탁월한 기술 지원에 대해 Daniel Bukala, Natalie Altmeyer 및 Funda Cay에게 감사드립니다. 원고를 편집 한 Jonathan Cotton, Greg Bowden 및 Paul Soubiran에게 감사드립니다. 이 작업은 Werner Siemens-Foundation과 Eberhard Karls University Tübingen의 의학 교수 ( &quot;Promotionskolleg&quot;) 및 CRC 156 (프로젝트 C3)을 통한 DFG의 지원을 받았다.

이 문서에 설명 된 모든 절차는 지침과 관리 및 실험 동물의 사용의 국제 표준을 따라 국가위원회 튀빙겐, 독일의 지역 동물 복지와 윤리위원회에 의해 승인되었다. 12 시간 광 : - 8 ~ 12 주령 BALB / C 및 C57BL / 6 마우스는 12 시간에 보관 하였다 암주기를 2 그룹으로 22 ± 1 ℃에서 IVCs 표준화 된 환경 조건에 수납 된 - 물 (5) 음식 액세스 수의. 1. 재료 준비 <ol><li> 사출 직전 각 데이터 시트에 따른 근 적외 형광 영상을위한 OI 염료 희석. 생체 내에서 MMP의 측정을 기동 OI 염료 (680 nm에서 여기 상업용 프로브)를 1.5 ml의 PBS 1X 20 nmol의 농도로 사용할 수 있습니다. 부드럽게 흔들거나 사용하기 전에 솔루션을 소용돌이. 빛으로부터 보호 할 때 최대 6 개월 동안 11 °의 C - OI 염료 2에 저장 될 수있다. </li&gt; <li> 정맥 내 (IV) 주사는 정맥 카테터를 준비한다. 20 U (50 ㎖ 헤파린 10 개 분사 유니트를 포함)는 0.9 % 식염수 용액으로 채워진 (0.5 mL) 중 인슐린 주사기 및 폴리에틸렌 카테터에 부착 된 30 게이지 바늘을 사용한다. OI가 염료의 마우스 당 2 nmol의 권장 복용량을 주입한다. </li></ol> 류마티스 관절염 및 만성 연락 과민 반응 2. 유도 <ol><li> 류마티스 관절염: <ol><li> RA를 유도하는 1X PBS (200 μL)를 1 (K / BxN 마우스 (10)로부터 얻은) 혈중 글루코스 -6- 포스페이트 이소 머라 제 (GPI)에 대해 1 함유 항체 (AB)의 100 μL 희석. -80 ° C에서 희석 된 혈청을 저장합니다. RA의 유도에 대한 상세 절차는 Monach 동부 등에 의해 설명된다. 8. </li><li> RA를 유도하기 위해 꼬리에 의해 부드럽게 각 마우스를 올려 t의 일 0에 희석 된 혈청 복강 내 (IP)의 200 μL를 주입그는 실험했다. 주입 후 마우스를 직접 케이지에 넣으십시오. </li><li> 선택적으로, AB 주입 전에 각 발목의 발목 직경을 측정하고 &quot;관절염 점수&quot;( 그림 1A )를 정의하십시오. 기계적 측정 장치 (마이크로 미터)를 사용하여 GPI- 혈청 후 ​​6 일째까지 매일 발목 부종을 측정하십시오. </li><li> RA 생쥐의 꼬리 정맥 에 생체 내 MMP 활성을 측정하기 위해 활성화 가능한 OI 염료 (단계 1.1 - 1.2)를 주사 GPI- 혈청 주사 후 5 일째 및 대조군 마우스의 꼬리 정맥 내로 투여 하였다. 꼬리 정맥 주사 후 24 시간 동안 광학 이미징 실험을 수행하십시오. </li></ol></li><li> 과민 반응에 연락하십시오 : <ol><li> C57BL / 6 생쥐의 sensitization 들어, 아세톤 / 오일의 4 : 1 혼합물에 용해 5 % TNCB 솔루션을 준비합니다. </li><li> 100 % 산소 (1.5 L / 분)로 증발 된 1.5 % 이소 플루 란을 사용하여 C57BL / 6 마우스를 마취시킨다. 마우스가 anesthetized되면, 자기 미친에 넣어<html> e 코 콘 (1.5 vol % 이소 플루 란 관에 연결된 5 ml 폴리에틸렌 주사기를 자르십시오)을 마취 유지하십시오. Anesthetized 동안 마른 동물의 눈 건조를 방지하기 위해 수의사 용 연고를 바르십시오. </li><li> 작은 동물 머리 트리머를 사용하여 배를 조심스럽게 (2 x 2 cm) 면도하십시오. 동물의 비특이적 인 형광 신호를 유발할 수 있고 연구 결과에 영향을 줄 수 있으므로 피부 손상을 피하십시오. </li><li> 동물을 sensitizing 100 μL 피펫을 사용하여 면도 복부 영역에서 천천히 5 % TNCB 솔루션의 80 μL를 적용합니다. 각막 손상을 방지하고 회복기 동안 낮은 체온을 피하기 위해 마우스의 눈이 침구와 닿지 않도록주의하면서 새장에 부드럽게 다시 놓습니다. </li><li> 민감화 6 일 후에 1 % TNCB 용액 (아세톤 / 오일의 9 : 1 혼합물에 용해)을 준비하고 급성 및 만성 CHSR을 유도하기 위해 피펫을 사용하여 오른쪽 귀에 20 μL를 적용합니다.&quot;&gt; 1 <ol><li> 100 μL 피펫을 사용하여 1 % TNCB 솔루션의 20 μL와 오른쪽 귀 양쪽에 1 차 도전 과제로 시작하고 CHR ( 그림 1B )를 이끌어 내기 위해 매 5 일 (감작 후 15 일) . 마이크로 미터 측정 장치를 사용하여 매일 귀 두께를 측정하십시오. </li></ol></li><li> 챌린지 12 시간 후 CHR 마우스의 생체 내 에서 MMP 활성을 측정하기 위해 활성화 가능한 OI 염료 (680 nm에서 여기가있는 상용 프로브)를 주입합니다 (1.1-1.2 단계). 