플래시팩 접근법을 통해 간단한 사내 초고성능 모세관 컬럼 제조. 이 절차의 목표는 LC-MS 프로테오믹스 분석을 위한 빠르고 쉬운 초고성능 모세관 기둥 포장을 위한 최적화된 프로토콜을 도입하는 것입니다. 현대 프로테오믹스는 초고성능 모세관 액체 크로마토그래피와 결합된 질량 분광법을 기반으로 합니다.
펩티드 분리는 주로 75 마이크로미터의 내부 직경을 가진 모세관 컬럼에서 수행됩니다. 상용 제품과 동등한 경우, 모세관 기둥을 사내에서 준비할 수 있습니다. 사용자 정의로 준비된 열은 상업적 비유와 유사한 분리 품질을 보여 주면서 많은 비용을 절감하고 소광 및 열 크기 사용자 지정을 허용합니다.
여기에서 는 FlashPack이라고 부르는 사내 모세관 기둥 제조에 최적화된 포장 절차를 시연합니다. 최적화의 배후는 매우 높은 흡착 슬러리 농도에서 포장하는 것입니다, 여전히 동일한 일반적인 100 바 압력 폭탄 포장 설정을 사용하는 동안. 이를 위해서는 높은 흡기 농도의 기둥 입구 주위에 형성되고 새로운 흡착 물질이 모세관에 유입되는 것을 방지하는 등 받굽기 클러스터를 지속적으로 분해해야 합니다.
기술적으로, 우리는 망치로 자석 바를 사용하여, 지속적으로 가열하고 소맷선 내부의 모세관 주위를 이동하여 그것을 달성한다. 적절하게 적용된 FlashPack은 포장 속도를 최대 10배까지 증가시킵니다. 따라서 부드러운 마이크로 메트릭비트 크기의 초고성능 소각을 포장하고 합리적인 시간에 최대 미터 길이의 매우 긴 컬럼을 제조하는 데 적합합니다.
열 준비 절차는 5단계로 구성됩니다. 포장 스테이션 조립 및 모세관 및 소경 슬러리 준비를 포함하는 세 가지 준비 단계. 그런 다음 모세관은 먼저 60 ~ 100 바 압력의 압력 폭탄에 포장됩니다.
그 다음에포장된 모세관을 HPLC 시스템에 연결하여 고압및 컬럼 절단을 크기로 포장합니다. FlashPack 프로시저는 공통 프로토콜 의 3단계와 4단계에서 변경해야 합니다. 우선, 포장 스테이션을 준비합니다.
그것은 적어도 50 바 출구 압력질소 가스 탱크로 구성되어 있습니다. 탱크는 자기 교반기에 배치되는 압력 폭탄의 벤트 밸브에 연결되어 있습니다. 통풍구 밸브의 콘센트는 좁은 ID PEEK 모세관을 통해 물병에 삽입되어 우울을 미세하게 제어 할 수 있습니다.
다음으로, 우리는 모세관을 준비합니다. 포장은 카실과 포르마이드에서 형성된 통합 유리 프릿으로 프릿모필로 할 수 있습니다. 또 다른 옵션은 서터 레이저 풀러에 의해 준비 뽑아 모세관에 팩하는 것입니다.
모세관은 의도한 컬럼 길이보다 10~15cm 더 오래 만들어야 합니다. 다음 비디오는 뽑아낸 방출기 모세관 포장의 예에 대해 준비됩니다. 절단 된 젤 로딩 파이펫 팁으로 당겨진 방출기 끝을 보호하십시오.
자세한 내용은 원고의 텍스트 버전을 참조하십시오. 다음 단계는 슬러리 준비입니다. 첫째, 1.5 밀리리터 원심분리기 튜브에 50 밀리그램의 드라이 스벤트를 넣습니다.
