저자는 올가 샤르마, 테레사 헌트 및 기술 지원에 대한 DZNE 현미경과 동물 시설의 직원을 감사드립니다.

동물을 포함한 모든 절차는 노르 트라 인베스트 팔렌 주 환경청 (LANUV)의 동물 보호위원회의 승인을 수행 하였다. 동물을 수용하고, 12 시간 광 / 암주기 및 음식과 물에 자유롭게 접근하는 표준 조건에 따라 든다고 하였다. 1. 동물 모델 <ol><li> Tg가 서로 엇 hemizygous (GFAP의 -luc +/-) hemizygous bigenic의 Tg (M83 +/- : GFAP의 -luc +/-) 생성 hemizygous의 Tg (M83 +/-) 마우스와 마우스 마우스 (15), (16). </li><li> 개똥 벌레 루시퍼 라제 (12), (17)을위한 트랜스 코딩 인간의 α- 시누 클레인의 표준 PCR과 존재를 실시간 PCR과 자손의 유전자형. </li><li> 여섯 - 투 - 8 주 시대에 동물을 접종한다. </li></ol> 2. 접종 제조 <ol><li> 미주리 준비로되어있는 한 20 mM 트리스 - 염산 (pH를 7.2) 150 mM의 NaCl을 함유하는 TBS 버퍼 (TBS) 완충액에 A53T 돌연변이와 nomeric 재조합 인간의 α- 시누 클레인은 앞서 설명한 14. </li><li> 800 rpm에서 5 일간 37 ℃에서 오비탈 진탕 단량체 재조합 인간의 α- 시누 클레인의 3 ㎍ / μL 교반하여 접종을 위해 섬유상의 α- 시누 클레인을 준비한다. </li><li> intraglossal 접종에 대한 복강 내 또는 2 ㎍ / μL 1 개 ㎍ / μL의 최종 농도에 도달하기 위해 인산 완충 용액 (PBS)에 브릴 어셈블리 희석. </li><li> 얼음 (각 펄스와 50 %로 설정된 진폭의 1 초 휴지 기간의 0.5 40 펄스)을 1 분 동안 초음파 처리와로드 알파 시누 클레인 브릴을 조각. 교차 접종에 의한 오염을 방지합니다. 다른 접종을 준비하는 깨끗한 초음파 프로브를 사용합니다. </li></ol> 3. Intraglossal 주사 <ol><li> intrape과 동물을 마취100 ㎎ / ㎏의 케타민과 10 밀리그램 / kg의 자일 라진 ritoneal 주입. 동물의 발가락을 꼬집어하고 적절한 마취을 보장하기 위해 자사의 사지를 철회하지 않는 것을 확인합니다. 마취 동안 건조를 방지하기 위해 동물의 눈에 수의사 연고를 사용합니다. </li><li> 신중 연구자 향 머리와 등쪽 누운 자세에서 가열 플레이트 상에 접착 테이프 narcotized 동물을 고정한다. </li><li> 초음파의 α- 시누 클레인 브릴 또는 PBS 5 μL와 27 G 일회용 피하 주사기를 채우기. </li><li> 동물의 입이 열려 개최 톱니 모양의 팁을 하나의 뭉툭한 코 엄지 손가락 집게를 사용하여 집게의 작은 제 2 쌍은주의 깊게 주입을위한 혀의 바닥면에 액세스 할 수 있도록하기 위해 혀를 당겨. </li><li> 설하 신경 부근의 혀의 오른쪽 또는 왼쪽 하단 측에 주사기 바늘을 주입한다. 천천히 5 초 후 접종을 주입. 천천히 접종 있도록 5 초 후 바늘을 철회조직을 침투하고 바늘을 철회하면서 손실되지 않습니다. </li><li> 그 고정물에서 동물을 해제하고 완전한 복구 될 때까지 지속적인 모니터링에서 가열 플레이트에 둡니다. </li></ol> 4. 복강 내 주사 <ol><li> 복강 내 주사를 위해, 2 L / min의 유량으로 2 %로 설정 증발기를 사용하여 이소 플루 란 / 산소 흡입 마취 챔버 내에 곧 동물을 마취시키다. 동물의 발가락을 꼬집어하고 적절한 마취을 보장하기 위해 자사의 사지를 철회하지 않는 것을 확인합니다. </li><li> 초음파의 α- 시누 클레인 브릴 또는 PBS 50 μL와 27 G 일회용 피하 주사기를 채우기. </li><li> 직접 마우스의 복강에 주사하고, 조사원으로부터 떨어져 대면하는 헤드와 등쪽 위치 동물 잡고 하향으로 대략 45 °로 복부 벽 뒤에있는 소장 또는 맹장 관통 피한다. 그들이 회복 될 때까지 동물을 모니터링마취에서. </li></ol> 5. 