꼬리 정맥 주사 24 시간 후 광학 이미징 실험을 수행하십시오 ( iv ). </li></ol></li></ol> 3. 광학 이미징을위한 동물 준비 <ol><li> 사용 된 OI 요원의 형광 신호와 자동 형광 (약 700 nm)의 간섭을 피하기 위해 낮은 또는 비 형광 chow ( 예 : 망간 무료)에 마우스 chow (적어도 이미징하기 전에 3) 스위치. </li><li> 동물을에 넣으십시오.(1.5 L / 분) (산소는 공기로 대체 될 수 있지만 하나의 실험 내에서 표준화 될 필요가 있음)로 증발 된 1.5 부피 %의 이소 플루 란을 사용하여 마취시킨다. </li><li> 마우스가 눈으로 마취되면, 자기 - 만든 코 콘 (1.5 vol % isoflurane 튜브에 연결된 절단 5 ML 폴리에틸렌 주사기에 의해 빌드)에 배치하고 마취를 유지합니다. </li><li> 작은 동물 머리 트리머를 사용하여 대상 부위 (2 cm x 2 cm)에 동물을 면도하십시오. 동물의 비특이적 인 형광 신호를 유발할 수 있고 연구 결과에 영향을 줄 수 있으므로 피부 손상을 피하십시오. 참고 : Hairs는 관심 부위 (ROI)에 따라 OI (마우스 스트레인에 따라 다르지만 흡수가 많거나 적음) 동안 형광 신호를 흡수 할 수 있습니다. </li><li> iv 주사의 경우, 따뜻한 물에 마우스의 꼬리를 두어 혈관 확장을 유도하고 주사 부위의 피부를 알코올로 부드럽게 씻고 카테터를꼬리의 말초 사이트. (가) 꼬리 정맥에 20 °의 각도에있는 바늘의 끝을 &quot;잘라&quot;주사기를 다시 현탁 카테터의 정확한 배치를 테스트 놓는다. </li><li> 카테터가 올바르게 위치되면, 주사기를 교체하고 OI 프로브 (2 nmol의)을 분사. 주입 후 주사기를 교체하고 0.9 % 생리 식염수 폴리에틸렌 관의 완전히 명확 죽은 볼륨의 25 μL를 주입. 주 : 사용 OI 염료의 조직 반감기 시간 생체 MMP 활성을 측정 (680 nm에서 여기와 상용 프로브)는 72 시간이다. 완전한 통관을 보장하기 위해, 염료의 재 주입은 이전에 주입 한 후 이전 칠일 이상 사용하지 않는 것이 좋습니다. </li></ol> 4. 광학 이미징 <ol><li> 시야 (FOV)의 중심에 OI 스캐너의 블랙 박스 검은 플라스틱 또는 종이 시트를 배치했다. </li><li> 측정 프로토콜을 설정하고 적절한 파장을 선택합니다 (여기 : 680 ± 10 nm의 전자임무 : 700 ± 10 nm) 및 영상 매개 변수. 참고 : 일부 OI 시스템에서는 몇 가지 이미징 염료에 대한 설정이 미리 정의되어 있습니다. </li><li> 형광 이미징을위한 올바른 프로토콜을 선택하려면 이미징 소프트웨어 (제조업체가 제공함)를 열고 시스템을 초기화하십시오. 대부분의 CCD 카메라는 작동 온도까지 냉각해야하며 10 분 정도 걸릴 수 있습니다. 안정적인 결과를 얻으려면 시스템이 준비 될 때까지 기다리십시오. </li><li> 생체 내 이미징 시스템 수집 컨트롤 패널 팝업을 관찰하면 선택한 각 필터 쌍이 시퀀스의 한 이미지를 나타냅니다. 이 경우 각각 680 ± 10 nm 및 700 ± 10 nm의 여기 및 방출 파장을 가진 상업용 염료에 대한 필터 쌍으로 하나의 이미지를 수집하고 측정을 시작하십시오 ( &quot;Acquire sequence&quot;). 자세한 내용은 제조업체 설명서를 참조하십시오. </li><li> 이미지에 적절하게 라벨을 지정하고 &quot;이미지 편집&quot;획득 순서 &quot;레이블&quot;는 다음 나타납니다 창 &quot;. </li><li> OI가 염료를 주입하기 전에, 각 동물의 기준 검사를 취하거나, 배경 신호를 구별하기 나이브 대조군을 사용한다. </li><li> OI가 염료의 꼬리 정맥 주사 후 시간은 OI 시스템에서 가장 높은 신호를 측정 할 수있는 위치에서, FOV의 중심에 동물을 배치하고, 측정을 시작한다. 참고 : 중요 : 저체온증 크게 이미징 에이전트의 분포에 영향을 미칠 수있다. 무대는 동물의 저체온증을 방지하기 위해 37 ° C까지 가열되어 있는지 확인합니다. 영상은 1 내지 5 개의 마우스의 동물 군에서 동시에 수행 될 수있다. 동시에 측정하는 동물의 수에 따라 FOV의 크기를 선택합니다. 각 마우스의 표시 여부를 확인하기 위해 밝은 필드 이미지를 취할 수 있습니다. </li></ol> 5. 데이터 분석 참고 : 다음 이미지 소프트웨어를 사용하여 데이터 분석을 수행제조업체의 프로토콜. <ol><li> RA의 측정을 위해서는 그림 2 와 같이 보정 된 광자 방출 단위를 사용하는 반면, 만성 CHSR은 신호 세기 (%)로 묘사됩니다. </li><li> ROI를 수동으로 그리려면 툴 플레이트를 사용하십시오. RA 이미지의 분석을 위해 각 동물의 모든 발목과 발에서 가장 높은 신호 주위에 배치 된 표준화 된 원을 사용하십시오. CHSR을 분석하려면 밝은 영역 이미지에 따라 ROI를 전체 오른쪽 귀와 왼쪽 귀 주위에 배치하십시오. </li><li> 특정 그린 ROI에서 광자 방출 또는 신호 강도 값을 측정하려면 &quot;측정&quot;을 누릅니다. 이 시스템은 설명적인 통계 분석을 위해 그려진 ROI에 값을 제공합니다. </li></ol>

