이 작품으로는 2012 사회의 독성 (SOT) 지원 되었다-그렇지 연구 (M. 팡) Colgate Palmolive 그랜트와 국제 협력 연구 기금 동물 및 식물 검역 기관, 한국 공화국 (M. 팡), 그리고는 NIEHS 부여 P30ES005022 (H. Zarbl). 우리는 그의 도움이 토론, 씨 Shao-An 후안 그의 실험적인 지원을, 및 그녀의 증거 독서에 대 한 양 키 미 나카타 첸 청 (맥 거 번의과 대학 대학에서 휴스턴에서 건강 과학 센터 택 사스의) 감사 하 고 싶습니다.

1. PER2 발기인 구동 불안정 Luciferase 기자 벡터의 건설 <ol><li>pLS 사용자 정의 구입 [hPER2P / rLuc / 순수 하지 않아] 인코딩 rLuc 및 인간 cDNA를 포함 하는 벡터 PER2 발기인 조각 (hPER2P, 941 bp) Sac 사이 사이트에서 나 고 뒷 다리 여러 복제 지역 17에 III.</li>
	<li>인간의 PER2 발기인 조각 잘라 (hPER2P, 941 bp)는 벡터에서.
	<ol><li>추가 2.5 µ L 제한 효소 버퍼, 10 µ L (180 기) pLS [hPER2P / rLuc / 순수 하지 않아] 벡터 및 1 µ L 각 금지 효소, Sac의 I (10 단위 / µ L) 및 뒷 다리 III (10 단위 / µ L)는 DNA/RNA/뉴클레오티드-무료에 microcentrifuge 튜브입니다. 부드럽게 pipetting으로 초순 (10.5 µ L) 25 µ L와 믹스를 추가.</li>
		<li>난방 블록에 90 분 동안 37 ° C에서 품.</li>
		<li>0.7 %agarose 젤 0.0001 %ethidium 평범한 사람 (EtBr) 벡터에서는 hPER2P을 포함 하는 제한 효소 반응의 전체 볼륨 (25 µ L) 실행. 
		참고: EtBr, 3,8-diamino-1-ethyl-6-phenylphenantridinium 브 로마 이드 (CAS 등록 번호: 1239-45-8)은 무 취 붉은 액체. 그것은 일반적으로 사용 되는 형광 태그 (핵 산 얼룩) agarose 젤 전기 이동 법으로 및 UV 빛에서 오렌지 색상으로 표시 하는 intercalating 에이전트입니다. 규제 기관 중 발암 물질 18로 분류 하지만 돌이킬 수 없는 돌연변이 효과의 가능한 위험 실험 동물에서 발생 합니다. 따라서, 우리가 포함 된 화학 위험 폐기물로 EtBr 사용된 agarose 젤과 전기 이동 법 버퍼 수집과 Rutgers 환경 건강 요청 &#38; 안전 (REHS)를 선택 하 고 안전 하 게 처분 하.</li>
		<li>Agarose 젤 941에 EtBr 형광 밴드를 포함 하는 한 조각 잘라 bp, 260 nm 파장에서 흡수 밀도 (OD)를 측정 하 여 정량화는 분 광 광도 계에 따라 DNA 젤 추출 키트, 젤에서 hPER2P 조각 정화.</li>
	</ol></li> <li>정한 반딧불 luciferase 식 벡터: pGL의 선형화 1.0 µ L (1 µ g) [Luc2P / 네오] 단계 1.2.1-1.2.2에 설명 된 대로 동일한 방법으로. 정량화는 분 광 광도 계를 사용 하 여 위에서 설명한 뒤 DNA 정리 키트는 벡터를 추출.</li>
	<li>선형화 벡터: pGL에는 hPER2P 선 [Luc2P / 네오]. 
	참고: 제조 업체 당 &#39; s 명령, 삽입 및 벡터의 이상적인 어 금 니 비율 2:1입니다. 50 ng 벡터, 삽입의 이상적인 금액은 23.6로 계산 수식, [(50 ng vector x 1.0 kb insert)/4.242 kb 벡터와 ng] (2/1) x 23.6 ng 삽입 =]. HPER2P의 농도에 따라 (7.26 ng / µ L) 및: pGL [Luc2P / 네오] (50 ng / µ L), 50 ng: pGL의 볼륨 [Luc2P / 네오] 23.6 ng hPER2P 각각 1 µ L 3.26 µ L로 계산 됩니다.
