랑겐 돌프 - 관류 토끼 심장에 막 횡단 잠재력

Sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ handling plays a key role in normal excitation-contraction coupling and aberrant SR Ca2+ handling is known to play a ...

High-resolution Optical Mapping of the Mouse Sino-atrial Node

Sino-atrial node (SAN) dysfunctions and associated complications constitute important causes of morbidity in patients with cardiac diseases. The development of novel pharmacological therapies to cure these patients relies on the thorough understanding of both normal physiology and pathophysiology of the SAN. Among the studies of cardiac pacemaking, the mouse SAN is widely used due to its feasibility for modifications in the expression of different genes that encode SAN ion channels or calcium handling proteins. Emerging evidence from electrophysiological and histological studies has also proved the representativeness and similarity of the mouse SAN structure and functions to larger mammals, including the presence of specialized conduction pathways from the SAN to the atrium and a complex pacemakers' hierarchy within the SAN. Recently, the technique of optical mapping has greatly facilitated the exploration and investigation of the origin of excitation and conduction within and from the mouse SAN, which in turn has extended the understanding of the SAN and benefited clinical treatments of SAN dysfunction associated diseases. In this manuscript, we have described in detail how to perform the optical mapping of the mouse SAN from the intact, Langendorff-perfused heart and from the isolated atrial preparation. This protocol is a useful tool to enhance the understanding of mouse SAN physiology and pathophysiology.

Here, we present a protocol for optical mapping of electrical activity from the mouse right atrium and especially the sino-atrial node, at a high spatial and temporal resolution.

마우스 중국 - 심방 노드의 고해상도 광학 매핑

Sino-atrial node (SAN) dysfunctions and associated complications constitute important causes of morbidity in patients with cardiac diseases. The ...

Dual-Dye Optical Mapping of Hearts from RyR2R2474S Knock-In Mice of Catecholaminergic Polymorphic Ventricular Tachycardia

The pro-arrhythmic cardiac disorder catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia (CPVT) manifests as polymorphic ventricular tachycardia episodes following physical activity, stress, or catecholamine challenge, which can deteriorate into potentially fatal ventricular fibrillation. The mouse heart is a widespread species for modeling inherited cardiac arrhythmic diseases, including CPVT. Simultaneous optical mapping of transmembrane potential (Vm) and calcium transients (CaT) from Langendorff-perfused mouse hearts has the potential to elucidate mechanisms underlying arrhythmogenesis. Compared with the cellular level investigation, the optical mapping technique can test some electrophysiological parameters, such as the determination of activation, conduction velocity, action potential duration, and CaT duration. This paper presents the instrumentation setup and experimental procedure for high-throughput optical mapping of CaT and Vm in murine wild-type and heterozygous RyR2-R2474S/+ hearts, combined with programmed electrical pacing before and during the isoproterenol challenge. This approach has demonstrated a feasible and reliable method for mechanistically studying CPVT disease in an ex vivo mouse heart preparation.

Dual-Dye Optical Mapping of Hearts from RyR2R2474S Knock-In Mice of Catecholaminergic Polymorphic Ventricular Tachycardia

This protocol introduces dual-dye optical mapping of mouse hearts obtained from wild-type and knock-in animals affected by catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia, including electrophysiological measurements of transmembrane voltage and intracellular Ca2+ transients with high temporal and spatial resolution.

Catecholaminergic Polymorphic Ventricular Tachycardia의 RyR2R2474S Knock-In 마우스의 심장에 대한 이중 염료 광학 매핑

The pro-arrhythmic cardiac disorder catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia (CPVT) manifests as polymorphic ventricular tachycardia episodes ...

Langendorff - perfused 토끼 하트의 Multiparametric 광 매핑

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