생물 발광 영상 <ol><li> 이미지의 Tg (M83 +/- : GFAP의 -luc +/-) 마우스 생물 발광 이미징 시스템을 사용하는 모든 2-4주. </li><li> 곧 묘화 2 L / min의 유량으로 2 %로 기화기로 이소 플루 란 / 산소 챔버에서 쥐를 마취 전에. 동물의 발가락을 꼬집어하고 적절한 마취을 보장하기 위해 자사의 사지를 철회하지 않는 것을 확인합니다. </li><li> 면도와 제모 크림 쥐의 머리를 털을 뽑다. 불특정 생물 발광을 차단하는 비 자극 마커와 블랙의 귀를 색상. </li><li> 30 ㎎ / ㎖의 스톡 용액에 D-PBS 칼륨 염 루시페린, 루시 페라 제의 기판을 희석. -20 ° C에서 1 mL를 씩이 보관하십시오. 노광에서 용해 D-루시페린 보호. </li><li> 주입하기 전에 동물의 무게를. 150 mg / kg (체중)의 주입을위한 D-루시페린의 정확한 양을 계산한다. 복강 주사 D-luciferin 및 마취 챔버에 동물을 반환한다. </li><li> 이미징 소프트웨어를 시작합니다. 이미징 시스템이 도달하면 작동 온도 제어판에서 &#39;초기화&#39;버튼을 클릭하여 시스템을 초기화합니다. </li><li> 버튼 &#39;발광&#39;과 &#39;사진&#39;을 선택합니다. 60 초, &#39;보통&#39;의 F / 정지 &#39;1&#39;로 비닝 (binning)과 &#39;끄기&#39;로 EM 이득에 노출 시간을 설정합니다. </li><li> 여기 필터 &#39;열기&#39;을 &#39;차단&#39;하고, 발광 필터로 설정되어 있는지 확인하고, 1.50 cm 피사체 높이를 설정. </li><li> 텐 분 D-루시페린과 주사 후, 촬상 챔버 내의 가열 플레이트 상에 동물을 배치하고 그 총구 올바르게 마취 출구에 배치되도록. 흡입 챔버로부터 이소 플루 란 / 산소 유량을 닫고 0.25 L / min의 유량으로 2 %의 증착과 촬상 챔버에 대한 흐름을 연다. 이미징 챔버 홍보의 문을 닫습니다operly. </li><li> 60 초 걸리는 생물 발광을 측정하기 위해 &#39;획득&#39;버튼을 클릭합니다. 이소 플루 란의 흐름을 중지하고 완전히 자신의 새장에 다시 반환 후 회복 될 때까지 동물을 모니터링 할 수 있습니다. </li><li> 생물 발광을 정량화하기 위해 이미징 소프트웨어를 사용합니다. &#39;도구 팔레트&#39;내에서의 투자 수익 (ROI) 도구 &#39;를 선택합니다. 의 투자 수익 (ROI) 도구 &#39;에서&#39;유형 &#39;에서&#39;측정 투자 수익 (ROI) &#39;를 선택합니다. </li><li> 의 투자 수익 (ROI) 도구 &#39;내에서 &quot;원&quot;도구를 클릭하고 풀다운 메뉴에서 그릴 로아의 수를 선택 - 이상적으로&#39;3 &#39;세 마우스에 대해. </li><li> 이미지에서 각 ROI와 아래는 &#39;속성&#39;1.25 cm에 폭과 높이를 조정 마우스 오른쪽 단추로 클릭합니다. 정량화 뇌 영역에 걸쳐 각각의 투자 수익 (ROI)을 배치합니다. </li><li> 화상의 상부 좌측에, &quot;빛 (광자) &#39;단위로 패널을 설정. </li><li> &#39;도구 팔레트&#39;내 선택 &#39;이미지 보정&#39;최소를 조정하고0.20e6에서 1.00e6에 인스턴스의 &#39;색 눈금&#39;의 최대. </li><li> &#39;파일&#39;에서 &#39;저장&#39;을 사용하여 데이터를 저장합니다. </li></ol> 6. 생화학 분석 <ol><li> 설립 프로토콜 (18), (19)에 따라 뇌와 척수를 분리합니다. </li><li> 조직 균질 기에서 6,000 rpm으로 30 초 두 사이클로 (PBS에 1 배 희석), 프로테아제 및 포스파타제 억제제의 존재하에 별도로 PBS에서 전체 뇌와 척수 전체 샘플 균질화. 뇌와 척수 시료를 20 % (중량 / 부피)의 최종 농도로 균질화되었는지 확인. </li><li> 10 s의 일정한 펄스와 50 %로 설정된 진폭 얼음들을 유지하면서 두 샘플을 초음파 처리. </li><li> PBS 중 1.5 M NaCl로 1 : 1 그들 희석 PBS 750 mM의 NaCl을 10 %의 균질을 조정한다. </li><li> 세포 파편을 분리하기 위해 5 분으로 1,000 XG에서 균질 원심 분리4 ° C. 