이 작품에 의해 국립 연구소의 일반 의료 과학의 보너스 번호 R35GM124868에서 건강의 국가 학회 및 듀크 대학에 의해 지원 되었다.

1. 레이아웃 및 정렬 설정
<ol>
	<li>설치 및 추적 여기의 준 레이저<ol>
		<li>집에서 만든 마운트를 사용 하 여 광학 테이블에 레이저 부착 마운트는 간단한 알루미늄 플레이트 설치 구멍을 이용한 레이저 머리와 광학 테이블입니다. 레이저는 안정성과 열 분산 금속 마운트에 단단히 부착 한다. 이 작품에 대 한 파장 맞게 특정 fluorophore 또는 실험에 선정 될 수 있다 488 nm 고체 레이저 조명 (그림 1)에 대 한 사용 합니다. 중요 한 요소는 레이저 파장 맞는 두 deflectors 사이 파 격판덮개에 의해 주로 결정 되는 2D EOD 작업 범위 (그림 1: W2). 488 nm 레이저는 녹색 또는 노란 형광 성 단백질 (GFP/YFP), 라이브 세포 실험에서 일반적인 형광 태그는 자극 효과적으로 수 있습니다.</li>
		<li>레이저 빔 높이 및 유 전체 거울의 쌍을 사용 하 여 방향을 조정 (그림 1: M). 레이저 빔 병렬 광학 테이블에 있는지 확인 하 고 적당 한 높이로 조정. 참고: 높이 선택 되어야 한다 현미경 플랫폼에 따라. 그것은 명시적으로 명시 되지 것입니다 하지만이 높이이 프로토콜에 사용 되는 모든 후속 거울에 대 한 유지 되어야 한다.</li>
		<li>렌즈의 쌍을 가진 빔 당기기 (그림 1: l 1과 L2). 렌즈의 초점 길이 2D EOD의 조리개에 의해 잘린 되 고 레이저 자리를 피하기 위해 신중 하 게 선택 되어야 한다. 클리핑 2D EOD 통과 후 레이저 빔 모양에 있는 변화에 의해 분명 하다. 여기에 준의 품질 차 후속 렌즈에 의해 증폭 될 것 이다 하 고 모든 분기 2D EOD 편향의 성능이 저하 됩니다 때문에 아주 중요 하다. 이상적으로, 적어도 20 m 거리 지점에 광속을 집중 하 여 광속을 당기기.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>장소는 작은 구멍 (그림 1: PH)의 첫 번째 준 렌즈의 초점에 적절 한 크기 (그림 1: L1).<ol>
		<li>적절 한 크기의 작은 구멍을 선택 하십시오. 작은 구멍 크기는 다음 계산에 따라 선택 될 수 있다: 
		<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56711/56711eq1.jpg"> 여기서 λ 는 레이저의 파장 f 첫 번째 렌즈의 초점 거리 이며 D 는 입력된 광속 직경.</li>
		<li>첫 번째 준 렌즈의 초점에 정확 하 게 배치 될 수 있도록 3 차원 번역 단계에 pinhole을 탑재 합니다.</li>
		<li>핀 홀의 위치를 조정 합니다. Pinhole 후 레이저 파워 미터를 놓고 전원 미터 판독을 최대화 하기 위해 XYZ에 핀 홀 위치를 조정 합니다. 회절 반지 관찰 2D EOD 앞 창포와 차단.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Glan 톰슨 편광판의 설치<ol>
		<li>Glan 톰슨 편광판을 넣어 (그림 1: GP) 후 두 번째 준 렌즈 (그림 1: L2) 레이저 광선의 편광을 청소. 최대 전송 전력 측정기와 함께 찾을 수 편광판을 회전 합니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>EODs의 설치<ol>
		<li>2 EODs를 사용 하 여 (그림 1: EOD1 &#38; EOD2) X, Y 방향에서 레이저를 빗 나가게 하. 침로 벗어남, 피치 및 각 EOD의 높이 조정 하 여 레이저 전송을 극대화 합니다.</li>
		<li>각 편향 측면에 제조업체에서 제공 하는 맞춤 마커를 사용 하 여 서로 관하여 2 개의 EODs를 맞춥니다.</li>
		<li>2D-EOD의 컨트롤러는 EOD의 출력 검사에 테스트 패턴을 적용 합니다. 이 수는 나이트 투어 (그림 2) 아래에 설명 된 FPGA 또는 간단한 사인 파동 함수 발생기에 의해 제공을 통해 있습니다. 최상의 성능을 위해 각 편향에 의해 편향 피 nanopositioner의 X 또는 Y 방향에 평행 해야 합니다. 이 방향에 대 한 전송 축 deflectors의 각도 방향으로 결정 됩니다. 2D EOD를 이동 하지 않고 편향 방향 회전, 압 전 nanopositioner 축에 편향 축 정렬 2D EOD 후 비둘기 프리즘을 배치 합니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>반 파 판의 설치<ol>
		<li>하프 웨이브 접시를 놓습니다 (그림 1: W1) Glan 톰슨 편광판 사이 (그림 1: GP) 들어오는 레이저 정렬 2D EOD 2D EOD의 편향 축과 편광 빔과. 2D EOD 후 긴 초점 렌즈 (300mm)를 놓고 레이저 포커스에서 sCMOS 카메라를 배치 합니다. 다음으로, 생성 (그림 2) 아래에 설명 된 나이트의 투어를 2D EOD를 켭니다. 하프 웨이브 접시를 돌려 하 여 균등 하 게 평방 레이저 분포는 카메라에 관찰.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>렌즈 한 쌍 및 릴레이 렌즈 쌍을 늘리지 빔 설치<ol>
		<li>렌즈의 쌍을 배치 (그림 1: L3 및 L4) 대물 렌즈의 후면 조리개를 채우기 위해 빔 확장 2D EOD 후 (그림 1: OL)와 렌즈의 다른 쌍 (그림 1: L5, L6)를 현미경 목표에 초점면 릴레이. 반드시 태그 렌즈 나중 단계에서 그들 사이 설치 될 것 이다 렌즈의 두 쌍이 사이 충분 한 공간을 두어야 합니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dichroic 필터, 렌즈, APD, 렌즈, 그리고 형광 방출 필터 검색 경로 완료 하는 데 초점을 맞추고 10/90 빔 스플리터를 설치 합니다.<ol>
		<li>색 성 필터를 설치 (그림 1: DC) 대물 렌즈 쪽으로 레이저를 반영 하기 위해. 긴 렌즈 튜브의 위아래에 두 홍 채를 사용 하 여 대물 렌즈의 센터를 통해 바로 서 레이저를 맞춥니다.</li>
		<li>10/90 빔 스플리터를 설치 (그림 1: BS) 이미징 sCMOS 카메라 (아래 설명 참조)와 추적 APD 통과의 90%에 의해 빛의 10%를 반영 하 여.</li>
		<li>APD를 맞춥니다. 대물 렌즈에 의해 한 coverslip에 레이저 초점. 객관적인 초점에는 coverslip 퍼 팅 APD 판독의 강도 확인 하 여 모든 다운스트림 요소를 정렬 하는 coverslip에서 반사를 사용 합니다. 빔 스플리터 설치 APD 초점 렌즈 (그림 1: L7)는 APD 3D 번역 단계에서 다음. 목표에서 레이저 반사 렌즈의 중심을 통과 하는 렌즈를 배치 합니다.</li></ol></li></ol>APD 위치는 coverslip에 레이저 반사에서 강도 극대화 하기 위해 3D 위치를 조정 하 여 최적화할 수 있습니다. 어떤 방향에서 검출기 위치 이동 강도 때 APD 위치 최적의 위치입니다.
		<li>Longpass 형광 방출 필터를 설치 (그림 1: F) 반영 하 고 흩어져 빛을 제거 하 빔 스플리터 전에.</li>
	
