1. 펩타이드 직렬 희석 <ol><li> 분석 완충액을 준비 : 행크스 25 mM의 HEPES, 0.1 % BSA 및 0.5 mM의 3- 이소 부틸 -1- 메틸 크 (IBMX), pH를 7.4로 보충 된 염 용액 (HBSS)에 버퍼링. </li><li> 체계적 다섯 384 웰 저용량 분석 플레이트의 각 웰에 분석 완충액 5 μL를 추가 벌크 시약 디스펜서를 사용한다. <ol><li> 제조업체의 지침에 따라 384 웰 플레이트의 각 웰에 5 μL 볼륨 추가를위한 분배 프로그램을 만들기 위해 내부 소프트웨어를 사용합니다. </li><li> 분석 버퍼와 주요 유체에 카세트 튜브를 분배 빠져. </li><li> 플레이트 캐리어 384도 낮은 볼륨 분석 플레이트를 놓습니다. </li><li> 를 눌러 시작. </li></ol></li><li> 100X 펩티드 스톡을 생성하는 분석 완충액에 관계없이 기억 차량의 모든 펩티드 시료를 희석. 주 : 스크리닝을 요구하는 펩타이드는 예를 들어, DMSO w (적절한 것으로 간주 포스페이트 완충 식염수 (PBS) 또는 디메틸 설폭 사이드 (DMSO)에 제공 될 수있다병이 같은 PEG 화와 같은 보조 수정)과 펩티드에 해로운 영향을 미친다. </li><li> 열 음향 자격을 갖춘 384 웰 폴리 프로필렌 마이크로 1-5로 25 μL를 100 배 펩타이드 주식을 분배. 이 판은 &#39;소스 판 A&#39;지정됩니다. 해당 소스 판을 확인 있지만 대상 플레이트, 평면 바닥하고 어쿠스틱 악기의 제조 업체에 의해 정의 된 특정 음향 허용 오차를 준수합니다. </li><li> 우물 A23에 25 μL의 100 배 기준 제어를 분배 및 소스 판 A의 A24 </li><li> 소스 A. 플레이트의 컬럼에 컬럼 21-22 11-15 30 μL의 분석 완충액으로 10 ㎕의 분석 완충액을 분배 </li><li> 열 번째 음향 정규화 384- 웰 폴리 프로필렌 마이크로 6-10 및 16-20 칼럼에 10 μL의 분석 완충액을 분주한다. 이 판은 &#39;소스 판 B&#39;를 지정한다. </li><li> 1 분 300 XG에 원심 분리기 소스 판 A와 B. 적절한 균형 플레이트를 포함합니다. </li><li> 음향 flui를 사용하여소스 A에 열 1에서 100 배 펩타이드 주식 (분석 버퍼) (100) 중간 희석 : D 디스펜서는 세 연속 1을 제조 자동화 로봇 시스템에 통합 참고 : 프로그래밍 소스 A와 소스 B (플레이트 레이아웃 그림 1 참조) 사이의 세 가지 음향 전송을 허용하는 판 포맷하고 (음향 유체 디스펜서의 제조 업체에 의해 제공) 용량 반응 소프트웨어가 필요합니다. 구체적으로는 1.9 상세 자동화 로봇 제어하에,이 실험에서 사용되는 액체 분배기의 사용 단계 (재료 표 참조) : <ol><li> 로봇의 판 호텔 섹션에로드 소스 접시와 분석 플레이트. </li><li> 오픈 자동화 된 로봇 소프트웨어 및로드 플레이트 재 포맷 및 용량 반응 프로그램 확장 프로토콜. &#39;실행&#39;을 클릭합니다. 참고 : 자동화 소스 플레이트 B의 열 6-10로 소스 플레이트 (A)의 열 1-5에서 250 NL을 전송하는 음향 유체 디스펜서를 지시하고, 두 번째 ACOUSTI섞어 15 ㎕의 분석 완충액으로 백필 더 큰 유체 볼륨을 처리 할 수있는 C 액 디스펜서. 자동화는 통합 원심 분리기 1 분 동안 300 XG에 원심 분리기 (적절한 균형 판은 모든 원심 분리 단계를 포함)에 소스 판 B를 전송합니다. 소스 플레이트 B 소스 판 A의 열 11-15로 소스 플레이트 B의 열 6-10에서 250 NL의 전송을 위해 음향 유체 분배기로 돌아 혼합 15 μl를 분석 버퍼 백필됩니다. 통합 원심 분리기 1 분 동안 300 XG에 원심 분리기에 자동화 전송 소스 플레이트를했다. 소스 플레이트 (A)는 다음 소스 판 B의 열을 16-20로 소스 플레이트 (A)의 열이 11 ~ 15에서 250 NL의 전송을 위해 음향 유체 분배기로 돌아 혼합 15 μl를 분석 버퍼 백필됩니다. 