This work was made possible by funding from the German Federal Ministry of Education and Research (BMBF, 1315883) as well as by the S&#228;chsische Aufbaubank (SAB) project 100116526 from a funding of the European Regional Development Fund (ERDF).

모든 인간의 혈액 샘플을 건강한 지원자로부터 획득하고,인가 된 백혈구 농축 프로토콜은 라이프 치히 대학의 의학 교수의 윤리위원회의 지침을 따릅니다. 쥐의 혈액과 실험 동물 관리 및 사용에 독일의 지침에 따라, 책임 지역 윤리위원회 (Landesdirektion 작센, Referat 24)에 의해 승인되었다. 1. 실험 설정 주 : 혈액 샘플에서 적혈구의 고갈에 대한 저장성 용해 절차는 시간이 중요한 과정이기 때문에, 사전에 프로토콜의이 부분에 필요한 모든 장치 (예를 들면, 완충액)을 제조 하였다. <ol><li> 저장성 용해 하나 15 ml의 원심 분리기 튜브와 혈액 샘플 당 후속 아미노 페닐 플루 오레 (APF) 염색 한 1.5 ml의 샘플 튜브 라벨. <ol><li> 백혈구 보충은 멸균 조건 하에서 수행 할 경우, 흐름 하에서 라벨링을 수행상자. </li></ol></li><li> 샘플 당 약 12​​ ml의 인산염 완충 식염수 (PBS, 10 mm)를 준비합니다. 백혈구는 멸균 조건 하에서 격리 여부되어야하는지 여부에 따라 공급의 준비 멸균 용액을 사용하거나 증류수 PBS 정제를 용해하거나 PBS를 준비한다. pH 값을 확인하고, 필요한 경우, 0.1 M 염산 및 수산화 나트륨 용액의 소량을 사용하여 pH를 7.4로 조정한다. <ol><li> 약 16 샘플에 대한 충분한 비 멸균 완충 용액을 얻었다 증류수 200 ㎖ 중의 (자재 표 참조) PBS 정제 녹인다. 원하는 경우, 멸균 여과하여 용액을 소독. </li></ol></li><li> 칼슘 보충 약 1 ml의 행크스 균형 염 용액 (HBSS) 2 + 샘플 당을 준비합니다. <ol><li> 100 ㎖의 HBSS 소금 (최종 부피)를 두 번 증류수 970 mg을 녹이고. 최종 부피까지 충전하기 전에, pH 값을 확인하여 pH 7.4로 조정한다. 낮은 버퍼 용량으로 인해, 매일 갓이 버퍼를 준비0.1 M 염산 및 수산화 나트륨 용액을 소량 사용하여 특별한주의와 pH 조정을 수행 할 거라고. 참고 멸균 용액은 실험에 따라 사용될 수있다. 용액을 멸균 여과에 의해 멸균 될 수있다. </li></ol></li><li> 두 버퍼 라벨 게다가와 튜브를 준비 (예를 들어, 50 ㎖ 원심 분리 관) 또는 플라스크 (예를 들어, 측정 컵 250 ㎖)에 미리 용해 저장성 절차 이중 증류수. 샘플 당 약 10 ㎖의 물을 준비합니다. </li><li> 얼음에 수행되는 APF 염색 (섹션 3), 분쇄 얼음 용기를 준비합니다. </li><li> 염색시 사용 작업 솔루션을 신속하게 준비 할 수 있도록 사전에 APF의 분취 량을 준비 (3.2 단계) 및 냉동와 APF 솔루션의 해동을 반복하지 않도록. 주 : APF는 일반적으로 5 ㎎ / ㎖의 메틸 아세테이트 (11.81 mM)을 원액으로 얻어진다. <ol><li> 0.5 ml의 튜브에 10 ~ 100 μL의 분취 량을 동결. APF는 최종 염색을 위해10 μM의 염료 농도 (단계 3.8)를 사용한다. </li></ol></li></ol> 적혈구 2. 저압 성 용해 주 : 오염을 피하기 위해 층류 벤치에서 (원심 단계 제외) 저장성 용해 공정을 수행한다. 실온에서 전체 절차를 수행한다. 근력 저하 용해 시간이 중요한 공정이기 때문에, 사전에 물 (2 mL) 및 PBS (5 ㎖)에 첨가 피펫을 조정 절차를 시작하기 전에 물과 PBS 플라스크 연다. 사용하기 전에 실온에서 PBS 용액과 증류수 저장한다. <ol><li> 각각의 혈액 샘플 전송에서 해당 15 ML의 원심 분리 관에 100 μL. 