이 프로토콜은 후보 항 HBV 화합물이 특히 NTCP 결합을 차단하여 바이러스 진입을 억제하는지 확인하도록 설계되었습니다. 이 기술은 HBV 진입 또는 감염의 초기 단계가 후보 화합물에 의해 중단 될 수 있는지 조사하기위한 것입니다. 절차를 시연하는 것은 내 실험실의 PSP 학생 인 Piyanoot Thongsri가 될 것입니다.
나트륨 타우로콜레이트 공동수송 폴리펩티드 또는 NTCP의 측정을 시작하려면, 성숙한 간세포를 8밀 이상의 에틸렌디아민테트라아세트산 또는 EDTA와 함께 15분 동안 배양한다. 세포 펠릿을 수집하고 PBS에 3.7 % 파라 포름 알데히드 300 마이크로 리터를 15 분 동안 첨가하여 간세포를 고정합니다. 그런 다음 세포 현탁액을 1.5 밀리리터 마이크로 원심 분리 튜브에 옮겨 300G 및 섭씨 25도에서 10 분 동안 원심 분리합니다.
앞에서 설명한 대로 10분 동안 원심분리기에서 1% 소 태아 혈청 또는 FBS를 함유하는 700 마이크로리터의 PBS를 사용하여 세포를 2회 세척한다. 그런 다음 실온에서 20분 동안 PBS 중 300마이크로리터의 0.05% Triton X 100으로 세포를 투과화합니다. 원심분리 후 1%FBS를 포함하는 700 마이크로리터의 PBS를 사용하여 각각 1분씩 3회 세척해 준다.
세포를 섭씨 4도에서 1 대 100 비율로 NTCP에 대한 1차 항체와 함께 30분 동안 배양한 다음, 파마 세척 완충액으로 3회 세척하고, 원심분리한다. Alexa Fluor 488에 접합된 2차 항체로 세포를 섭씨 4도에서 30분 동안 염색하고 각각 1분 동안 파마 세척 완충액을 3회 세척을 반복합니다. 300G에서 원심분리한 후, 1%FBS를 함유하는 200마이크로리터의 PBS로 세포 펠릿을 재현탁시킨다.
소프트웨어에서 FSC, SSC, FITC 또는 PE를 포함한 유세포 분석을 위한 측정 파라미터를 선택합니다. 자동 보정 조정을 설정하고 원고에 설명된 대로 보정 컨트롤을 포함합니다. 다음으로, 염색되지 않은 샘플을 분당 60 마이크로 리터의 중간 유체 유속으로 실행합니다. 전방 산란 및 측면 산란 임계값이 관심 있는 세포 집단을 덮을 때까지 조정합니다.
이 영역의 게이트 영역을 표시하고 모든 보상 제어에 적용하십시오. 염색되지 않은 컨트롤을 사용하여 광 배율 튜브 또는 PMT 형광을 설정하고 음의 사분면에서 FITC 또는 PE의 PMT 전압을 조정합니다. 양성 염색 샘플을 실행하고 양성 사분면 척도에서 FITC 또는 PE를 조정합니다.
염색되지 않은 FITC 염색 또는 PE 컨트롤을 실행하고 보정을 계산하여 샘플 설정에 적용합니다. 다음으로 간세포 샘플을 실행하여 NTCP 수준을 측정합니다. 다음으로, BD FACSuite 창, 컨트롤 튜브, 데이터 소스 탭을 순차적으로 선택하여 염색된 간세포 분석을 시작합니다.
원시 데이터가 나타날 때까지 기다립니다. 그런 다음 오른쪽의 워크 시트 탭에서 타원 게이트 버튼을 클릭하고 마우스 커서를 사용하여 셀 모집단과 SSC 및 FSC 점도표를 선택합니다. 그런 다음 원 P1이 나타날 때까지 기다리십시오.
간격 게이트 버튼을 클릭하고 플루오레세인 이소티오시아네이트 염색 히스토그램에서 영역을 표시합니다. 가장 높은 형광 강도 값에서 오른쪽으로 시작합니다. P2 줄이 화면에 나타납니다.
실험 튜브를 클릭하고 워크시트 탭의 데이터가 변경되는지 확인합니다. 통계 버튼을 클릭 한 다음 빈 공간과 워크 시트를 클릭하십시오. 이어서, 나트륨 타우로콜레이트 공동수송 폴리펩티드 집단의 통계적 값을 관찰한다.
100% 합류 MHC 웰 플레이트에서 배지를 흡인하고 윌리엄 E 배지로 희석한 4개의 마이크로몰 사이클로스포린 A를 2시간 동안 추가합니다. 다음으로, 후보 B 형 간염 바이러스 진입 억제제를 흡인하여 4 % 폴리에틸렌 글리콜을 함유 한 Williams E 배지 1 밀리리터로 대체합니다. 이어서, 배양 배지를 B형 간염 바이러스 입자와 함께 섭씨 37도에서 18시간 동안 웰당 100개의 감염 다중으로 배양한다.
그런 다음 2ml의 차가운 PBS에서 상청액을 버리고 부드럽게 소용돌이 치면서 결합되지 않은 B 형 간염 바이러스로 오래된 배지를 헹굽니다. 세포를 2 밀리리터의 완전한 윌리엄 E 배지로 7 일 동안 배양 한 후 세포를 PBS로 세척하고 실온에서 15 분 동안 3.7 % 파라 폼 알데히드 및 PBS로 고정시켰다. 감염된 세포를 1차 항체에서 실온에서 60분 동안 IF 차단 용액으로 순차적으로 배양하여 섭씨 4도에서 밤새 블로킹 용액에서 1 내지 200으로 희석한다.