자동화는 1 분 300 XG에 통합 원심 분리기 및 원심 분리기에 소스 판 B를 전송합니다. 주 : 마지막 투여 량 반응 프로토콜을 전송하는 탄성 분배 지시(소스 플레이트 A와 소스 플레이트 B 모두에서) 4 직렬 희석 소스 판 우물의 각에서 필요한 볼륨을 분석 플레이트에 중복으로 전체 11 점 곡선을 구성하는 (위의 단계 1.2에서 5 ㎕를 분석 버퍼로 미리 채워진 ). 자동화 통합 원심 분리기에 전송 분석 플레이트 및 원심 분리기 1 분 300 XG에. </li></ol></li></ol> 2. 셀 준비 <ol><li> 20 mL의 분석 완충액에서 37 ºC 수욕 재현 탁하고 빠르게 목표 마우스 GLP-1 수용체를 발현 녹여 동결 보존 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포. </li><li> 실온에서 200 XG (RT)에서 5 분 동안 원심 분리 세포 현탁액. 적절한 균형을 포함합니다. </li><li> 뜨는을 취소하고 10 ml의 분석 버퍼에 세포 펠렛을 재현 탁. </li><li> 트리 판 블루 1 및 자동 세포 계수기를 사용하여 생존 세포 밀도를 결정 : 세포 스톡 1 희석. 아 당 8,000 세포 (동등한 ml의 1.6 × 10 6 세포에서 분석 버퍼에 재현 탁 세포분석 판 리터). </li><li> 실온에서 30 분 동안 (5 μL를 분석 완충액에 희석 한 펩티드를 포함)을 분석 플레이트의 각 웰에 세포 현탁액을 5 μL를 추가 배양 벌크 시약 디스펜서를 사용한다. </li></ol> 3. HTRF 캠프 탐지 분석 <ol><li> 사용하기 전에 30 분 동안 실온 HTRF의 cAMP 분석 키트를 준비한다. </li><li> (캠프 검출법의 제조자에 의해 제공된 고유의 제제) 용해 완충액에 희석 1시 20분 별도로 각 HTRF 시약 (크립 테이트 및 D2)을 준비한다. 참고 :주의 : 용해 버퍼가 칼륨 독성 플루오 라이드 (KF)과 기형 (13)를 포함한다. 폐기, KF를 포함하는 분석 플레이트를 밀봉하고 소각 및 액체 폐기물은 이전 싱크대 아래로 폐기 물 &lt;1 밀리몰 / L로 희석해야한다. </li><li> 분석 플레이트의 모든 웰에 5 μL의 크립 테이트 시약을 추가 벌크 시약 디스펜서를 사용합니다. </li><li> 콜럼 5 μL의 D2 시약을 추가 벌크 시약 디스펜서를 사용NS 분석 판 1-22. </li><li> 수작업의 비 - 특이 적 결합 (NSB) 대조군 웰과 웰 E23-P24에 D2 시약 5 μl를 제공하기 위해 분석 플레이트의 웰 A23-D24에 5 ㎕의 용해 완충액을 피펫. </li><li> 우물을 섞어 실온에서 200 XG에서 1 분 동안 분석 플레이트를 원심 분리기. </li><li> 증발 및 사진 표백을 최소화하고 1 시간 동안 실온에서 배양 분석 플레이트를 커버. </li><li> 620 nm에서 플레이트 리더를 사용하여 665 nm에서 320 nm의 여기 및 발광을 사용하여 형광 공명 에너지 전달 (FRET) 신호를 측정한다. </li></ol> 4. 데이터 분석 <ol><li> 모든 우물에서 배경을 뺄 NSB을 의미합니다. </li><li> 다음과 같이 665 나노 미터 / 620 nm의 비율에서 % 델타 F를 계산합니다 : 비율 = (A 665nm / A 620 ㎚)는 10 (4) X 델타 F = ((샘플 비율 - 비율 NSB) / 비율 NSB는)) × 100 여기서 비율 NSB없이 D2 시약 우물을 =. </li><li> %의 activat을 계산다음 자극되지 않은 세포와 세포 사이의 이온 최대 GLP-1을 리간드로 자극 : % 활성 = (% Fsample 델타가 - %가 DeltaFunstimulated 셀) / (%의 DeltaFGLP-1 세포 자극 - % DeltaF 자극되지 않은 세포) × 100 </li><li> 기준 제어부 (1)에 의해 정의 된 바와 같은 활성 % 4- 매개 변수 병참 분석 그래프를 통해 농도 - 반응 곡선을 분석한다. </li></ol>