참고 : 본 실험에서 혈액 시료는 일반적으로 응집을 방지하기 위하여 헤파린 10 U / ㎖를 함유한다. 그러나 의한 샘플 물질의 다른 소스에 항응고제의 특성 및 농도는 다를 수있다. APF 염색에 미치는 영향은 비교 예에 의해 테스트해야다른 유형 또는 항 응집제의 농도로 보충 된 혈액 샘플로부터 얻은 결과와 그 결과를 보내고. </li><li> 2 ml의 증류수를 추가하고, 중간 레벨로 설정 볼텍스 혼합기를 사용하여 샘​​플을 혼합한다. 다음 샘플 당 5 ml의 PBS를 추가하고 와류 믹서를 사용하여 혼합, 60 초 동안 샘플을 품어. 주의 : 샘플을 약 5까지 병렬로 제조 될 수있다. 샘플 순서 비교 배양 시간을 달성하기 위해 물 및 PBS를 첨가 동일하게 유지. </li><li> PBS를 첨가한다 (단계 2.2)을 실온에서 6 분, 450 × g으로 원심 분리하여 모든 샘플에서 남은 그대로 펠렛 세포에 의한 등장 성 상태의 재생 후. </li><li> 테이블 폐기물 빈으로 쏟아져하여 상층 액을 제거합니다. 원심 분리 튜브를 반전하고 종이 타월 위에 개방을 눌러 많은 액체를 가능한 한 제거합니다. 세포 펠렛은 가능한 한 건조되었는지 확인합니다. </li><li> (단계 2.2) 이전에 설명 된대로 저장성 용해 절차를 반복합니다. 엔OTE는 원칙적으로 본 저장성 용해 절차 얻어지는 혼합 백혈구 분획의 순도에 따라 두 번 이상 반복 될 수있다 (2.5-2.3이 단계). 두 용해가 혼합 얻어진 세포 분획에서 적혈구 잔존 주 단계 후에 약 25 %이다. </li><li> 실온에서 6 분, 450 × g으로 원심 분리에 의해 나머지 본래 세포 펠렛. 뜨는 (단계 2.4 참조)를 제거합니다. 펠릿에 500 ㎕의 HBSS를 추가하고 균일 한 용액이 얻어 질 때까지 부드럽게 녹인다. 따라 표시 1.5 ml의 샘플 튜브에 각 샘플을 전송합니다. </li><li> 실험에 따라서 직접 (유동 세포 계측법을 통해 예) 얻어진 샘플 25 (32) (단일 세포 유형의 식별을위한) 형광 표지 된 항체로 염색 분석 (세포 활성화 실험) 세포 자극으로 33 부화 또는 얼음 사용에 저장된 후에. 연구의 목적에 따라 즉시 후속 실험을 수행과립구 보낸 혼합 백혈구 분획은 약 20 시간의 매우 짧은 반감기를 갖는다. 참고 :이 또한 아래에 설명 된 퍼 옥시 다제 활성 염색을 위해 보유하고있다. </li></ol> 3. 할로겐 퍼 옥시 다제 활동 염색 참고 : 혈액 유래 헴 퍼 옥시다아제 MPO 및 EPO에 의해 HOCl- 및 HOBr 생산 명명 된 hypohalous 산에 의해 형광에 산화 APF를 사용하여 정량한다. 형광 표지 된 항체와 세포 라벨링 APF 염색과 조합하여 수행되는 경우에 따라서, 형광의 발광 신호에 간섭을 피하기 형광체. <ol><li> 얼음에 4 ° C에서 APF 염색을 수행합니다. </li><li> APF의 작동 용액을 제조하는 염료의 적절한 분액을 해동 (예, 10 μL, 11.81 mM)을하고 정확하게 일 밀리미터 (예를 들면, 10 μL에 108.1 μl의 완충액을 추가)하는 HBSS로 희석. <ol><li> 각 샘플 (500 ㎕의 세포 용액) 5 μ 준비설명 APF 작업 용액의 리​​터. 따라서, 118.1 μL APF 작업 용액 (1 ㎜)이 약 20 샘플을 준비하는 산출 APF (11.81 mM)을 하나 10 μL 나누어지는을 사용합니다. 때문에 피펫 동안 손실을 계산보다 약 10 % 더 APF 작업 솔루션을 준비합니다. </li></ol></li><li> 상기 APF 염색의 과산화 효소 특이성을 확인 헴 퍼 옥시 다제 억제제 4- 아미노 벤조산 히드라 지드 (4- ABAH) 35 제어 샘플을 준비하기 위해. <ol><li> 용매 500 μL에 756 mg의 4- ABAH 희석하여 디메틸 술폭 시드 4- ABAH (151.17 g / 몰) (DMSO)에 1 M 스톡 용액을 제조 하였다. 