	
	<li>태그 렌즈의 설치<ol>
		<li>렌즈 두 쌍 사이의 태그 렌즈를 놓습니다 ( 그림 1사이: L4 및 L5)로 전에 언급 하 고 그림 1에 표시 된. 빔이 수직 센터의 태그 렌즈를 통해 전달 되도록 요, 피치, 높이 및 가로 위치를 조정 합니다.</li>
	</ol>
	</li>

2. 샘플 준비입니다.
<ol>
	<li>고정된 입자 준비<ol>
		<li>희석을 190 nm 형광 구슬 ~ 5 × 108 구슬/mL PBS에. 압 전 단계의 샘플 홀더에 coverslip 마운트에 400 µ L 비즈 솔루션 추가 (구슬의 볼륨 샘플 소유자에 따라 달라 집니다; 그리고 여기에 사용 되는 샘플 홀더 챔버의 직경은 18 m m). 여기에 사용 되는 구슬, PBS 입자는 coverslip에 입금 하면.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>무료 이동 입자 준비<ol>
		<li>110 nm 형광 구슬 희석 ~ 5 × 108 구슬/mL 디 물. coverslip에 400 µ L 비즈 솔루션을 추가 하 고 압 전 단계의 샘플 홀더에 탑재.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 최적화 추적 매개 변수
<ol>
	<li>래스터 스캔 고정된 입자<ol>
		<li>고정된 입자 샘플을 현미경 위에.</li>
		<li>레이저, micropositioner 컨트롤러, 압 전 nanopositioner 컨트롤러, 태그 렌즈 컨트롤러 및 EOD 컨트롤러를 켭니다. 참고 순서가 중요 하지 않습니다. 폐쇄 루프에서 압 전 nanopositioner를 실행 합니다.</li>
		<li>래스터 스캔 사용자 지정 스캔 소프트웨어 프로그램 (그림 S3, 소프트웨어 저자에서 요청 시 제공), 2D EOD는 나이트 투어 (그림 2)에서 APD에서 카운트를 수집는 피에 조 드라이브를 사용 하 여 XYZ에 샘플 nanopositioner, 위치 계산 (그림 S2)를 수행 합니다. 단계 크기는 40 nm와 검사 범위는 2 µ m.<ol>
			<li>목표의 초점에는 coverslip를, 형광 방출 필터를 제거 하 고는 micropositioner의 Z 위치의 기능으로 신호 강도 극대화 하는 coverslip에서 레이저의 반사를 사용 합니다. 초점면에서 샘플을 배치 후 형광 방출 필터 다시 배치 합니다.</li>
			<li>스캔 프로그램을 엽니다. '시작', '마침', 그리고 '단계'에 숫자를 입력 하 여 검색 범위와 스텝 크기를 설정 합니다. 먼저 큰 검사 범위 및 (예를 들어, 10 x 10 µ m 범위 200 nm 스텝 크기) 입자를 찾으려고 단계 크기를 설정 합니다. 입자를 찾는 후에 검색 범위를 축소 하 고 단계 크기 (예를 들어, 2 x 2 µ m 범위 100 nm 스텝 크기). 형광 초점을 찾아 3D 래스터 스캔을 수행 하는 '스캔' 버튼을 클릭 합니다.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>태그 렌즈 설정 ( 그림 3참조)<ol>
		<li>태그 렌즈 제어 소프트웨어를 클릭 하십시오. 클릭 '연결', '전원' 순차적으로 합니다.</li>
		<li>트리거 신호 출력 단계를 변경 하려면 출력 트리거 모드를 바꿀 필요가 있다. 먼저 'Multiplane'을 'RGB'에서 모드 변경 하 고 다시 그것을 변경 합니다. 이제는 단계 수 변경 (그림 3b).</li>
		<li>0 °, 90 °, 270 ° 되도록 출력 단계를 설정 합니다. 이 세 가지 경험적으로 잘 작동을 발견 하는 위상 공간을 포함 하는 모든 세 단계를 사용할 수 있지만 (그림 3c).</li>
		<li>68,500 Hz 주파수 설정을 선택 합니다.</li>
		<li>최적의 주파수를 찾을 그것은 종종 주파수 검색 범위를 변경 하는 데 필요한입니다. '고급', '설정'을 클릭 합니다. 변화는 ' 최대. Freq(Hz)' 71,500 hz 70000 Hz에서 열 0의. 이 어떤 주파수 범위는 적절 하 게 조정할 수 있습니다. 클릭 '저장 교정', '종료 교정' (그림 3).</li>
		<li>새로운 교정 유효화 하려면 다른 주파수 (예, 189,150 Hz)에 공명을 전환 하 고 다음 68,500 Hz 주파수 설정 (그림 3e)로 다시 전환.</li>
		<li>35% 진폭을 점진적으로 변경 합니다. '공명 잠금'을 클릭 합니다. 주파수 고정 후 ' 공명 잠금 해제 ' (그림 3e)를 클릭 합니다. 태그 렌즈 지금 사용 준비가 되어 있습니다.</li>
		<li>보정, 있도록 예상된 위치 실제 위치에 동일한 그림 4e와 같이 추정에 사용 되는 매개 변수를 변경, f. 입력 x, y의 스캐닝 범위와 z 클릭 '스캔' 버튼 이동 XYZ에 샘플을 검사 하는 움직이는 레이저 자리를 통해 입자입니다. 입자의 위치 레이저 초점을 통해 검색으로 위치 추정 루프 (그림 S1)에 의해 결정 예상된 입자 위치와 동의 해야 합니다. 예상된 위치 이미지 (그림 4 층)에서 예상된 위치와 실제 위치 (그림 4 d) 사이의 관계를 추출할 수 있습니다. 위치, 동의 하지 않는 경우 위치 추정 루프 (그림 S1)에 사용 되는 레이저 위치 (ck)의 값을 조정 합니다.</li>
		<li>정렬 태그 렌즈<ol>
			<li>태그 렌즈 컨트롤러 해제 되어 때는 래스터 스캔 촬영 태그 렌즈를 설치 하기 전에 설치 태그 렌즈 동일 보여야 후 입자 이미지 (아래 설명 참조). 다음, 형광 입자 Z 스택 위치 및 태그 렌즈 (그림 4)의 각도 조정 하 z nanopositioner와 함께 목표를 이동 하 여 검색을 수행 합니다. 있을 때까지 아무 드리프트 입자 이미지에 Z 위치 (그림 4 d)의 함수로 입자의 XY 위치에서 변경 하는 경우 Z 방향에 따라 XY 평면에 태그 렌즈의 위치를 조정 합니다. 추적 시스템은 태그 렌즈의 정렬 후 사용할 준비가.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>입자 모니터링을 위한 sCMOS 카메라의 설치<ol>
		<li>그들은 추적 되는 동안 입자를 시각화 하는 sCMOS 카메라를 설치 합니다. 추적 시스템의 모든 구성 설치 하 고 최적화 된 후에 sCMOS를 설치 합니다.</li></ol></li></ol>현미경에 고정된 형광 입자 샘플을 로드 하 고 객관적인 초점 볼륨에서 1 개 입자를 잠그려면 추적 프로그램을 실행 합니다. 그런 다음 100 m m 초점 거리 렌즈를 설치 (그림 1: L8) 및 sCMOS. 입자의 이미지는 작고 밝은 자리에 초점을 맞추고 sCMOS 위치를 조정 합니다.
	