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저자가 공개하는 게 없다.

OI는 전임상 연구 에서 비 침습적 생체 내 분자 이미징을위한 매우 유용하고 빠르며 저렴한 도구입니다. OI의 특별한 강점은 염증 반응과 같은 매우 역동적 인 과정을 모니터하는 능력입니다. 또한 OI는 수 일에서 수주에 이르는 장기간의 질병 경과를 추적 할 수있게 해줍니다. OI는 양전자 방출 단층 촬영 (PET) 또는 자기 공명 영상 (MRI)과 같은 다른 생체 내 ...

류마티스 성 관절염 (RA)이나 건선의 건선과 같은자가 면역 질환은 지연 형 과민 반응 (DTHR)으로 분류됩니다. 1 RA는 부식성 윤 활막염과 관절 파괴를 특징으로하는 일반적인자가 면역 질환입니다. 염증 세포의 침투와 증식, 염증 세포의 발현 증가로 판 누스 형성, 연골 및 뼈 파괴를 일으키는 염증 관절염 관절. matrix metalloproteinases (MMPs)에 의한 콜라겐과 같은 세포 외 기질 분자의 절단은 조직 전환과 혈관 신생에 필수적이며 조직 파괴를 유발합니다. 5 , 6 접촉 과민 반응 (CHR)은 호중구가 응집되어 산화가 일어난다는 특징이 있습니다. RA와 유사하게 CHR의 MMP는 변이 형이다만성 염증을 설정하기 위해 조직 변환, 세포의 이동과 혈관 신생에 VED. RA를 조사하기 위해, 글루코스 -6- 포스페이트 이소 머라 제 (GPI) -serum 주입 마우스 모델을 사용 하였다. GPI에 대한 항체를 포함하는 트랜스 제닉 K / BxN 마우스 8 혈청 류마티스 염증 GPI 혈청 주입 후 6 일째에 부은 발목 최대 24 시간 (1.1 참조)에서 개발하기 시작 후 나이브 BALB / c 마우스에 주입 하였다. 만성 CHR을 분석하기 위해, C57BL / 6 마우스는 복부에 trinitrochlorobenzene (TNCB)에 민감했다. 오른쪽 귀는 감작 후 일주를 시작하기 5 회까지 도전되었다 (도 1.1 및 1.2 참조). 비침 작은 동물 OI 주로 임상 연구에서 사용되어, 직관 형 형광등 chemiluminescent- 및 생물 발광-신호의 생체 내 연구에 기초한 기술이다. 취득한 반 정량적 데이터는 molec에 대한 통찰력을 제공합니다울라 기관의 메커니즘과 건강의 조직뿐만 아니라 병에 걸린 실험 동물 모델 및 측정을 따라 길이 방향의 수 (예를 들어 생체 내에서 치료 반응 프로파일을 평가하기 위해). 같은 동물이 아닌 시점에 따라 다른 마우스를 사용하는 여러 시점에서 후속 연구에서 측정 할 수있는 종 연구의 큰 장점은 동물 수의 감소이다. OI의 해상도는 기관의 상세한 기능 이미징 및 실험 동물에서 더 작은 조직 구조를 할 수 있습니다. -70 ° C까지 많은 장치에서 냉각되어 좁은 투과 스펙트럼, A A 차광판에 의해 산란 빛으로부터 보호 &quot;어두운 박스&quot;및 대전 성 결합 소자 (CCD) 카메라와 특정한 여기 및 방사 필터를 사용 매우 특정한 수 있고 형광 신호 민감한 측정. excitation-과 함께 형광 제를 사용하여근적외선 형광 창 (650 - 950 nm)의 방출 스펙트럼에서 신호 대 잡음비가 크게 향상 될 수 있습니다. 근적외선 형광 창은 헤모글로빈과 물에 의한 신호 흡수가 상대적으로 낮을뿐만 아니라 배경 자동 자기장이 낮다는 특징이 있습니다. 9 이것은 작은 동물의 조직에서 2cm까지 침투 깊이를 허용합니다. OI- 프로브는 표적 조직을 직접 ( 예 : 형광 표지 된 항체에 의해) 처리하거나 표적 조직에서 활성화시킬 수 있습니다 ( 예 : 프로테아제). 활성화 가능한 OI 프로브는 Förster 공명 에너지 전달 (FRET)으로 인해 비활성화 된 형태로 광학적으로 침묵하며, 이는 분자 내의 여기 에너지를 다른 영역으로 이동시키는 퀀칭 부분 (quenching moiety)으로 향하게됩니다. 염료가 (예를 들어 프로테아제에 의해) 절단되면, 에너지는 더 이상 분자 내에서 전달되지 않으며, 형광 신호는 OI에 의해 검출 될 수있다. 이것은 높은 특이성을 갖는 OI 프로브의 설계를 허용합니다뚜렷한 생물학적 과정과 탁월한 신호 대 잡음비. 다음 프로토콜은 동물의 준비, 생체 내에서 MMP-2, -3, -9 및 -13 활성 및 염증의 두 실험 모델 (RA, CHR)을 이미지화하기 위해 Activatable OI 프로브를 사용하여 OI 측정을 자세히 설명합니다.

