We gratefully acknowledge support by the Harold and Pauline Price Chair in Ophthalmology and the Jules Stein Eye Institute to MBG, the NEI Core grant (EY00331-43) to SN. Research was supported in part by a generous gift from the Sakaria family to SN and MGB, and from an unrestricted grant from the Research to Prevent Blindness to the Department of Ophthalmology. We thank Charlotte Yiyi Wang at Berkeley School of Optometry for obtaining initial OCT images of subretinal injections.

동물 : 로스 앤젤레스 캘리포니아 대학 (UCLA)에서 자란 야생 형 C57BL / 6J 마우스. 17주 세, 남성과 여성의 쥐를 포함 - 모든 동물 (11)이었다. 모든 마우스 그룹 수납 임의의 사료 및 물과 함께 12시 12분 / 암주기에서 유지시켰다. 모든 실험은 안과 및 비전 연구에서 동물의 사용을위한 UCLA 및 비전 연구 협회와 안과 정책의 제도적 지침에 따라 수행되었다. 참고 : 모든 약물과 주사 에이전트가 미국 약전 (USP) 등급이다. 1. 수술 준비 <ol><li> 식염수 믹스 100 ㎎ / ㎏ 케타민 8 ㎎ / ㎏ 자일 라진의 복강 내 주사로 마우스를 마취. 마우스가 더 발가락 핀치 또는 각막 터치 반사가 없도록 깊이로 마취를 관리 할 수 ​​있습니다. </li><li> 순환 물 패드와 37.0 ° C에서 체온을 유지한다. </li><li> 2.5 % 페닐에 눈 D와 학생들을 팽창ROPS 및 트림 수염이 시각화를 용이하게한다. 수염 따라서, 위스커가 눈에 명확 블록 액세스하지 위스커의베이스 부분만을 제거한다 트리밍 마우스 상당한 감각 입력을 제공한다. 우리의 경험에 의하면, 마우스는이 절차 후 정상 회복을 보여줍니다. 메틸 눈을 적용하면 건조를 방지하고 마취 유도 과도 백내장 (13)을 최소화하기 위해 삭제합니다. </li><li> 수술 (즉, betadine와 에탄올 또는 뜨거운 구슬) 이전에 악기를 소독. </li><li> 시각화를 수행 할 경우 무균 환경에서 희석 형광을 (0.01 % 0.9 % 식염수를 사용하여) 준비 (즉, 바이오 안전성 캐비닛) (아래 섹션 3 참조). </li></ol> 2. 사출 현장 준비 <ol><li> 적절한 주입 부피 (예를 들어, 0.3-1.0 μL) 주사기 (예를 들어, 5 μL 주사기)을 준비한다. </li><li> 눈이 디에서 명확하게 볼 위로 향하게되도록 마우스를 배치현미경을 ssecting. </li><li> 부드럽게 뾰족한 집게로 시간적 결막을 꼬집어. 곡선 Vannas 가위를 사용하여 약 90 도의 원주 절개를합니다. </li><li> 기본 장부의 캡슐 단계를 반복 2.3. </li><li> 비강 지구를 회전하면서 뾰족한 집게로 주변의 결합 조직을 절제. 시신경 약 0.5 mm 일시 주사 부위를 향해 작동한다. 복고풍 궤도 동을 방해하지 않도록 세심한주의를 사용합니다. </li></ol> 3. 공막과 망막 주입 참고 :이 절차를 배우면서 0.9 %의 식염수에 0.01 %의 형광의 주입이 시각화 지원하기 위해 사용하는 것이 좋습니다. 형광의 지형 분포를 효과적으로 안저 화상 (아래 섹션 4 참조)과 함께 설명 될 수있다. <ol><li> 부드럽게 22.5도 안과 블레이드와 아이 컵을 긁는하여 주사 부위에 작은 공막 절개를합니다. 이 절개 수오단, 바늘 끝이 공막을 통과 할 수 있도록 충분히 커야 신분증. </li><li> 5 각도 경 사진 33 G 바늘 (삽입 -. 경사가 직면하고 망막에 각도 병렬로 공막에 10 °를 (원하는 볼륨을 주사 예를 들어, 학습 목적으로 0.01 % 플루 오레 0.3 ~ 1.0 μL). 참고 : 철저하게 각 주입하기 전에 적당한 용매 및 탈 이온수의 연속적인 세척과 청소하여 주사기의 불임을 유지한다. </li><li> 바늘을 이동하지 않고, 심지어 압력으로 천천히 플런저 (이상 ~ 3 초) 우울. 주 : 바늘이 망막 하 공간에있을 때, 상기 플런저를 누르면서, 약간의 저항이 느껴질 것이다. 바늘 공막 또는 RPE를 관통하지 않는 경우 바늘이 망막, 높은 저항을 천공하는 경우 최소한의 저항이 더 없을 것이다. </li><li> 역류를 최소화하기 위해 바늘을 인출하기 전에 몇 초 동안 기다립니다. </li><li> 멸균 완충 식염수로 눈을 씻어 눈 시간을 보장다시 정상 위치로 회전 할있다. </li></ol> 및 OCT 안저 영상에 의한 망막 박리 4. 