다음 단계의 상층 액을 유지하고 알약을 폐기합니다. </li><li> 제조업체의 지시에 따라 bicinchoninic 산 (BCA) 분석을 사용하여 균질의 단백질 농도를 측정한다. 얼음 위에서 15 분 동안 10 % (중량 / 부피)의 최종 농도에서 N-laurylsarcosyl 척수 균질의 뇌 균질 물에서 총 단백질 1.0 mg을 0.8 mg의 인큐베이션. </li><li> 증류수 10 % (중량 / 부피)의 3 mL의 슈 크로즈 쿠션 상에 균질 오버레이, 4 ° C에서 1 시간 동안 465,000 XG 그들을 초 원심 분리기. </li><li> 4 % 도데 실 황산나트륨 (SDS), 2 % β 메르 캅토 에탄올, 192 mM의 글리신, 25 개 mM 트리스, 5 % (중량 / 부피) 수 크로스를 함유하는 완충액에 재현 탁 펠릿. </li><li> 5 분 동안 100 ℃에서 샘플을 비등하고 morpholineethanesulfonic 술폰산 (MES) 버퍼 시스템에 대한 전기 SDS 폴리 아크릴 아미드 겔 상에 로딩들을. </li><li> 주사 전자 현미경 (SEM)으로 분리 된 폴리 비닐 리덴 디 플루오로 단백질 (PVDF) 멤브레인 전송시스템을 모래 바닥 idry. </li><li> 가교 35 RPM으로 로터에 실온에서 30 분 동안 PBS에서 (부피 / 부피) 포르말린 용액 멤브레인 단백질 0.4 %의 막을 인큐베이션. </li><li> 0.05 % (부피 / 부피의)을 포함하는 TBS 버퍼 트윈 20, 실온에서 1 시간 동안 5 % (중량 / 부피) 우유에서 막을 차단. </li><li> 4 ℃에서 밤새 블로킹 완충액에 일차 항체로 블롯을 인큐베이션. </li><li> TBS 버퍼 막 세 번 세척하고, 실온에서 1 시간 동안 TBS에서 페 록시 또는 형광 접합 된 이차 항체로 부화. </li><li> 확립 된 프로토콜 20에 따라 화학 발광 또는 형광으로 결합 이차 항체를 시각화. </li></ol> 7. 면역 형광 분석 <ol><li> 휴지 프로세싱 스테이션에서 해부 뇌 및 척수 탈수 및 파라핀 스테이션을 사용하여 파라핀에 그들을 삽입. </li><li> 파라핀 포매 TIS 컷8 개 μm의 두께 코로나 섹션 마이크로톰으로 고소와 유리 슬라이드에 섹션을 탑재합니다. </li><li> 10 분에서 5 개의 분리 크 실롤 조에이를 배양하여 조직 절편을 Deparaffinize 및 등급 에탄올 욕 (100 %, 90 %, 70 %, 50 %)의 시리즈를 통해 최종적으로 H 2 O로 재수 </li><li> 실온에서 5 분간 0.01 M 시트 레이트 완충액 (pH 6.0)의 섹션을 인큐베이션 추가적으로 마이크로파 오븐에서 10 분 동안 삶아. </li><li> 섹션을 실온까지 냉각하고, 내인성 퍼 옥시 다제를 억제하는 30 분 동안 3 % 과산화수소로 부화하자. </li><li> 20 % (부피 / 권) 정상 염소 혈청, 1 % (부피 / 부피) 소 혈청 알부민 (BSA), 0.5 % 트리톤 X-100을 실온에서 1 시간 동안 PBS에 함께 배양하여 조직 절편을 차단. </li><li> 1 % (부피 / 부피) 정상 염소 혈청, 1 % (부피 / 부피) BSA, 0.25 % 트리톤 X-PBS에서 밤새 100에서 4 ℃로 희석 차 항체와 함께 인큐베이션 섹션. </li> &lt;리&gt; 0.25 % (부피 / 부피의) 트리톤 X-100의 PBS 일단 PBS로 두 번 씻어 섹션. </li><li> 해당 형광 접합 된 이차 항체를 실온에서 1 시간 동안 1 % 희석 핵 염색 DAPI (용적 / 권) 정상 염소 혈청, 1 % (부피 / 부피) BSA 및 PBS와 섹션 얼룩. </li><li> 0.25 % (부피 / 부피의) 트리톤 X-100의 PBS 일단 PBS로 두 번 세척 한 후, 내장 미디어 슬라이드를 커버 슬립 및 공 초점 레이저 주사 현미경에 의한 염색을 시각화. </li></ol>