	

4. 3D 추적 자유롭게 확산 하는 나노 입자의
<ol>
	<li>넣어 110 nm 무료 현미경에 입자 샘플을 이동합니다.</li>
	<li>레이저, 마이크로-포지 셔 너 컨트롤러, 압 전 nanopositioner 컨트롤러, 태그 렌즈 컨트롤러 및 EOD 컨트롤러를 켭니다. 오픈 루프에서 압 전 nanopositioner를 실행 합니다. 3.2 단계에 따라 태그 렌즈 소프트웨어를 설정 합니다.</li>
	<li>열고 추적 소프트웨어 (저자에서 요청 시 사용 가능)를 실행 합니다. 섹션 3에 최적화 된 값으로 위치 추정 매개 변수를 설정 합니다.</li>
	<li>목표의 초점에는 coverslip를, 형광 방출 필터를 제거 하 고는 micropositioner의 Z 위치의 기능으로 신호 강도 극대화 하는 coverslip에서 레이저의 반사를 사용 합니다. coverslip 찾는 후 레이저는 coverslip 그리고 솔루션에 초점을 초점 위치 15 µ m 증가. 장소 다시 형광 방출 필터.</li>
	<li>통합 컨트롤 상수를 설정 합니다. 낮은 값에서 시작 하 고 진동 입자의 위치 정보에서 볼 수 있습니다 때까지 천천히 증가 통합 컨트롤 상수를 설정할 수 있습니다. 진동 관찰 되 면 진동 발생 값의 80%를 통합 제어 상수를 설정 합니다. 전형적인 값 XY '통합 이득'에 대 한 0.012 0.004 Z '통합 이득'에 대 한 주위에 있을 것입니다.</li>
	<li>' 트랙 임계값 '와 ' 트랙 최소 ' 추적 임계값을 설정 하 고 '검색' 및 ' 자동 트랙 '을 클릭 하 여 추적 실험을 시작 합니다. 종료 추적에 대 한 임계값은 백그라운드 수준 보다 약간 높은 설정 하 고 추적 트리거 임계값은 배경 보다 약 2 배 높은. 여기, 트리거링 추적에 대 한 임계값은 3 kHz 고 궤적을 종료에 대 한 임계값은 1.5 kHz.</li>
</ol>