평가 <ol><li> 즉시 주사의 품질을 평가하기위한 주사 후 적절한 시간에 간섭 단층 촬영을 수행하는 망막 구조를 평가하는 데 필요한 포스트 분사를 가리킨다. 주의 : 유사한 연구에서의 OCT 사용의 예는 이전에 7,14을 설명 하였다. <ol><li> 조정 및 주사 부위를 대상으로 OCT의 이미지를 맞 춥니 다. 주사 부위는 중간 선 및 시신경 헤드 시간 0.5 mm이어야한다. 최적의 중심 이탈이 프레임 밖으로 경우에만 필요 여부로 반복합니다. </li></ol></li><li> 망막 박리를 시각화하고 엉 - 얼굴 안저 영상 7, 14과 주입 영역을 염색. 참고 :의 OCT 이미징 시스템을 사용할 수없는 경우, 연습 벡터와 형광 소량의 주입은 형광 angio을 수행하는 안저 카메라로 시각화 수 있습니다동일한 여기 파장을 사용하여 필터를 차단 그래피로. 하이퍼 형광의 지역화 된 영역은 혈관 아래에 표시되고 망막 하 공간이 제대로 대상으로하면 혈관이 선명하고 뚜렷한 경계를해야합니다. 사출에서 여과포의 가장자리는 하이포 형광에 하이퍼의 전환에 의해 경계가 될 것입니다. 여러 악기는 마우스이 기능을 제공한다; 여기에 사용 된 장비는 다른 14 설명한다. </li></ol> 5. 수술 후 케어 <ol><li> 주입 된 눈의 각막 표면에 트리플 항생제 안과 크림의 두꺼운 코트를 적용합니다. </li><li> 복구를위한 깨끗한 독방 새장에 마우스를 놓습니다. 그들은 완전히 회복 될 때까지 수술을받은 마우스를 함께 사용하지 마십시오. </li><li> 마취 회복 중에 호흡과 온도를 모니터링합니다. 그들은 흉골 드러 누움을 유지할 수있을 때까지 동물을 모니터링합니다. </li><li> 추가 적절한 수술 후 모니터링을 수행및 수술후 통증 관리 카프로 펜의 서브 피하 주사 (5 ㎎ / ㎏)을 포함한 치료. </li></ol> 전위도에 의해 망막 기능의 6 평가 (ERG) <ol><li> ERG 분석 미리 주입을 수행하고 적절한 시간에 망막 기능을 평가하기 위해 필요에 따라 포스트 분사. 주사는 망막 하 공간에 만들어진 경우, 망막 박리는 72 시간 내에 해결됩니다. <ol><li> 이전에 14,15을 설명한대로 전과 주입 후 망막 기능을 평가하기 위해 표준 ERG 기술을 사용합니다. </li></ol></li></ol> 7. 3D 재건 및 여과포 볼륨 정량화 참고 : 고 대비가보기의 프레임 내에서 전체 분리를 포괄와 10월 스캔이 사용하기에 최적입니다. ImageJ에 / 피지 17,18 및 Imaris이 사용되었지만, 다른 소프트웨어를 사용할 수있다. <ol><li> 관심의 B 검사를 내보내기 ImageJ에 / 피지 및 작물 (이미지&gt; 자르기)은 OCT (SC)의 부분에 가져 오기는 사각형 선택 도구를 사용하여 모델링된다. <ol><li> 콘트라스트 조정 (이미지&gt;&gt; 밝기 / 명암 대비를 조정)과 선으로 두 부분을 연결하여 누락 된 경계를 묘사. </li><li> 광 수용체 층에 RPE에 걸쳐있는 줄 도구 (들고 이동)과 직선을 그립니다. 측정 (측정&gt; 분석) 라인의 길이는 단계 7.8에 대한 최대 박리의 크기를 얻을 수있다. </li></ol></li><li> 가져 오기 &quot;회색 RGB&quot;플러그인 및 MATLAB 컴파일러 런타임을 사용해서 (재료의 표 참조) 3 차원 재구성 소프트웨어 프레임립니다. </li><li> OCT를 스캔 (X, Y, Z)에서 교정 매개 변수를 사용하여 (이미지 속성 아래) 복셀 크기를 설정합니다. </li><li> 네 번째 채널을 만들기 위해, 각 채널에 동일한 가중치와 (이미지 속성 아래) &quot;RGB 회색에&quot;플러그인을 실행합니다. 원래 빨강 - 녹색 - 파랑 채널을 삭제합니다. </li><li> 콘트라스트 변화를 이용하여 그레이 채널을 전환. 저장 이미지. </li><li> 의 &quot;추가를 클릭합니다EW 표면의 &quot;3D-보기 탭에서 버튼을 표면을 만드는 가이드 4 단계 과정을 시작합니다. <ol><li> 표면 레벨 세부 사항 (4 단계의 1)를 설정합니다. 참고 : 우리의 경험에 12.0-8.0 가장 유효 범위이었다. </li><li> (배경 선택에 따라) 최대 영역 크기 7.1.2에서 측정 된 최대 박리의 크기보다 약간 이하로 설정합니다. 회색 채널 반전 (4 단계의 2) 표면을 작성하고 취소. </li><li> 망막의 외부 음의 공간과 분리의 표면이 접촉 (4의 3 단계)로 제공하지 않도록 최대 값으로 임계 값을 설정합니다. </li><li> 복셀의 개수는 필터의 종류를 설정하고 크기별로 분리 사이트 네가티브 공간을 격리. 표면 (4 단계 4)를 완료합니다. 참고 : 분리 표면의 볼륨이 통계 탭에서 볼륨 아래에 있습니다. </li></ol></li></ol>