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</ol>

The authors have nothing to disclose.

이 프로토콜은 직렬 샘플의 1 μl를 필요로하는 3 × 106의 농도 범위 펩티드 시료를 희석하는 자동 분배 탄성의 성공적인 적용을 설명한다. 이 방법의 가장 큰 장점은 일반적으로 시약 전송 및 믹싱에 필요한 실험 용기 (예 : 피펫 팁 등) plasticware에 샘플 감소 노출을 통해 plasticware에 펩타이드의 흡착을 최소화를 통해 데이터 품질을 높이는 것입니다. 탄성 분배 완전히 plasticware의 사용을 배제...

GLP-1R은 제 2 형 당뇨병 (2)의 처리에서 설정된 약물 표적이다. 이 수용체에 대한 천연 펩티드 작용제, GLP-1은 2-3 분 (3)의 생체 내 반감기를 갖는다. 아데 닐 레이트 사이 클라 제의 활성화에 네이티브 G 단백질의 커플 링을 통해 제 메신저는 cAMP의 하류 생산의 G 단백질 결합 수용체 표적 결과 GLP-1의 결합. 축적 된 캠프의 측정은 강력한 분석 수용체 활성화를 모니터링하고 선호하는 물리 화학적 특성을 가진 활성 GLP-1 유사체에 대한 선별을 제공합니다. 이러한 분석은 농도 - 반응 곡선을 구성하기 시험 샘플의 일련의 희석을 필요로하고, 펩티드 샘플 나눠 때 특히 복잡하다. 팁 기반 일련 희석 준비에서 잠재적 인 오류는 이전에 1,4,5 설명 하였다. 펩타이드는 신뢰할 수없는 힘 추정 결과, plasticware에 흡착됩니다. 펩티드 손실 t 통해 최소화 될 수있다그는 소 혈청 버퍼에서 알부민 (BSA)와 실리콘 처리 plasticware의 사용, 아직 결합 단백질의 포함은 예측할 수없는 남아 있습니다. 특히, 실험 용기에 GLP-1의 결합의 편차가 6을 설명 하였다. 수성 분석 완충액으로 팁, 마이크로 타이 터 플레이트에서 침출 단백질 기능 (7, 8)을 방해 할 수 실험실 plasticware에 사용 된 안정 화제의 또 다른 합병증이있다. 따라서, 방법 plasticware 노출을 감소시키기는 측정의 정확성을 증가시킬 필요가있다. 어쿠스틱 액체 디스펜서 인접 분석 플레이트 (9)로 정밀한 나노 리터 액적 토출의 결과, 유체 시료의 표면에 고주파 음향 신호를 집중한다. 탄성 분사의 사용은 제조 및 대형 합성 화합물 라이브러리의 스크리닝을위한 제약 산업 표준 및 기술은 잘 작은 molecul 대한 검증되었습니다에스 10. 우리의 지식, 우리는 재조합 및 합성 펩타이드의 제조를위한 음향 분배를 설명하는 첫 번째 그룹이며, 우리는 이전에 기존의 팁 기반의 방법 1에 비해 향상된 정확도를보고했다. 이 문서에서는 완전히 자동화 된 플레이트 처리 로봇 시스템에 비접촉 음향 전송에 의한 펩타이드 직렬 및 직접 희석의 준비의 통합을 설명합니다. 샘플 음향 전달을 감싸는 다수의 방법은 이전에 11 설명되었다. 우리는 2 단계 방법의 중간 스톡 농도를 준비하고 직렬의 전체 용량 - 반응 곡선의 생성에 대한 펩타이드 유사체 희석을 이용한다. 제조 된 펩타이드는 세포를 대상 마우스 GLP-1R 발현과 함께 배양하고, 우리는 펩티드 작동 제의 액티브의 판독 이러한 세포 내에서의 cAMP 축적을 측정하기 위해, 시판 균질 시간 - 분해 형광 (HTRF) 분석을 사용하여성만. 상기 분석은 견고하고 높은 처리량 384- 웰 포맷 의무 일상적 모두 분석법 개발에 적용되는 약물 스크리닝 (12)을 투사한다.