또한 HBSS에서 4 ABAH 1/10 희석. </li></ol></li><li> 각각 &quot;70 mM의 H 2 O (2)&quot;과 &quot;7 mM의 H 2 O (2)&quot;을 가진 H 2 O이 작동 용액 라벨 개의 1.5 mL의 원심 분리 튜브의 제조. <ol><li> &quot;70 mM의 H 2 O 2&quot;로 표시된 튜브에서 갓 10 μl를 희석약 88 mM의 농도를 얻기 위해 증류수 990 μL를 사용하여 H 2 O (2)의 30 % 스톡 용액 (8.8 mM)을 중. 얼음에 보관하고 4 시간 이내에 사용한다. 참고 : H 2 O 2는 일반적으로 공급 업체에 의해 30 % 원액으로 전달된다. 4 ℃에서 저장 될 때, 그것은 약 3 년 동안 안정하다. 분해를 방지하기 위해 증류수에 H 2 O 2의 희석을 수행합니다. (2) H 2 O 희석은 0.1 M NaOH 용액에서 제조 될 수있다. </li><li> 정확한 H를 결정하기위한 2 O 2 농도로 레이블 된 1.5 ㎖의 튜브에 증류수 900 ㎕를이 용액 100 μl를 첨가함으로써 처음으로 H 2 O 2 스톡 용액 (약 88 mm)를 추가로 1 ~ 10의 희석을 준비 &quot;7mm의 H 2 O 2&quot;. </li><li> (AN-UV 비스 photospectrometer를 사용하여 근거리 UV 범위 (예를 들면, 200 ~ 300 ㎚)에서의 스펙트럼을 기록하고 240 nm에서 흡광도를 사용49 240 = 34 M -1 cm-1)가 제 2 H 2 O 2 원액 (34)에 실제 H 2 O 2 농도를 결정한다. 기준 큐벳은 증류수가 들어 있는지 확인합니다. 측정에 사용하는 석영 큐벳을 위해 UV 영역에서 스펙트럼을 기록되어있다. </li><li> 이 결과로부터 모두 H 2 O 2 스톡 용액의 정확한 농도를 계산한다. 증류수 적당량 첨가함으로써 &quot;70mm의 H 2 O 2&quot;샘플 튜브 정확히 70mm의 상기 제 원액의 농도를 조정한다. 얼음에 얻어진 작업 솔루션을 저장하고 1 시간 이내에 사용한다. </li></ol></li><li> 1 mm의 최종 농도에 해당하는 샘플 4 ABAH 작업 용액 (100 mM)을 5 μl를 추가합니다. APF 추가하기 전에 배양기에서 37 ° C에서 15 분 동안 샘플을 품어. </li><li> 각 5 μL APF 작업 용액 (1 ㎜)를 추가500 ㎕의 샘플을 10 μM의 최종 염료 농도가 얻었다. (중간 설정에서 볼텍스 믹서를 사용하여, 예) 샘플을 부드럽게 혼합하고 37 ° C에서 30 분 동안 배양한다. </li><li> 700 μM의 최종 농도 각 500 μL 시료에 5 μL의 H 2 O 2 작동 용액 (70 mm)를 추가합니다. 부드럽게 샘플을 혼합하고 37 ℃에서 60 분 동안 그들을 품어. 병렬로 적절한 제어 측정을 수행한다. 주 : 제어 측정은 700 μM H 2 O (2) 세포에 대한 독성이없는 것으로 나타났다. 도 현저한 세포 반응이 관찰되었다. 주 : APF 염색 또한, H 2 O 2의 첨가를 생략 과학적 문제에 의존하여 수행 될 수있다. H (2) O (2)의 첨가는 세포에 의한 최대의 HOCl 및 HOBr 생산의 검출을 허용하면서 과산화수소가없는 경우에만 기저 염소 EPO 및 MPO 활성이 결정된다. 티그는 후자 상당히 높은 형광 신호를 의미한다. </li><li> 세포 펠렛 들어 10 실온에서 분, 400 X g 위해 원심 분리. 철저하게 펠렛을 파괴하지 않고 뜨는을 제거하고 세포를 재현 탁 250 ㎕를 HBSS를 추가합니다. 참고 : 샘플은 현재 25 유동 세포 계측법을 통해 분석을위한 준비가되어 있습니다. </li><li> 표백을 피하기 위해 분석 될 때까지 어둠 속에서 샘플을 저장합니다. 480-490 nm에서 여기 후 약 525 nm의 37에서 형광의 방출을 감지합니다. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