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</ol>

None of the authors have any commercial disclosures.

망막 주사 바이러스 벡터의 전달을위한 선택의 방법이며, 감광체와 기초 연구 및 임상 치료 모두에서 RPE를 조작하기위한 세포 유래 줄기 치료. 환자에서 망막 주사는 일반적으로 직접 시각화 바늘함으로써, 유리체에서 전방 공막과 망막의 뒤쪽 코어 유리체 절제술 및 침투를 수행하고 있습니다. 눈 수정체 이미 않는 백내장 형성 일찍 발생하는 가장 절제술 절차와 마찬가지로 일반적이다. 마우스...

망막 주사는 광 수용체 및 기본 RPE 1, 2에 미치는 영향을 연구하기 위해 쥐의 망막에 세포 및 바이러스 에이전트를 전달하는 주요 수단이다. 마우스에서 대부분의 망막 주입 프로토콜은 transcorneal 또는 적도에 transcleral 주사 부위 앞쪽 (그림 1)를 사용합니다. 이 방법은 새김 눈과 렌즈의 결과 혼탁의 감각 신경 망막과 홍채, 망막 출혈, 망막 박리 실질적이고 지속적인 망막 부종 3-9의 유리체, 침투의 무결성의 중단을 포함하는 고유의 담보가 손상 될 수 있습니다. 실험 조작은 치료 적 개입 3,7,10,11의 효과를 평가하기 위해 이러한 효과를 극복해야한다. 이 연구는, 이러한 합병증을 피할 후방 transcleral 주입 방법의 상세한 설명 및 유효성을 제공 외상을 최소화 서브 타겟팅 높은 성공률을 갖는다망막 공간. 쥐의 망막 하 공간을 대상으로 주사 종종 수행하는 것이 매우 어렵고, 대부분의 연구자들은 벡터가 잘못된 위치로 전달하거나 상당한 망막 손상은 전체 망막 박리 (6), 예를 들어 존재하는 시도 실패 고주파 발생. 때문에 사출 합병증 분석에서 제외 눈의 수는 일반적으로 마우스 연구에서보고되지 않고, 우리의 경험에서 다른 연구자와 논의 실패 주사의 수가 50 %만큼 높을 수 및 경험에 따라 달라질 수 있으며 주사를 수행하는 연구자의 기능을 제공합니다. 주입의 성공은 일반적으로 직접 안저 화상 및 / 또는 광 결맞음 단층 촬영 7,9에 의해 평가된다. 생쥐의 망막 주사에 대한 높은 성공률과 쉽게 습득 방법은 실험을 촉진하고 레의 전임상 연구의 비용을 줄일 수 있습니다미국에서 실명의 주요 원인은 망막 질환에 대한 atments. 후방은 여기에 설명 transcleral 망막 주사 기술은 임상 및 임상 프로토콜 9,12-에서 적응이다. 주입 된 쥐에서 수행 된 비 침습적 진단 평가는 온화하고 매우 지역화 피해를 입증하고 추가 담보 렌즈, 망막과 망막 색소 상피 손상이 부족하다. 따라서 이러한 연구와 연관된 비용을 감소, - (90 % 이상 80) 또한, 비교적 적은 연습, 실험자 높은 성공률 이러한 결과를 얻을 수있다. 이 절차는 전임상 연구에서 감광체 및 / 또는 행 RPE 세포 바이러스 또는 약물 치료 적 개입을 제공하도록 쉽게 실험 간섭을 평가할 수있다.