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</ol>

저자가 공개하는 게 없다.

Tg는 (M83 +/- : GFAP의 -luc +/-)의 복막 내로의 α- 시누 클레인 브릴의 말초 주입 마우스 synucleinopathies의 중요한 특성 요점을 되풀이하는 신경 염증을 동반 신경 질환을 유발하는 용이 한 방법을 나타낸다. 마찬가지로, 혀 주입 트랜스 제닉 마우스에서의 α- 시누 클레인의 prionoids 의해 neuroinvasion 대한 다른 경로를 나타내고 있지만, 덜 효율적이다. 우리는 주사 후 420일에서 실험을...

알파 - 시누 클레인은 특히 자기 씨앗 용량에, 프리온 단백질의 것과 유사 세포 사이의 연결 경로를 따라 미스 폴딩을 전파 특성을 가지고 성장 증거가있다. 알파 - 시누 클레인의이 속성은 &#39;프리온 같은&#39;또는 &#39;prionoid&#39;라고, 새로 건강한 뉴런 1, 2를 이식하는 병에 걸린 뉴런에서 잘못 접힌 알파 - 시누 클레인의 전달률을 제안 이식 실험에서 관찰에 의해 지원됩니다 3, 4. 또한 뇌 또는 주변부, 예 뒷다리 근육이나 장벽의 말단 부분의 α- 시누 클레인 병리의 확산의 결과로 잘못 폴딩의 α- 시누 클레인의 직접 분사 CNS의 5, 6, 7, &lt;SUP 클래스 = &quot;외부 참조&quot;&gt; 8, 9, 10. 우리는 더 상세히 주변 경로를 통해 알파 시누 클레인의 prionoids의 송신을 분석 미스 폴딩의 α- 시누 클레인은 단일 intraglossal 또는 복강 내 주사 한 후 이전 프리온 위해 아니라 잘못 폴딩 알파 위해 도시되었던 기능을 CNS를 neuroinvade 수 있는지 질문을 해결 시누 클레인. 혀에 프리온 주입 후 CNS의 neuroinvasion는 뇌간 (11)에있는 설하 신경의 핵 리드 혀 설하 신경을 따라 전달을 통해 달성된다. 하여 성상 세포의 활성화를 모니터 프리온 프로모터, 인간의 α- 시누 클레인의 A53T 변이체를 과발현하고 반딧불이 GFAP 프로모터의 제어 하에서 루시페라아제 마우스 : 마우스 모델로 우리의 Tg (GFAP의 -luc +/- M83를 +/-) 선택한 생물 발광, 이전의 뇌에서와 같이쥐 12 프리온은 감염. 우리의 손에 bigenic의 Tg (M83 +/- : GFAP의 -luc +/-) 다른 사람 (13)에 의해 도시 된 바와 같이 마우스는 시대의 23개월까지 질병을 개발하지 않았다. 뇌에서 병리학, Tg 및 척수와 intraglossal 또는 복강 내 경로 유도 된 신경 질환을 통해 인간의 α- 시누 클레인 브릴의 단일 주입 : 가설을지지 생쥐 (+/- +/- M83 GFAP의 -luc) 알파 - 시누 클레인의 prionoids 프리온 (14)와 중요한 특성을 공유합니다.

<table><tbody><tr><td>anti-actin antibody</td><td>Merck Millipore</td><td>MAB1501</td><td></td></tr><tr><td>anti-alpha-synuclein, phospho S129 antibody [pSyn#64]</td><td>Wako</td><td>015-25191</td><td></td></tr><tr><td>anti-alpha-synuclein, phospho S129 antibody [EP1536Y]</td><td>Abcam</td><td>ab51253</td><td></td></tr><tr><td>anti-GFAP antibody</td><td>Dako</td><td>Z0334 01</td><td></td></tr><tr><td>anti-IBA-1 antibody</td><td>Wako</td><td>019-19741</td><td></td></tr><tr><td>anti-Sequestosome-1 (p62) antibody</td><td>Proteintech</td><td>18420-1-AP</td><td></td></tr><tr><td>anti-ubiquitin antibody [Ubi-1]</td><td>Merck Millipore</td><td>MAB1510</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td><td>Invitrogen</td><td>14190169</td><td></td></tr><tr><td>Ketamine&amp;nbsp;</td><td>Ratiopharm</td><td></td><td>100 mg/kg</td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Ratiopharm</td><td></td><td>10 mg/kg</td></tr><tr><td>27 G syringe</td><td>VWR</td><td>613-4900</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane&amp;nbsp;</td><td>Piramal Healthcare</td><td>PZN&amp;nbsp; 4831850</td><td></td></tr><tr><td>Depilatory cream</td><td>Veet</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Secureline lab marker&amp;nbsp;</td><td>Neolab</td><td>25040</td><td></td></tr><tr><td>D-luciferin potassium salt</td><td>Acris</td><td>LK10000</td><td>30 mg/mL stock solution</td></tr><tr><td>Thermomixer</td><td>Eppendorf</td><td>5776671</td><td></td></tr><tr><td>Sonopuls Mini20 sonicator</td><td>Bandelin</td><td>3648</td><td></td></tr><tr><td>IVIS Lumina II imaging system</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Living Image 3.0 Software</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tg(M83&lt;sup&gt;+/-&lt;/sup&gt;) mice or B6;C3-Tg(Prnp-SNCA*A53T)83Vle/J mice</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>004479</td><td></td></tr><tr><td>Standard pattern forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11000-16</td><td></td></tr><tr><td>Narrow pattern forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11002-12</td><td></td></tr><tr><td>N-laurylasarcosyl</td><td>Sigma</td><td>L5125-100G</td><td></td></tr><tr><td>Optima Max-XP ultracentrifuge&amp;nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>TLA-110 rotor&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Thickwall polycarbonate tubes</td><td>Beckman Coulter</td><td>362305</td><td></td></tr><tr><td>NuPAG Novex 4-12% Bis-Tris Midi Protein Gels</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>WG1401BOX</td><td></td></tr><tr><td>HRP conjugated antibody</td><td>Cayman</td><td>Cay10004301-1</td><td></td></tr><tr><td>IR Dye 680 conjugated antibody&amp;nbsp;</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>926-68070</td><td></td></tr><tr><td>SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>34075</td><td></td></tr><tr><td>Stella 3200 imaging system</td><td>Raytest</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Odyssey infrared imaging system&amp;nbsp;</td><td>LI-COR Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tween 20&amp;nbsp;</td><td>MP Biomedicals</td><td>TWEEN201</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>SA/T8787</td><td></td></tr><tr><td>Immobilon-FL PVDF membrane</td><td>Merck Millipore</td><td>IPFL00010</td><td></td></tr><tr><td>Xylol</td><td>Sigma</td><td>Roth</td><td></td></tr><tr><td>Hydrogen peroxide</td><td>Sigma</td><td>SA/00216763/000500</td><td>working solution 3%</td></tr><tr><td>Bovine serum albumine (BSA)&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A3294-100G</td><td></td></tr><tr><td>Goat serum</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PCN5000</td><td></td></tr><tr><td>4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D1306</td><td>working dilution 1:50,000</td></tr><tr><td>Fluoromount media&amp;nbsp;</td><td>Omnilab</td><td>SA/F4680/000025</td><td></td></tr><tr><td>LSM700 confocal laser scanning microscope</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HALT protease and phosphatase inhibitors</td><td>Thermo Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>10516495</td><td></td></tr><tr><td>Precellys 24-Dual homogenizer&amp;nbsp;</td><td>Peqlab</td><td>91-PCS24D</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 conjugated antibody</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A31619</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 conjugated antibody</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11005</td><td></td></tr><tr><td>Pierce&amp;nbsp;BCA&amp;nbsp;Protein&amp;nbsp;Assay&amp;nbsp;Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10741395</td><td></td></tr><tr><td>Microtome RM2255</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSM700 confocal laser scanning microscope</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