<table><tbody><tr><td>Cornergel</td><td>Gerhard Mann GmbH</td><td>1224635</td><td>ophthalmic ointment&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Forene</td><td>Abbott GmbH</td><td>4831850</td><td>isoflurane</td></tr><tr><td>U40 insulin syringe</td><td>Becton Dickinson and Company</td><td>324876</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sintetica</td><td>6093089</td><td></td></tr><tr><td>High-Med-PE 0.28 x 0.61 mm</td><td>Reichelt Chemietechnik GmbH+Co</td><td>28460</td><td>polyethylene tubing, inner diameter 0.28 mm, outer diameter 0.61&amp;nbsp;mm&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>BD Regular Bevel Needles, 30 G</td><td>Becton Dickinson &amp;amp; Co. Ltd.</td><td>305106</td><td>30 G injection cannula</td></tr><tr><td>RTA-0011 isoflurane vaporizer</td><td>Vetland Medical Sales and Services LLC</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Artagain drawing paper</td><td>Strathmore Artist Paper</td><td>446-8</td><td>coal black</td></tr><tr><td>IVIS Spectrum</td><td>Perkin Elmer</td><td>124262</td><td>Optical imaging system</td></tr><tr><td>BD Regular Bevel Needles, 25 G</td><td>Becton Dickinson and Company</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>2-Chloro-1,3,5-trinitrobenzene</td><td>Sigma Aldrich GmbH</td><td>7987456F</td><td>TNCB</td></tr><tr><td>MMPSense 680</td><td>Perkin Elmer&amp;nbsp;</td><td>NEV10126</td><td>fluorescent imaging dye</td></tr><tr><td>Oditest&amp;nbsp;</td><td>Koreplin GmbH</td><td>C1X018</td><td>mechanical measurment</td></tr><tr><td>Miglyol 812</td><td>SASOL</td><td>-</td><td>Oil</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;BALB/C, C57BL/6</td><td>Charles River Laboratories&amp;nbsp;</td><td>-</td><td>Mice used for experiements</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma Aldrich GmbH</td><td></td><td>For dilution of the RA serum&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Pipette (100 &amp;micro;L)</td><td>Eppendorf&amp;nbsp;</td><td></td><td>Used for TNCB application&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>shaver&amp;nbsp;</td><td>Wahl&amp;nbsp;</td><td>9962</td><td>Animal hair trimmer</td></tr><tr><td>Living Image&amp;nbsp;</td><td>Perkin Elmer&amp;nbsp;</td><td></td><td>Imaging software to measure OI</td></tr></tbody></table>

non-invasive in vivo fluorescence optical imaging of inflammatory mmp activity using an activatable fluorescent imaging agent

이 논문은 서로 다른 2 가지 마우스 염증 모델 인 류마티스 관절염 (RA)과 접촉 한 생체 내 형광 광학 이미징 (OI) 을 통해 활성화 가능한 형광 프로브에 의한 매트릭스 금속 단백질 분해 효소 (MMP) - 활성을 영상화하는 비 침습적 인 방법을 설명합니다 과민 반응 (CHR) 모델. 근적외선 (NIR) 창 (650 - 950 nm)의 파장을 갖는 빛은 650 nm 이하의 파장에 비해 깊은 조직 침투와 최소한의 신호 흡수를 허용합니다. 형광 OI를 사용하는 주요 이점은 다른 동물 모델에서 저렴하고 빠르고 쉽게 구현할 수 있다는 것입니다. 활성화 가능한 형광성 프로브는 비활성 상태에서는 광학적으로 침묵하지만 프로테아제에 의해 활성화되면 높은 형광성을 갖습니다. 활성화 된 MMP는 조직 파괴를 일으키고 RA 및 CHR과 같은 지연 형 과민 반응 (DTHR)에서 질병 진행에 중요한 역할을합니다. 또한 MMP는연골 및 뼈의 파괴와의 키 프로테아제 - 염증성 사이토 카인에 반응 대 식세포, 섬유 아세포 및 연골 세포에 의해 유발된다. 여기뿐만 아니라 질병의 유도 후 6 일 MMP-2, -3 같은 키 MMP의 활성화되어 프로브, -13 및 -13를 사용하여 근처 RA에서 MMP 활성의 적외선 형광 OI 및 대조군 마우스에 대한 촬상 프로토콜을 기술 급성 (1 배 도전)과 만성 건강한 귀에 비해 오른쪽 손잡이 (5 배 도전) CHR와 마우스에있다.