<table><tbody><tr><td>Hamilton Model 62 RN SYR</td><td>Hamilton</td><td>87942</td><td>Syringe x 1</td></tr><tr><td>Hamilton Needle 33 G, 1.0&quot;, 20 DEG, point 3 (304 stainless steel)</td><td>Hamilton</td><td>7803-05</td><td>Needles x 6</td></tr><tr><td>Vannas Curved Scissors</td><td>Ted Pella, INC.</td><td>1347</td><td>5 mm Blade</td></tr><tr><td>22.5 Degree Microsurgery Knife</td><td>Wilson Ophthalmic Corp.</td><td>91204</td><td></td></tr><tr><td>Ketaject&amp;nbsp;</td><td>Phoenix</td><td>NDC 57319-609-02</td><td>Ketamine</td></tr><tr><td>Anased</td><td>Lloyd Laboratories</td><td>NDC 61311-482-10</td><td>Xylazine</td></tr><tr><td>Fluorescein 10% AK-Fluor</td><td>Akorn</td><td>NDC 17478-253-10</td><td>100 mg/ml</td></tr><tr><td>0.9% Saline USP</td><td>Hospira</td><td>NDC 0409-4888-50</td><td>0.9% NaCl</td></tr><tr><td>Antibiotic Ointment</td><td>Akorn</td><td>NDC 17478-235-35</td><td>Ophthalmic</td></tr><tr><td>Water Circulating Pump</td><td>Gaymar</td><td>TP-500 T/Pump&amp;nbsp;</td><td>P/N 07999-000</td></tr><tr><td>sd-OCT</td><td>Bioptigen</td><td>R-Series</td><td>Commercial</td></tr><tr><td>Fundus Camera</td><td>Phoenix Research Laboratories</td><td>MICRON III</td><td></td></tr><tr><td>Tweezers Type 3</td><td>Ted Pella, INC.</td><td>5385-3SU</td><td></td></tr><tr><td>2.5% Phenylephrine</td><td>Paragon BioTeck</td><td>NDC 42702-102-15</td><td>Ophthalmic</td></tr><tr><td>IMARIS8</td><td>Bitplane</td><td></td><td>Version 8.1.2</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td>V1.8.0_77</td></tr><tr><td>Hypromellose&amp;nbsp;2.5%</td><td>Goniovisc</td><td>AX0401</td><td>Methylcellulose</td></tr><tr><td>Eye Drops (Rinse)</td><td>Bausch &amp;amp; Lomb</td><td></td><td>Saline Solution</td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Zeiss</td><td>Stemi 2000</td><td>Microscope</td></tr><tr><td>Light source</td><td>Fostec</td><td>P/N 20520</td><td>Light source</td></tr></tbody></table>

an alternative and validated injection method for accessing the subretinal space via a transcleral posterior approach

망막 주사 성공적으로 직접 감광체로 노광 및 망막 색소 상피 (RPE)를 갖는 interphotoreceptor / 망막 구획 단백질의 치료 적 개입 바이러스제, 세포를 제공하는 사람과 설치류에서 모두 사용되었다. 플라스 미노 겐의 망막 주사뿐만 아니라 최근 전임상 및 임상 시험 고급 망막 질환과 개인에게 바이러스 성 벡터와 줄기 세포를 제공하는 안전 및 / 또는 효능을 증명하고있다. 망막 질환, 특히 유전 적 망막 이영양증의 마우스 모델은 이러한 치료를 테스트하기 위해 필수적이다. 설치류에서 가장 흔한 주입 절차 망막 전방 접근 작은 transcorneal transcleral 또는 절개를 사용하는 것이다. 이 방법, 주사 바늘은 기본 RPE 및 삽입에 영향을주지 감각 신경 망막을 관통 쉽게 닉 렌즈, 렌즈 혼탁 및 비 침습적 imagi의 손상을 유발NG. transcleral를 통해 망막 하 공간에 액세스, 후방 접근 방식은 이러한 문제를 피할 수 : 바늘은 망막 침투하지 않고, 시신경에서 약 0.5 mm 공막을 통과하고 유리체을 방해 방지 할 수 있습니다. 담보 손상 초점 공막 및 과도, 장액 망막 박리의 효과와 관련이 제한됩니다. 이 방법의 단순성은 안구 손상을 최소화 망막 재 부착 빠른 복구를 보장하고, 낮은 실패율을 갖는다. 망막과 망막 색소 상피에 최소한의 손상 효과의 명확한 평가와 치료제 자신의 직접적인 영향 수 있습니다. 이 원고는, 바이러스 벡터, 약리 에이전트를 대상으로 높은 효능, 최소한의 손상과 빠른 복구와 쥐의 망막 하 공간으로 세포 나 유도 만능 줄기 (IPS) 줄기 세포에 사용할 수있는 새로운 망막 주입 기술에 대해 설명합니다.

