우리의 프로토콜은 높은 수율에서 제대로 처리 된 KRAS의 격리 및 분리를 허용합니다. 정통 farnesylated 및 carboxymethylated KRAS의 생산은 포유류 세포에서와 같이 그들의 막에 KRAS가 있는 실험을 능력을 발휘할 수 있게 합니다. 프로토콜의 높은 수율은 이전 작업과 차별화됩니다.
우리는 일반적으로 발현 물질의 리터 당 단백질의 3 ~ 5 밀리 그램을 정화. 이를 통해 다양한 생물물리학 및 구조 생물학 실험을 수행할 수 있습니다. KRAS는 암의 20%와 췌장암에서 90%에서 돌연변이됩니다.
따라서 진정으로 가공된 단백질을 생산하는 프로토콜을 갖는 것은 암세포의 막에 있을 때와 같이 실제 단백질을 연구할 수 있도록 약물 스크린 개발에 매우 유용합니다. 이 프로토콜은 또한 세포에서 파네산되고 완전히 가공되는 그밖 단백질을 공부하기 위한 아주 유용합니다. 그리고 따라서, 당신이해야 할 모든 관심의 단백질로 KRAS를 교환하고 바쿨로 바이러스에 넣어.
중요한 단계는 양이온 교환 크로마토그래피 주변의 단계입니다. 적절한 컬럼을 사용하고 단백질이 낮은 소금 완충제에 있는 시간을 제한하는 것은 성공을 위해 필수적입니다. 강수량이 스노우 글로브 유형의 이벤트가 아니라는 것을 이해하면 새로운 프로토콜을 안내하는 데 도움이됩니다.
이는 양이온 교환 열 부하를 여러 개의 더 작은 하중으로 나눌 필요성을 보여 줌으로써 강화됩니다. 세포를 용해하고, 용해물을 명확히 하고, IMAC에 의한 표적 단백질을 정화한 후, SDS 페이지와 쿠마시 염색을 사용하여 단백질 분획을 분석한다. 피크 분획을 풀링하고 섭씨 4도에서 버퍼 D 2리터에 대해 밤새 수영장을 투석합니다.
다음 날, 투석에서 샘플을 제거하고 10 분 동안 4, 000 배 g에서 원심 분리하여 침전을 제거하십시오. 최종 투석 및 명확한 샘플은 여전히 흐릿하지만 추가 처리 없이 CEX 컬럼에 적용할 수 있습니다. 버퍼 G의 세 컬럼 부피로 세척하여 20 밀리리터 양이온 교환 열을 준비한 다음, 3개의 열 부피의 완충F.Next로, 20밀리리터의 최종 염화나트륨 농도를 100 밀리미터의 최종 염화나트륨 농도로 희석하고 샘플을 교환 열에 적용한다.
소량의 시료를 한 번에 희석하는 것이 중요하며 희석 후 즉시 컬럼에 도포하여 단백질의 강수량을 제한하는 것이 중요합니다. 이전 희석이 부하 끝에 가까워지면 새로 희석된 샘플로 컬럼을 계속 로드합니다. 그런 다음 일반적으로 세 개의 열 볼륨이 필요한 버퍼 F로 컬럼을 기준용량(280)으로 세척합니다.
버퍼 F에서 65%의 완충제 G까지 400 밀리리터 그라데이션으로 컬럼에서 단백질을 엘테하여 6밀리리터 분획으로 용액을 수집합니다. 그라데이션이 완료되면, 65%버퍼 G.의 추가 1.5 컬럼 볼륨에 대한 열을 계속 세척하여 SDS 페이지와 쿠마시 블루 얼룩 분석과 크로마토그램의 UV 추적 검사를 기반으로 양극분획을 선택합니다. 그런 다음 단백질을 풀과 원고 방향에 따라 His6 TEV 프로테아프로 소화합니다.
소화 및 투석 후, 단백질을 분당 3밀리리터로 버퍼 A로 평가한 20 밀리리터 IMAC 컬럼에 적재합니다. 이 크로마토그래피 동안 7밀리리터 분획을 수집하고 총 3개의 열 버퍼 A로 또는 기준선 흡수도에 도달할 때까지 컬럼을 세척합니다. 완충 C의 5개의 컬럼 부피 그라데이션을 0%에서 10%로 조정하고 7밀리리터 분획을 수집합니다.
그런 다음 SDS 페이지를 통해 양수 분수를 식별합니다. SDS 페이지로 분석할 때, 명확한 용액에는 융합 단백질 His6-MBP-tev-KRAS4b에 해당하는 약 65킬로달톤으로 이동하는 어두운 밴드가 포함되어야 합니다. 공동 표현된 FNTAb는 48킬로달톤으로 이동합니다.
정제 내의 CEX 단계는 프로테오시스의 범위를 감소시키고 완전히 가공된 단백질을 풍부하게 하기 때문에 중요하지만 프로토콜의 가장 복잡한 부분입니다. 이 단계의 일반적인 결과는 KRAS4b-FMe를 가진 눈에 띄는 피크 3이 있지만 용출 프로파일은 가변적일 수 있습니다. ESIMS를 이용한 온전한 질량 분석은 단백질의 정확한 분자 질량을 확인하고 이에 의해 파네실화 또는 카박스티메틸화의 상대적 비율을 확인한다.
일반적인 최종 제비는 일부 검출 가능한 KRAS4b-FARN을 포함 하는 동안, 이 비율은 미만 15%이 분석에서 피크 높이 측면에서. 네이티브 질량 분석은 GDP에 바인딩 된 KRAS4b의 질량을 결정하는 데 사용되었다. 샘플 용매는 아세테이트 암모늄으로 교환되어 원어민 복합체가 그대로 유지될 수 있도록 부드러운 이온화를 보장하였다.
KRAS4b-FMe및 리포솜의 상호 작용은 KRAS4b-FMe가 멤브레인에 결합하기 위해 필요한 파네실화 및 카박스티메틸화를 검증하기 위해 표면 플라스몬 공명으로 측정되었다. 예상대로, KRAS4b-FMe는 리포솜에 묶여 있었고, 처리되지 않은 KRAS4b는 그렇지 않았다. 단백질이 낮은 소금에 노출되는 시간을 최소화하는 것은 수율에 영향을 미치는 프로토콜의 가장 중요한 단일 측면입니다.
단백질은 완충E의 희석 에 이어이 낮은 염 농도에서 간단히 단백질은 LIPosomes 또는 나노 디스크와 같은 막 모방을 사용하여 KRAS가 상호 작용하는 지질을 조사하는 다양한 생물 물리 학적 실험에 사용될 수 있습니다. 이러한 데이터를 사용하여 KRAS가 세포의 혈장 막과 상호 작용하는 방법을 추정하기 시작할 수 있습니다. 정제 된 KRAS-FMe를 사용하여, 우리의 동료는이 단백질의 farnesylated 및 메틸화 된 형태에 특정 된 chaperone와 복합체에서 KRAS의 엑스레이 결정 구조를 해결할 수 있었다.