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<li>McHale, K., Mabuchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intramolecular+Fluorescence+Correlation+Spectroscopy+in+a+Feedback+Tracking+Microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Intramolecular Fluorescence Correlation Spectroscopy in a Feedback Tracking Microscope.</a> Biophys. J. 99 (1), 313-322 (2010).</li>
<li>McHale, K., Mabuchi, H. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ja906979j">Precise Characterization of the Conformation Fluctuations of Freely Diffusing DNA: Beyond Rouse and Zimm.</a> J. Am. Chem. Soc. 131 (49), 17901-17907 (2009).</li>
<li>McHale, K., Berglund, A. J., Mabuchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantum+Dot+Photon+Statistics+Measured+by+Three-Dimensional+Particle+Tracking%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Quantum Dot Photon Statistics Measured by Three-Dimensional Particle Tracking.</a> Nano Lett. 7 (11), 3535-3539 (2007).</li>
<li>Juette, M. F., Bewersdorf, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-Dimensional+Tracking+of+Single+Fluorescent+Particles+with+Submillisecond+Temporal+Resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Three-Dimensional Tracking of Single Fluorescent Particles with Submillisecond Temporal Resolution.</a> Nano Lett. 10 (11), 4657-4663 (2010).</li>
<li>Katayama, Y., Burkacky, O., Meyer, M., Bräuchle, C., Gratton, E., Lamb, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-Time+Nanomicroscopy+via+Three-Dimensional+Single-Particle+Tracking%5BTitle%5D)+AND+%22ChemPhysChem%22%5BJournal%5D)">Real-Time Nanomicroscopy via Three-Dimensional Single-Particle Tracking.</a> ChemPhysChem. 10 (14), 2458-2464 (2009).</li>
<li>Perillo, E. P., Liu, Y. -L., Huynh, K., Liu, C., Chou, C. -K., Hung, M. -C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+and+high-resolution+three-dimensional+tracking+of+single+particles+using+nonlinear+and+multiplexed+illumination%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Deep and high-resolution three-dimensional tracking of single particles using nonlinear and multiplexed illumination.</a> Nat Commun. 6, (2015).</li>
<li>Hou, S., Lang, X., Welsher, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+real-time+3D+single-particle+tracking+using+a+dynamically+moving+laser+spot%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Lett%22%5BJournal%5D)">Robust real-time 3D single-particle tracking using a dynamically moving laser spot.</a> Opt. Lett. 42 (12), 2390-2393 (2017).</li>
<li>Chenouard, N., Smal, I., de Chaumont, F., Maska, M., Sbalzarini, I. F., Gong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Objective+comparison+of+particle+tracking+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">Objective comparison of particle tracking methods.</a> Nat Meth. 11 (3), 281-289 (2014).</li>
<li>Shechtman, Y., Weiss, L. E., Backer, A. S., Sahl, S. J., Moerner, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+3D+scan-free+multiple-particle+tracking+over+large+axial+ranges+with+Tetrapod+point+spread+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Precise 3D scan-free multiple-particle tracking over large axial ranges with Tetrapod point spread functions.</a> Nano Lett. 15 (6), 4194-4199 (2015).</li>
<li>Lee, H. -lD., Sahl, S. J., Lew, M. D., Moerner, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+double-helix+microscope+super-resolves+extended+biological+structures+by+localizing+single+blinking+molecules+in+three+dimensions+with+nanoscale+precision%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Phys.+Lett%22%5BJournal%5D)">The double-helix microscope super-resolves extended biological structures by localizing single blinking molecules in three dimensions with nanoscale precision.</a> Appl. Phys. Lett. 100 (15), 153701(2012).</li>
<li>Pavani, S. R. P., Thompson, M. A., Biteen, J. S., Lord, S. J., Liu, N., Twieg, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional%2C+single-molecule+fluorescence+imaging+beyond+the+diffraction+limit+by+using+a+double-helix+point+spread+function%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional, single-molecule fluorescence imaging beyond the diffraction limit by using a double-helix point spread function.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (9), 2995-2999 (2009).</li>
<li>Sancataldo, G., Scipioni, L., Ravasenga, T., Lanzanò, L., Diaspro, A., Barberis, A., et al. <a target="_blank" href="https://www.osapublishing.org/optica/abstract.cfm?uri=optica-4-3-367">Three-dimensional multiple-particle tracking with nanometric precision over tunable axial ranges.</a> Optica. 4 (3), 367-373 (2017).</li>
<li>Balzarotti, F., Eilers, Y., Gwosch, K. C., Gynnå, A. H., Westphal, V., Stefani, F. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanometer+resolution+imaging+and+tracking+of+fluorescent+molecules+with+minimal+photon+fluxes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Nanometer resolution imaging and tracking of fluorescent molecules with minimal photon fluxes.</a> Science. 355 (6325), 606(2017).</li>
<li>Duocastella, M., Theriault, C., Arnold, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+particle+tracking+via+tunable+color-encoded+multiplexing%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Lett%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional particle tracking via tunable color-encoded multiplexing.</a> Opt. Lett. 41 (5), 863-866 (2016).</li>
<li>Duocastella, M., Sun, B., Arnold, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+imaging+of+multiple+focal+planes+for+three-dimensional+microscopy+using+ultra-high-speed+adaptive+optics%5BTitle%5D)+AND+%22BIOMEDO%22%5BJournal%5D)">Simultaneous imaging of multiple focal planes for three-dimensional microscopy using ultra-high-speed adaptive optics.</a> BIOMEDO. 17 (5), (2012).</li>
<li>Mermillod-Blondin, A., McLeod, E., Arnold, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-speed+varifocal+imaging+with+a+tunable+acoustic+gradient+index+of+refraction+lens%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Lett%22%5BJournal%5D)">High-speed varifocal imaging with a tunable acoustic gradient index of refraction lens.</a> Opt. Lett. 33 (18), 2146-2148 (2008).</li>
<li>Wang, Q., Moerner, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+strategy+for+trapping+single+fluorescent+molecules+in+solution+using+the+ABEL+trap%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Phys.+B%22%5BJournal%5D)">Optimal strategy for trapping single fluorescent molecules in solution using the ABEL trap.</a> Appl. Phys. B. 99 (1), 23-30 (2010).</li>
<li>Fields, A. P., Cohen, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+tracking+of+a+Brownian+particle%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Express%22%5BJournal%5D)">Optimal tracking of a Brownian particle.</a> Opt. Express. 20 (20), 22585-22601 (2012).</li>
<li>Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+Nanometer+Localization+Analysis+for+Individual+Fluorescent+Probes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Precise Nanometer Localization Analysis for Individual Fluorescent Probes.</a> Biophys. J. 82 (5), 2775-2783 (2002).</li>
</ol>

저자 아무 경쟁 금융 관심사를 선언합니다.

비록 최근 몇 년 동안에서 3D 단일 입자 추적 방법의 많은 품종 등장, 간단한 설치를 사용 하 여 낮은 광자 수 속도로 고속 3D 확산의 강력한 실시간 추적은 여전히 중요 한 생물학의 응용을 제한 하는 도전 문제입니다. 3D DyPLoT 메서드를 사용 하면 이러한 문제는 여러 가지 방법으로이 프로토콜 주소에서 설명합니다. 첫째, 여기 및 탐지 경로 간단 하 고 강력한 정렬을 만드는 다른 구현에 비해 크게 ?...

