이 작품은 ARK로, 미국 심장 협회 14GRNT20390154에서 수상에 의해 부분적으로 인디애나 대학교 - 퍼듀 대학교 인디애나 폴리스에서 연구 지원 기금 그랜트 (RSFG)에 의해 부분적으로 지원

1. 세균성 식입니다. 참고 : 본 연구에 사용 된 발현 플라스미드는하기 표 1에 기재되어있다. 본 연구에서 사용 된 용액, 미디어, 버퍼는 표 2에 기재되어있다. 고세균 테아 소단위 유전자의 클로닝 및 발현 플라스미드의 발생이 다른 18,20 설명한다. 요컨대, 서브 유닛의 재조합 동시 발현을위한 플라스미드는 각각의 서브 유닛 (18, 20)의 비교 발현 수준을 획득하는 데 도움이 bicistronic 오페론 전략을 사용한다. 아래에 나열된 식 매개 변수는이 연구에서 프로 테아 서브 유닛에 대한 최적의 것으로 경험적으로 결정했다. 다른 고세균 종에서, 또는 다른 재조합 단백질 복합체 (토론 참조) 프로 테아를 들어, 다른 프로 테아 돌연변이에 대한 표현을 최적화 할 필요가있다. <ol><li> (화학적으로 유능한 대장균 BL21에 관심의 발현 플라스미드를 변환DE3) 세포. </li><li> 갓 얼음에 해동 된 DE3 세포의 나누어지는로 - (100 NG 일반적으로 50), 20 분 동안 얼음에 품어 계속 플라스미드의 2 μL - 1을 추가합니다. </li><li> 열 충격 45 초 동안 42 ° C에서 세포와 additionl 2 분 동안 얼음에 튜브를 반환합니다. </li><li> LB 배지 1 mL를 넣고 1 시간 동안 (150 rpm으로)을 진탕 37 ° C에서 품어. </li><li> ((카나마이신이 보충 된 LB 고체 배지를 함유하는 플레이트이 항생제 본 연구 인코딩 저항에 사용 된 모든 플라스미드)) 관 LB 플레이트 상에 형질 전환 혼합물의 200 μL - 100 확산. 37 ºC O / N에서 번호판을 품어. </li><li> 다음 날 아침, 유리 문화 튜브에 액체 LB-관 미디어의 3 mL의에 LB-칸 판에서 단일 콜로니를 접종. 약 2.5 (150 RPM)을 진탕 37 ºC에서 품어 - 3 시간, 또는까지 혼탁이 관찰된다. </li><li> 분광 광도계 600 nm의 (OD 600)에서 문화의 광학 밀도를 측정한다. 셀 숭배를 희석6 ㎖의 최종 부피 0.4의 OD 600 데워진 LB 관 매체 적당량 URE. 40 분 37 ºC에서 진탕 다시 시작합니다. </li><li> 1 mM의 최종 농도 원액에서 IPTG를 첨가하여 액체 배양 물에서 단백질 발현을 유도한다. 7 시간 - 약 6 (150 RPM)을 진탕 37 ºC에서 품어. </li><li> 1.5 ML의의 microcentrifuge 튜브에 그 전체가 세균 세포 배양을 수확. </li><li> microcentrifuge 관에 문화의 1.5 ML을 추가합니다. 1 분 동안 10,000 × g에서 원심 분리기. </li><li> 뜨는을 취소하고 펠렛에 동일한 문화의 또 다른 1.5 mL를 넣어. 1 분 동안 10,000 × g에서 원심 분리기. </li><li> 전체 문화까지 단계를 반복 1.11은 microcentrifuge 관에 수확한다. </li><li> 용해 될 때까지 -80 ° C에서 유도 된 펠렛을 저장합니다. </li></ol> 2. 세균 용해와 해물을 혼합. 노트: </strong&gt; 동시 발현을 통해 연구 샘플의 경우, 2.1 (및 하위 섹션)을 따릅니다. 해물 혼합을 필요로하는 샘플의 경우, 2.2 절 (및 하위 섹션)을 따릅니다. 프로토콜에 포함 된 TSP (총, 가용성, 펠렛) 분석은 혼합 해물 (토론 참조) 중 결합 α와 β 서브 유닛의 대략 동일한 금액을 보장 할 수있는 단백질 발현을 최적화에 유용하다. 또한 다운 스트림 결과가 예상되지 않는 한 경우 (즉,이 단백질이 발현 및 가용성 것을 확인합니다) 중요한 제어 기능을 제공합니다. 따라서, 우리는 매우 초기 TSP 분석을 포함하는 것이 좋습니다. 최적의 프로토콜은 특정 서브 유니트 조합에 대해 달성되면, TSP 분석 엄격 이하 선택적으로 설명하는 이유이다 필요하지 않다. <ol><li> 균체 및 가용성 분획 제제의 용해. <ol><li> 5 분 동안 얼음에 유도 된 세포 펠렛을 해동. 용해 완충액 600 μL에 펠렛을 재현 탁. </li><li> Inc의총 조질 용 해물을 생성하기 위해 30 분 동안 (150 RPM)를 진탕하면서 30 ºC의 현탁액 ubate. 참고 : 다음 단계 및 다음 하위 섹션은 선택 사항입니다. </li><li> 별도의 1.5 ML의의 microcentrifuge 튜브에 총 원유 해물에서 두 25 μL 씩을 제거하고 다음과 같이 TSP 분석을 실시하고 있습니다. <ol><li> 두 25 μL 씩 중 하나, 1X의 최종 농도로 5 배 SDS 샘플 버퍼를 추가한다. &quot;총 원유 해물&quot;에 대한 &quot;T&quot;와 튜브 라벨. </li><li> 5 분 완전히 단백질을 변성하는 100 ºC에서 &quot;T&quot;샘플을 품어. </li><li> 한편, 제 25 μL 나누어지는을 10 분간 10,000 × g에서이를 원심 분리. 조심스럽게 작은 펠렛을 방해하지 않고 뜨는을 제거하고 새로운 1.5 ML의 microcentrifuge 관에 전송할 수 있습니다. &quot;가용 분&quot;에 대한 새로운 관 &quot;S&quot;를 레이블. </li><li> 작은 펠릿 왼쪽 behi에차 이전 단계에서, 재현 탁에 용해 버퍼와 소용돌이의 25 μL를 추가합니다. &quot;펠릿 부분&quot;이 관 &quot;P&quot;를 레이블. </li><li> 은 &quot;S&quot;와 &quot;P&quot;튜브에 6 μL 5 배의 SDS 샘플 버퍼를 추가하고 상술 한 바와 같이 100 ºC에서 품어. 참고 : TSP 샘플 표현을 분석하는 그 날 사용하지 않을 경우 필요할 때까지, 그들은 -20 ºC에서 동결 할 수있다. 12 % 및 / 또는 15 % 표준 SDS-PAGE 겔에 바로로드되기 전에, 상기 한 바와 같이 일단 해동, 그들은, 100 ºC에서 reincubated해야합니다. </li></ol></li><li> TSP에 분석이 수행되는 동안 원심 총 조질 용 해물의 잔여 550 μL 10 분 동안 10,000 × g에서 (또는 총 조질 용 해물의 전체 600 μL TSP 분석이 수행되지 않은 경우). 신선한 1.5 ML의 microcentrifuge 관에 뜨는을 수집합니다. 이 정제에 사용되는 수용성 분해물이다. </li></ol></li><li> 해물 혼합. <ol><li> 단계 2.1.1 위 2.1.2에 설명 된대로 용해을 수행하십시오. </li><li> 원하는 β 서브 유닛을 표현하는 박테리아에서 총 원유 해물의 600 μL를 사용하여 원하는 α 서브 유닛을 표현하는 박테리아에서 총 원유 해물의 600 μL를 섞는다. 천천히 30 분 동안 진탕 37 ºC에서 품어. 주 :이 (논의 참조) 혼합 용 해물 중에 최대 어셈블리를 달성하는 인큐베이션 시간을 최적화하는 것이 필요할 수있다. 시간과 여기에 제시된 온도는이 연구에서 재조합 단백질에 최적이며, 다른 곳에서 (18)를 측정 하였다. </li><li> 원심 분리기 10 분 동안 10,000 × g에서 혼합 해물은 불용성 펠렛에서 용해성 물질을 분리합니다. 새로운 1.5 ML의 microcentrifuge 관에 뜨는을 전송합니다. 단백질 정제에 대해이 혼합 용해 해물을 사용합니다. </li></ol></li></ol> 고정화 코발트 친 화성 수지를 통해 3. 단백질 정제(ICAR). <ol><li> 수지 평형. <ol><li> 철저하게 병을 반전 수지를 재현 탁하고 1.5 ML의 microcentrifuge 관에 슬러리의 50 μL를 전송합니다. 펠릿 수지 2 분 동안 700 × g에서 원심 분리기. 조심스럽게 뜨는을 대기음. 참고 : 우리는 액체의 대부분을 제거하기 위해 파란색 1 mL를 피펫 팁을 사용하여 피펫 포부를 실시하고 있습니다. 백색 2 μL 팁 비드를 덮는 액체의 매우 얇은 층을 남겨두고 나머지 상층 액 제거의 미세 제어를 위해 사용된다. </li><li> 부드럽게 수지 펠렛 2 분 동안 700 × g에서 수지와 원심 분리기를 재현 탁 1 mL의 버퍼 A. 