<table><tbody><tr><td>Hanks&amp;rsquo; Balanced Salt solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H8264</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>3-Isobutyl-1-methylxanthine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I7018</td><td>Prepared as a 0.5 M stock in DMSO</td></tr><tr><td>GLP-1 (7-36) amide</td><td>Bachem</td><td>H-6795</td><td>Prepared as a 1 mg/ml stock in PBS, referred to as &#039;100x reference control&#039;</td></tr><tr><td>Test peptides</td><td>Produced in-house at MedImmune</td><td></td><td>Supplied at various concentrations in DMSO or PBS as appropriate</td></tr><tr><td>100x peptide stock</td><td>Produced in-house at MedImmune</td><td></td><td>Test peptide diluted into assay buffer to 100x final required concentration</td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Cedex XS Cell Analyzer</td><td>Innovatis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Corning 384 well plates, low volume</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>4514</td><td></td></tr><tr><td>Echo Qualified 384-Well Polypropylene Microplate</td><td>Labcyte Inc.</td><td>P-05525</td><td></td></tr><tr><td>Echo Qualified Reservoir</td><td>Labcyte Inc.</td><td>ER-0055</td><td></td></tr><tr><td>Echo 550 Liquid Handler</td><td>Labcyte Inc.</td><td></td><td>Droplet transfer volumes in increments of 2.5 nl</td></tr><tr><td>Echo 525 Liquid Handler</td><td>Labcyte Inc.</td><td></td><td>Droplet transfer volumes in increments of 25 nl</td></tr><tr><td>ACell Benchtop Automation&amp;nbsp;</td><td>HighRes Biosolutions</td><td>MC522</td><td></td></tr><tr><td>Cellario Lab Automation Scheduling software for Life Science Robotics</td><td>HighRes Biosolutions</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MultidropCombi Reagent Dispenser</td><td>ThermFisher Scientific</td><td>5840300</td><td>Referred to as &#039;bulk reagent dispenser&#039;</td></tr><tr><td>HTRF cAMP Dynamic 2 kit</td><td>Cisbio Bioassays</td><td>62AM4PEJ</td><td></td></tr><tr><td>EnVision Multilabel Reader</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

automated acoustic dispensing for the serial dilution of peptide agonists in potency determination assays

소분자 약물 발견과 같이, 펩티드 작동 선별하여 농도 - 반응 곡선을 생성하는 펩티드의 일련의 희석을 필요로한다. 펩티드를 스크리닝 종래 팁 기반 시료 처리 방법을 통해 흡착 펩티드 손실 증가 된 기회를 제공 plasticware 큰 표면적에 노출 펩티드로 복잡한 계층을 제공한다. plasticware 과도한 노출을 방지하는 플라스틱에 대한 밀착성을 통해 펩티드 손실을 감소시키고, 따라서 효능 예측의 부정확성을 최소화하고, 우리는 이전 펩티드 작동 (1)의 시험 관내 높은 처리량 스크리닝 분배 비접촉 탄성의 장점을 설명하고있다. 여기서는 마우스 글루카곤 유사 펩타이드 -1 수용체 (GLP-1R)에 펩티드 작동 스크리닝의 예를 이용하여 마이크로 타이 터 플레이트 펩티드 계열 희석 비접촉 탄성 제조 완전히 통합 된 자동화 솔루션을 논의한다. 우리의 방법은 높은 허용-throughput 작용제에 대한 화면을 분석 세포 기반 쉽게 증가 시료 처리를 지원하기 위해, 또는 (기타 표적 세포주 패널, 예) 분석 플레이트 사본 수가 증가를 허용하도록 확장 가능하다.

<html> 우리는 일상적 탄성 송금 펩티드 희석 두 단계 방법을 사용한다. 첫 번째 단계의 경우, 자동으로 정렬 음향 디스펜서는 두 개의 소스 판에서 네 재고 펩타이드 중간 희석액을 만드는 데 사용됩니다 (그림 1A, B). 두 번째 단계에서, 우리는 상기 각 테스트 펩티드 (도 1C)에 대한 11 점의 농도 범위를 만들기 위해 소스 판 A 및 B에서 스?...

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Automated Acoustic Dispensing for the Serial Dilution of Peptide Agonists in Potency Determination Assays

Peptide adsorption to plasticware during traditional tip-based serial dilutions can significantly impact potency determination and confound the understanding of structure-activity relationships used for lead identification and lead optimization phases of drug discovery. Here methods for automated acoustic non-contact serial dilution of peptide samples are described.

효능 판별 분석에서 펩타이드 작용제의 직렬 희석에 대한 분배 자동 음향

As with small molecule drug discovery, screening for peptide agonists requires the serial dilution of peptides to produce concentration-response curves. ...

automated-acoustic-dispensing-for-serial-dilution-peptide-agonists

Research

JoVE Journal

Biochemistry

7.6K 조회수.  MedImmune. Peptide adsorption to plasticware during traditional tip-based serial dilutions can significantly impact potency determination and confound the understanding of structure-activity relationships used for lead identification and lead optimization phases of drug discovery. Here methods for automated acoustic non-contact serial dilution of peptide samples are described. 