고급 이미징 기술의 출현 분자 수준 내려가면서 세포 현상의 더 상세한 구조를 보고 창을 열었습니다. 확률적 광학 재건 현미경 (스톰)1,2,3, 사진 활성화 지역화 현미경 (손바닥),45,6,7 같은 방법 , 구조화 조명 현미경 (SIM)8,,910,11및 자극 방출 소모 현미경 (호텔 위치)12,13, 14 까지 구조와 살아있는 세포의 기능으로 전례 없는 세부 정보를 제공 하는 회절 한계 저쪽에 갔을. 그러나, 전체 이해 어떻게 이러한 시스템의 동작 구조 정보 뿐 아니라 동적 정보 필요 합니다. 위에 나열 된 슈퍼 해상도 방법 포함 절충 한 공간 해상도 시간적 해상도, 제한 시간 정밀도는 동적 프로세스를 탐색할 수 있습니다. 고정밀 공간 및 시간적 해상도 RT-3D-SPT15,,1617,18,19,20, 제공 하는 방법 21,22,23,24,25,26,27,,2829. 여기, 우리는 구별을 그릴 전통적인 3D-SPT30 RT-3D-SPT. 전통 사이 3D SPT 하려면 (이 중 confocal 현미경 또는 epifluorescence 현미경을 사용 하 여 얻을 수 있다 3 차원 이미지 데이터의 시간 시리즈 오른쪽 구성 제공). 전통적인 3D-SPT에서 입자의 좌표는 궤적을 만들 각 이미지 스택에 입자를 찾아서 연속 볼륨에 위치를 연결 하 여 데이터 수집 후 결정 됩니다. 이러한 방법에 대 한 궁극적인 시간적 해상도 체적 이미징 속도 의해 결정 됩니다. Confocal 현미경, 이것은 쉽게 수십 초 초 규모 에입니다. 어떤 점에서 광학 경로 조작 축 위치 정보를 추출할 수 있도록 하는 epifluorescence 방법에 대 한 시간적 해상도 카메라 노출 또는 판독 시간에 의해 제한 됩니다. 이 epifluorescent 메서드는 축 정보를 수집할 수 있습니다 범위에서 제한 됩니다, 그리고 디자인 및 적응 광학이이 범위 10 µ m 또는 더 많은31,32 연장 비록 푸리에 비행기 단계에서 최근 진행 마스크 , 33 , 34.
반면, 실시간 3D SPT 3D 이미지 스택 취득 하 고 사후에 입자를 찾는에 의존 하지 않습니다. 대신, 실시간 위치 정보는 단일 포인트 감지기를 통해 추출 되 고 피드백 적용에 효과적으로 고속 압 전 단계에 사용 하는 렌즈의 초점에 입자를 "잠금". 입자의 위치 제한의 연속 측정을 얼마나 많은 광자를 수집할 수 있습니다 의해서만 수 있습니다. 또한,이 메서드는 긴 범위 이동할 때 입자의 스펙트럼 심문 수 있습니다. RT-3D-SPT 적용 작품 nanoscale 개체, 어떤 점에서 입자는 지속적으로 조사 하 고 큰 레이저 파워에 대 한 필요 없이 실시간 또는 광학 측정에 대 한 힘 없는 광학 트랩에 가깝다 강요 합니다. 그 RT-3D-SPT 낮은 광자 수 요금20,29, 3 차원에 빨리 퍼지는 개체 (최대 20 µ m2/s)25,29 의 연속 심문을 위해는 수단을 제공 합니다. 35, 그것은 세포내 화물 수송, 리간드-수용 체 바인딩 및 단일 virions의 extracellular 역학 등 빠르거나 과도 생물 학적 과정으로 창을 제공 해야 합니다. 그러나,이 시점에, RT-3D-SPT의 응용 프로그램 제한 되었습니다이 기술을 사전에 작업 그룹의 소수.
한 변화는 실시간 3D SPT 메서드에서 필요한 광학 레이아웃의 복잡성입니다. 대부분의 방법에 대 한 광 피드백 압 전 단계에 의해 제공 됩니다. 입자 게 작은 움직임을 X, Y, 또는 Z, 단일 포인트 감지기에서 정보는 오류 함수 변환에 먹이로 압 전 nanopositioner에 고속에 차례 이동 입자의 모션을 효과적으로 중화 샘플 목표 렌즈 기준으로 장소에 그것을 잠금. X에 작은 위치 움직임을 측정 하기 위해 Y, 그리고 Z, 여러 감지기 (4 또는 5는 구현에 따라)15,,1821 또는 여러 여기 명소 (2-4는 낮은 경우 적용 될 수는 잠금 증폭기 X를 추출 하는 데 사용 됩니다 및 Y 위치를 회전을 사용 하 여 레이저 자리)25,28 적용 됩니다. 이러한 여러 탐지 및 방출 반점의 오버랩 어려워질 시스템 및 유지 관리.
여기, 우리 3D-DyPLoT29라는 단순화 된 광학 설계 고속 표적은 고정 3D SPT 방법 제시. 3D DyPLoT 2D EOD와 태그 렌즈36,,3738 을 사용 하 여 동적으로 높은 속도로 (50khz XY, Z 70 kHz) 객관적인 초점 볼륨 통해 초점된 레이저 자리를 이동. 레이저 초점 위치와 광자 도착 시간을 결합 하 여 입자의 3D 위치를 낮은 광자 수 속도 에서도 신속 하 게 얻을 수 있습니다. 2D-EOD 기사의 투어 패턴39 X Y 평면에서 1 x 1 µ m의 사각형 크기에에서 레이저 초점을 태그 렌즈 축 방향으로 2-4 µ m의 범위에서 레이저 초점을 이동 한다. 최적화 된 위치 추정 알고리즘29,40 3 차원에서 3D 파티클 위치를 얻을 수 있습니다. 3D 동적으로 움직이는 레이저 자리, 광 양자 눈사태 포토 다이오드 (APD), 실시간 입자 위치 계산, 압 전 단계 피드백 및 데이터 기록에서 계산의 제어 필드 프로그래머블 게이트 어레이 (FPGA)에서 수행 됩니다.이 프로토콜에서 우리 3D-DyPLoT 현미경 광학 정렬, 고정된 입자와 보정을 포함 하 여, 단계별 구축 하는 방법을 설명 하 고 마지막으로 입자 추적 무료. 데모, 110 nm 형광 구슬 했다 추적 지속적으로 물에 한 번에 분.
여기에 설명 된 방법 그것은 낮은 조명 수준에서 바이러스, 나노 입자, 및 endosomes 같은 소포를 포함 하 여 빠른 속도로 움직이는 형광 프로브를 지속적으로 모니터링을 원하는 모든 응용 프로그램에 대 한 이상적인 선택입니다. 이전 방법을 달리 한 흥분 및 단일 검색 통로, 맞춤 및 유지 보수를 간단 하가 있다. 또한, 대형 탐지 영역 쉽게 신속 하 게 확산 하는 입자, (10 kHz) 아래로 낮은 신호 레벨에서 추적 하는 능력은이 방법을 낮은 조명 응용 프로그램29에 이상적 동안 데리 러이 현미경에서는.