믹스의 추가합니다. 조심스럽게 뜨는을 대기음이 세척 단계를 한 번 더 반복한다. </li></ol></li><li> 평형화 수지에 2.1 또는 2.2에서 이전에 취득한 가용성 해물을 적용합니다. 60 분 4 ºC에서 부드러운 회전 튜브를 품어. g &lt;700 ×에서 튜브를 원심 분리기/ 5 분 안에&gt; 조심스럽게 뜨는을 대기음. </li><li> 비특이적으로 결합 단백질을 제거하기 위해 다음과 같이 수지를 씻으십시오. <ol><li> 버퍼 (A)의 1 mL의에 재현 탁 수지는 부드러운 10 분 동안 4 ºC에서 락을 함께 품어. 5 분 동안 700 × g에서 튜브를 원심 분리기 조심스럽게 뜨는을 대기음. 이 세척 단계를 한 번 더 반복합니다. </li><li> 재현 탁 버퍼 B 1 용액 (5 mM의 이미 다졸와 버퍼 A)와 수지와 부드러운 5 분 동안 4 ºC에서 락을 함께 품어. 5 분 동안 700 × g에서 튜브를 원심 분리기 조심스럽게 뜨는을 대기음. 이 세척 단계를 한 번 더 반복합니다. </li><li> 재현 탁 버퍼 C 1 ㎖ (10 mM의 이미 다졸와 버퍼 A)와 수지와 부드러운 5 분 동안 4 ºC에서 락을 함께 품어. 5 분 동안 700 × g에서 튜브를 원심 분리기 조심스럽게 뜨는을 대기음. </li></ol></li><li> t (200 mM의 이미 다졸과 완충액 A) 버퍼 (400)의 E μL를 첨가하여 단백질을 용리수지 O. 부드러운 5 분 동안 4 ºC에서 락을 함께 품어. 5 분 동안 700 × g에서 원심 분리기. </li><li> 새로운 1.5 mL의 원심 분리 관에 정제 된 단백질을 포함하는 상층 액을 전송합니다. </li><li> 다음 연속 원심 분리에 의해 정제 된 단백질을 탈염. <ol><li> 정제 된 단백질의 400 μL에 (이 160 밀리미터에서 200 밀리미터에서 이미 다졸 농도를 감소) 100 μL 완충액 A를 추가합니다. 10 kDa의 분자량 컷 - 오프 0.5 mL를 ultracentrifugal 필터로 정제 된 단백질을 적용합니다. 5 분 동안 14,000 × g에서 원심 분리기. </li><li> 여과 액을 취소하고 다시 보유 및 원심 분리기를 희석 400 μL 완충액 A를 추가합니다. 이미 다졸 농도가 아래 4 mm로 떨어질 때까지 원심 분리 / 희석주기를 계속합니다. 각 원심 분리 ~ 70 μL (또는 약 7 배)까지 500 μl를 집중하는 경우 예를 들어, 두 개의 사이클 appr, 출발 160 mM의 이미 다졸 농도 (7 × 7 = 49 배)을 줄일oximately 3.3 mm이다. </li><li> BCA 분석 (21)를 사용하여 탈염 샘플의 단백질 농도를 측정한다. 주 : 제조자의 지침에 따라 탈염은 BCA 분석에 대한 허용 한계 이하로 이미 다졸 농도를 감소시킬 필요가있다. 본 연구실은 민감하기 때문에 BCA 분석을 선호 큰 동적 범위를 가지며, 더 적은 단백질을 단백질의 변화를 나타낸다. 그러나, 단백질의 농도를 측정하는 다른 방법은 BCA 분석을 대체 할 수있다. 핵심은 각 방법의 장점과 한계를 인식하는 것입니다. </li></ol></li><li> 1X의 최종 농도 5 배 기본 샘플 버퍼를 추가하고 전기를 진행합니다. 또한, 매장 샘플 나중에 분석을 위해 -20 ºC에서. </li></ol> 4. 비 변성 폴리 아크릴 아미드 젤 전기 영동 (PAGE). 주의 : 미 중합 아크릴 아미드는 신경독이다. 적절한 보호 GEA을 착용아르 자형. <ol><li> 다음과 같이 비 변성 PAGE 젤을 준비합니다. <ol><li> 깨끗한 유리 플레이트를 사용하여 주조 스탠드 주조 겔 카세트를 준비한다. 작은 자석 교반기 위에 그라데이션 메이커를 놓고 각 챔버에 작은 교반 막대를 배치합니다. </li><li> (/ V W) 아크릴 아미드 및 2 % (W / V) 비스 아크릴 스톡 용액은 5 %와 10 %를 준비하여 40 % (W / V) 네이티브 해결 버퍼에서 아크릴 아마이드 겔 용액. 비스 아크릴 아미드하는 총 아크릴 아미드의 비율이 37.5 있는지 확인하십시오 : 1. 얼음에 칠 쏟아져하기 전에. 주 : 여기에서 사용되는 비 변성 PAGE 시스템은 램 믈리 SDS-PAGE 시스템과 본질적으로 동일하고, SDS (22)를 생략하여. </li><li> 중합을 개시 아크릴 아미드 솔루션 (물에서 제조 / v)의 원액 w (10 %에서) 황산 암모늄을 추가합니다. 황산 암모늄의 최종 농도는 0.1 %이다 (W / V). </li><li> 그라데이션 메이커의 두 챔버에 아크릴 아미드 솔루션을 따르십시오. 출구 튜브 삽입 B를etween 겔 카세트의 판, 자석 교반기를 활성화하고 그라데이션 메이커 밸브를 엽니 다. 10 % 비 변성 그라데이션 젤 - 5를 따르십시오. </li><li> 일단 부, 이소프로판올의 얇은 층으로 겔을 오버레이하여 겔을 30 분 동안 중합 할 수있다. 이 기간 동안, 네이티브 해결 버퍼에 신선한 5 % 아크릴 아마이드 겔 용액을 준비합니다. 젤 세트 후, 아이소 프로필 알코올을 부어 물총 병에서 탈 이온수로 겔의 상단을 씻어. </li><li> 상기 제조 한 5 % 겔 용액 (정확히 같은 4.1.3에 기재되어 있음)과 황산 암모늄을 추가 한 유리판가 가득 할 때까지 중합 된 겔 위에 붓는다. 젤 빗를 삽입합니다. 오버레이 젤은 추가로 30 분 동안 중합하도록 허용합니다. </li><li> 겔 중합되면, 전기 영동 장치에 겔 카세트를 조립한다. 또한, 사용할 준비가 될 때까지 젖은 종이 타월 및 플라스틱 랩에 싸서 4 ºC에서 젤을 저장합니다. </li></ol></li><li> 일단 비 변성 PAGE 젤 ELEC에 조립영동 장치는 10 배 네이티브 실행 버퍼 재고 신선한 준비 1X 기본 실행 버퍼 탱크를 채우십시오. </li><li> 각 웰 유리 주사기를 사용으로, (3)의 단부에서 얻어진 정제 된 단백질 10 μg의로드. </li><li> 웰 중 하나에 (1X 네이티브 실행 완충액에 희석 된) 고 분자량 천연 단백질 표준로드 2 μL. </li><li> (- 4.5 시간 약 4) 55 V, 4 ºC에서 젤을 실행 염료 전면 겔을 실행 할 때까지. </li><li> 비 변성 겔뿐만 아니라, 표준 SDS-PAGE (22)에 의해 정제 된 단백질의 분취 량을 분석한다. <ol><li> 1X의 최종 농도로 5 배 SDS 샘플 완충액 (3)의 단부에서 얻어진 정제 된 단백질 샘플의 분취 량 (10 μg의)를 섞는다. </li><li> 5 분 동안 100 ºC에서 품어 12 표준 % 및 / 또는 15 % SDS-PAGE 젤 (22)에로드합니다. </li><li> 20 분 동안 80V에서 실행하고 염료 전면 겔 (도망 때까지 120 V에서이 약의 추가이다itional 12 % 겔 75 분, 및 15 % 겔을 120 분). </li></ol></li></ol> 5. 떠올리 활동 및 단백질 염색법. <ol><li> 전기 신중 별도의 유리판에 이어 탈 이온수 50 ㎖를 함유하는 겔 트레이에 비 변성 겔 옮긴다. 부드러운 5 분 동안 흔들와 젤을 씻어. 물을 버리고이 세척 단계를 세 번 반복한다. </li><li> 다음과 같이 기판 오버레이 분석을 수행합니다. <ol><li> 형광 펩타이드 기질 SUC-LLVY-AMC를 포함하는 버퍼를 개발의 1 mL를 넣고 겔에 걸쳐 균일하게 확산. 30 분 37 ºC에서 품어. 주 : 유리로드 또는 겔 릴리 (별도의 유리판, 플라스틱에 사용되는 작은 쐐기)는 겔상의 액체를 확산하는데 사용될 수있다. </li><li> 조심 의한 절단 된 펩티드 기질에 겔 촬상 시스템의 UV transilluminator가 겔 상으로 전송 및 형광을 관찰한다. 기록 이미지입니다. 조심스럽게 겔 바 전송겔 트레이 (CK). </li><li> 부드럽게 흔들 5 분 동안 탈 이온수 50 mL로 두 번 씻어 겔. </li><li> 부드럽게 흔들 60 분 동안 콜로이드 쿠마시 염색 용 시약을 10 mL로 젤을 염색. 배경까지 50 mL의 물 Destain 젤은 분명해진다. 이 염색 공정뿐만 아니라 표준 SDS-PAGE 겔에 적용된다. </li></ol></li></ol>