bioluminescence imaging of neuroinflammation in transgenic mice after peripheral inoculation of alpha-synuclein fibrils

잘못 접힌 알파 - 시누 클레인의 프리온 같은 동작을 연구하기 위해 마우스 모델은 중추 신경계 (CNS)에서 신경 병리학을 일으킬 알파 - 시누 클레인의 prionoids의 빠르고 간단하게 전송을 허용하는 것이 필요하다. 마우스, 프리온 단백질 프로모터로부터 A53T 돌연변이와 인간의 α- 시누 클레인 과발현과 반딧불에서 루시퍼 : 여기에서는 bigenic의 Tg (GFAP의 -luc +/- M83 +/-)으로의 α- 시누 클레인 브릴의 intraglossal 또는 복강 내 주사를 설명 글 리아 섬유 성 산성 단백질 프로모터 (GFAP), 신경 병리학 적 질환을 유발하기에 충분하다. 동물 그들이 도달 할 때까지 자연 질환 무료 남아 8 개월 이형의 Tg (GFAP의 -luc +/- M83 +/-)의 나이에 시작 심한 신경 학적 증상이 동형 접합의 Tg (M83 + / +) 마우스와 비교 22개월의 나이. 흥미롭게 intraperitone 통해 알파 시누 클레인 브릴 주입229 ± 십칠일의 중간 배양 시간과 마우스 : 알 경로가 다섯의 Tg (GFAP의 -luc +/- M83 +/-) 네 마비와 신경 학적 질병을 유발. 병에 걸린 동물은 뇌와 척수에서 인산화 된 알파 - 시누 클레인의 심각한 예금을 보였다. 알파 시누 클레인의 축적은 sarkosyl 불용성이었고 유비퀴틴과 P62와 colocalized 및 성상 신경교 증 및 microgliosis 결과 염증 반응을 수반 하였다. 놀랍게도, 혀에 알파 - 시누 클레인 원 섬유의 접종 285 일 후에 알파 - 시누 클레인 병리를 보여주는 다섯 주입 동물의 한으로 질병을 일으키는 덜 효과적이었다. 우리의 연구 결과는 (+/- M83을 : GFAP의 -luc를 +/-) 복강 내 경로를 통해 intraglossal 노선과 더욱 그렇다 통해 접종의 Tg에 synucleinopathies의 관련 특징과 신경 학적 질병을 유도하기 적합하다는 것을 보여 쥐를. 이 유도 프리온 같은 기전 연구를위한 새로운 모델을 제공합니다보다 상세히의 α- 시누 클레인의 prionoids d 개의.

마우스 (표 1 및도 1)은 혀 또는 bigenic의 Tg의 CNS (GFAP의 -luc +/- +/- M83)의 복막 유도 병리학 통해 알파 시누 클레인의 prionoids 주변의 주입. 알파 - 시누 클레인 섬유소와 하나의 복강 내 주사 한 후, 다섯 마우스의 네 229 ± 십칠일의 중간 배양 시간과 신경 학적 질환을 개발했다. 놀랍게도, 단지 1 ~ 5의 마우스 285 일 후 알파 - 시누...

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Bioluminescence Imaging of Neuroinflammation in Transgenic Mice After Peripheral Inoculation of Alpha-Synuclein Fibrils

(+/- M83 : GFAP의 -luc +/-)의 Tg는 복막 내로 또는 혀의 α- 시누 클레인 브릴의 말초 주입 가족적 A53T 돌연변이와 반딧불이 루시퍼 라제와 인간의 α- 시누 클레인 표현 마우스, 신경 염증을 포함한 신경 병리학을 유도 할 그들의 중추 신경계한다.

알파 - 시누 클레인 브릴의 주변 접종 후 형질 전환 마우스의 신경 염증의 생물 발광 영상

To study the prion-like behavior of misfolded alpha-synuclein, mouse models are needed that allow fast and simple transmission of alpha-synuclein ...

bioluminescence-imaging-neuroinflammation-transgenic-mice-after

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.5K 조회수.  German Center for Neurodegenerative Diseases (DZNE).  (+/- M83 : GFAP의 -luc +/-)의 Tg는 복막 내로 또는 혀의 α- 시누 클레인 브릴의 말초 주입 가족적 A53T 돌연변이와 반딧불이 루시퍼 라제와 인간의 α- 시누 클레인 표현 마우스, 신경 염증을 포함한 신경 병리학을 유도 할 그들의 중추 신경계한다. 