<table><tbody><tr><td>2D Electro-optic Deflector&amp;nbsp;</td><td>ConOptics</td><td>M310A</td><td>2 required</td></tr><tr><td>Power supply for EOD</td><td>ConOptics</td><td>412</td><td>Converts FPGA ouput to high voltage for EOD</td></tr><tr><td>TAG&amp;nbsp; Lens</td><td>TAG Optics</td><td>TAG 2.0</td><td>Used to deflect laser along axial direction</td></tr><tr><td>XY piezoelectric nanopositioner</td><td>MadCity Labs</td><td>Nano-PDQ275HS</td><td>Used for moving the sample to lock the particle in the objective focal volume in&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Z piezoelectric nanoposiitoner</td><td>MadCity Labs</td><td>Nano-OP65HS</td><td>Used to move the objective lens to follow the diffusing particle</td></tr><tr><td>Micropositioner</td><td>MadCity Labs</td><td>MicroDrive</td><td>Used to coarsely position sample and evaluate</td></tr><tr><td>Objective Lens</td><td>Zeiss</td><td>PlanApo</td><td>High numerical aperture required for best sensitivity. 100X, 1.49 NA, M27, Zeiss</td></tr><tr><td>sCMOS camera</td><td>PCO</td><td>pco.edge 4.2</td><td>Used to monitor the particle&#039;s position</td></tr><tr><td>APD</td><td>Excelitas</td><td>SPCM-ARQH-15</td><td>Lower dark counts beneficial</td></tr><tr><td>Field programmable gate array</td><td>National Instruments</td><td>NI-7852r</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td>National Instruments</td><td>LabVIEW</td><td></td></tr><tr><td>Tracking excitation laser</td><td>JDSU</td><td>FCD488-30</td><td></td></tr><tr><td>Lens</td><td>ThorLabs</td><td>AC254-150-A-ML</td><td>L1</td></tr><tr><td>Lens</td><td>ThorLabs</td><td>AC254-200-A-ML</td><td>L2</td></tr><tr><td>Pinhole</td><td>ThorLabs</td><td>P75S</td><td>PH</td></tr><tr><td>Glan-Thompson Polarizer</td><td>ThorLabs</td><td>GTH5-A</td><td>GT</td></tr><tr><td>Half-wave plate</td><td>ThorLabs</td><td>WPH05M-488</td><td>WP</td></tr><tr><td>Lens</td><td>ThorLabs</td><td>AC254-75-A-ML</td><td>L3</td></tr><tr><td>Lens</td><td>ThorLabs</td><td>AC254-250-A-ML</td><td>L4</td></tr><tr><td>Lens</td><td>ThorLabs</td><td>AC254-200-A-ML</td><td>L5</td></tr><tr><td>Lens</td><td>ThorLabs</td><td>AC254-200-A-ML</td><td>L6</td></tr><tr><td>Dichroic Mirror</td><td>Chroma</td><td>ZT405/488/561/640rpc</td><td>DC</td></tr><tr><td>Fluorescence Emission Filter</td><td>Chroma</td><td>D535/40m</td><td>F</td></tr><tr><td>10/90 beamsplitter</td><td>Chroma</td><td>21012</td><td>BS</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>190 nm fluorescent nanoparticles</td><td>Bangs laboratories</td><td>FC02F/9942</td><td></td></tr><tr><td>110 nm fluorescent nanoparticles</td><td>Bangs laboratories</td><td>FC02F/10617</td><td></td></tr><tr><td>Coverslip</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545A</td><td></td></tr><tr><td>Powermeter</td><td>Thorlabs</td><td>PM100D</td><td></td></tr><tr><td>CMOS</td><td>Thorlabs</td><td>DCC1545M</td><td></td></tr><tr><td>Iris</td><td>Thorlabs</td><td>SM1D12D</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Mad City Labs</td><td>RM21</td><td></td></tr></tbody></table>

a protocol for real-time 3d single particle tracking

실시간 3 차원 단일 입자 추적 (RT-3D-SPT) 셀룰러 시스템에 빠르고, 3D 프로세스에 주실 가능성이 있다. 다양 한 실시간 3D SPT 방법을 최근 몇 년 동안에 앞으로 넣어 왔다, 고속 추적 3D 낮은 광자 수 속도에서 입자 확산 남아 있다 도전. 또한, 실시간 3D SPT 설정은 일반적으로 복잡 하 고 어려운 구현, 생물 학적 문제에 그들의 광범위 한 응용 프로그램을 제한. 이 프로토콜 낮은 광자 수 전송률 (10 kHz)에서 3D 동적 광자 지역화 추적 (3D-DyPLoT), 높은 방산 속도 (최대 20 µ m2/s)와 입자를 추적할 수 있는 라는 실시간 3D SPT 시스템을 제공 합니다. 3D DyPLoT 사용 하 여 2D 전기 광학 전향 장치 (2D-EOD)와 단일 초점 드라이브 가변 음향 그라데이션 (태그) 렌즈 레이저 3D에서 동적으로. 최적화 된 위치 추정 알고리즘을 결합 하 여, 3D DyPLoT 높은 추적 속도 높은 지역화 정밀도와 단일 입자에 잠글 수 있습니다. 단일 여기 및 단일 검색 경로 레이아웃 때문 3D DyPLoT 강력 하 고 쉽게 설치 하는. 이 프로토콜에는 3D-DyPLoT 단계를 구축 하는 방법을 설명 합니다. 첫째, 광학 레이아웃을 설명 합니다. 다음, 시스템 보정 이며 래스터 190 nm 형광 구슬 압 전 nanopositioner로 검색 하 여 최적화 된. 마지막으로, 실시간 3D 추적 능력을 보여 110 nm 형광 구슬은 물에서 추적 됩니다.

고정된 입자 (그림 4)를 검색 하 고 자유롭게 확산 110 nm 형광 입자 추적 (그림 5)는 위의 프로토콜에 따라 수행 했다. 입자 스캔 스캔에서 각 지점에서 위치 추정 입자의 동시에 계산 하는 동안 압 전 nanopositioner 및 빈 광자를 이동 하 여 수행 되었다. 스캔 이미지 심지어 강도 (그림 4a)의 사각형을 표시 하 고 ...

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A Protocol for Real-time 3D Single Particle Tracking

건설 및 운영의 실시간 3D 단일 입자 추적 현미경 추적 나노 형광의 높은 방산 속도 낮은 광자 수 요금에서 프로브이 프로토콜 세부 사항.

실시간 3D 단일 입자 추적에 대 한 프로토콜

Real-time three-dimensional single particle tracking (RT-3D-SPT) has the potential to shed light on fast, 3D processes in cellular systems. Although ...

a-protocol-for-real-time-3d-single-particle-tracking

Research

JoVE Journal

Bioengineering

14.8K 조회수.  Duke University. 건설 및 운영의 실시간 3D 단일 입자 추적 현미경 추적 나노 형광의 높은 방산 속도 낮은 광자 수 요금에서 프로브이 프로토콜 세부 사항.

비디오: A Protocol for Real-time 3D Single Particle Tracking

Three-dimensional Particle Tracking Velocimetry for Turbulence Applications: Case of a Jet Flow

3D-PTV is a quantitative flow measurement technique that aims to track the Lagrangian paths of a set of particles in three dimensions using stereoscopic recording of image sequences. The basic components, features, constraints and optimization tips of a 3D-PTV topology consisting of a high-speed camera with a four-view splitter are described and discussed in this article. The technique is applied to the intermediate flow field (5 &#60;x/d &#60;25) of a circular jet at Re &#8776; 7,000. Lagrangian flow features and turbulence quantities in an Eulerian frame are estimated around ten diameters downstream of the jet origin and at various radial distances from the jet core. Lagrangian properties include trajectory, velocity and acceleration of selected particles as well as curvature of the flow path, which are obtained from the Frenet-Serret equation. Estimation of the 3D velocity and turbulence fields around the jet core axis at a cross-plane located at ten diameters downstream of the jet is compared with literature, and the power spectrum of the large-scale streamwise velocity motions is obtained at various radial distances from the jet core.

A three-dimensional particle tracking velocimetry (3D-PTV) system based on a high-speed camera with a four-view splitter is described here. The technique is applied to a jet flow from a circular pipe in the vicinity of ten diameters downstream at Reynolds number Re &#8776; 7,000.

3D-PTV is a quantitative flow measurement technique that aims to track the Lagrangian paths of a set of particles in three dimensions using stereoscopic ...