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Y., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conserved+20S+proteasome+assembly+factor+requires+a+C-terminal+HbYX+motif+for+proteasomal+precursor+binding.">A conserved 20S proteasome assembly factor requires a C-terminal HbYX motif for proteasomal precursor binding.</a> Nat Struct Mol Biol. 18, 622-629 (2011).</li><li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid.">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Anal Biochem. 150, 76-85 (1985).</li><li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4.">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227, 680-685 (1970).</li><li>Chen, P., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autocatalytic+subunit+processing+couples+active+site+formation+in+the+20S+proteasome+to+completion+of+assembly.">Autocatalytic subunit processing couples active site formation in the 20S proteasome to completion of assembly.</a> Cell. 86, 961-972 (1996).</li><li>Li, X., Kusmierczyk, A. R., Wong, P., Emili, A., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=beta-Subunit+appendages+promote+20S+proteasome+assembly+by+overcoming+an+Ump1-dependent+checkpoint.">beta-Subunit appendages promote 20S proteasome assembly by overcoming an Ump1-dependent checkpoint.</a> EMBO J. 26, 2339-2349 (2007).</li><li>Kusmierczyk, A. R., Kunjappu, M. J., Funakoshi, M., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multimeric+assembly+factor+controls+the+formation+of+alternative+20S+proteasomes.">A multimeric assembly factor controls the formation of alternative 20S proteasomes.</a> Nat Struct Mol Biol. 15, 237-244 (2008).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

우리는 재조합 고세균 프로 테아 좀을 이용하여 비 변성 PAGE를 테아 조립체 분석에 결합 방법의 이점을 보여준다. 프로 테아 서브 유닛의 박테리아 동시 발현의 일반적인 방법 9,11 신속한 분석이 가능하지만 키 어셈블리 중간체를 공개하지 않을 수 있습니다. 우리 조립체 이벤트의 더 넓은 영상을 개발하는 혼합 용 해물과 동시 발현을 조합 한 제안. 이러한 결합 접근...