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A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation

Traditionally in neuroscience, in vivo two photon imaging of the murine central nervous system has either involved the use of open-skull1,2 or thinned-skull 3 preparations. While the open-skull technique is very versatile, it is not optimal for studying microglia because it is invasive and can cause microglial activation. Even though the thinned-skull approach is minimally invasive, the repeated re-thinning of skull required for chronic imaging increases the risks of tissue injury and microglial activation and allows for a limited number of imaging sessions. Here we present a chronic thin-skull window method for monitoring murine microglia in vivo over an extended period of time using two-photon microscopy. We demonstrate how to prepare a stable, accessible, thinned-skull cortical window (TSCW) with an apposed glass coverslip that remains translucent over the course of three weeks of intermittent observation. This TSCW preparation is far more immunologically inert with respect to microglial activation than open craniotomy or repeated skull thinning and allows an arbitrary number of imaging sessions during a time period of weeks. We prepare TSCW in CX3CR1 GFP/+ mice 4 to visualize microglia with enhanced green fluorescent protein to &le;150 &mu;m beneath the pial surface. We also show that this preparation can be used in conjunction with stereotactic brain injections of the HIV-1 neurotoxic protein Tat, adjacent to the TSCW, which is capable of inducing durable microgliosis. Therefore, this method is extremely useful for examining changes in microglial morphology and motility over time in the living brain in models of HIV Associated Neurocognitive Disorder (HAND) and other neurodegenerative diseases with a neuroinflammatory component.

A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation

We describe a method for repeatedly visualizing murine microglia and circulating monocytes in vivo over hours, days or weeks using transcranial two-photon microscopy. We demonstrate how to prepare a thinned-skull window that allows intermittent observation of quiescent microglia that can be activated by adjacent stereotactic injection of the HIV-1 regulatory protein Tat.

만성 두 광자를위한 박막 해골 창 기법 생체내에서</emNeuroinflammation의 모델 Murine Microglia의> 이미징

Traditionally in neuroscience, in vivo two photon imaging of the murine central nervous system has either involved the use of open-skull1,2 or ...

연구

신경과학

Oral Administration of Rotenone using a Gavage and Image Analysis of Alpha-synuclein Inclusions in the Enteric Nervous System

In Parkinson's disease (PD) patients, the associated pathology follows a characteristic pattern involving inter alia the enteric nervous system (ENS) 1,2, the olfactory bulb (OB), the dorsal motor nucleus of the vagus (DMV)3, the intermediolateral nucleus of the spinal cord 4 and the substantia nigra, providing the basis for the neuropathological staging of the disease4,5. The ENS and the OB are the most exposed nervous structures and the first ones to be affected. Interestingly, PD has been related to pesticide exposure6-8. Here we show in detail two methods used in our previous study 9. In order to analyze the effects of rotenone acting locally on the ENS, we administered rotenone using a gavage to one-year old C57/BL6 mice. Rotenone is a widely used pesticide that strongly inhibits mitochondrial Complex I 10. It is highly lipophylic and poorly absorbed in the gastrointestinal tract 11. Our results showed that the administration of 5 mg/kg of rotenone did not inhibit mitochondrial Complex I activity in the muscle or the brain. Thus, suggesting that using our administration method rotenone did not cross the hepatoportal system and was acting solely on the ENS. Here we show a method to administer pesticides using a gavage and the image analysis protocol used to analyze the effects of the pesticide in alpha-synuclein accumulation in the ENS. The first part shows a method that allows intragastric administration of pesticides (rotenone) at a desired precise concentration. The second method shows a semi-automatic image analysis protocol to analyze alpha-synuclein accumulation in the ENS using an image analysis software.

Parkinson's disease has been related to the exposure to pesticides. Here we show a method to deliver pesticides using a gastric tube at the desired concentration and a method to analyze their effect in alpha-synuclein accumulation in the enteric nervous system.

장용 신경계의 알파 synuclein의 흠도의 Gavage 및 이미지 분석을 사용하여 Rotenone의 구강 관리

In Parkinson's disease (PD) patients, the associated pathology follows a characteristic pattern involving inter alia the enteric nervous system (ENS) 1,2, ...

In vivo Imaging Method to Distinguish Acute and Chronic Inflammation

Inflammation is a fundamental aspect of many human diseases. In this video report, we demonstrate non-invasive bioluminescence imaging techniques that distinguish acute and chronic inflammation in mouse models. With tissue damage or pathogen invasion, neutrophils are the first line of defense, playing a major role in mediating the acute inflammatory response. As the inflammatory reaction progresses, circulating monocytes gradually migrate into the site of injury and differentiate into mature macrophages, which mediate chronic inflammation and promote tissue repair by removing tissue debris and producing anti-inflammatory cytokines. Intraperitoneal injection of luminol (5-amino-2,3-dihydro-1,4-phthalazinedione, sodium salt) enables detection of acute inflammation largely mediated by tissue-infiltrating neutrophils. Luminol specifically reacts with the superoxide generated within the phagosomes of neutrophils since bioluminescence results from a myeloperoxidase (MPO) mediated reaction. Lucigenin (bis-N-methylacridinium nitrate) also reacts with superoxide in order to generate bioluminescence. However, lucigenin bioluminescence is independent of MPO and it solely relies on phagocyte NADPH oxidase (Phox) in macrophages during chronic inflammation. Together, luminol and lucigenin allow non-invasive visualization and longitudinal assessment of different phagocyte populations across both acute and chronic inflammatory phases. Given the important role of inflammation in a variety of human diseases, we believe this non-invasive imaging method can help investigate the differential roles of neutrophils and macrophages in a variety of pathological conditions.