즉, 주식 소르벤트 바이알이 될 것입니다. 이 비디오는 Dr.Maisch의 Reprosil Pur C18 AQ 1.9 마이크로 미터의 사용으로 준비되었습니다. 스톡 소벤트 바이알에 메탄올 1밀리리터를 넣습니다.
10 초 동안 소용돌이. 그리고 또 다른 10 초 동안 초음파 욕조에서 초음파 처리합니다. 20~30분 동안 충분히 몸을 담근 다음 소용돌이를 한 번 더 초음파 처리합니다.
작동 하는 sorbent 유리병을 준비 합니다. 그것은 폭탄에 맞는 원물 바닥 유리병이어야합니다. 특정 압력 폭탄 설계에 따라 또 다른 1.5 밀리리터 원심분리기 튜브 또는 기타 바이알일 수 있습니다.
우리는 압력 폭탄의 높이로 잘라 스커트 원상 바닥 나사 캡 튜브를 사용합니다. 스톡 스벤트 바이알에서 소광을 다시 중단하고 500 마이크로리터를 작업 용 실로 옮기고 자석 바 2 x 3 밀리미터 크기로 옮습니다. 메탄올을 곁들인 밀리리터 1밀리리터에 작동 유리병에 상단.
작업 바이알이 중력에 의해 정착할 수 있도록 10 분 동안 테이블에 서게하십시오. 이 단계의 결과는 약 4밀리미터 높이의 느슨한 소릭의 바닥 층이 있는 원물 바닥 유리병이어야 합니다. 층이 너무 낮으면 스톡 바이알에서 좀 더 흡착합니다.
따라서 준비된 작업 바이알은 수개월 에 걸쳐 여러 열을 준비하기 위한 것입니다. 작동 하는 sorbent 유리병 2 시간 이상 교반 하지 않고 유지 하는 경우, 그것은 소용돌이, 초음파 및 포장 하기 전에 중력에 의해 다시 정착 해야 합니다. 모든 것이 준비되면 압력 폭탄에 포장, 4 단계로 진행합니다.
융합된 실리카 모세혈관과 압력 폭탄으로 작업할 때항상 보호 안경을 착용하십시오. 동시에 보호 장갑은 권장되지 않습니다. 그들은 음직경 모세 혈관의 적절한 처리에 필요한 터치 감각을 심각하게 줄이고 실수로 이어질 수 있습니다.
압력 폭탄에 흡기 유리병을 놓고 모든 매듭을 단단히 고정합니다. 분당 60~100발의 회전을 시작하고, 프릿또는 당겨진 방출기 모세관을 폭탄에 삽입합니다. 유리병의 맨 아래에 밀어 넣은 다음 2~3밀리미터를 들어 올리고 매듭을 고정시하십시오.
모세관을 고치기 위해 최소한의 필요한 힘을 적용하십시오. 모세관이 제대로 고정되어 있는지 확인합니다. 손으로 모세관을 당기는 것은 불가능해야합니다.
매우 천천히, 모세관의 열린 끝을 유지하면서 압력 폭탄 밸브를 열어 얼굴에서 멀리 가리켰다. 포장 프로세스의 초기 단계를 보십시오. 가압 시, 소버벤트는 모세관을 채우고 전체 길이에 대해 불투명해진다.
소광이 말단 내부에 짐을 싸기 시작하자마자, 배압이 증가하고, 흐름이 느려지고, 모세관 내부의 심지어 는 소광 된 슬러리가 여러 개의 소벤트 패킷으로 바칩니다. 이미 포장 된 소광은 조밀하게 착색 된 지속적으로 성장하는 지역으로 볼 수 있습니다. 소경구가 채워진 부위를 모세관 길이의 70% 이상이어야 하며, 포장 공정의 전체 기간 동안 작은 소경없는 틈이 있는 작은 틈새를 유지한다.