Multiprotein 단지는 수많은 중요한 세포 활동 1을 수행한다. 이 단지의 많은, 더 많은 그들의 조립 2,3에 대한보다 자신의 구조와 기능에 대한 알려져있다. 프로 테아는 하나의 복잡하고 삶의 모든 영역에서 발견된다. 진핵 생물에서이 분자 기계는 유비퀴틴 / 프로 테아 좀 시스템 (UPS)의 핵심이며, 세포 내 단백질 분해 (4)의 주요 경로를 제공합니다. 20S 프로 테아 솜을, 또는 코어 입자 (CP) (5), 즉, 19S 규제 입자 (RP) (6)에 의해 하나 또는 양 말단에서 캡핑 될 수합니다 (26S 프로 테아라고 함) 진핵 테아는 두 개의 주요 서브 어셈블리로 이루어진다. 20 대 프로 테아 큰 구획 단백질 분해 효소이다. 그 급 구조가 절대적으로 삶의 모든 영역에 걸쳐 보존과 구조적으로 관련 서브 유닛의 두 가지 유형을 포함하는 4 ~ 7 원환의 스택으로 구성되며, α; 그리고 5,7,8을 β. 진핵 생물에있어서, 2 개의 외부 링은 각각 일곱 별개의 α 서브 유닛으로 구성되며, 두 개의 내부 링은 각각 일곱 별개 β 소단위로 구성된다; 단백질 분해 활성은 β 서브 유닛의 세 내에 존재한다. 대조적으로, 고세균 및 세균의 CP 링은 일반적으로 오직 하나의 α 형과 β 서브 유닛의 한 형태로 구성된다. 고세균 프로 테아 좀은 그들의 조성 단순성 및 그들의 대응 진핵 9-13과 공통 어셈블리기구 공유 모두 테아 조립체를 연구하는 것이 중요 모델 시스템을 제공했다. 요약하면, α 서브 유닛은 서브 유닛 조립 β있는에 발판 역할을하는 첫 번째 α 링으로 조립한다. 상승을주는 결과 반 프로 테아 좀 (α 7 β 7) 이량은 완전히 CP (α 7 β 7 β 7 α 7) 조립합니다. 이량 동안 propeptides은 β 서브 유닛에 존재자기 촉매 촉매 N 말단 트레오닌를 노출, 제거됩니다. 어셈블리를 모델링 고세균 프로 테아 좀의 사용은 빈번하게 대장균에서 재조합 고세균 테아 단백질의 생성을 이용한다. 이 다양한 조합으로 제조 될 수있는 서브 유닛 자체 프로 테아 좀을 생산하지 않는 숙주 유기체에서 WT 및 돌연변이 버전 모두 같은 수 있기 때문에 가치가있는 접근법이다. 다중 단백질 복합체의 조립을 모니터링 생화학 조립 중간체 및 전구체에서 완전히 조립 된 복합체를 분리하는 분류 방법의 일종이 필요합니다. 때문에 폴리 아크릴 아미드 젤 전기 영동 (PAGE) 비 변성 뛰어난 해결 능력, 다양한 큰 multiprotein 단지 14 ~ 17의 분류에서 특히 유용한 것으로 입증되었습니다. 재조합 고세균 테아 생산 및 비 변성 PAGE의 조합 dissectin에서 강력한 접근되었다g의 프로 테아 좀 어셈블리 9,11,12,18. 그러나,이 방법이 적용되는 (즉. α 및 β 서브 유닛의 동시 발현 재조합을 통해) 통상의 방법은 중요한 단점을 갖는다. 조립 협동 반응은 강하게 농도 의존적 3이다. 세포 내부의 단백질 농도로 인해 배제 체적 효과 (19)이 매우 높은 점을 감안, 조립 반응은 생체 내에서 급속하게 진행. 따라서 α와 β 서브 유닛이 동시 발현 될 때 중요한 조립 중간체를 그리워하는 것이 가능하다. 여기, 우리는 재조합 고세균 프로 테아 서브 유닛을 사용하여 프로 테아 좀 어셈블리의 연구에서 결합 된 접근 방식에 대한 주장한다. 이 방식에서, 두 동시 발현과 해물 혼합 방법이 이용된다. 동시 발현 덜 노동 집약적이기 때문에 전자는 어셈블리의 신속한 분석이 가능합니다. 후자는 혼합하여 α와 β 서브 유닛, 별도의 표현에 따라 달라집니다. 이 requi 비록동시 발현보다 고해상도 조금 더 많은 노력, 그것은 동시 발현 동안 놓친 중간체를 검출 할 수있는 능력에 의해 보상 이상이다. 함께, 이러한 방법은 두 테아 조립체의 더욱 완전한 그림을 제공 할 수있다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="701">
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:165px;">Acrylamide (40%) solution</td>
			<td style="width:123px;">Biorad</td>
			<td style="width:105px;">1610104</td>
			<td style="width:309px;">Unpolymerized acrylamide is a neurotoxin. Wear proper protective equipment</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:165px;">Amicon ultra 0.5ml centrifugal filters</td>
			<td style="width:123px;">EMDMillipore</td>
			<td>UFC501024</td>
			<td style="width:309px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:165px;">Ammonium persulfate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3678</td>
			<td style="width:309px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:165px;">ATP</td>
			<td style="width:123px;">Sigma</td>
			<td style="width:105px;">A7699</td>
			<td style="width:309px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:165px;">BCA assay kit</td>
			<td style="width:123px;">Pierce</td>
			<td style="width:105px;">23225</td>
			<td style="width:309px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:165px;">Bisacrylamide (2%) solution</td>
			<td style="width:123px;">Biorad</td>
			<td style="width:105px;">1610142</td>
			<td style="width:309px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:165px;">Bromophenol blue</td>
			<td style="width:123px;">Sigma</td>
			<td style="width:105px;">B8026</td>
			<td style="width:309px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:165px;">DNaseI</td>
			<td style="width:123px;">Sigma</td>
			<td style="width:105px;">DN25</td>
			<td style="width:309px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:165px;">Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td style="width:123px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:105px;">BP172</td>
			<td style="width:309px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:165px;">E.coli BL21 competent cells</td>
			<td style="width:123px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:105px;">69450</td>
			<td style="width:309px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:165px;">GelCode Blue</td>
			<td style="width:123px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:105px;">24592</td>
			<td style="width:309px;">Colloidal coomassie stain reagent for gels</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:165px;">Gel doc EZ system</td>
			<td style="width:123px;">Biorad</td>
			<td>1708270</td>
			<td style="width:309px;">Gel documentation system</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:165px;">Gel releasers</td>
			<td style="width:123px;">Biorad</td>
			<td>1653320</td>
			<td style="width:309px;">Wedge shaped plastic used to separate gel plates; useful for spreading liquid.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:165px;">Glass rod</td>
			<td style="width:123px;">Thermo Fisher</td>
			<td>11-380B</td>
			<td style="width:309px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:165px;">Glycerol</td>
			<td style="width:123px;">Sigma</td>
			<td style="width:105px;">49767</td>
			<td style="width:309px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:165px;">Glycine</td>
			<td style="width:123px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:105px;">BP3865</td>
			<td style="width:309px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:165px;">Hamilton syringe</td>
			<td style="width:123px;">Thermo Fisher</td>
			<td>14-813-38</td>
			<td style="width:309px;">Glass syringe for loading gels</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:165px;">HEPES</td>
			<td style="width:123px;">US Biologicals</td>
			<td style="width:105px;">H2010</td>
			<td style="width:309px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:165px;">HMW Native calibration kit</td>
			<td style="width:123px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:105px;">170445-01</td>
			<td style="width:309px;">High molecular weight protein standards</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:165px;">Hoefer SG30</td>
			<td style="width:123px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:105px;">03-500-277</td>
			<td style="width:309px;">Gradient maker</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:165px;">Imidazole</td>
			<td style="width:123px;">US Biologicals</td>
			<td style="width:105px;">280671</td>
			<td style="width:309px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:165px;">IPTG</td>
			<td style="width:123px;">US Biologicals</td>
			<td style="width:105px;">I8500</td>
			<td style="width:309px;">For induction of protein expression</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:165px;">Isopropanol</td>
			<td style="width:123px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:105px;">BP26181</td>
			<td style="width:309px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:165px;">Kanamycin sulfate</td>
			<td style="width:123px;">US Biologicals</td>
			<td style="width:105px;">K0010</td>
			<td style="width:309px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:165px;">Lysozyme</td>
			<td style="width:123px;">Sigma</td>
			<td style="width:105px;">L6876</td>
			<td style="width:309px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:165px;">MgCl2</td>
			<td style="width:123px;">Fluka analytical</td>
			<td style="width:105px;">630680</td>
			<td style="width:309px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:165px;">Mini Protean Tetra Cell</td>
			<td style="width:123px;">Biorad</td>
			<td style="width:105px;">1658002EDU</td>
			<td style="width:309px;">Gel electrophoresis apparatus</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:165px;">NaCl</td>
			<td style="width:123px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:105px;">S640-3</td>
			<td style="width:309px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:165px;">NaOH</td>
			<td style="width:123px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:105px;">S318-1</td>
			<td style="width:309px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:165px;">Pefabloc SC</td>
			<td style="width:123px;">Roche</td>
			<td style="width:105px;">11429876001</td>
			<td style="width:309px;">Protease inhibitor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:165px;">pET42</td>
			<td style="width:123px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:105px;">70562</td>
			<td style="width:309px;">Expression plasmid</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:165px;">Precision plus all blue standard</td>
			<td style="width:123px;">Biorad</td>
			<td style="width:105px;">1610373</td>
			<td style="width:309px;">Molecular protein standard for SDS-PAGE</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:165px;">Quickchange mutagenesis kit</td>
			<td style="width:123px;">Agilent technologies</td>
			<td style="width:105px;">200521</td>
			<td style="width:309px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:165px;">Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td style="width:123px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:105px;">BP166</td>
			<td style="width:309px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:165px;">Suc-LLVY-AMC</td>
			<td style="width:123px;">Enzo lifesciences</td>
			<td style="width:105px;">BML P802-0005</td>
			<td style="width:309px;">Fluorogenic substrate</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:165px;">Talon Metal Affinity Resin</td>
			<td style="width:123px;">Clontech</td>
			<td style="width:105px;">635502</td>
			<td style="width:309px;">Immobilized-cobalt affinity resin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:165px;">TEMED</td>
			<td style="width:123px;">Sigma</td>
			<td style="width:105px;">T7024</td>
			<td style="width:309px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:165px;">Tris</td>
			<td style="width:123px;">US Biologicals</td>
			<td style="width:105px;">T8600</td>
			<td style="width:309px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:165px;">Triton-X100</td>
			<td style="width:123px;">Sigma</td>
			<td style="width:105px;">93426</td>
			<td style="width:309px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:165px;">Tryptone</td>
			<td style="width:123px;">Bacto BD</td>
			<td style="width:105px;">211699</td>
			<td style="width:309px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:165px;">UV sample tray</td>
			<td style="width:123px;">Biorad</td>
			<td>1708271</td>
			<td style="width:309px;">For UV imaging of gels</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:165px;">Yeast extract</td>
			<td style="width:123px;">Bacto BD</td>
			<td style="width:105px;">212720</td>
			<td style="width:309px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