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High-Throughput DNA Plasmid Multiplexing and Transfection Using Acoustic Nanodispensing Technology

Cell transfection, indispensable for many biological studies, requires controlling many parameters for an accurate and successful achievement. Most often performed at low throughput, it is moreover time-consuming and error-prone, even more so when multiplexing several plasmids. We developed an easy, fast, and accurate method to perform cell transfection in a 384-well plate layout using acoustic droplet ejection (ADE) technology. The nanodispenser device used in this study&#160;is based on this technology and allows precise nanovolume delivery at high speed from a source well plate to a destination one. It can dispense and multiplex DNA and transfection reagent according to a predesigned spreadsheet. Here we present an optimal protocol to perform ADE-based high-throughput plasmid transfection which makes it possible to reach an efficiency of up to 90% and a nearly 100% cotransfection in cotransfection experiments. We extend initial work by proposing a user-friendly spreadsheet-based macro, able to manage up to four plasmids/wells from a library containing up to 1,536 different plasmids, and a tablet-based pipetting guide application. The macro designs the necessary template(s) of the source plate(s) and generates the ready-to-use files for the nanodispenser and tablet-based application. The four-steps transfection protocol involves i) a diluent dispense with a classical liquid handler, ii) plasmid distribution and multiplexing, iii) a transfection reagent dispense by the nanodispenser, and iv) cell plating on the prefilled wells. The described software-based control of ADE plasmid multiplexing and transfection allows even nonspecialists in the field to perform a reliable cell transfection in a fast and safe way. This method enables rapid identification of optimal settings for a given cell type and can be transposed to higher-scale and manual approaches. The protocol eases applications, such as human ORFeome protein (set of open reading frames [ORFs] in a genome) expression or CRISPR-Cas9-based gene function validation, in nonpooled screening strategies.

This protocol describes high-throughput plasmid transfection of mammalian cells in a 384-well plate using acoustic droplet ejection technology. The time-consuming, error-prone DNA dispensing and multiplexing, but also the transfection reagent dispensing, are software-driven and performed by a nanodispenser device. The cells are then seeded in these prefilled wells.

음향 나노 디스펜싱 기술을 사용한 고처리량 DNA 플라스미드 멀티플렉싱 및 트랜스펙션

Cell transfection, indispensable for many biological studies, requires controlling many parameters for an accurate and successful achievement. Most often ...

연구

유전학

Reliable Mechanochemistry: Protocols for Reproducible Outcomes of Neat and Liquid Assisted Ball-mill Grinding Experiments

The equilibrium outcomes of ball mill grinding can dramatically change as a function of even tiny variations in the experimental conditions such as the presence of very small amounts of added solvent. To reproducibly and accurately capture this sensitivity, the experimentalist needs to carefully consider every single factor that can affect the ball mill grinding reaction under investigation, from ensuring the grinding jars are clean and dry before use, to accurately adding the stoichiometry of the starting materials, to validating that the delivery of solvent volume is accurate, to ensuring that the interaction between the solvent and the powder is well understood and, if necessary, a specific soaking time is added to the procedure. Preliminary kinetic studies are essential to determine the necessary milling time to achieve equilibrium. Only then can exquisite phase composition curves be obtained as a function of the solvent concentration under ball mill liquid assisted grinding (LAG). By using strict and careful procedures analogous to the ones here presented, such milling equilibrium curves can be obtained for virtually all milling systems. The system we use to demonstrate these procedures is a disulfide exchange reaction starting from the equimolar mixture of two homodimers to obtain at equilibrium quantitative heterodimer. The latter is formed by ball mill grinding as two different polymorphs, Form A and Form B. The ratio R = [Form B] / ([Form A] + [Form B]) at milling equilibrium depends on the nature and concentration of the solvent in the milling jar.

We present detailed procedures to produce experimental equilibrium curves of the phase composition as a function of solvent concentration in a solid state system under milling conditions.

신뢰할 수 있는 Mechanochemistry: 스트레이트 및 액체의 재현 결과 대 한 프로토콜 지원 볼 밀 분쇄 실험

The equilibrium outcomes of ball mill grinding can dramatically change as a function of even tiny variations in the experimental conditions such as the ...