호중구를 인간 혈액에서 가장 풍부한 백혈구과 마찬가지로 퍼 옥시 다제 양성 세포의 분리는 종종 이러한 셀에 초점을 밀도 구배 원심 분리 (38)에 의해 다른 백혈구에서 호중구의 분리를 포함한다. 호중구는 훨씬 덜 풍부 뮤린 혈액 샘플에 대해서는 아직 후자보다 복잡한 방법 39 40을 사용한다. 또한 두 방법 모두는 또한 더 큰 혈액 볼륨의 필요성, 샘플에서 퍼 옥시 다제 ?...

다형 핵 백혈구 (백혈구라고도 과립구) 및 단핵구는 혈액 -1,2-의 선천 면역 세포의 중요한 구성 요소를 나타낸다. 이들은 병원균뿐만 아니라, 획득 면역 시스템의 활성화 및 전신성 염증 반응 2-4 개시까지 기본 방위에 기여한다. 그러나, 특히 호중구 과립구의 가장 풍부한 형태 및 단핵구는 크게 급성 염증성 사건 (5)의 규제와 종단에 기여한다. 따라서,이 세포는 류마티스 관절염 -6,7- 같은 만성 염증성 질환에서 중요한 역할을 할 수있다. 사실, 천식, 만성 염증성기도 질환, 호산구의 세포 사멸을 손상 혈액 여덟 번째 대부분 과립구 형 특징이다. 그러나 과립구의 세포 사멸 및 대 식세포에 의해 자신의 빠른 제거는 휴대​​ 종료하는 동안 두 가지 중요한 단계는염증 9-11의. 명명 된 면역 세포 두 밀접하게 관련 효소, 즉 마이 엘 로퍼 옥시 다제 (MPO, 호중구와 단핵구)와 호산구 퍼 옥시 다제 (EPO, 호산구)에서 12, 13에서 찾을 수 있습니다. 이 헴 퍼 옥시다아제는 고전 그들이 두 전자적으로 해당 저자 (의사) 내지 (의사 -) 할로겐 자신의 살균 특성 14-16 알려져있다 halous 산을 산화로 체액 성 면역 반응 관련이 있습니다. 생리 학적 조건 MPO 주로 양식 차아 염소산 (의 HOCl)과 hypothiocyanite (- OSCN) 후자와 하이포 아 브롬 산 (HOBr)이 EPO 17-19로 형성되어있다. 새로운 결과는이 (의사 -) 할로겐 효소 활성은 또한 염증 반응의 조절과 면역 반응 (20, 21)의 종료에 기여할 수 있음을 시사한다. 사실, MPO 및 가공 제품의 HOCl 의해 생산 T 세포 기반 적응 면역 반응을 억제 22-2 나타났다4. 이 생리적 기능 MPO와 EPO의 기여를 만성 염증성 질환의 선천 면역에서 백혈구의 면역 학적 역할에 대한 추가 통찰력을 얻을 수를 결정하기 위해 우리는 빨리 후속 특정 소형 혈액으로부터 백혈구를 농축하는 방법을 개발 이들 세포의 할로겐화 퍼 옥시 다제 활성의 결정. 적혈구 고갈 위해 우리는 낮은 재료 비용으로 빠른 백혈구 농축에 이르게 증류수, 두-이후 저장성 용해 단계를 포함하는 표준화 된 방법을 선택했습니다. 후속 할로겐 MPO의 결정 및 EPO의 활동에 대한 HOCl- 및 HOBr 특정 염료 아미노 페닐 플루 오레 (APF)는 25 ~ 27을 사용 하였다. 퍼 옥시다아제 비특이적 염색 방법 28,29 적용 달리,이 방법은 종종 심각한 손상 infl에 할로겐 옥시다아제 활성의 선택적 검출을 허용ammation 30, 31.

<table><tbody><tr><td>&lt;em&gt;Materials/Equipment&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 ml centrifugation tubes</td><td>VWR/Corning</td><td>734-0451</td><td>-</td></tr><tr><td>1.5 ml sample tubes</td><td>VWR/Eppendorf</td><td>211-2130DE</td><td>-</td></tr><tr><td>Pipettes for volumes up to 5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt;, 3120000070</td><td>We are using Eppendorf Resarch plus pipettes with adjustable volumes in the range 1-10 &amp;micro;l, 10-100 &amp;micro;l, 100-1,000 &amp;micro;l an 500-5,000 &amp;micro;l</td></tr><tr><td>laminar flow bench</td><td>Thermo Electron Corperation</td><td>HeraSafe</td><td>-</td></tr><tr><td>Vortex mixer</td><td>Bender &amp;amp; Hobein AG</td><td>Vortex Genie 2</td><td>-</td></tr><tr><td>Tabletop centrifuge</td><td>Kendro Laboratory Products</td><td>Laborfuge 400R</td><td>The centrifuge should be able to be used at 450 x g</td></tr><tr><td>Small centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5415D</td><td>The centrifuge should be able to be used at 400 x g</td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Heraeus</td><td>cytoperm 2</td><td>Settings: 37 &amp;deg;C, 95% humidity, 5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; content</td></tr><tr><td>UV-Vis spectrophotometer</td><td>Varian</td><td>Cary 50 bio</td><td>A spectrum between 200 and 300 nm has to be recorded. Thus quartz cuvettes have to be applied</td></tr><tr><td>Flow cytometer</td><td>Becton, Dickinson</td><td>BD Facs Calibur</td><td>Any flow cytometer can be used which is equiped with a laser suitable for the excitation of fluorescein (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt;, 488 nm argon laser)</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Chemicals&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline (PBS)</td><td>amresco</td><td>K812</td><td>sterile solution, ready to use</td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td>tablets for solving in 200 ml millipore water</td></tr><tr><td>Hanks balanced salt solution (HBSS) with Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1387</td><td>970 mg/100 ml, carefully check and adjust the pH value to 7.4</td></tr><tr><td>Hydrochloric acid</td><td>Merck Millipore</td><td>1.09057.1000</td><td>1 M solution</td></tr><tr><td>Sodium hydroxide</td><td>Riedel-deHa&amp;euml;n</td><td>30620</td><td>Solid pellets. For a 1 M solution solve 4 g/100 ml Millipore water</td></tr><tr><td>Aminophenyl fluorescein</td><td>Cayman</td><td>10157</td><td>5 mg/ml solution (11.81 mM) in methyl acetate, aliquots (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; 100 &amp;micro;l) should be prepared and stored at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Hydrogen peroxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1009</td><td>This 30% stock solution corresponds to a concentration of about 8.8 M. Further dilutions have to be freshly prepared in distilled water immediately prior to use and quantified by absorbance measurements</td></tr><tr><td>4-aminobenzoic acid hydrazide (4-ABAH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A41909</td><td>A first stock solution of 1 M should be prepared in DMSO a second one of 100 mM by 1:10 dilution in HBSS</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>VWR chemicals</td><td>23500.26</td><td>-</td></tr></tbody></table>

fast and specific assessment of the halogenating peroxidase activity in leukocyte-enriched blood samples