포장 과정에서 주의해야 할 몇 가지 일반적인 문제가 있습니다. 그들은 모세관에 효율적인 소경 배달을 유지하기 위해 기내 설정 조정이 필요합니다. 가장 빈번한 문제는 새 소벤트가 모세관에 들어가지 않는 반면 이미 내부에 있는 소벤트가 계속 움직이면 됩니다.
대부분의 경우 모세관 입구는 자체 집계 된 소경모 클러스터에 의해 차단됩니다. 이러한 단계를 sorbent 흐름이 복원할 때까지 하나씩 적용한 다음 나머지 문제 관련 단계를 건너뜁니다. 회전 속도를 분당 500라운드로 늘리고 즉시 60RPM으로 줄입니다.
대부분의 경우 스벤트 흐름을 복원합니다. 나머지 포장 공정에 대해 회전 속도를 최소 60RPM으로 확인합니다. 도움이 되지 않으면 포장 폭탄을 잠시 배출하고 즉시 다시 가압하십시오.
도움이되지 않거나 차단이 다시 발생하면 소경 층 내부의 모세관을 재배치하십시오. 소릭의 부재는 모세관 오픈 엔드가 자석 막대 위에 너무 높기 때문에 컬럼 끝이 닿지 않기 때문입니다. 또는 모세관은 너무 낮게 배치되고 바이알 바닥에 붙어 있습니다.
먼저 폭탄을 완전히 배출한 다음 너트를 풀고 모세관을 바닥으로 밀어 넣은 다음 2밀리미터 뒤로 당깁니다. 너트를 수정합니다. 밸브를 열어 폭탄을 가압하고 포장을 계속합니다.
포장 문제에 대한 자세한 내용은 메서드의 텍스트 버전에 설명되어 있습니다. 대상 열 길이와 5~7cm가 달성될 때까지 컬럼을 계속 포장하십시오. 회전을 중지하고 매우 천천히 폭탄을 우울.
폭탄 밸브를 조금 열고 물병 내부에 거품이 터질 때까지 기다립니다. 그런 다음 밸브를 조금 더 넓게 열고 거품이 느려질 때까지 기다립니다. 따라서 증분 단계에서 밸브에서 가스가 나오지 때까지 압력을 방출하십시오.
밸브를 한 번에 열지 마십시오. 그것은 모세관 내부의 버블링으로 이어질 것입니다 및 여학생은 유리병으로 다시 가는. 이 경우 폭탄을 다시 가압하고 열이 다시 포장될 때까지 기다립니다.
가스가 통풍구 밸브에서 나오는 것을 멈추면 포장 된 모세관을 압력 폭탄에서 꺼내십시오. 컬럼을 건조시키지 마십시오. 추가 포장을 위해 HPLC 시스템에 즉시 연결되지 않은 경우 포장 된 모세관을 10 % 에탄올 솔루션으로 완전히 잠급으로써 저장에 넣습니다.
연결이 끊어진 HPLC 열은 동일한 방식으로 저장됩니다. 오늘 더 이상 포장이 계획되지 않으면 폭탄에서 흡인 유리병을 꺼내 단단히 닫습니다. 열을 더 포장할 수 있도록 보관하십시오.
5단계, HPLC 포장. HPLC 연결을 통해 포장된 모세관을 HPLC 시스템에 연결합니다. 높은 유기 용매의 흐름을 시작합니다.
약 300개의 막대를 대상으로 포장된 길이에 따라 흐름을 조정합니다. 40센티미터의 경우 모세관은 분당 200-300의 유량을 사용합니다. 포장되는 모세관 내부의 느슨한 소경구를 주의하여 전체 포장 길이에 추가하십시오.
흐름을 멈추지 않고 컬럼 본체를 초음파 욕조에 두 번 찍어 넣습니다. 열 본문의 일부만 몰입하는 것이 중요합니다. 열 끝과 모세관 연결을 침지 마십시오.