화학

Scalable High Throughput Selection From  Phage-displayed Synthetic Antibody Libraries

The demand for antibodies that fulfill the needs of both basic and clinical research applications is high and will dramatically increase in the future. However, it is apparent that traditional monoclonal technologies are not alone up to this task. This has led to the development of alternate methods to satisfy the demand for high quality and renewable affinity reagents to all accessible elements of the proteome. Toward this end, high throughput methods for conducting selections from phage-displayed synthetic antibody libraries have been devised for applications involving diverse antigens and optimized for rapid throughput and success. Herein, a protocol is described in detail that illustrates with video demonstration the parallel selection of Fab-phage clones from high diversity libraries against hundreds of targets using either a manual 96 channel liquid handler or automated robotics system. Using this protocol, a single user can generate hundreds of antigens, select antibodies to them in parallel and validate antibody binding within 6-8 weeks. Highlighted are: i) a viable antigen format, ii) pre-selection antigen characterization, iii) critical steps that influence the selection of specific and high affinity clones, and iv) ways of monitoring selection effectiveness and early stage antibody clone characterization. With this approach, we have obtained synthetic antibody fragments (Fabs) to many target classes including single-pass membrane receptors, secreted protein hormones, and multi-domain intracellular proteins. These fragments are readily converted to full-length antibodies and have been validated to exhibit high affinity and specificity. Further, they have been demonstrated to be functional in a variety of standard immunoassays including Western blotting, ELISA, cellular immunofluorescence, immunoprecipitation and related assays. This methodology will accelerate antibody discovery and ultimately bring us closer to realizing the goal of generating renewable, high quality antibodies to the proteome.

A method is described with visual accompaniment for conducting scalable, high throughput selections from phage-displayed combinatorial synthetic antibody libraries against hundreds of antigens simultaneously. Using this parallel approach, we have isolated antibody fragments that exhibit high affinity and specificity for diverse antigens that are functional in standard immunoassays.

파지 - 표시 합성 항체 라이브러리의 확장 성 높은 처리량 선택

The demand for antibodies that fulfill the needs of both basic and clinical research applications is high and will dramatically increase in the future. ...

면역학 및 감염병학

Automated Robotic Liquid Handling Assembly of Modular DNA Devices

Recent advances in modular DNA assembly techniques have enabled synthetic biologists to test significantly more of the available &#34;design space&#34; represented by &#34;devices&#34; created as combinations of individual genetic components. However, manual assembly of such large numbers of devices is time-intensive, error-prone, and costly. The increasing sophistication and scale of synthetic biology research necessitates an efficient, reproducible way to accommodate large-scale, complex, and high throughput device construction.
Here, a DNA assembly protocol using the Type-IIS restriction endonuclease based Modular Cloning (MoClo) technique is automated on two liquid-handling robotic platforms. Automated liquid-handling robots require careful, often times tedious optimization of pipetting parameters for liquids of different viscosities (e.g. enzymes, DNA, water, buffers), as well as explicit programming to ensure correct aspiration and dispensing of DNA parts and reagents. This makes manual script writing for complex assemblies just as problematic as manual DNA assembly, and necessitates a software tool that can automate script generation. To this end, we have developed a web-based software tool, http://mocloassembly.com, for generating combinatorial DNA device libraries from basic DNA parts uploaded as Genbank files. We provide access to the tool, and an export file from our liquid handler software which includes optimized liquid classes, labware parameters, and deck layout. All DNA parts used are available through Addgene, and their digital maps can be accessed via the Boston University BDC ICE Registry. Together, these elements provide a foundation for other organizations to automate modular cloning experiments and similar protocols.
The automated DNA assembly workflow presented here enables the repeatable, automated, high-throughput production of DNA devices, and reduces the risk of human error arising from repetitive manual pipetting. Sequencing data show the automated DNA assembly reactions generated from this workflow are ~95% correct and require as little as 4% as much hands-on time, compared to manual reaction preparation.

Here, an automated workflow to perform modular DNA &#34;device&#34; assembly using a modular cloning DNA assembly method on liquid-handling robots is presented. The protocol uses an intuitive software tool for generating liquid handler picklists for combinatorial DNA device library generation, which we demonstrate using two liquid handling platforms.

모듈형 DNA 장치 조립 로봇 액체 처리 자동화

Recent advances in modular DNA assembly techniques have enabled synthetic biologists to test significantly more of the available &#34;design space&#34; ...