examining proteasome assembly with recombinant archaeal proteasomes and nondenaturing page:  the case for a combined approach

프로 테아 좀은 삶의 모든 영역에서 발견된다. 자신의 어셈블리를 완전히 이해되지 않지만 그들은, 진핵 생물의 세포 내 단백질 분해의 주요 경로를 제공합니다. 모든 프로 테아 두 heptameric α 서브 유닛 반지 사이에 끼워 두 heptameric β 서브 유닛 반지를 포함, 구조적으로 보존 된 코어 입자 (CP), 또는 20S 프로 테아 좀 (proteasome)를 포함한다. 고세균 20S 프로 테아 좀은 진핵 생물의 대응에 비해 구조적으로 간단, 아직 그들은 모두 공통의 조립 메커니즘을 공유 할 수 있습니다. 따라서, 고세균 20S 프로 테아 좀은 진핵 세포 프로 테아 조립을위한 중요한 모델이 될 것을 계속한다. 특히, 비 변성 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동 (PAGE)와 결합 고세균 (20S)의 프로 테아 좀의 재조합 발현는 프로 테아 좀의 생합성에 많은 중요한 통찰력을 산출했다. 여기, 우리는 고세균 프로 테아 α의 동시 발현의 일반적인 전략을 개선하는 방법을 논의하고 β 서브 유닛 전에 nondenaturi하기NG PAGE. 우리는 신속하고 효율적인 있지만, 혼자 동시 발현 방식이 키 어셈블리 중간체를 놓칠 수 있다는 것을 보여줍니다. 프로 테아 좀의 경우, 동시 발현은 반 프로 테아 좀의 감지, 중간 포함하는 하나의 완전한 α-링과 하나의 완전한 β-링을 허용하지 않을 수 있습니다. 그러나,이 중간 용이 해물 혼합을 통해 검출된다. 우리는 해물 혼합과 동시 발현을 결합하는 어셈블리를 분석에 더 철저 접근을 산출, 아직 노동 nonintensive 유지하는 것이 좋습니다. 이 접근은 다른 재조합 multiprotein 복합체의 연구에 유용 할 수있다.