이 논문에서는 작은 전체 혈액 샘플에서 백혈구의 신속하고 표준화 된 농축을위한 프로토콜을 설명한다. 이 절차는 적혈구의 저 삼투압의 용해를 기반으로 비 - 인간 기원의 혈액뿐만 아니라 인간의 샘플에 적용될 수있다. 약 50 ~ 100 μL의 작은 초기 샘플 볼륨이 작은 실험 동물에서 반복 채혈에이 방법을 적용 할 수 있습니다. 또한, 백혈구 농축 여러 실험실 환경에서이 방법을 적용하고, 분 이내에 화학 물질 및 계측에 대한 낮은 재료 노력으로 얻을 수있다. 백혈구의 표준화 정제는 매우 선택적 헴 퍼 옥시다아제의 할로겐화 퍼 옥시 다제 활성을 평가하기 염색법, 마이 엘 로퍼 옥시 다제 (MPO)와 호산구 퍼 옥시 다제 (EPO), 즉, 차아 및 하이포 아 브롬 산 (의 HOCl 및 HOBr)의 형성과 결합된다. MPO 강하게 neut 표현되지만rophils 인간 혈액과 단핵 세포에 가장 풍부한 면역 세포 유형은 관련 효소 EPO 독점적 호산구 표현된다. 이러한 효소의 활성은 할로겐화 거의 HOCl- 및 HOBr 특정 염료 아미노 페닐 플루 오레 (APF) 및 차 퍼 옥시 다제 기질, 과산화수소를 사용하여 해결된다. 이후의 유세포 분석되면 모든 퍼 옥시 다제 양성 세포 (호중구, 단핵구, 호산구)를 구별하고 그들의 할로겐화 퍼 옥시다아제 활성을 정량화 할 수있다. APF 염색은 세포 표면 마커의 적용과 결합 될 수 있기 때문에,이 프로토콜은 특히 백​​혈구 하위 분획을 해결하기 위해 확장 될 수있다. 상기 방법은 인간 및 쥐 백혈구에 양의 HOCl 및 HOBr 생산 검출에 적용 할 수있다. 만성 염증성 질환에서 이러한 효소 제품의 광범위하고 다양하게 설명 면역 역할을 감안할 때, 이러한 프로토콜의 이해에 기여백혈구 파생 된 헴의 퍼 옥시다아제의 면역 학적 관련성.

이전에보고 된 바와 같이, 상술 한 방법은 인간 및 인간 이외의 물질 (32)에 모두 적용 가능한 것으로 밝혀졌다. 천식 증상이있는 쥐에 대해 표시 또한 같이 APF 염색은 전신 염증성 상태의 차이를 감지 할 수있는 적절한 도구가 될 수 있습니다. 따라서 우리는이 프로토콜을 사용하는 후속 연구에서 반복적으로 프리 스탄 유도 관절염 (PIA) 여성 다크 아구 티 쥐에?...

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Fast and Specific Assessment of the Halogenating Peroxidase Activity in Leukocyte-enriched Blood Samples

This protocol describes the quick enrichment of leukocytes from small blood samples for a subsequent specific determination of the halogenating peroxidase activity within the cells. The method can be applied to human and non-human material and may contribute to the evaluation of new inflammatory markers.

백혈구가 풍부한 혈액 샘플의 할로겐 퍼 옥시 다제 활동의 신속하고 구체적인 평가

In this paper a protocol for the quick and standardized enrichment of leukocytes from small whole blood samples is described. This procedure is based on ...

fast-specific-assessment-halogenating-peroxidase-activity-leukocyte

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

10.2K 조회수.  University of Leipzig. This protocol describes the quick enrichment of leukocytes from small blood samples for a subsequent specific determination of the halogenating peroxidase activity within the cells. The method can be applied to human and non-human material and may contribute to the evaluation of new inflammatory markers.

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Imaging Approaches to Assessments of Toxicological Oxidative Stress Using Genetically-encoded Fluorogenic Sensors

While oxidative stress is a commonly cited toxicological mechanism, conventional methods to study it suffer from a number of shortcomings, including destruction of the sample, introduction of potential artifacts, and a lack of specificity for the reactive species involved. Thus, there is a current need in the field of toxicology for non-destructive, sensitive, and specific methods that can be used to observe and quantify intracellular redox perturbations, more commonly referred to as oxidative stress. Here, we present a method for the use of two genetically-encoded fluorogenic sensors, roGFP2 and HyPer, to be used in live-cell imaging studies to observe xenobiotic-induced oxidative responses. roGFP2 equilibrates with the glutathione redox potential (EGSH), while HyPer directly detects hydrogen peroxide (H2O2). Both sensors can be expressed into various cell types via transfection or transduction, and can be targeted to specific cellular compartments. Most importantly, live-cell microscopy using these sensors offers high spatial and temporal resolution that is not possible using conventional methods. Changes in the fluorescence intensity monitored at 510 nm serves as the readout for both genetically-encoded fluorogenic sensors when sequentially excited by 404 nm and 488 nm light. This property makes both sensors ratiometric, eliminating common microscopy artifacts and correcting for differences in sensor expression between cells. This methodology can be applied across a variety of fluorometric platforms capable of exciting and collecting emissions at the prescribed wavelengths, making it suitable for use with confocal imaging systems, conventional wide-field microscopy, and plate readers. Both genetically-encoded fluorogenic sensors have been used in a variety of cell types and toxicological studies to monitor cellular EGSH and H2O2 generation in real-time. Outlined here is a standardized method that is widely adaptable across cell types and fluorometric platforms for the application of roGFP2 and HyPer in live-cell toxicological assessments of oxidative stress.