생체공학

A Semi-automated Approach to Preparing Antibody Cocktails for Immunophenotypic Analysis of Human Peripheral Blood

Immunophenotyping of peripheral blood by flow cytometry determines changes in the frequency and activation status of peripheral leukocytes during disease and treatment. It has the potential to predict therapeutic efficacy and identify novel therapeutic targets. Whole blood staining utilizes unmanipulated blood, which minimizes artifacts that can occur during sample preparation. However, whole blood staining must also be done on freshly collected blood to ensure the integrity of the sample. Additionally, it is best to prepare antibody cocktails on the same day to avoid potential instability of tandem-dyes and prevent reagent interaction between brilliant violet dyes. Therefore, whole blood staining requires careful standardization to control for intra and inter-experimental variability.
Here, we report deployment of an automated liquid handler equipped with a two-dimensional (2D) barcode reader into a standard process of making antibody cocktails for flow cytometry. Antibodies were transferred into 2D barcoded tubes arranged in a 96 well format and their contents compiled in a database. The liquid handler could then locate the source antibody vials by referencing antibody names within the database. Our method eliminated tedious coordination for positioning of source antibody tubes. It provided versatility allowing the user to easily change any number of details in the antibody dispensing process such as specific antibody to use, volume, and destination by modifying the database without rewriting the scripting in the software method for each assay.
A proof of concept experiment achieved outstanding inter and intra- assay precision, demonstrated by replicate preparation of an 11-color, 17-antibody flow cytometry assay. These methodologies increased overall throughput for flow cytometry assays and facilitated daily preparation of the complex antibody cocktails required for the detailed phenotypic characterization of freshly collected anticoagulated peripheral blood.

Whole blood Immunophenotyping is indispensable for monitoring the human immune system. However, the number of reagents required and the instability of specific fluorochromes in premixed cocktails necessitates daily reagent preparation. Here we show that semi-automated preparation of staining antibody cocktail helps establish reliable immunophenotyping by minimizing variability in reagent dispensing.

사람 말초 혈액의 Immunophenotypic 분석에 대한 항체 칵테일을 준비하는 반 자동화 된 접근

Immunophenotyping of peripheral blood by flow cytometry determines changes in the frequency and activation status of peripheral leukocytes during disease ...

Optimizing the Use of a Liquid Handling Robot to Conduct a High Throughput Forward Chemical Genetics Screen of Arabidopsis thaliana

Chemical genetics is increasingly being employed to decode traits in plants that may be recalcitrant to traditional genetics due to gene redundancy or lethality. However, the probability of a synthetic small molecule being bioactive is low; therefore, thousands of molecules must be tested in order to find those of interest. Liquid handling robotics systems are designed to handle large numbers of samples, increasing the speed with which a chemical library can be screened in addition to minimizing/standardizing error. To achieve a high-throughput forward chemical genetics screen of a library of 50,000 small molecules on Arabidopsis thaliana (Arabidopsis), protocols using a bench-top multichannel liquid handling robot were developed that require minimal technician involvement. With these protocols, 3,271 small molecules were discovered that caused visible phenotypic alterations. 1,563 compounds induced short roots, 1,148 compounds altered coloration, 383 compounds caused root hair and other, non-categorized, alterations, and 177 compounds inhibited germination.

Optimizing the Use of a Liquid Handling Robot to Conduct a High Throughput Forward Chemical Genetics Screen of Arabidopsis thaliana

A high throughput screen of synthetic small molecules was conducted on the model plant species, Arabidopsis thaliana. This protocol, developed for a liquid handling robot, increases the speed of forward chemical genetics screens, accelerating the discovery of novel small molecules affecting plant physiology.

높은 처리량 앞으로 화학 유전학의 화면 애기 thaliana 을 액체 처리 로봇의 사용을 최적화

Chemical genetics is increasingly being employed to decode traits in plants that may be recalcitrant to traditional genetics due to gene redundancy or ...

Antimicrobial Synergy Testing by the Inkjet Printer-assisted Automated Checkerboard Array and the Manual Time-kill Method

As rates of multidrug-resistant (MDR) pathogens continue to rise, outpacing the development of new antimicrobials, novel approaches to treatment of MDR bacteria are increasingly becoming a necessity. One such approach is combination therapy, in which two or more antibiotics are used together to treat an infection against which one or both of the drugs may be ineffective alone. When two drugs, in combination, exert a greater than additive effect, they are considered synergistic. In vitro investigation of synergistic activity is an important first step in evaluating the possible efficacy of drug combinations. Two main in vitro synergy testing methods have been developed: the checkerboard array and the time-kill study. In this paper, we present an automated checkerboard array method that makes use of inkjet printing technology to increase the efficiency and accuracy of this technique, as well as a standard manual time-kill synergy method. The automated checkerboard array can serve as a high-throughput screening assay, while the manual time-kill study provides additional, complementary data on synergistic activity and killing.
The checkerboard array is a modification of standard minimum inhibitory concentration (MIC) testing, in which bacteria are incubated with antibiotics at different concentration combinations and evaluated for growth inhibition after overnight incubation. Manual performance of the checkerboard array requires a laborious and error-prone series of calculations and dilutions. In the automated method presented here, the calculation and dispensing of required antibiotic stock solution volumes are automated through the use of inkjet printer technology. In the time-kill synergy assay, bacteria are incubated with the antibiotics of interest, both together and individually, and sampled at intervals over the course of 24 h for quantitative culture. The results can determine whether a combination is synergistic and whether it is bactericidal, and provide data on inhibition and killing of bacteria over time.