접근 transcleral 망막 주사는 0.3 μL (N = 18), 0.5 μL (N = 8)과 0.01 %의 형광의 1.0 μL (N = 5)의 주사로 16 야생형 생쥐에서 31 건강한 눈을 수행 하였다 후방. 한쪽 눈으로 인해 구조 및 기능 분석을 방지 미리 기존의 각막 혼탁에 주입에서 제외 하였다. 모든 주입 눈이 보고서에 포함되어 있습니다. 의도하지 않은 망막 박리는 유리체에 감각 신경 망막 또는 누설의 천공은 검출되지 않...

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An Alternative and Validated Injection Method for Accessing the Subretinal Space via a Transcleral Posterior Approach

Subretinal injections are the most common technique for delivering large therapeutic agents such as proteins and viral vectors to photoreceptors and the retinal pigment epithelium. An alternative method in mice that successfully targets the subretinal space with minimal collateral damage and fast recovery times is described here.

망막 하 공간에 액세스하기위한 대안의 검증 사출 방법<i&gt;를 통해</i&gt;를 Transcleral 후방 접근

Subretinal injections have been successfully used in both humans and rodents to deliver therapeutic interventions of proteins, viral agents, and cells to ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

An Alternative and Validated Injection Method for Accessing the Subretinal Space via a Transcleral Posterior Approach

13.2K 조회수.  University of California, Los Angeles. Subretinal injections are the most common technique for delivering large therapeutic agents such as proteins and viral vectors to photoreceptors and the retinal pigment epithelium. An alternative method in mice that successfully targets the subretinal space with minimal collateral damage and fast recovery times is described here.

비디오: An Alternative and Validated Injection Method for Accessing the Subretinal Space via a Transcleral Posterior Approach

Performing Subretinal Injections in Rodents to Deliver Retinal Pigment Epithelium Cells in Suspension

The conversion of light into electrical impulses occurs in the outer retina and is accomplished largely by rod and cone photoreceptors and retinal pigment epithelium (RPE) cells. RPE provide critical support for photoreceptors and death or dysfunction of RPE cells is characteristic of age-related macular degeneration (AMD), the leading cause of permanent vision loss in people age 55 and older. While no cure for AMD has been identified, implantation of healthy RPE in diseased eyes may prove to be an effective treatment, and large numbers of RPE cells can be readily generated from pluripotent stem cells. Several interesting questions regarding the safety and efficacy of RPE cell delivery can still be examined in animal models, and well-accepted protocols used to inject RPE have been developed. The technique described here has been used by multiple groups in various studies and involves first creating a hole in the eye with a sharp needle. Then a syringe with a blunt needle loaded with cells is inserted through the hole and passed through the vitreous until it gently touches the RPE. Using this injection method, which is relatively simple and requires minimal equipment, we achieve consistent and efficient integration of stem cell-derived RPE cells in between the host RPE that prevents significant amount of photoreceptor degeneration in animal models. While not part of the actual protocol, we also describe how to determine the extent of the trauma induced by the injection, and how to verify that the cells were injected into the subretinal space using in vivo imaging modalities. Finally, the use of this protocol is not limited to RPE cells; it may be used to inject any compound or cell into the subretinal space.

Here we present a community accepted protocol in multimedia format for subretinally injecting a bolus of RPE cells in rats and mice. This approach can be used for determining rescue potentials, safety profiles, and survival capacities of grafted RPE cells upon implantation in animal models of retinal degeneration.

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The conversion of light into electrical impulses occurs in the outer retina and is accomplished largely by rod and cone photoreceptors and retinal pigment ...