α 서브 유닛이 형태 링 (9)에 결합하면 프로 테아 좀 어셈블리 (그림 1) 시작합니다. C는 말단 헥사 히스티딘은 (그의 태깅) 유도체 (표 1) 태그로서 호열 Methanococcus maripaludis S2에서 α 서브 유닛을 대장균에서 발현되는 경우가 설명 될 수있다. 재조합-α 단백질 자신의 페이지를 비 변성하여 ICAR 그래피 분석 한 결과, 두 개의 밴드 (도 2A, 레인...

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Examining Proteasome Assembly with Recombinant Archaeal Proteasomes and Nondenaturing PAGE:  The Case for a Combined Approach

이 프로토콜은 서브 유닛의 동시 발현 재조합 프로 테아 좀 어셈블리의보다 철저한 검사를 위해 혼합 postlysis 서브 유닛을 모두 사용합니다.

재조합 고세균 프로 테아과 비 변성 페이지로 프로 테아 조립 검사 : 케이스를 결합 접근에 대한

Proteasomes are found in all domains of life. They provide the major route of intracellular protein degradation in eukaryotes, though their assembly is ...

The overall goal of this experiment is to analyze assembly of a multi-protein complex such as the proteasome, using recombinant subunits, and nondenaturing Polyacrylamide Gel Electrophoresis, or PAGE.This method can help answer key questions in the proteasome field such as, what intermediate species are encountered along the assembly pathway of this protein complex.The main advantage of this technique is that it allows rapid screening of assembly by two parallel approaches, allowing detection of on and off pathway intermediates.This procedure begins with bacterial expression as described in the text protocol.To perform bacterial lysis, thaw the induced cell pallet co-expressing the desired combination of proteasome subunits, on ice for five minutes.Once thawed, resuspend the pallet in 600 microliters of Lysis Buffer.Incubate the suspension at 30

examining-proteasome-assembly-with-recombinant-archaeal-proteasomes

Research

JoVE Journal

Biochemistry

6.6K 조회수.  Indiana University-Purdue University, Indianapolis (IUPUI). The overall goal of this experiment is to analyze assembly of a multi-protein complex such as the proteasome, using recombinant subunits, and nondenaturing Polyacrylamide Gel Electrophoresis, or PAGE.This method can help answer key questions in the proteasome field such as, what intermediate species are encountered along the assembly pathway of this protein complex.The main advantage of this technique is that it allows rapid screening of assembly by two parallel approaches, allowing detection...

비디오: Examining Proteasome Assembly with Recombinant Archaeal Proteasomes and Nondenaturing PAGE:  The Case for a Combined Approach

A Facile and Efficient Approach for the Production of Reversible Disulfide Cross-linked Micelles

Nanomedicine is an emerging form of therapy that harnesses the unique properties of particles that are nanometers in scale for biomedical application. Improving drug delivery to maximize therapeutic outcomes and to reduce drug-associated side effects are some of the cornerstones of present-day nanomedicine. Nanoparticles in particular have found a wide application in cancer treatment. Nanoparticles that offer a high degree of flexibility in design, application, and production based on the tumor microenvironment are projected to be more effective with rapid translation into clinical practice. The polymeric micellar nano-carrier is a popular choice for drug delivery applications.
In this article, we describe a simple and effective protocol for synthesizing drug-loaded, disulfide cross-linked micelles based on the self-assembly of a well-defined amphiphilic linear-dendritic copolymer (telodendrimer, TD). TD is composed of polyethylene glycol (PEG) as the hydrophilic segment and a thiolated cholic acid cluster as the core-forming hydrophobic moiety attached stepwise to an amine-terminated PEG using solution-based peptide chemistry. Chemotherapy drugs, such as paclitaxel (PTX), can be loaded using a standard solvent evaporation method. The O2-mediated oxidation was previously utilized to form intra-micellar disulfide cross-links from free thiol groups on the TDs. However, the reaction was slow and not feasible for large-scale production. Recently, an H2O2-mediated oxidation method was explored as a more feasible and efficient approach, and it was 96 times faster than the previously reported method. Using this approach, 50 g of PTX-loaded, disulfide cross-linked nanoparticles have been successfully produced with narrow particle size distribution and high drug loading efficiency. The stability of the resulting micelle solution is analyzed using disrupting conditions such as co-incubation with a detergent, sodium dodecyl sulfate, with or without a reducing agent. The drug-loaded, disulfide cross-linked micelles demonstrated less hemolytic activity when compared to their non-cross-linked counterparts.

To deliver cancer drugs to tumor sites with high specificity and reduced side effects, new methods based on nanoparticles are required. Here, we describe disulfide cross-linked micelles that can be easily prepared by hydrogen peroxide-mediated oxidation and are able to dissociate efficiently under a reducing tumor environment to release payloads.

가역 디설파이드 가교 미셀 제조를위한 손쉬운 효율적인 접근법

Nanomedicine is an emerging form of therapy that harnesses the unique properties of particles that are nanometers in scale for biomedical application. ...

연구

생화학

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating these studies, reincorporation of detergent-solubilized membrane proteins into liposomes is a stochastic process where protein topology is impossible to enforce. This paper offers an alternative method to these challenging techniques that utilizes a liposome-based scaffold. Protein solubility is enhanced by deletion of the transmembrane domain, and these amino acids are replaced with a tethering moiety, such as a His-tag. This tether interacts with an anchoring group (Ni2+ coordinated by nitrilotriacetic acid (NTA(Ni2+)) for His-tagged proteins), which enforces a uniform protein topology at the surface of the liposome. An example is presented wherein the interaction between Dynamin-related protein 1 (Drp1) with an integral membrane protein, Mitochondrial Fission Factor (Mff), was investigated using this scaffold liposome method. In this work, we have demonstrated the ability of Mff to efficiently recruit soluble Drp1 to the surface of liposomes, which stimulated its GTPase activity. Moreover, Drp1 was able to tubulate the Mff-decorated lipid template in the presence of specific lipids. This example demonstrates the effectiveness of scaffold liposomes using structural and functional assays and highlights the role of Mff in regulating Drp1 activity.