Antimicrobial synergy testing is used to evaluate the effect of two or more antibiotics used in combination and is typically performed by one of two methods: the checkerboard array or the time-kill assay. Here, we present an automated, inkjet printer-assisted checkerboard array synergy technique and a classic time-kill synergy study.

잉크젯 프린터 기반으로 테스트 자동화 된 바둑판 배열 및 수동 시간 죽 일 방법 항균 시너지

As rates of multidrug-resistant (MDR) pathogens continue to rise, outpacing the development of new antimicrobials, novel approaches to treatment of MDR ...

<meta charset="utf8"></head><body>Dual Reporters를 사용한 Mycobacterium abscessus 에 대한 High-Throughput Screening Assay

Assay Development for High-Throughput Drug Screening Against Mycobacteria

Mycobacterium abscessus (Mab) infections are challenging to treat due to high intrinsic drug resistance, comparable to multidrug-resistant tuberculosis. Treatments are extremely ineffective and based on a multi-drug regimen, resulting in low patient compliance. Consequently, the scientific community is urged to identify new and effective drugs to treat these infections. One of the strategies employed to this end is drug repurposing - the process of identifying new therapeutic opportunities for existing drugs in the market, circumventing the time required to establish pharmacokinetic and safety profiles of new drugs. With most studies on drug development against Mab relying on traditional and time-consuming methods, an assay for high-throughput drug screening was developed against mycobacteria using an in house developed double-reporter strain of Mab. Using liquid-handling robotics, automated microscopy, and analysis, alongside in house developed double reporter strains, bacterial viability can be rapidly measured using two different readouts, luminescence and fluorescence, without adding reagents or performing any extra steps. This reduces time and variability between assays, a major advantage for high-throughput screenings. The described protocol was validated by screening a library of 1280 compounds. The obtained results were corroborated by the literature, with efficient detection of active compounds. Thus, this work fulfilled the aim of supplying the field with a new tool to help fight this extremely drug-resistant bacteria.

<meta charset="utf8"></head><body>저자 스포트라이트: M. abscessus 치료법의 효율적인 발견을 위한 확장 가능한 약물 스크리닝 프로토콜

This study developed an assay for high-throughput screening against Mycobacterium abscessus with a&#160;recently created double reporter strain, using fluorescence and luminescence to assess bacterial viability quickly. This protocol will be relevant for researchers aiming to screen new drugs against this drug-resistant bacteria.

Mycobacteria에 대한 고처리량 약물 스크리닝을 위한 분석 개발

Mycobacterium abscessus (Mab) infections are challenging to treat due to high intrinsic drug resistance, comparable to multidrug-resistant tuberculosis. ...

효능 판별 분석에서 펩타이드 작용제의 직렬 희석에 대한 분배 자동 음향

요약

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음향 나노 디스펜싱 기술을 사용한 고처리량 DNA 플라스미드 멀티플렉싱 및 트랜스펙션

신뢰할 수 있는 Mechanochemistry: 스트레이트 및 액체의 재현 결과 대 한 프로토콜 지원 볼 밀 분쇄 실험

파지 - 표시 합성 항체 라이브러리의 확장 성 높은 처리량 선택

모듈형 DNA 장치 조립 로봇 액체 처리 자동화

사람 말초 혈액의 Immunophenotypic 분석에 대한 항체 칵테일을 준비하는 반 자동화 된 접근

높은 처리량 앞으로 화학 유전학의 화면 애기 thaliana 을 액체 처리 로봇의 사용을 최적화

잉크젯 프린터 기반으로 테스트 자동화 된 바둑판 배열 및 수동 시간 죽 일 방법 항균 시너지

Mycobacteria에 대한 고처리량 약물 스크리닝을 위한 분석 개발

Mycobacteria에 대한 고처리량 약물 스크리닝을 위한 분석 개발

Mycobacteria에 대한 고처리량 약물 스크리닝을 위한 분석 개발