연구

의학

Limbal Approach-Subretinal Injection of Viral Vectors for Gene Therapy in Mice Retinal Pigment Epithelium

The eye is a small and enclosed organ which makes it an ideal target for gene therapy. Recently various strategies have been applied to gene therapy in retinopathies using non-viral and viral gene delivery to the retina and retinal pigment epithelium (RPE). Subretinal injection is the best approach to deliver viral vectors directly to RPE cells. Before the clinical trial of a gene therapy, it is inevitable to validate the efficacy of the therapy in animal models of various retinopathies. Thus, subretinal injection in mice becomes a fundamental technique for an ocular gene therapy. In this protocol, we provide the easy and replicable technique for subretinal injection of viral vectors to experimental mice. This technique is modified from the intravitreal injection, which is widely used technique in ophthalmology clinics. The representative results of RPE/choroid/scleral complex flat-mount will help to understand the efficacy of this technique and adjust the volume and titer of viral vectors for the extent of gene transduction.

Subretinal injection is a surgical technique for effective gene delivery to retinal pigment epithelium in the mouse eye. Here we describe an easy and replicable method for subretinal injection of viral vectors to retinal pigment epithelium in experimental mice.

마우스 망막 색소 상피의 유전자 치료에 대한 바이러스 벡터의 윤부 접근 - 망막 주입

The eye is a small and enclosed organ which makes it an ideal target for gene therapy. Recently various strategies have been applied to gene therapy in ...

신경과학

A Step by Step Protocol for Subretinal Surgery in Rabbits

Age related macular degeneration (AMD), retinitis pigmentosa, and other RPE related diseases are the most common causes for irreversible loss of vision in adults in industrially developed countries. RPE transplantation appears to be a promising therapy, as it may replace dysfunctional RPE, restore its function, and thereby vision.
Here we describe a method for transplanting a cultured RPE monolayer on a scaffold into the subretinal space (SRS) of rabbits. After vitrectomy xenotransplants were delivered into the SRS using a custom made shooter consisting of a 20-gauge metallic nozzle with a polytetrafluoroethylene (PTFE) coated plunger. The current technique evolved in over 150 rabbit surgeries over 6 years. Post-operative follow-up can be obtained using non-invasive and repetitive in vivo imaging such as spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT) followed by perfusion-fixed histology.
The method has well-defined steps for easy learning and high success rate. Rabbits are considered a large eye animal model useful in preclinical studies for clinical translation. In this context rabbits are a cost-efficient and perhaps convenient alternative to other large eye animal models.

Retinal pigment epithelium (RPE) replacement strategies and gene-based therapy are considered for several retinal degenerative conditions. For clinical translation, large eye animal models are required to study surgical techniques applicable in patients. Here we present a rabbit model for subretinal surgery geared towards RPE transplantation, which is versatile and cost-efficient.

토끼의 망막 수술에 대한 단계 프로토콜에 의해 단계

Age related macular degeneration (AMD), retinitis pigmentosa, and other RPE related diseases are the most common causes for irreversible loss of vision in ...

Development of a Refined Protocol for Trans-scleral Subretinal Transplantation of Human Retinal Pigment Epithelial Cells into Rat Eyes

Degenerative retinal diseases such as age-related macular degeneration (AMD) are the leading cause of irreversible vision loss worldwide. AMD is characterized by the degeneration of retinal pigment epithelial (RPE) cells, which are a monolayer of cells functionally supporting and anatomically wrapping around the neural retina. Current pharmacological treatments for the non-neovascular AMD (dry AMD) only slow down the disease progression but cannot restore vision, necessitating studies aimed at identifying novel therapeutic strategies. Replacing the degenerative RPE cells with healthy cells holds promise to treat dry AMD in the future. Extensive preclinical studies of stem cell replacement therapies for AMD involve the transplantation of stem cell-derived RPE cells into the subretinal space of animal models, in which the subretinal injection technique is applied. The approach most frequently used in these preclinical animal studies is through the trans-scleral route, which is made difficult by the lack of direct visualization of the needle end and can often result in retinal damage. An alternative approach through the vitreous allows for direct observation of the needle end position, but it carries a high risk of surgical traumas as more eye tissues are disturbed. We have developed a less risky and reproducible modified trans-scleral injection method that uses defined needle angles and depths to successfully and consistently deliver RPE cells into the rat subretinal space and avoid excessive retinal damage. Cells delivered in this manner have been previously demonstrated to be efficacious in the Royal College of Surgeons (RCS) rat for at least 2 months. This technique can be used not only for cell transplantation but also for delivery of small molecules or gene therapies.