In vivo Imaging Method to Distinguish Acute and Chronic Inflammation

We describe a non-invasive imaging method for distinguishing inflammatory stages. Systemic delivery of luminol reveals areas of acute inflammation dependent upon MPO activity in neutrophils. In contrast, injection of lucigenin allows for visualization of chronic inflammation dependent upon Phox activity in macrophages.

생체 내 이미징 방법에 급성 및 만성 염증을 구별하는

Inflammation is a fundamental aspect of many human diseases. In this video report, we demonstrate non-invasive bioluminescence imaging techniques that ...

면역학 및 감염병학

Bioluminescence and Near-infrared Imaging of Optic Neuritis and Brain Inflammation in the EAE Model of Multiple Sclerosis in Mice

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in SJL/J mice is a model for relapsing-remitting multiple sclerosis (RRMS). Clinical EAE scores describing motor function deficits are basic readouts of the immune-mediated inflammation of the spinal cord. However, scores and body weight do not allow for an in vivo assessment of brain inflammation and optic neuritis. The latter is an early and frequent manifestation in about 2/3 of MS patients. Here, we show methods for bioluminescence and near-infrared live imaging to assess EAE evoked optic neuritis, brain inflammation, and blood-brain barrier (BBB) disruption in living mice using an in vivo imaging system. A bioluminescent substrate activated by oxidases primarily showed optic neuritis. The signal was specific and allowed the visualization of medication effects and disease time courses, which paralleled the clinical scores. Pegylated fluorescent nanoparticles that remained within the vasculature for extended periods of time were used to assess the BBB integrity. Near-infrared imaging revealed a BBB leak at the peak of the disease. The signal was the strongest around the eyes. A near-infrared substrate for matrix metalloproteinases was used to assess EAE-evoked inflammation. Auto-fluorescence interfered with the signal, requiring spectral unmixing for quantification. Overall, bioluminescence imaging was a reliable method to assess EAE-associated optic neuritis and medication effects and was superior to the near-infrared techniques in terms of signal specificity, robustness, ease of quantification, and cost.

We show a technique for in vivo live bioluminescence and near-infrared imaging of optic neuritis and encephalitis in the experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) model for multiple sclerosis in SJL/J mice.

마우스의 다발성 경화증의 EAE 모델에서 시신경염 및 뇌 염증의 생물 발광 및 근적외선 영상

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in SJL/J mice is a model for relapsing-remitting multiple sclerosis (RRMS). Clinical EAE scores describing ...

의학

In Vivo Imaging of Cx3cr1gfp/gfp Reporter Mice with Spectral-domain Optical Coherence Tomography and Scanning Laser Ophthalmoscopy

Spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT) and scanning laser ophthalmoscopy (SLO) are extensively used in experimental ophthalmology. In the present protocol, mice expressing green fluorescent protein (gfp) under the promoter of Cx3cr1 (BALB/c-Cx3cr1gfp/gfp) were used to image microglia cells in vivo in the retina. Microglia are resident macrophages of the retina and have been implicated in several retinal diseases1,2,3,4,5,6. This protocol provides a detailed approach for generation of retinal B-scans, with SD-OCT, and imaging of microglia cell distribution in Cx3cr1gfp/gfp mice with SLO in vivo, using an ophthalmic imaging platform system. The protocol can be used in several reporter mouse lines. However, there are some limitations to the protocol presented here. First, both SLO and SD-OCT, when used in the high-resolution mode, collect data with high axial resolution but the lateral resolution is lower (3.5 &#181;m and 6 &#181;m, respectively). Moreover, the focus and saturation level in SLO is highly dependent on parameter selection and correct alignment of the eye. Additionally, using devices designed for human patients in mice is challenging due to the higher total optical power of the mouse eye compared to the human eye; this can lead to lateral magnification inaccuracies7, which are also dependent on the magnification by the mouse lens among others. However, despite that the axial scan position is dependent upon lateral magnification, the axial SD-OCT measurements are accurate8.

In Vivo Imaging of Cx3cr1gfp/gfp Reporter Mice with Spectral-domain Optical Coherence Tomography and Scanning Laser Ophthalmoscopy

This protocol describes how high-resolution imaging techniques such as spectral domain optical coherence tomography and scanning laser ophthalmoscopy can be utilized in small rodents, using an ophthalmic imaging platform system, to obtain information on retinal thickness and microglial cell distribution, respectively.

Vivo에서 스펙트럼-도메인 광학 일관성 단층 촬영 스캐닝 레이저 Ophthalmoscopy와 Cx3cr1gfp/gfp 기자 쥐의 이미징

Spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT) and scanning laser ophthalmoscopy (SLO) are extensively used in experimental ophthalmology. In the ...