경구 용 BALB / c 마우스에서 류마티스 성 관절염 (RA)을 유도하기 위해, 동물에게 0 일째에 GPI에 대한자가 항체 (1x PBS로 1 : 1로 희석)를 주사 하였다.이 GPI- 혈청에서 최대 염증 (발목 부종) RA 모델은 주사 후 6 일째 날 11에 있다. 따라서, 2 nmol의 활성화 가능한 OI 염료가 준비되었고 5 일째에 관절염 마우스 및 건강한 대조 동물의 꼬리 정맥에 주사되었다. 주사...

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Non-invasive In Vivo Fluorescence Optical Imaging of Inflammatory MMP Activity Using an Activatable Fluorescent Imaging Agent

이 논문은 염증의 두 가지 실험 모델에서 키 매트릭스 메탈의 생체 내 활성을 시각화 기동 광학 이미징 프로브를 사용하여 형광 이미지의 적용을 설명한다.

비 침습적<em&gt; In Vivo</em&gt; 활성화 가능한 형광 이미징 에이전트를 사용한 염증성 MMP 활성의 형광 광학 이미징

This paper describes a non-invasive method for imaging matrix metalloproteinases (MMP)-activity by an activatable fluorescent probe, via in vivo ...

non-invasive-vivo-fluorescence-optical-imaging-inflammatory-mmp

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Non-invasive In Vivo Fluorescence Optical Imaging of Inflammatory MMP Activity Using an Activatable Fluorescent Imaging Agent

8.7K 조회수.  Eberhard Karls University of Tübingen.  이 논문은 염증의 두 가지 실험 모델에서 키 매트릭스 메탈의 생체 내 활성을 시각화 기동 광학 이미징 프로브를 사용하여 형광 이미지의 적용을 설명한다. 

비디오: Non-invasive In Vivo Fluorescence Optical Imaging of Inflammatory MMP Activity Using an Activatable Fluorescent Imaging Agent

Long-term Intravital Immunofluorescence Imaging of Tissue Matrix Components with Epifluorescence and Two-photon Microscopy

Besides being a physical scaffold to maintain tissue morphology, the extracellular matrix (ECM) is actively involved in regulating cell and tissue function during development and organ homeostasis. It does so by acting via biochemical, biomechanical, and biophysical signaling pathways, such as through the release of bioactive ECM protein fragments, regulating tissue tension, and providing pathways for cell migration. The extracellular matrix of the tumor microenvironment undergoes substantial remodeling, characterized by the degradation, deposition and organization of fibrillar and non-fibrillar matrix proteins. Stromal stiffening of the tumor microenvironment can promote tumor growth and invasion, and cause remodeling of blood and lymphatic vessels. Live imaging of matrix proteins, however, to this point is limited to fibrillar collagens that can be detected by second harmonic generation using multi-photon microscopy, leaving the majority of matrix components largely invisible. Here we describe procedures for tumor inoculation in the thin dorsal ear skin, immunolabeling of extracellular matrix proteins and intravital imaging of the exposed tissue in live mice using epifluorescence and two-photon microscopy. Our intravital imaging method allows for the direct detection of both fibrillar and non-fibrillar matrix proteins in the context of a growing dermal tumor. We show examples of vessel remodeling caused by local matrix contraction. We also found that fibrillar matrix of the tumor detected with the second harmonic generation is spatially distinct from newly deposited matrix components such as tenascin C. We also showed long-term (12 hours) imaging of T-cell interaction with tumor cells and tumor cells migration along the collagen IV of basement membrane. Taken together, this method uniquely allows for the simultaneous detection of tumor cells, their physical microenvironment and the endogenous tissue immune response over time, which may provide important insights into the mechanisms underlying tumor progression and ultimate success or resistance to therapy.

The extracellular matrix undergoes substantial remodeling during wound healing, inflammation and tumorigenesis. We present a novel intravital immunofluorescence microscopy approach to visualize the dynamics of fibrillar as well as mesh-like matrix components with high spatial and temporal resolution using epifluorescence or two-photon microscopy.

표면 형광을 가진 조직 매트릭스 구성 요소 및 두 개의 광자 현미경의 장기의 intravital 면역 형광 이미징

Besides being a physical scaffold to maintain tissue morphology, the extracellular matrix (ECM) is actively involved in regulating cell and tissue ...