Subretinal injection has been widely applied in preclinical studies of stem cell replacement therapy for age-related macular degeneration. In this visualized article, we describe a less risky, reproducible and precisely modified subretinal injection technique via the trans-scleral approach to deliver cells into rat eyes.

쥐의 눈으로 인간 망막 안료 상피 세포의 트랜스 scleral Subretinal 이식에 대 한 세련 된 프로토콜의 개발

Degenerative retinal diseases such as age-related macular degeneration (AMD) are the leading cause of irreversible vision loss worldwide. AMD is ...

Retinal Pigment Epithelium Transplantation in a Non-human Primate Model for Degenerative Retinal Diseases

Retinal pigment epithelial (RPE) transplantation holds great promise for the treatment of inherited and acquired retinal degenerative diseases. These conditions include retinitis pigmentosa (RP) and advanced forms of age-related macular degeneration (AMD), such as geographic atrophy (GA). Together, these disorders represent a significant proportion of currently untreatable blindness globally. These unmet medical needs have generated heightened academic interest in developing methods of RPE replacement. Among the animal models commonly utilized for preclinical testing of therapeutics, the non-human primate (NHP) is the only animal model that has a macula. As it shares this anatomical similarity with the human eye, the NHP eye is an important and appropriate preclinical animal model for the development of advanced therapy medicinal products (ATMPs) such as RPE cell therapy.
This manuscript describes a method for the submacular transplantation of an RPE monolayer, cultured on a polyethylene terephthalate (PET) cell carrier, underneath the macula onto a surgically created RPE wound in immunosuppressed NHPs. The fovea-the central avascular portion of the macula-is the site of the greatest mechanical weakness during the transplantation. Foveal trauma will occur if the initial subretinal fluid injection generates an excessive force on the retina. Hence, slow injection under perfluorocarbon liquid (PFCL) vitreous tamponade is recommended with a dual-bore subretinal injection cannula at low intraocular pressure (IOP) settings to create a retinal bleb. 
Pretreatment with an intravitreal plasminogen injection to release parafoveal RPE-photoreceptor adhesions is also advised. These combined strategies can reduce the likelihood of foveal tears when compared to conventional techniques. The NHP is a key animal model in the preclinical phase of RPE cell therapy development. This protocol addresses the technical challenges associated with the delivery of RPE cellular therapy in the NHP eye.

The non-human primate (NHP) is an ideal model for studying human retinal cellular therapeutics due to the anatomical and genetic similarities. This manuscript describes a method for submacular transplantation of retinal pigment epithelial cells in the NHP eye and strategies to prevent intraoperative complications associated with macular manipulation.

퇴행성 망막 질병을 위한 비인간 영장류 모형에 있는 망막 안료 상피 이식

Retinal pigment epithelial (RPE) transplantation holds great promise for the treatment of inherited and acquired retinal degenerative diseases. These ...

Transpupillary-Guided Trans-Scleral Transplantation of Subretinal Grafts in a Retinal Degeneration Mouse Model

Transplantation of photoreceptor cells and retinal pigment&#160;epithelial (RPE) cells provide a potential therapy for retinal degeneration diseases. Subretinal transplantation of therapeutic donor cells into mouse recipients is challenging due to the limited surgical space allowed by the small volume of the mouse eye. We developed a trans-scleral surgical transplantation platform with direct transpupillary vision guidance to facilitate the subretinal delivery of exogenous cells in mouse recipients. The platform was tested using retinal cell suspensions and three-dimensional retinal sheets collected from rod-rich Rho::EGFP mice and cone-rich OPN1LW-EGFP;NRL-/- mice, respectively. Live/dead assay showed low cell mortality for both forms of donor cells. Retinal grafts were successfully delivered into the subretinal space of a mouse model of retinal degeneration, Rd1/NS, with minimum surgical complications as detected by multimodal confocal scanning laser ophthalmoscope (cSLO) imaging. Two months post-transplantation, histological staining demonstrated evidence of advanced maturation of the retinal grafts into &#39;adult&#39; rods and cones (by robust Rho::EGFP, S-opsin, and OPN1LW:EGFP expression, respectively) in the subretinal space. Here, we provide a surgical platform that can enable highly accurate subretinal delivery with a low rate of complications in mouse recipients. This technique offers precision and relative ease of skill acquisition. Furthermore, the technique could be used not only for studies of subretinal cell transplantation but also for other intraocular therapeutic studies including gene therapies.

This protocol presents a transpupillary vision-guided trans-scleral approach to safely and precisely deliver subretinal cellular grafts, with a low rate of surgical complications, in mouse recipients with or without retinal degeneration.