This manuscript describes the use of genetically-encoded fluorogenic reporters in an application of live-cell imaging for the examination of xenobiotic-induced oxidative stress. This experimental approach offers unparalleled spatiotemporal resolution, sensitivity, and specificity while avoiding many of the shortcomings of conventional methods used for the detection of toxicological oxidative stress.

유전자로 인코딩된 Fluorogenic 센서를 사용 하 여 독성 산화 스트레스의 평가에 접근을 이미징

While oxidative stress is a commonly cited toxicological mechanism, conventional methods to study it suffer from a number of shortcomings, including ...

연구

암 연구학

HPLC-based Assay to Monitor Extracellular Nucleotide/Nucleoside Metabolism in Human Chronic Lymphocytic Leukemia Cells

This method describes a sensitive, specific, reliable and reproducible reverse phase high-performance liquid chromatography (RP-HPLC) assay developed and validated for the quantification of extracellular purine nucleotides and nucleosides produced by purified chronic lymphocytic leukemia (CLL) cells under different culture conditions. The chromatographic separation of adenosine 5&#39;-monophosphate (AMP), adenosine (ADO) and inosine (INO) is performed at RT on a silica-based, reversed-phase column that is used for polar compound retention. The method includes a binary mobile phase, which consists of 7 mM ammonium acetate and acetonitrile with a flow rate of 1.00 ml/min. The eluates are monitored using a Photodiode Array UV detector set at 260 nm. A standard calibration curve is generated to calculate the equation for the analytical quantification of each purine compound. System control, data acquisition and analysis are then performed. Applying this protocol, AMP, INO and ADO elute at 7, 11 and 11.9 min, respectively, and the total run time for each sample is 20 min. This protocol may be applied to different cell types and cell lines (both suspension and adherent), using culture media as matrix. The advantages are easy and fast sample preparation and the requirement of a small amount of supernatant for analysis. Furthermore, the use of a serum-free medium allows skipping the protein precipitation step with acetonitrile that impacts the final concentration of purine compounds. One of the limitations of the method is the requirement of the equilibration column run before each single sample run, making the total run time of the experiment longer and preventing high throughput screening applications.

The protocol described here represents an easy and reproducible method that employs reverse phase high-performance liquid chromatography (RP-HPLC) to measure purine metabolism on chronic lymphocytic leukemia (CLL) cells cultured under different conditions.

HPLC 기반 분석은 인간의 만성 림프 구성 백혈병 세포에 세포 외 뉴클레오티드 / 뉴 클레오 시드 신진 대사를 모니터링하기

This method describes a sensitive, specific, reliable and reproducible reverse phase high-performance liquid chromatography (RP-HPLC) assay developed and ...

화학

Detection of Total Reactive Oxygen Species in Adherent Cells by 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein Diacetate Staining

Oxidative stress is an important event under both physiological and pathological conditions. In this study, we demonstrate how to quantify oxidative stress by measuring total reactive oxygen species (ROS) using 2&#39;,7&#39;-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA) staining in colorectal cancer cell lines as an example. This protocol describes detailed steps including preparation of DCFH-DA solution, incubation of cells with DCFH-DA solution, and measurement of normalized intensity. DCFH-DA staining is a simple and cost-effective way to detect ROS in cells. It can be used to measure ROS generation after chemical treatment or genetic modifications. Therefore, it is useful for determining cellular oxidative stress upon environment stress, providing clues to mechanistic studies.

Here, we present a protocol to detect total cellular reactive oxygen species (ROS) using 2&#39;,7&#39;-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA). This method can visualize cellular ROS localization in adherent cells with a fluorescence microscope and quantify ROS intensity with a fluorescence plate reader. This protocol is simple, efficient and cost-effective.

2',7'-디클로로디하이드로플루오레세신 디아세테이트 염색에 의한 부착세포에서 총 반응성 산소종 검출

Oxidative stress is an important event under both physiological and pathological conditions. In this study, we demonstrate how to quantify oxidative ...

생화학

Bioenergetics and the Oxidative Burst: Protocols for the Isolation and Evaluation of Human Leukocytes and Platelets

Mitochondrial dysfunction is known to play a significant role in a number of pathological conditions such as atherosclerosis, diabetes, septic shock, and neurodegenerative diseases but assessing changes in bioenergetic function in patients is challenging.&#160;Although diseases such as diabetes or atherosclerosis present clinically with specific organ impairment, the systemic components of the pathology, such as hyperglycemia or inflammation, can alter bioenergetic function in circulating leukocytes or platelets. This concept has been recognized for some time but its widespread application has been constrained by the large number of primary cells needed for bioenergetic analysis.&#160;This technical limitation has been overcome by combining the specificity of the magnetic bead isolation techniques, cell adhesion techniques, which allow cells to be attached without activation to microplates, and the sensitivity of new technologies designed for high throughput microplate respirometry.&#160;An example of this equipment is the extracellular flux analyzer. Such instrumentation typically uses oxygen and pH sensitive probes to measure rates of change in these parameters in adherent cells, which can then be related to metabolism. Here we detail the methods for the isolation and plating of monocytes, lymphocytes, neutrophils and platelets, without activation, from human blood and the analysis of mitochondrial bioenergetic function in these cells. In addition, we demonstrate how the oxidative burst in monocytes and neutrophils can also be measured in the same samples. Since these methods use only 8-20 ml human blood they have potential for monitoring reactive oxygen species generation and bioenergetics in a clinical setting.