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

This paper describes a method for assessing the interactions and assemblies of integral membrane proteins in vitro with various partner factors in a lipid-proximal environment.

비계 리포좀을 사용하여 근위 지질 단백질 - 단백질 상호 작용을 재구성<em&gt; 체외</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Multimer-PAGE: A Method for Capturing and Resolving Protein Complexes in Biological Samples

There are many well-developed methods for purifying and studying single proteins and peptides. However, most cellular functions are carried out by networks of interacting protein complexes, which are often difficult to investigate because their binding is non-covalent and easily perturbed by purification techniques. This work describes a method of stabilizing and separating native protein complexes from unmodified tissue using two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis. Tissue lysate is loaded onto a non-denaturing blue-native polyacrylamide gel, then an electric current is applied until the protein migrates a short distance into the gel. The gel strip containing the migrated protein is then excised and incubated with the amine-reactive cross-linking reagent dithiobis(succinimidyl propionate), which covalently stabilizes protein complexes. The gel strip containing cross-linked complexes is then cast into a sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel, and the complexes are separated completely. The method relies on techniques and materials familiar to most molecular biologists, meaning it is inexpensive and easy to learn. While it is limited in its ability to adequately separate extremely large complexes, and has not been universally successful, the method was able to capture a wide variety of well-studied complexes, and is likely applicable to many systems of interest.

A method for stabilizing and separating native protein complexes from unmodified tissue lysate using an amine-reactive protein cross-linker coupled to a novel two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) system is presented.

다량 체-PAGE : 생물학적 샘플에서 캡처하는 방법 및 해결 단백질 단지

There are many well-developed methods for purifying and studying single proteins and peptides. However, most cellular functions are carried out by ...

Rab10 Phosphorylation Detection by LRRK2 Activity Using SDS-PAGE with a Phosphate-binding Tag

Mutations in leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) have been shown to be linked with familial Parkinson&#39;s disease (FPD). Since abnormal activation of the kinase activity of LRRK2 has been implicated in the pathogenesis of PD, it is essential to establish a method to evaluate the physiological levels of the kinase activity of LRRK2. Recent studies revealed that LRRK2 phosphorylates members of the Rab GTPase family, including Rab10, under physiological conditions. Although the phosphorylation of endogenous Rab10 by LRRK2 in cultured cells could be detected by mass spectrometry, it has been difficult to detect it by immunoblotting due to the poor sensitivity of currently available phosphorylation-specific antibodies for Rab10. Here, we describe a simple method of detecting the endogenous levels of Rab10 phosphorylation by LRRK2 based on immunoblotting utilizing sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) combined with a phosphate-binding tag (P-tag), which is N-(5-(2-aminoethylcarbamoyl)pyridin-2-ylmetyl)-N,N&#39;,N&#39;-tris(pyridin-2-yl-methyl)-1,3-diaminopropan-2-ol. The present protocol not only provides an example of the methodology utilizing the P-tag but also enables the assessment of how mutations as well as inhibitor treatment/administration or any other factors alter the downstream signaling of LRRK2 in cells and tissues.

The present study describes a simple method of detecting endogenous levels of Rab10 phosphorylation by leucine-rich repeat kinase 2.

Rab10 인 산화 탐지 LRRK2 활동 인산 염-바인딩 태그와 SDS 페이지를 사용 하 여

Mutations in leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) have been shown to be linked with familial Parkinson&#39;s disease (FPD). Since abnormal activation of ...

Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays

Membrane fusion is a crucial process in the eukaryotic cell. Specialized proteins are necessary to catalyze fusion. Atlastins are endoplasmic reticulum (ER) resident proteins implicated in homotypic fusion of the ER. We detail here a method for purifying a glutathione S-transferase (GST) and poly-histidine tagged Drosophila atlastin by two rounds of affinity chromatography. Studying fusion reactions in vitro requires purified fusion proteins to be inserted into a lipid bilayer. Liposomes are ideal model membranes, as lipid composition and size may be adjusted. To this end, we describe a reconstitution method by detergent removal for Drosophila atlastin into preformed liposomes. While several reconstitution methods are available, reconstitution by detergent removal has several advantages that make it suitable for atlastins and other similar proteins. The advantage of this method includes a high reconstitution yield and correct orientation of the reconstituted protein. This method can be extended to other membrane proteins and for other applications that require proteoliposomes. Additionally, we describe a FRET based lipid mixing assay of proteoliposomes used as a measurement of membrane fusion.

Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays

Biological membrane fusion is catalyzed by specialized fusion proteins. Measuring the fusogenic properties of proteins can be achieved by lipid mixing assays. We present a method for purifying recombinant Drosophila atlastin, a protein that mediates homotypic fusion of the ER, reconstituting it to preformed liposomes, and testing for fusion capacity.

지질 혼합 애신을 위한 리포솜으로 재조합 초파리 아틀라스틴의 세제 지원 재구성

Membrane fusion is a crucial process in the eukaryotic cell. Specialized proteins are necessary to catalyze fusion. Atlastins are endoplasmic reticulum ...

Activated Cross-linked Agarose for the Rapid Development of Affinity Chromatography Resins - Antibody Capture as a Case Study

The purification of monoclonal antibodies (mAbs) is commonly achieved by Protein A affinity chromatography, which can account for up to 25% of the overall process costs. Alternative, cost-effective capture steps are therefore valuable for industrial-scale manufacturing, where large quantities of a single mAb are produced. Here we present a method for the immobilization of a DsRed-based epitope ligand to a cross-linked agarose resin allowing the selective capture of the HIV-neutralizing antibody 2F5 from crude plant extracts without using Protein A. The linear epitope ELDKWA was first genetically fused to the fluorescent protein DsRed and the fusion protein was expressed in transgenic tobacco (Nicotiana tabacum) plants before purification by immobilized metal-ion affinity chromatography. Furthermore, a method based on activated cross-linked agarose was optimized for high ligand density, efficient coupling and low costs. The pH and buffer composition and the soluble ligand concentration were the most important parameters during the coupling procedure, which was improved using a design-of-experiments approach. The resulting affinity resin was tested for its ability to selectively bind the target mAb in a crude plant extract and the elution buffer was optimized for high mAb recovery, product activity and affinity resin stability. The method can easily be adapted to other antibodies with linear epitopes. The new resins allow gentler elution conditions than Protein A and could also reduce the costs of an initial capture step for mAb production.

In this procedure, a DsRed-based epitope ligand is immobilized to produce a highly selective affinity resin for the capture of monoclonal antibodies from crude plant extracts or cell culture supernatants, as an alternative to Protein A.