망막 변성 마우스 모델에서 망막하 이식편의 Transpupillary-Guided Trans-Scleral Transplantation

Transplantation of photoreceptor cells and retinal pigment&#160;epithelial (RPE) cells provide a potential therapy for retinal degeneration diseases. ...

Subretinal Transplantation of Human Embryonic Stem Cell Derived-retinal Pigment Epithelial Cells into a Large-eyed Model of Geographic Atrophy

Geographic atrophy (GA), the late stage of dry age-related macular degeneration is characterized by loss of the retinal pigment epithelial (RPE) layer, which leads to subsequent degeneration of vital retinal structures (e.g., photoreceptors) causing severe vision impairment. Similarly, RPE-loss and decrease in visual acuity is seen in long-term follow up of patients with advanced wet age-related macular degeneration (AMD) receiving intravitreal anti-vascular endothelial growth factor (VEGF) treatment. Therefore, on the one hand, it is fundamental to efficiently derive RPE cells from an unlimited source that could serve as replacement therapy. On the other hand, it is important to assess the behavior and integration of the derived cells in a model of the disease entailing surgical and imaging methods as close as possible to those applied in humans. Here, we provide a detailed protocol based on our previous publications that describes the generation of a preclinical model of GA using the albino rabbit eye, for evaluation of the human embryonic stem cell derived retinal pigment epithelial cells (hESC-RPE) in a clinically relevant setting. Differentiated hESC-RPE are transplanted into naive eyes or eyes with NaIO3-induced GA-like retinal degeneration using a 25 G transvitreal pars plana technique. Evaluation of degenerated and transplanted areas is performed by multimodal high-resolution non-invasive real-time imaging.

Retinal pigment epithelial cells could serve as a cell-replacement therapy for the advanced form of dry age-related macular degeneration. This protocol describes the generation of a large-eyed model of geographic atrophy and the subretinal transplantation of human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelial cells into this model of disease.

지리적 위축의 눈이 큰 모델에 인간 배아 줄기 세포 유래 망막 색소 상피 세포의 subretinal 이식

Geographic atrophy (GA), the late stage of dry age-related macular degeneration is characterized by loss of the retinal pigment epithelial (RPE) layer, ...

생물학

시력 회복: 망막 변성을 위한 줄기세포 치료

Sub-Retinal Delivery of Human Embryonic Stem Cell Derived Photoreceptor Progenitors in rd10 Mice

Regeneration of photoreceptor cells using human pluripotent stem cells is a promising therapy for the treatment of both hereditary and aging retinal diseases at advanced stages. We have shown human recombinant retina-specific laminin isoform matrix is able to support the differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) to photoreceptor progenitors. In addition, sub-retinal injection of these cells has also shown partial restoration in the rd10 rodent and rabbit models. Sub-retinal injection is known to be an established method that has been used to deliver pharmaceutical compounds to the photoreceptor cells and retinal pigmented epithelial (RPE) layer of the eye due to its proximity to the target space. It has also been used to deliver adeno-associated viral vectors into the sub-retinal space to treat retinal diseases. The sub-retinal delivery of pharmaceutical compounds and cells in the murine model is challenging due to the constraint in the size of the murine eyeball. This protocol describes the detailed procedure for the preparation of hESC-derived photoreceptor progenitor cells for injection and the sub-retinal delivery technique of these cells in genetic retinitis pigmentosa mutant, rd10 mice. This approach allows cell therapy to the targeted area, in particular the outer nuclear layer of the retina, where diseases leading to photoreceptor degeneration occur.

저자 스포트라이트: 시력 회복의 발전 - 망막 질환을 위한 줄기세포 기반 치료 

We describe a detailed protocol for the preparation of post-cryopreserved hESC-derived photoreceptor progenitor cells and the sub-retinal delivery of these cells in rd10 mice.

rd10 마우스에서 인간 배아 줄기 세포 유래 광수용체 전구체의 망막하 전달

Regeneration of photoreceptor cells using human pluripotent stem cells is a promising therapy for the treatment of both hereditary and aging retinal ...

망막 하 공간에 액세스하기위한 대안의 검증 사출 방법

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망막 변성 마우스 모델에서 망막하 이식편의 Transpupillary-Guided Trans-Scleral Transplantation

지리적 위축의 눈이 큰 모델에 인간 배아 줄기 세포 유래 망막 색소 상피 세포의 subretinal 이식

rd10 마우스에서 인간 배아 줄기 세포 유래 광수용체 전구체의 망막하 전달

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