연구

생체공학

In vivo Imaging Method to Distinguish Acute and Chronic Inflammation

Inflammation is a fundamental aspect of many human diseases. In this video report, we demonstrate non-invasive bioluminescence imaging techniques that distinguish acute and chronic inflammation in mouse models. With tissue damage or pathogen invasion, neutrophils are the first line of defense, playing a major role in mediating the acute inflammatory response. As the inflammatory reaction progresses, circulating monocytes gradually migrate into the site of injury and differentiate into mature macrophages, which mediate chronic inflammation and promote tissue repair by removing tissue debris and producing anti-inflammatory cytokines. Intraperitoneal injection of luminol (5-amino-2,3-dihydro-1,4-phthalazinedione, sodium salt) enables detection of acute inflammation largely mediated by tissue-infiltrating neutrophils. Luminol specifically reacts with the superoxide generated within the phagosomes of neutrophils since bioluminescence results from a myeloperoxidase (MPO) mediated reaction. Lucigenin (bis-N-methylacridinium nitrate) also reacts with superoxide in order to generate bioluminescence. However, lucigenin bioluminescence is independent of MPO and it solely relies on phagocyte NADPH oxidase (Phox) in macrophages during chronic inflammation. Together, luminol and lucigenin allow non-invasive visualization and longitudinal assessment of different phagocyte populations across both acute and chronic inflammatory phases. Given the important role of inflammation in a variety of human diseases, we believe this non-invasive imaging method can help investigate the differential roles of neutrophils and macrophages in a variety of pathological conditions.

In vivo Imaging Method to Distinguish Acute and Chronic Inflammation

We describe a non-invasive imaging method for distinguishing inflammatory stages. Systemic delivery of luminol reveals areas of acute inflammation dependent upon MPO activity in neutrophils. In contrast, injection of lucigenin allows for visualization of chronic inflammation dependent upon Phox activity in macrophages.

생체 내 이미징 방법에 급성 및 만성 염증을 구별하는

Inflammation is a fundamental aspect of many human diseases. In this video report, we demonstrate non-invasive bioluminescence imaging techniques that ...

면역학 및 감염병학

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous number of imaging techniques currently available and the progress in instrumentation, there is still a need for highly sensitive probes that are suitable for in vivo imaging. One typical problem of available preclinical fluorescent probes is their rapid clearance in vivo, which reduces their imaging sensitivity. To circumvent rapid clearance, increase number of dye molecules at the target site, and thereby reduce background autofluorescence, encapsulation of the near-infrared fluorescent dye, DY-676-COOH in liposomes and verification of its potential for in vivo imaging of inflammation was done. DY-676 is known for its ability to self-quench at high concentrations. We first determined the concentration suitable for self-quenching, and then encapsulated this quenching concentration into the aqueous interior of PEGylated liposomes. To substantiate the quenching and activation potential of the liposomes we use a harsh freezing method which leads to damage of liposomal membranes without affecting the encapsulated dye. The liposomes characterized by a high level of fluorescence quenching were termed Lip-Q. We show by experiments with different cell lines that uptake of Lip-Q is predominantly by phagocytosis which in turn enabled the characterization of its potential as a tool for in vivo imaging of inflammation in mice models. Furthermore, we use a zymosan-induced edema model in mice to substantiate the potential of Lip-Q in optical imaging of inflammation in vivo. Considering possible uptake due to inflammation-induced enhanced permeability and retention (EPR) effect, an always-on liposome formulation with low, non-quenched concentration of DY-676-COOH (termed Lip-dQ) and the free DY-676-COOH were compared with Lip-Q in animal trials.

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

The use of fluorophores for in vivo imaging can be greatly limited by opsonization, rapid clearance, low detection sensitivity and cytotoxic effects on the host. Encapsulation of fluorophores in liposomes by film hydration and extrusion leads to fluorescence quenching and protection which enables in vivo imaging with high detection sensitivity.

위한 도구로 리포좀 캡슐화 된 근적외선 형광의 형광 담금질<em&gt; 생체</em&gt; 광학 이미징

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous ...

In Vivo Optical Imaging of Brain Tumors and Arthritis Using Fluorescent SapC-DOPS Nanovesicles

We describe a multi-angle rotational optical imaging (MAROI) system for in vivo monitoring of physiopathological processes labeled with a fluorescent marker. Mouse models (brain tumor and arthritis) were used to evaluate the usefulness of this method. Saposin C (SapC)-dioleoylphosphatidylserine (DOPS) nanovesicles tagged with CellVue Maroon (CVM) fluorophore were administered intravenously. Animals were then placed in the rotational holder (MARS) of the in vivo imaging system. Images were acquired in 10&#176; steps over 380&#176;. A rectangular&#160;region of interest (ROI) was placed across the full image width at the model disease site. Within the ROI, and for every image, mean fluorescence intensity was computed after background subtraction. In the mouse models studied, the labeled nanovesicles were taken up in both the orthotopic and transgenic brain tumors, and in the arthritic sites (toes and ankles). Curve analysis of the multi angle image ROIs determined the angle with the highest signal. Thus, the optimal angle for imaging each disease site was characterized. The MAROI method applied to imaging of fluorescent compounds is a noninvasive, economical, and precise tool for in vivo quantitative analysis of the disease states in the described mouse models.

In Vivo Optical Imaging of Brain Tumors and Arthritis Using Fluorescent SapC-DOPS Nanovesicles

We describe a multi-angle rotational optical imaging (MAROI) system for in vivo quantitation of a fluorescent marker delivered by saposin C (SapC)-dioleoylphosphatidylserine (DOPS) nanovesicles. Employing mouse models of cancer and arthritis, we demonstrate how the MAROI signal curve analysis can be used for the precise mapping and biological characterization of disease processes.

형광 SAPC-DOPS Nanovesicles을 사용하여 뇌 종양 및 관절염의 생체 광학 이미징

We describe a multi-angle rotational optical imaging (MAROI) system for in vivo monitoring of physiopathological processes labeled with a fluorescent ...