흡착침대가 수축을 멈추면 컬럼 본체를 초음파 욕조에 두 번 더 찍어 흐름을 멈추지 않고 두 번 더 찍어 넣습니다. 300 바에서 10분 동안 열을 추가로 실행합니다. 흐름을 중지하고 압력이 세 막대 아래로 떨어질 때까지 기다렸다가 열을 분리합니다.
간격과 변색이 없는 경우 컬럼을 시각적으로 검사합니다. 발견되면 흐름 하에서 초음파 처리가 반복될 수 있습니다. 중요한 실험의 경우 새 열을 만드는 것이 좋습니다.
열을 원하는 길이로 잘라냅니다. 제대로 절단은 열 효율을위한 전제 조건입니다. 서기와 폴리 아미드 코팅에 노치를 확인합니다.
부분적으로 모세관을 부수고 두 조각을 분리합니다. 세라믹 웨이퍼 또는 랩핑 필름으로 기둥 프런트 엔드를 연마합니다. 초고압 연결을 사용하여 컬럼을 LC 시스템에 다시 연결합니다.
작업 흐름 속도를 2%B로 시작합니다. 작업 흐름 속도는 열 매개 변수에 따라 조정됩니다. 예를 들어 100마이크로미터 ID 컬럼은 분당 500나노리터에서 실행됩니다.
압력이 평형화되고 열 의 역압을 확인할 때까지 기다립니다. 제대로 준비된 컬럼은 길이와 흡착 특성에 비례하는 역압을 제공합니다. 예를 들어, 2마이크로미터 소광으로 포장된 30cm 모세관 기둥은 2%용매 B.에서 450~500개의 백압력을 가하고 있습니다.생성된 컬럼이 예상 범위 내에서 역압을 제공하는 경우, 사용할 준비가 되어 있습니다.
백압력이 예상 범위를 훨씬 벗어나면 열이나 LC 시스템에서 문제가 있습니다. FlashPack을 포장하는 것은 100 바 포장 압력에서 1 시간 이내에 1.9 마이크로 미터 의 소벤트로 50 센티미터에 포장 된 모세관을 생성합니다. 예를 들어, 우리는 1.9 마이크로 미터 ReprosilPur C18 AQ 소벤트와 당겨 진 방사체 모세관에 포장 30 센티미터 100 마이크로 미터 ID 초고압 열을 생산하고 있습니다.
포장은 50센티미터 길이의 방사체 모세관으로 60 개의 바에서 수행되었습니다. 모세관은 40분 만에 40cm로 포장되었고, 모세관 내부에는 더 많은 소광이 포장되지 않았습니다. 포장 된 모세관은 HPLC 시스템에 연결되어 용매 B와 분당 300 나노 리터에서 실행, 이는 우리의 경우 80 %아세토나이트, 0.1 %의 포믹 산이었다.
마지막 포장 길이는 43센티미터였습니다. 기둥은 30cm 절단되었습니다. 99%의 용매 B로 분당 500 나노리터의 작업 흐름에서 컬럼은 275개의 막대의 역압을 주었으며, 이는 예상 값에 가깝습니다.
컬럼을 테스트하기 위해, 우리는 2-50%B에서 15분 그라데이션에서 시토크롬 C 단백질의 트립틱 다이제스트 50fmol을 분리하여 최소 테일링으로 매우 대칭적이었습니다. 평균 FWHM은 약 3초였습니다.
설명된 프로토콜은 적절한 시간에 설정된 공통 100 bar 패킹에서 UHPLC 열을 생성할 수 있습니다. 짧은 HPLC 또는 UPLC 열은 몇 분 만에 포장할 수 있으며, 긴 30-50센티미터 기둥은 1시간 이내에 포장됩니다. 이 방법은 RP및 기타 화학을 모든 열 ID로 압축하는 데 효율적입니다.
생성된 컬럼은 유사한 크기와 소각 매개 변수의 다른 상업적 열만큼 이나 효과적입니다.