연구

공학

Preparation and 3D Tracking of Catalytic Swimming Devices

We report a method to prepare catalytically active Janus colloids that "swim" in fluids and describe how to determine their 3D motion using fluorescence microscopy. One commonly deployed method for catalytically active colloids to produce enhanced motion is via an asymmetrical distribution of catalyst. Here this is achieved by spin coating a dispersed layer of fluorescent polymeric colloids onto a flat planar substrate, and then using directional platinum vapor deposition to half coat the exposed colloid surface, making a two faced "Janus" structure. The Janus colloids are then re-suspended from the planar substrate into an aqueous solution containing hydrogen peroxide. Hydrogen peroxide serves as a fuel for the platinum catalyst, which is decomposed into water and oxygen, but only on one side of the colloid. The asymmetry results in gradients that produce enhanced motion, or "swimming". A fluorescence microscope, together with a video camera is used to record the motion of individual colloids. The center of the fluorescent emission is found using image analysis to provide an x and y coordinate for each frame of the video. While keeping the microscope focal position fixed, the fluorescence emission from the colloid produces a characteristic concentric ring pattern which is subject to image analysis to determine the particles relative z position. In this way 3D trajectories for the swimming colloid are obtained, allowing swimming velocity to be accurately measured, and physical phenomena such as gravitaxis, which may bias the colloids motion to be detected.

A method to prepare catalytically active Janus colloids that can "swim" in fluids and determine their 3D trajectories is presented.

촉매 수영 장치의 제조 및 3D 추적

We report a method to prepare catalytically active Janus colloids that "swim" in fluids and describe how to determine their 3D motion using fluorescence ...

Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules

Single-molecule localization microscopy probes the position and motions of individual molecules in living cells with tens of nanometer spatial and millisecond temporal resolution. These capabilities make single-molecule localization microscopy ideally suited to study molecular level biological functions in physiologically relevant environments. Here, we demonstrate an integrated protocol for both acquisition and processing/analysis of single-molecule tracking data to extract the different diffusive states a protein of interest may exhibit. This information can be used to quantify molecular complex formation in living cells. We provide a detailed description of a camera-based 3D single-molecule localization experiment, as well as the subsequent data processing steps that yield the trajectories of individual molecules. These trajectories are then analyzed using a numerical analysis framework to extract the prevalent diffusive states of the fluorescently labeled molecules and the relative abundance of these states. The analysis framework is based on stochastic simulations of intracellular Brownian diffusion trajectories that are spatially confined by an arbitrary cell geometry. Based on the simulated trajectories, raw single-molecule images are generated and analyzed in the same way as experimental images. In this way, experimental precision and accuracy limitations, which are difficult to calibrate experimentally, are explicitly incorporated into the analysis workflow. The diffusion coefficient and relative population fractions of the prevalent diffusive states are determined by fitting the distributions of experimental values using linear combinations of simulated distributions. We demonstrate the utility of our protocol by resolving the diffusive states of a protein that exhibits different diffusive states upon forming homo- and hetero-oligomeric complexes in the cytosol of a bacterial pathogen.

3D single-molecule localization microscopy is utilized to probe the spatial positions and motion trajectories of fluorescently labeled proteins in living bacterial cells. The experimental and data analysis protocol described herein determines the prevalent diffusive behaviors of cytosolic proteins based on pooled single-molecule trajectories.

단일 분자 추적 현미경 검사법 - 세포화 분자의 확산 상태를 결정하는 도구

Single-molecule localization microscopy probes the position and motions of individual molecules in living cells with tens of nanometer spatial and ...

생화학

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., kinetics, coexistence of different states and populations, transient interactions), which are typically hidden in ensemble measurements, such as those obtained with standard biochemical or microscopy methods. Thus, dynamic events, such as receptor-receptor interactions, can be followed in real time in a living cell with high spatiotemporal resolution. This protocol describes a method based on labeling with small and bright organic fluorophores and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy to directly visualize single receptors on the surface of living cells. This approach allows one to precisely localize receptors, measure the size of receptor complexes, and capture dynamic events such as transient receptor-receptor interactions. The protocol provides a detailed description of how to perform a single-molecule experiment, including sample preparation, image acquisition and image analysis. As an example, the application of this method to analyze two G-protein-coupled receptors, i.e., &#946;2-adrenergic and &#947;-aminobutyric acid type B (GABAB) receptor, is reported. The protocol can be adapted to other membrane proteins and different cell models, transfection methods and labeling strategies.

This protocol describes how to use total internal reflection fluorescence microscopy to visualize and track single receptors on the surface of living cells and thereby analyze receptor lateral mobility, size of receptor complexes as well as to visualize transient receptor-receptor interactions. This protocol can be extended to other membrane proteins.

단일 분자 형광 현미경에 의한 수용체 역학의 고해상도 시공간 분석

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

생체공학

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a modified two-photon microscope1. As opposed to conventional approaches (raster scan or wide field based on a stack of frames), the 3D orbital tracking allows to localize and follow with a high spatial (10 nm accuracy) and temporal resolution (50 Hz frequency response) the 3D displacement of a moving fluorescent particle on length-scales of hundreds of microns2. The method is based on a feedback algorithm that controls the hardware of a two-photon laser scanning microscope in order to perform a circular orbit around the object to be tracked: the feedback mechanism will maintain the fluorescent object in the center by controlling the displacement of the scanning beam3-5. To demonstrate the advantages of this technique, we followed a fast moving organelle, the lysosome, within a living cell6,7. Cells were plated according to standard protocols, and stained using a commercially lysosome dye. We discuss briefly the hardware configuration and in more detail the control software, to perform a 3D orbital tracking experiment inside living cells. We discuss in detail the parameters required in order to control the scanning microscope and enable the motion of the beam in a closed orbit around the particle. We conclude by demonstrating how this method can be effectively used to track the fast motion of a labeled lysosome along microtubules in 3D within a live cell. Lysosomes can move with speeds in the range of 0.4-0.5 &#181;m/sec, typically displaying a directed motion along the microtubule network8.

In this video protocol we track - at high speed and in three dimensions - fluorescently labeled lysosomes within living cells, using the orbital tracking method in a modified two-photon microscope.

수정 된 두 개의 광자 현미경에서 3D 궤도 추적 : 세포 내 소포의 추적에 응용

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

Controlling Flow Speeds of Microtubule-Based 3D Active Fluids Using Temperature

We present a method for using temperature to tune the flow speeds of kinesin-driven, microtubule-based three-dimensional (3D) active fluids. This method allows for tuning the speeds in situ without the need to manufacture new samples to reach different desired speeds. Moreover, this method enables the dynamic control of speed. Cycling the temperature leads the fluids to flow fast and slow, periodically. This controllability is based on the Arrhenius characteristic of the kinesin-microtubule reaction, demonstrating a controlled mean flow speed range of 4&#8211;8 &#181;m/s. The presented method will open the door to the design of microfluidic devices where the flow rates in the channel are locally tunable without the need for a valve.