의학

In Vivo Two-Color 2-Photon Imaging of Genetically-Tagged Reporter Cells in the Skin

Fibroblasts are mesenchymal cells that change their morphology upon activation, ultimately influencing the microenvironment of the tissue they are located in. Although traditional imaging techniques are useful in identifying protein interactions and morphology in fixed tissue, they are not able to give insight as to how quickly cells are able to bind and uptake proteins, and once activated how their morphology changes in vivo. In the present study, we ask 2 major questions: 1) what is the time-course of fibroblast activation via toll-like receptor-4 (TLR4) and lipopolysaccharide (LPS) interaction and 2) how do these cells behave once activated? Using 2-photon imaging, we have developed a novel technique to assess the ability of LPS-FITC to bind to its cognate receptor, TLR4, expressed on peripheral fibroblasts in the genetic reporter mouse line; FSP1cre; tdTomatolox-stop-lox&#160;in vivo. This unique approach allows researchers to create in-depth, time-lapse videos and/or pictures of proteins interacting with live cells that allows one to have an increased level of granularity in understanding how proteins can alter cellular behavior.

Morphological changes occur in immune responsive fibroblast cells following activation and promote alterations in cellular recruitment. Utilizing 2-photon imaging in conjunction with a genetically engineered Fibroblast-specific protein 1 (FSP1)-cre; tdTomato floxed-stop-floxed (TB/TB) mouse line and green fluorescently tagged lipopolysaccharide-FITC, we can illustrate highly specific uptake of lipopolysaccharide in dermal fibroblasts and morphological changes in vivo.

피부에 있는 유전으로 표를 붙인 기자 세포의 Vivo 2 색 2-광자 화상 진찰에서

Fibroblasts are mesenchymal cells that change their morphology upon activation, ultimately influencing the microenvironment of the tissue they are located ...

Bioluminescence and Near-infrared Imaging of Optic Neuritis and Brain Inflammation in the EAE Model of Multiple Sclerosis in Mice

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in SJL/J mice is a model for relapsing-remitting multiple sclerosis (RRMS). Clinical EAE scores describing motor function deficits are basic readouts of the immune-mediated inflammation of the spinal cord. However, scores and body weight do not allow for an in vivo assessment of brain inflammation and optic neuritis. The latter is an early and frequent manifestation in about 2/3 of MS patients. Here, we show methods for bioluminescence and near-infrared live imaging to assess EAE evoked optic neuritis, brain inflammation, and blood-brain barrier (BBB) disruption in living mice using an in vivo imaging system. A bioluminescent substrate activated by oxidases primarily showed optic neuritis. The signal was specific and allowed the visualization of medication effects and disease time courses, which paralleled the clinical scores. Pegylated fluorescent nanoparticles that remained within the vasculature for extended periods of time were used to assess the BBB integrity. Near-infrared imaging revealed a BBB leak at the peak of the disease. The signal was the strongest around the eyes. A near-infrared substrate for matrix metalloproteinases was used to assess EAE-evoked inflammation. Auto-fluorescence interfered with the signal, requiring spectral unmixing for quantification. Overall, bioluminescence imaging was a reliable method to assess EAE-associated optic neuritis and medication effects and was superior to the near-infrared techniques in terms of signal specificity, robustness, ease of quantification, and cost.

We show a technique for in vivo live bioluminescence and near-infrared imaging of optic neuritis and encephalitis in the experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) model for multiple sclerosis in SJL/J mice.

마우스의 다발성 경화증의 EAE 모델에서 시신경염 및 뇌 염증의 생물 발광 및 근적외선 영상

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in SJL/J mice is a model for relapsing-remitting multiple sclerosis (RRMS). Clinical EAE scores describing ...

Fluorescence-mediated Tomography for the Detection and Quantification of Macrophage-related Murine Intestinal Inflammation

Murine models of disease are indispensable to scientific research. However, many diagnostic tools such as endoscopy or tomographic imaging are not routinely employed in animal models. Conventional experimental readouts often rely on post mortem and ex vivo analyses, which prevent intra-individual follow-up examinations and increase the number of study animals needed. Fluorescence-mediated tomography enables the non-invasive, repetitive, quantitative, three-dimensional assessment of fluorescent probes. It is highly sensitive and permits the use of molecular makers, which allows for the specific detection and characterization of distinct molecular targets. In particular, targeted probes represent an innovative tool for analyzing gene activation and protein expression in inflammation, autoimmune disease, infection, vascular disease, cell migration, tumorigenesis, etc. In this article, we provide step-by-step instructions on this sophisticated imaging technology for the in vivo detection and characterization of inflammation (i.e., F4/80-positive macrophage infiltration) in a widely used murine model of intestinal inflammation. This technique might also be used in other research areas, such as immune cell or stem cell tracking.

Target-specific probes represent an innovative tool for analyzing molecular mechanisms, such as protein expression in various types of disease (e.g., inflammation, infection, and tumorigenesis). In this study, we describe a quantitative three-dimensional tomographic assessment of intestinal macrophage infiltration in a murine model of colitis using F4/80-specific fluorescence-mediated tomography.

검색 및 대 식 세포 관련 Murine 창 자 염증의 정량화에 대 한 단층 형광 중재

Murine models of disease are indispensable to scientific research. However, many diagnostic tools such as endoscopy or tomographic imaging are not ...