Blood leukocytes and platelets can be used as a marker of overall bioenergetic health of an individual and so have the potential to monitor pathological processes and the impact of treatments. Here&#160;we describe a method to isolate and measure mitochondrial function and the oxidative burst in these cells.

인간 백혈구 및 혈소판의 분리 및 평가를위한 프로토콜 : 생물 에너지와 산화 버스트

Mitochondrial dysfunction is known to play a significant role in a number of pathological conditions such as atherosclerosis, diabetes, septic shock, and ...

면역학 및 감염병학

Hellgrammite as a Non-Conventional Biomonitor for Surface Water and Environmental Health Assessment

The larvae of dobsonflies from the genus Corydalus, commonly known as Hellgrammites, are characterized by their notable size, extensive range of occurrence, and extended period of immaturity, which can last up to one year. Hellgrammites are clearly known to exhibit sensitivity to pollution and habitat structure impacts. Given these unique features, using Corydalus texanus larvae is highly suitable as reliable biomonitoring agents to assess the ecological integrity of aquatic ecosystems. This protocol aims to provide the necessary tools for C. texanus assessment and demonstrate their efficacy through a case study. Research findings have practical implications, indicating that C. texanus larvae exhibit early-warning responses to mining pollution, bioaccumulating high amounts of heavy metals such as Zn, Fe, and Al. The presence or absence of C. texanus populations may serve as a helpful indicator for identifying potential issues related to ecosystem health. The unconventional approach has shown early warnings of pollution in mining-impacted sites, highlighting the need for timely action to protect the environment. Given their unique traits, the use of C. texanus larvae is highly suggested as a reliable non-conventional bioindicator.

This protocol describes the use of biomarkers for the early detection of deleterious impacts in aquatic ecosystems. The biomarkers are closely related to sentinel traits, and their changes aid in detecting early-warning damages.

The larvae of dobsonflies from the genus Corydalus, commonly known as Hellgrammites, are characterized by their notable size, extensive range of ...

환경과학

Cell-free Biochemical Fluorometric Enzymatic Assay for High-throughput Measurement of Lipid Peroxidation in High Density Lipoprotein

Low high-density lipoprotein cholesterol (HDL-C) levels are one of the most powerful independent negative predictors of atherosclerotic cardiovascular disease (CVD). The structure and function of HDL rather than HDL-C may more accurately predict atherosclerosis. Several HDL protein and lipid compositional changes that impair HDL function occur in inflammatory states such as atherosclerosis. HDL function is usually determined by cell based assays such as cholesterol efflux assay but these assays have numerous drawbacks lack of standardization. Cell-free assays may give more robust measures of HDL function compared to cell-based assays. HDL oxidation impairs HDL function. HDL has a major role in lipid peroxide transport and high amount of lipid peroxides is related to abnormal HDL function. Lipid-probe interactions should be considered when interpreting the results of non-enzymatic fluorescence assays for measuring the lipid oxidative state. This motivated us to develop a cell-free biochemical enzymatic method to assess HDL lipid peroxide content (HDLox) that contributes to HDL dysfunction. This method is based on the enzyme horseradish peroxidase (HRP) and the fluorochrome Amplex Red that can quantify (without cholesterol oxidase) the lipid peroxide content per mg of HDL-C. Here a protocol is describedfor determination of HDL-lipid peroxidation using the fluorochrome reagent. Assay variability can be reduced by strict standardization of experimental conditions. Higher HDLox values are associated with reduced HDL antioxidant function. The readout of this assay is associated with readouts of validated cell-based assays, surrogate measures of cardiovascular disease, systemic inflammation, immune dysfunction, and associated cardiovascular and metabolic risk phenotypes. This technical approach is a robust method to assess HDL function in human disease where systemic inflammation, oxidative stress and oxidized lipids have a key role (such as atherosclerosis).

We describe here a fluorometric cell-free biochemical assay for determination of HDL-lipid peroxidation. This rapid and reproducible assay can be used to determine HDL function in large scale studies and can contribute to our understanding of HDL function in human disease.

고밀도 지단백에 지질 과산화의 높은 처리량 측정을 위한 생 화 확 적인 세포-무료 Fluorometric 효소 분석 결과

Low high-density lipoprotein cholesterol (HDL-C) levels are one of the most powerful independent negative predictors of atherosclerotic cardiovascular ...