The goal of this protocol is to use temperature to control the flow speeds of three-dimensional active fluids. The advantage of this method not only allows for regulating flow speeds in situ but also enables dynamic control, such as periodically tuning flow speeds up and down.

We present a method for using temperature to tune the flow speeds of kinesin-driven, microtubule-based three-dimensional (3D) active fluids. This method ...

Mass-Sensitive Particle Tracking to Characterize Membrane-Associated Macromolecule Dynamics

Short-lived or transient interactions of macromolecules at and with lipid membranes, an interface where a multitude of essential biological reactions take place, are inherently difficult to assess with standard biophysical methods. The introduction of mass-sensitive particle tracking (MSPT) constitutes an important step toward a thorough quantitative characterization of such processes. Technically, this was made possible through the advent of interferometric scattering microscopy (iSCAT)-based mass photometry (MP). When the background removal strategy is optimized to reveal the two-dimensional motion of membrane-associated particles, this technique allows the real-time analysis of both diffusion and molecular mass of unlabeled macromolecules on biological membranes. Here, a detailed protocol to perform and analyze mass-sensitive particle tracking of membrane-associated systems is described. Measurements performed on a commercial mass photometer achieve time resolution in the millisecond regime and, depending on the MP system, a mass detection limit down to 50 kDa. To showcase the potential of MSPT for the in-depth analysis of membrane-catalyzed macromolecule dynamics in general, results obtained for exemplary protein systems such as the native membrane interactor annexin V are presented.

This protocol describes an iSCAT-based image processing and single-particle tracking approach that enables the simultaneous investigation of the molecular mass and the diffusive behavior of macromolecules interacting with lipid membranes. Step-by-step instructions for sample preparation, mass-to-contrast conversion, movie acquisition, and post-processing are provided alongside directions to prevent potential pitfalls.

막과 관련된 거대분자 역학을 특성화하기 위한 질량 민감성 입자 추적

Short-lived or transient interactions of macromolecules at and with lipid membranes, an interface where a multitude of essential biological reactions take ...

Image Processing Protocol for the Analysis of the Diffusion and Cluster Size of Membrane Receptors by Fluorescence Microscopy

Particle tracking on a video sequence and the posterior analysis of their trajectories is nowadays a common operation in many biological studies. Using the analysis of cell membrane receptor clusters as a model, we present a detailed protocol for this image analysis task using Fiji (ImageJ) and Matlab routines to: 1) define regions of interest and design masks adapted to these regions; 2) track the particles in fluorescence microscopy videos; 3) analyze the diffusion and intensity characteristics of selected tracks. The quantitative analysis of the diffusion coefficients, types of motion, and cluster size obtained by fluorescence microscopy and image processing provides a valuable tool to objectively determine particle dynamics and the consequences of modifying environmental conditions. In this article we present detailed protocols for the analysis of these features. The method described here not only allows single-molecule tracking detection, but also automates the estimation of lateral diffusion parameters at the cell membrane, classifies the type of trajectory and allows complete analysis thus overcoming the difficulties in quantifying spot size over its entire trajectory at the cell membrane.

Here, we present a protocol for single particle tracking image analysis that allows quantitative evaluation of diffusion coefficients, types of motion and cluster sizes of single particles detected by fluorescence microscopy.

확산의 분석 및 형광 현미경 검사 법에 의해 수용 체 막의 클러스터 크기에 대 한 프로토콜을 처리 하는 이미지

Particle tracking on a video sequence and the posterior analysis of their trajectories is nowadays a common operation in many biological studies. Using ...

면역학 및 감염병학

3D Particle Tracking for Noninvasive In Vivo Analysis of Synaptic Microtubule Dynamics in Dendrites and Neuromuscular Junctions of Drosophila

Microtubules (MTs) play critical roles in neuronal development, but many questions remain about the molecular mechanisms of their regulation and function. Furthermore, despite progress in understanding postsynaptic MTs, much less is known about the contributions of presynaptic MTs to neuronal morphogenesis. In particular, studies of in vivo MT dynamics in Drosophila sensory dendrites yielded significant insights into polymer-level behavior. However, the technical and analytical challenges associated with live imaging of the fly neuromuscular junction (NMJ) have limited comparable studies of presynaptic MT dynamics. Moreover, while there are many highly effective software strategies for automated analysis of MT dynamics in vitro and ex vivo, in vivo data often necessitate significant operator input or entirely manual analysis due to inherently inferior signal-to-noise ratio in images and complex cellular morphology. &#160;To address this, this study optimized a new software platform for automated and unbiased in vivo particle detection. Multiparametric analysis of live time-lapse confocal images of EB1-GFP labeled MTs was performed in both dendrites and the NMJ of Drosophila larvae and found striking differences in MT behaviors. MT dynamics were furthermore analyzed following knockdown of the MT-associated protein (MAP) dTACC, a key regulator of Drosophila synapse development, and identified statistically significant changes in MT dynamics compared to wild type. These results demonstrate that this novel strategy for the automated multiparametric analysis of both pre- and postsynaptic MT dynamics at the polymer-level significantly reduces human-in-the-loop criteria. The study furthermore shows the utility of this method in detecting distinct MT behaviors upon dTACC-knockdown, indicating a possible future application for functional screens of factors that regulate MT dynamics in vivo. Future applications of this method may also focus on elucidating cell type and/or compartment-specific MT behaviors, and multicolor correlative imaging of EB1-GFP with other cellular and subcellular markers of interest.&#160;

<meta charset="utf8"></head><body>초파리의 수상돌기 및 신경근 접합부에서 시냅스 미세소관 역학의 비침습적 생체 내 분석을 위한 3D 입자 추적

This study presents a noninvasive intravital neuronal imaging strategy combined with a new software strategy to achieve automated, unbiased tracking and analysis of in vivo microtubule (MT) plus-end dynamics in the sensory dendrites and the neuromuscular junctions of Drosophila.

초파리의 수상돌기 및 신경근 접합부에서 시냅스 미세소관 역학의 비침습적 생체 내 분석을 위한 3D 입자 추적

Microtubules (MTs) play critical roles in neuronal development, but many questions remain about the molecular mechanisms of their regulation and function. ...

실시간 3D 단일 입자 추적에 대 한 프로토콜

요약

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초파리의 수상돌기 및 신경근 접합부에서 시냅스 미세소관 역학의 비침습적 생체 내 분석을 위한 3D 입자 추적

초파리의 수상돌기 및 신경근 접합부에서 시냅스 미세소관 역학의 비침습적 생체 내 분석을 위한 3D 입자 추적