Visualization of Inflammatory Caspases Induced Proximity in Human Monocyte-Derived Macrophages

Inflammatory caspases include caspase-1, -4, -5, -11, and -12 and belong to the subgroup of initiator caspases. Caspase-1 is required to ensure correct regulation of inflammatory signaling and is activated by proximity-induced dimerization following recruitment to inflammasomes. Caspase-1 is abundant in the monocytic cell lineage and induces maturation of the pro-inflammatory cytokines interleukin (IL)-1&#946; and IL-18 to active secreted molecules. The other inflammatory caspases, caspase-4 and -5 (and their murine homolog caspase-11) promote IL-1&#946; release by inducing pyroptosis. Caspase Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is a tool used to measure inflammatory caspase induced proximity as a readout of caspase activation. The caspase-1, -4, or -5 prodomain, which contains the region that binds to the inflammasome, is fused to non-fluorescent fragments of the yellow fluorescent protein Venus (Venus-N [VN] or Venus-C [VC]) that associate to reform the fluorescent Venus complex when the caspases undergo induced proximity. This protocol describes how to introduce these reporters into primary human monocyte-derived macrophages (MDM) using nucleofection, treat the cells to induce inflammatory caspase activation, and measure caspase activation using fluorescence and confocal microscopy. The advantage of this approach is that it can be used to identify the components, requirements, and localization of the inflammatory caspase activation complex in living cells. However, careful controls need to be considered to avoid compromising cell viability and behavior. This technique is a powerful tool for the analysis of dynamic caspase interactions at the inflammasome level as well as for the interrogation of the inflammatory signaling cascades in living MDM and monocytes derived from human blood samples.

This protocol describes the workflow to obtain monocytes-derived macrophages (MDM) from human blood samples, a simple method to efficiently introduce inflammatory caspase Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) reporters into human MDM without compromising cell viability and behavior, and an imaging-based approach to measure inflammatory caspase activation in living cells.

인간 단핵구 유래 대식세포에서 근접성을 유도한 염증성 카스파제의 시각화

Inflammatory caspases include caspase-1, -4, -5, -11, and -12 and belong to the subgroup of initiator caspases. Caspase-1 is required to ensure correct ...

비침습적 전방십자인대 손상 및 수술이 생쥐의 프로테아제 활성에 미치는 영향

Non-Invasive Compression-Induced Anterior Cruciate Ligament (ACL) Injury and In Vivo Imaging of Protease Activity in Mice

Traumatic joint injuries such as anterior cruciate ligament (ACL) rupture or meniscus tears commonly lead to post-traumatic osteoarthritis (PTOA) within 10-20 years following injury. Understanding the early biological processes initiated by joint injuries (e.g., inflammation, matrix metalloproteinases (MMPs), cathepsin proteases, bone resorption) is crucial for understanding the etiology of PTOA. However, there are few options for in vivo measurement of these biological processes, and the early biological responses may be confounded if invasive surgical techniques or injections are used to initiate OA. In our studies of PTOA, we have used commercially available near-infrared protease activatable probes combined with fluorescence reflectance imaging (FRI) to quantify protease activity in vivo following non-invasive compression-induced ACL injury in mice. This non-invasive ACL injury method closely recapitulates clinically relevant injury conditions and is completely aseptic since it does not involve disrupting the skin or the joint capsule. The combination of these injury and imaging methods allows us to study the time course of protease activity at multiple time points following a traumatic joint injury.

저자 스포트라이트: 골관절염 진행에 대한 전방십자인대 손상의 초기 사건 및 장기 효과 조사

Non-invasive ACL injury is a reliable and clinically relevant method for initiating post-traumatic osteoarthritis (PTOA) in mice. This injury method also allows for in vivo quantification of protease activity in the joint at early time points post-injury using protease-activatable near infrared probes and fluorescence reflectance imaging.

비침습적 압박 유도 전방 십자인대(ACL) 손상 및 생쥐의 프로테아제 활성에 대한 생체 내 이미징

Traumatic joint injuries such as anterior cruciate ligament (ACL) rupture or meniscus tears commonly lead to post-traumatic osteoarthritis (PTOA) within ...

비 침습적

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표면 형광을 가진 조직 매트릭스 구성 요소 및 두 개의 광자 현미경의 장기의 intravital 면역 형광 이미징

생체 내 이미징 방법에 급성 및 만성 염증을 구별하는

위한 도구로 리포좀 캡슐화 된 근적외선 형광의 형광 담금질

형광 SAPC-DOPS Nanovesicles을 사용하여 뇌 종양 및 관절염의 생체 광학 이미징

피부에 있는 유전으로 표를 붙인 기자 세포의 Vivo 2 색 2-광자 화상 진찰에서

마우스의 다발성 경화증의 EAE 모델에서 시신경염 및 뇌 염증의 생물 발광 및 근적외선 영상

검색 및 대 식 세포 관련 Murine 창 자 염증의 정량화에 대 한 단층 형광 중재

인간 단핵구 유래 대식세포에서 근접성을 유도한 염증성 카스파제의 시각화

비침습적 압박 유도 전방 십자인대(ACL) 손상 및 생쥐의 프로테아제 활성에 대한 생체 내 이미징

비침습적 압박 유도 전방 십자인대(ACL) 손상 및 생쥐의 프로테아제 활성에 대한 생체 내 이미징