<meta charset="utf8"></head><body>Detection of Superoxide Anion in Platelets Using Fluorescence Imaging and EPR을 사용한 과산화물 음이온 검출

Alternative Methods for the Detection of Superoxide Anion Generation in Platelets

Reactive oxygen species (ROS) are highly unstable oxygen-containing molecules. Their chemical instability makes them extremely reactive and gives them the ability to react with important biological molecules such as proteins, nucleic acids, and lipids. Superoxide anions are important ROS generated by the reduction of molecular oxygen reduction (i.e., acquisition of one electron). Despite their initial implication exclusively in aging, degenerative, and pathogenic processes, their participation in important physiological responses has recently become apparent. In the vascular system, superoxide anions have been shown to modulate the differentiation and function of vascular smooth muscle cells, the proliferation and migration of vascular endothelial cells in angiogenesis, the immune response, and the activation of platelets in hemostasis. The role of superoxide anions is particularly important in the dysregulation of platelets and the cardiovascular complications associated with a plethora of conditions, including cancer, infection, inflammation, diabetes, and obesity. It has, therefore, become extremely relevant in cardiovascular research to be able to effectively measure the generation of superoxide anions by&#160;human platelets,&#160;understand the redox-dependent mechanisms regulating the balance between hemostasis and thrombosis and, eventually,&#160;identify novel pharmacological tools for the modulation of platelet responses leading to thrombosis and cardiovascular complications. This study presents three experimental protocols successfully adopted for the detection of superoxide anions in platelets and the study of the redox-dependent mechanisms regulating hemostasis and thrombosis: 1) dihydroethidium (DHE)-based superoxide anion detection by flow cytometry; 2) DHE-based superoxide anion visualization and analysis by single platelet imaging; and 3) spin probe-based quantification of superoxide anion output in platelets by electron paramagnetic resonance (EPR).

<meta charset="utf8"></head><body>저자 스포트라이트: ROS 검출을 위한 혁신적인 기법 및 혈소판 연구에 대한 시사점

The generation of superoxide anion is essential for the stimulation of platelets and, if dysregulated, critical for thrombotic diseases. Here, we present three protocols for the selective detection of superoxide anions and the study of redox-dependent platelet regulation.

혈소판에서 과산화물 음이온 생성을 검출하기 위한 대체 방법 

Reactive oxygen species (ROS) are highly unstable oxygen-containing molecules. Their chemical instability makes them extremely reactive and gives them the ...

Evaluation of a Point-of-Care Testing Analyzer for Measuring Peripheral Blood Leukocytes

White blood cell (WBC) is an important indicator of inflammation in the body, and it can help distinguish between bacterial and viral infections. At present, most primary medical institutions in China have a poor percentage of adoption of blood-testing technology, and a hematology detection system with a high price to performance ratio and easy operation is urgently needed in primary healthcare centers. This paper introduces the principle and operation procedures of a point-of-care testing (POCT) card-based leukocyte analyzer (evaluated system), which was used to detect WBC indexes such as neutrophils, lymphocytes, and intermediate group cells (including eosinophils, basophils, and monocytes) in whole blood. The results from the evaluated system were compared to those from two commercial automatic hematology analyzers (reference system). The correlation and consistency between the evaluated system and the commercial reference systems were analyzed. The results showed that WBC count and number of granulocytes detected by the evaluated and reference systems showed a strong positive correlation (rs = 0.972 and 0.973, respectively), while the number of lymphocytes showed a relatively low correlation (rs = 0.851). A Bland-Altman plot showed that the major difference between the values detected by the evaluated system and the reference systems is within 95% limits of agreement (LoA), indicating that the two systems are in good agreement. In conclusion, the evaluated system has an excellent correlation, robust consistency, and a reliable comparison with the results of the widely used automatic hematology analyzers. It is ideal for WBC detection in primary medical institutions where a full-automatic five-category hematology analyzer is unavailable, especially during the COVID-19 normalized prevention and control period.

A protocol to measure peripheral blood leukocytes using a POCT card-based leukocyte analyzer is presented here. Same blood samples were tested by two automated hematology analyzers to evaluate the consistency and accuracy of the results. The results showed that the evaluated analyzer had a good correlation with the reference system.

말초 혈액 백혈구 측정을 위한 POS(Point-of-Care) 테스트 분석기 평가

White blood cell (WBC) is an important indicator of inflammation in the body, and it can help distinguish between bacterial and viral infections. At ...

백혈구가 풍부한 혈액 샘플의 할로겐 퍼 옥시 다제 활동의 신속하고 구체적인 평가

요약

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유전자로 인코딩된 Fluorogenic 센서를 사용 하 여 독성 산화 스트레스의 평가에 접근을 이미징

HPLC 기반 분석은 인간의 만성 림프 구성 백혈병 세포에 세포 외 뉴클레오티드 / 뉴 클레오 시드 신진 대사를 모니터링하기

2',7'-디클로로디하이드로플루오레세신 디아세테이트 염색에 의한 부착세포에서 총 반응성 산소종 검출

인간 백혈구 및 혈소판의 분리 및 평가를위한 프로토콜 : 생물 에너지와 산화 버스트

Hellgrammite as a Non-Conventional Biomonitor for Surface Water and Environmental Health Assessment

고밀도 지단백에 지질 과산화의 높은 처리량 측정을 위한 생 화 확 적인 세포-무료 Fluorometric 효소 분석 결과

혈소판에서 과산화물 음이온 생성을 검출하기 위한 대체 방법

혈소판에서 과산화물 음이온 생성을 검출하기 위한 대체 방법

혈소판에서 과산화물 음이온 생성을 검출하기 위한 대체 방법

말초 혈액 백혈구 측정을 위한 POS(Point-of-Care) 테스트 분석기 평가