Exogenous Administration of Microsomes-associated Alpha-synuclein Aggregates to Primary Neurons As a Powerful Cell Model of Fibrils Formation

For years, the inability of replicating formation of insoluble alpha-synuclein (&#945;S) inclusions in cell cultures has been a great limitation in the study of &#945;S aggregation in Parkinson&#39;s Disease (PD). Recently, the development of new animal models through the exogenous inoculation of brain extracts from diseased &#945;S transgenic mice or PD patients has given new hopes to the possibility of creating more adequate cell models of &#945;S aggregation. Unfortunately, when it comes to cells in cultures, administration of raw brain extracts has not proven as successful as in mice and the source of choice of exogenous aggregates is still in vitro preformed &#945;S fibrils.
We have developed a method to induce the formation of intracellular &#945;S inclusions in primary neurons through the exogenous administration of native microsomes-associated &#945;S aggregates, a highly toxic &#945;S species isolated from diseased areas of transgenic mice. This fraction of &#945;S aggregates that is associated with the microsomes vesicles, is efficiently internalized and induces the formation of intracellular inclusions positive for aggregated and phosphorylated &#945;S. Compared to in vitro-preformed fibrils which are made from recombinant &#945;S, our method is faster and guarantees that the pathogenic seeding is made with authentic &#945;S aggregates extracted from diseased animal models of PD, mimicking more closely the type of inclusions obtained in vivo. As a result, availability of tissues rich in &#945;S inclusions is mandatory.
We believe that this method will provide a versatile cell-based model to study the microscopic aspects of &#945;S aggregation and the related cellular pathophysiology in vivo and will be a starting point for the creation of more accurate and sophisticated cell paradigm of PD.

The goal of this protocol is to provide a cell-based system that replicates the formation of alpha-synuclein aggregates in vivo. Intracellular alpha-synuclein inclusions are seeded in primary neurons by the internalization and propagation of exogenous administered native microsomes-associated alpha-synuclein aggregates isolated from diseased alpha-synuclein transgenic mice.

소 대형의 강력한 셀 모델로 기본 신경 하 Microsomes 관련 알파 synuclein 집계의 외 인 관리

For years, the inability of replicating formation of insoluble alpha-synuclein (&#945;S) inclusions in cell cultures has been a great limitation in the ...

Bioluminescence Imaging of Neuroinflammation in a Transgenic Mouse

<a href='https://app.jove.com/v/55503/bioluminescence-imaging-neuroinflammation-transgenic-mice-after'>Source: Breid, S., et. al. Bioluminescence Imaging of Neuroinflammation in Transgenic Mice After Peripheral Inoculation of Alpha-Synuclein Fibrils. J. Vis. Exp. (2017)</a>This video demonstrates the bioluminescence imaging of neuroinflammation in transgenic mice, showcasing luciferase-luciferin reactions in activated astrocytes. The protocol enables non-invasive quantification of astrocytic activation, aiding studies on CNS inflammation and therapeutic efficacy.

Source: Breid, S., et. al. Bioluminescence Imaging of Neuroinflammation in Transgenic Mice After Peripheral Inoculation of Alpha-Synuclein Fibrils. J. ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neuroimaging

Neurodegeneration & Disease Monitoring

In Vivo Imaging of Retinal Microglia in a Mouse Model of Glaucoma

Source:&#160;<a href='https://app.jove.com/v/52731/in-vivo-dynamics-of-retinal-microglial-activation-during-neurodegeneration-confocal-ophthalmoscopic-imaging-and-cell-morphometry-in-mouse-glaucoma'>Bosco, A.,&#160;et al. In Vivo Dynamics of Retinal Microglial Activation During Neurodegeneration: Confocal Ophthalmoscopic Imaging and Cell Morphometry in Mouse Glaucoma. J. Vis. Exp. (2015)</a> &#160;This video demonstrates in vivo imaging of retinal microglia in a mouse model of glaucoma. A transgenic mouse with fluorescent protein-expressing retinal microglia is positioned under an ophthalmoscope. Infrared illumination is used to locate the optic nerve head (ONH), and the focal plane is established using retinal blood vessels as landmarks. Fluorescent imaging is then employed to visualize the fluorescent microglia. Activated microglia, characterized by enlarged cell bodies and reduced branching complexity, are assessed.

Source:&#160;Bosco, A.,&#160;et al. In Vivo Dynamics of Retinal Microglial Activation During Neurodegeneration: Confocal Ophthalmoscopic Imaging and Cell ...

Fluorescence Imaging of Neuro-Immune Dynamics Using a Skull Implant

<a href='https://app.jove.com/v/61454/precise-brain-mapping-to-perform-repetitive-vivo-imaging-neuro-immune'>Source:&#160; Bisht, K., et al. Precise brain mapping to perform repetitive in vivo imaging of neuro-immune dynamics in mice. J. Vis. Exp. (2020)</a>This video demonstrates fluorescence imaging of neuro-immune dynamics in a transgenic mouse with a skull implant. Vascular and neuronal stability is imaged alongside dynamic microglial changes, reflecting immune responses to neuronal activity.

Source:&#160; Bisht, K., et al. Precise brain mapping to perform repetitive in vivo imaging of neuro-immune dynamics in mice. J. Vis. Exp. (2020)This ...

Live Imaging & In Vivo Tracking

Bioluminescence Imaging in an EAE Mouse Model

Source:&#160;Schmitz, K.,&#160;et al., Bioluminescence and Near-infrared Imaging of Optic Neuritis and Brain Inflammation in the EAE Model of Multiple ...