선호도 크로마토그래피 수지의 신속한 개발을 위한 활성화된 상호 연결 아가로스 - 사례 연구로서의 항체 포획

The purification of monoclonal antibodies (mAbs) is commonly achieved by Protein A affinity chromatography, which can account for up to 25% of the overall ...

A Customizable Approach for the Enzymatic Production and Purification of Diterpenoid Natural Products

Diterpenoids form a diverse class of small molecule natural products that are widely distributed across the kingdoms of life and have critical biological functions in developmental processes, interorganismal interactions, and environmental adaptation. Due to these various bioactivities, many diterpenoids are also of economic importance as pharmaceuticals, food additives, biofuels, and other bioproducts. Advanced genomics and biochemical approaches have enabled a rapid increase in the knowledge of diterpenoid-metabolic genes, enzymes, and pathways. However, the structural complexity of diterpenoids and the narrow taxonomic distribution of individual compounds in often only a single species remain constraining factors for their efficient production. Availability of a broader range of metabolic enzymes now provide resources for producing diterpenoids in sufficient titers and purity to facilitate a deeper investigation of this important metabolite group. Drawing on established tools for microbial and plant-based enzyme co-expression, we present an easily operated and customizable protocol for the enzymatic production of diterpenoids in either Escherichia coli or Nicotiana benthamiana, and the purification of desired products via silica chromatography and semi-preparative HPLC. Using the group of maize (Zea mays) dolabralexin diterpenoids as an example, we highlight how modular combinations of diterpene synthase (diTPS) and cytochrome P450 monooxygenase (P450) enzymes can be used to generate different diterpenoid scaffolds. Purified compounds can be used in various downstream applications, such as metabolite structural analyses, enzyme structure-function studies, and in vitro and in planta bioactivity experiments.

Here we present easy to use protocols for producing and purifying diterpenoid metabolites through the combinatorial expression of biosynthetic enzymes in Escherichia coli or Nicotiana benthamiana, followed by chromatographic product purification. The resulting metabolites are suitable for various studies including molecular structure characterization, enzyme functional studies, and bioactivity assays.

디테르페노이드 천연제품의 효소 생산 및 정화를 위한 맞춤형 접근법

Diterpenoids form a diverse class of small molecule natural products that are widely distributed across the kingdoms of life and have critical biological ...

Fully Processed Recombinant KRAS4b: Isolating and Characterizing the Farnesylated and Methylated Protein

Protein prenylation is a key modification that is responsible for targeting proteins to intracellular membranes. KRAS4b, which is mutated in 22% of human cancers, is processed by farnesylation and carboxymethylation due to the presence of a &#39;CAAX&#39; box motif at the C-terminus. An engineered baculovirus system was used to express farnesylated and carboxymethylated KRAS4b in insect cells and has been described previously. Here, we describe the detailed, practical purification and biochemical characterization of the protein. Specifically, affinity and ion exchange chromatography were used to purify the protein to homogeneity. Intact and native mass spectrometry was used to validate the correct modification of KRAS4b and to verify nucleotide binding. Finally, membrane association of farnesylated and carboxymethylated KRAS4b to liposomes was measured using surface plasmon resonance spectroscopy.

Prenylation is an important modification on peripheral membrane binding proteins. Insect cells can be manipulated to produce farnesylated and carboxymethylated KRAS4b in quantities that enable biophysical measurements of protein-protein and protein-lipid interactions

완전히 가공된 재조합 KRAS4b: 판자및 메틸화 단백질을 분리하고 특성화

Protein prenylation is a key modification that is responsible for targeting proteins to intracellular membranes. KRAS4b, which is mutated in 22% of human ...

Simple In-House Ultra-High Performance Capillary Column Manufacturing with the FlashPack Approach

Capillary ultra-high performance liquid chromatography (UHPLC) is currently a method of choice for the sample separation step in LC-MS-based proteomics. However, capillary columns are much less robust in comparison to their higher flow countertypes. Because of easy contamination and blocking, they often need replacement. That makes them a markedly expensive part of the total LC-MS analysis cost. In-house packing of UHPLC capillary columns saves a lot of money and allows customization. However, the standard packing procedure in the 100-bar pressure bomb works well only for HPLC columns but is too slow for UHPLC sorbents. Here we provide a description of an optimized FlashPack protocol applied to the same 100-bar pressure bomb setup. The method is based on packing from ultra-high sorbent concentration slurry and is developed for in-house manufacturing of UHPLC capillary columns of unlimited length in reasonable time.

Here we present a protocol for the optimized FlashPack capillary column packing procedure. Application of an optimized protocol to a common 100-bar pressure bomb setup allows 10-times faster packing and manufacturing of long ultra-high performance capillary columns.

플래시팩 접근법을 통해 간단한 사내 초고성능 모세관 컬럼 제조

Capillary ultra-high performance liquid chromatography (UHPLC) is currently a method of choice for the sample separation step in LC-MS-based proteomics. ...

A Competent Hepatocyte Model Examining Hepatitis B Virus Entry through Sodium Taurocholate Cotransporting Polypeptide as a Therapeutic Target

Hepatitis B virus (HBV) infection has been considered a crucial risk factor for hepatocellular carcinoma. Current treatment can only lessen the viral load but not result in complete remission. An efficient hepatocyte model for HBV infection would offer a true-to-life viral life cycle that would be crucial for the screening of therapeutic agents. Most available anti-HBV agents target lifecycle stages post viral entry but not before viral entry. This protocol details the generation of a competent hepatocyte model capable of screening for therapeutic agents targeting pre-viral entry and post viral entry lifecycle stages. This includes the targeting of sodium taurocholate cotransporting polypeptide (NTCP) binding, cccDNA formation, transcription, and viral assembly based on imHC or HepaRG as host cells. Here, the HBV entry inhibition assay used curcumin to inhibit HBV binding and transporting functions via NTCP. The inhibitors were evaluated for binding affinity (KD) with NTCP using isothermal titration calorimetry (ITC)-a universal tool for HBV drug screening based on thermodynamic parameters.

We present a protocol to screen anti-hepatitis B virus (HBV) compounds targeting pre- and post-viral entry lifecycle stages, using isothermal titration calorimetry to measure binding affinity (KD) with host sodium taurocholate cotransporting polypeptide. Antiviral efficacy was determined through the suppression of viral lifecycle markers (cccDNA formation, transcription, and viral assembly).

치료 표적으로 폴리펩티드를 공동 수송하는 나트륨 타우로 콜레이트를 통한 B 형 간염 바이러스 진입을 조사하는 유능한 간세포 모델

Hepatitis B virus (HBV) infection has been considered a crucial risk factor for hepatocellular carcinoma. Current treatment can only lessen the viral load ...