이어서 실온에서 1시간 동안 1 내지 500 희석하여 세포를 배양하기 전에 세척액을 이용하여 각각 1분씩 3회 세척해 준다. 세 번 세척한 후 DAPI가 있는 페이드 방지 장착 매체로 샘플을 장착하고 유리 커버 슬립으로 덮습니다. DAPI 및 PE 필터가 장착된 형광 현미경을 사용하여 20 x 대물 렌즈로 형광 신호를 검출하여 후보 화합물의 항 HBV 진입 활성을 결정합니다.
세포 결합 분석을 위해, 이전에 입증 된대로 세포를 준비하고 섭씨 4도에서 2 시간 동안 B 형 간염 바이러스 입자와 함께 배양하십시오. 배지를 버린 후 부드러운 소용돌이로 차가운 PBS 2ml로 세포를 헹굽니다. 그런 다음 세포 스크레이퍼를 사용하여 감염된 세포를 수확하고 용해 완충액으로 세포를 파괴합니다.
세포 용해물을 수집 튜브로 옮겨 원고에 설명된 온도 조건을 사용하여 중합효소 연쇄 반응으로 전체 DNA를 추출합니다. 앞에서 입증 된 바와 같이 세포를 준비한 후, 실온에서 15 분 동안 나트륨 타우로 콜산 용액으로 간세포를 배양하고, 용액을 흡인하고, 차가운 hepes로 세포를 세 번 세척한다. 다음으로, 300-500 마이크로 리터의 차가운 hepes를 추가하여 얼음 위의 세포 스크레이퍼로 세포를 수확합니다.
20 초 동안 20 킬로 헤르츠에서 초음파로 세포를 균질화하고 5 분 동안 얼음 위에서 배양하십시오. 10, 000 G에서 원심분리한 후, 상층액을 수집하고 타우로콜산 ELISA 분석 키트를 사용하여 세포내 타우로콜산 농도를 평가하였다. 등온 적정 열량계 또는 ITC 기기에서 세포와 주사기를 세척하려면 ITC 소프트웨어를 실행하십시오.
실험 실행 강조 표시 탭에서 19 주입 도트 ITCM에 대한 마이크로 cal 방법을 선택하고 열기를 클릭합니다. 새 창이 열리면 청소 탭을 클릭하고 청소 방법 창에서 셀 세척 방법에 대한 세척 버튼과 주사기 세척 방법에 대한 헹굼 버튼을 선택합니다. 다음을 클릭하고 화면의 지시를 따릅니다.
샘플을 ITC에 로드한 후 실험 실행 탭 아래에 있는 로드 버튼을 클릭합니다. 그런 다음 다음을 클릭하고 이 로드 단계가 완료될 때까지 비디오 지침을 따릅니다. 주사기를 사용하여 샘플 셀의 용액 버퍼로 기준 셀을 버퍼에 15 마이크로 몰 NTCP로 채 웁니다.
여분의 용액을 제거한 다음 기포를 피하면서 150 마이크로 몰 커큐민 리간드 용액으로 주사기를 채 웁니다. 실험 실행 탭 아래의 실행 단추를 클릭하여 샘플을 실행합니다. 실험 정보 및 설정이 왼쪽에 표시됩니다.
리간드 단백질 농도와 온도 세부 정보를 입력합니다. 시작을 클릭하여 주입 프로세스를 수행합니다. 단백질 리간드 상호 작용이 완료 될 때까지 1.4 시간 동안 기다리십시오.
주입이 완료되면 강조 표시된 분석 버튼을 선택하여 분석 소프트웨어를 사용하여 원시 데이터를 분석합니다. 그런 다음 개요를 클릭하여 원시 데이터를 표시하고 피팅 모델을 하나의 결합 사이트 세트로 선택합니다. 특히 MHC의 분화 단계에서 이핵 세포 및 다각형 모양의 형태를 포함한 간 성숙 특징이 관찰되었습니다.
분화된 HepaRG 및 분화된 MHC에서 NTCP 발현의 큰 증가가 관찰되었다. 고도로 글리코 실화 된 형태의 NTCP는 분화 된 HepaRG보다 분화 된 MHC에서 더 많이 검출되었습니다. NTCP 수준은 미분화 세포보다 분화된 MHC 세포에서 더 높았다.
바이러스 면역형광염색은 감염 후 7일째에 항 HBV 진입 활성을 평가하고, 세포 표면 수용체에 대한 바이러스 결합 수준을 실시간 중합효소 연쇄 반응에 의해 평가하였다. 타우로 콜산 섭취 분석은 후보 화합물의 징벌 적 억제 활성이 NTCP를 통한 B 형 간염 바이러스 결합을 감소 시킨다는 것을 시사했다. 비색 변화는 샘플 세포에 대한 연속 주입으로 감지되었습니다.
표준 비선형 최소 제곱 회귀는 데이터에 잘 맞는 하나의 결합 부위를 기반으로 플롯되었습니다. 실선은 SBB 결합에 대한 실험값에 가장 적합하고 B형 간염 바이러스 입자가 섭씨 4도에서 배양되는 것을 나타내었다. 타우로 콜산 업데이트는 방사성 기술을 사용하여 평가할 수 있습니다.
방사성 타우로 콜산의 수준은 액체 시뮬레이션 카운터를 사용하여 정량화 할 수 있습니다. 이 기술은 감염 또는 재감염을 예방하는 데 도움이 되는 항바이러스 요법의 조사 활동에서 바이러스 항목을 간단하고 빠르게 선별합니다.