	<ol><li>추가 2 µ L T4 DNA 리가 반응 버퍼 (10 배) (50 mM Tris HCl, 10 m m MgCl 2, 1 mM ATP, 그리고 10 mM DTT), 3.26 µ L (23.6 ng) hPER2P, 1 µ L (50 기): pGL [Luc2P / 네오], 13.74 µ L 물 최대 20 µ L 부드럽게 혼합.</li>
		<li>1 µ L T4 DNA 리가 (400 단위 / µ L) 추가 부드럽게 혼합 고 thermocycler, 하룻밤 사이에 16 ° C에서 품 어, 다음 제조 업체 마다 얼음에 합자 벡터 진정 &#39; s 지시.</li>
	</ol></li> <li>합자 벡터: pGL 변환 [hPer2P / Luc2P / 네오] 화학적으로 유능한 대장균을 19.
	<ol><li>42 ° c, catabolite 억압 (S.O.C.) 매체와 슈퍼 최적의 국물을 따뜻한 물 목욕을 설정 (2 %Tryptone, 0.5% 효 모 추출, 10 mM NaCl, 2.5 m m KCl, 10mm MgCl 2, 10 m m MgSO 4 및 20 m m 포도 당) 실 온에서 Luria Bertani (파운드) 한 천 배지 (100 µ g/mL 암 피 실린, 80 µ g/mL X gal 및 0.5 µ M IPTG 포함) 37 ° C 배양 기에서 따뜻하게 하 고 얼음에 녹여 각 변환에 대 한 세포의 유능한 대장균 한 유리병.</li>
		<li>추가 6 µ L (21 기) 벡터 또는 1 µ L 출혈 (30 ng) 화학적 유능한 대장균 (50 µ L)에의 한 튜브를 벡터 (부정적인 제어)을 다음 부드럽게 혼합 튜브를 플립. 30 분에 대 한 얼음에 품 어</li>
		<li>30 42 ° C 물 욕조에 충격 열 동요 없이 하 고 얼음을 반환 s</li>
	</ol></li> <li>블루/화이트 심사를 사용 하 여 합자 벡터와 변형 대장균 식민지 선택.
	<ol><li>변환 된 대장균에 추가 250 µ L S.O.C. 매체 튜브 및 200 rpm에서 떨고와 37 ° C에서 1 시간에 품 어.</li>
		<li>10-50 µ L의 변형된 대장균 파운드 한 천 격판덮개의 표면에 균일 하 게 확산. 넣어 접시 거꾸로 37 ° C 배양 기에서 하룻밤. 
		참고: 효율적인 복제 반응 몇 백 식민지를 생산 한다. 두 개의 다른 볼륨을 도금 적어도 하나의 접시 큰, 분명 흰색 또는 파란색 색상과 잘 간격된 식민지 해야한다 되도록 것이 좋습니다. 식민지는 너무 작은 때 색상은 구별할 수 10 배 (50 X) 현미경을 사용 하 여 도움이 됩니다.</li>
		<li>소독된 치아 막대기, 격판덮개에서 3-6 백색 식민지를 선택 하 고 50 µ g/mL 암 피 실린과 파운드 문화 매체의 4 mL를 포함 하는 하나의 문화 관으로 각 식민지를 놓습니다.</li>
		<li>200 rpm에서 밤새 흔들어 37 ° C에서 튜브를 품 어. 4 mL의 2 개 mL를 사용 하 여 DNA를 추출 플라스 미드 DNA 추출 미니 준비 키트 제조 업체 당 대장균 배양 &#39; s 지시.</li>
	</ol></li> <li>확인 하 고 삽입을 분석 (hPER2P, 941 bp) <ol><li>플라스 미드 DNA 제한 효소로 소화 하 고 삽입 확인 하십시오 단계 1.2.1-1.2.3에 설명 된 대로 전기 이동 법을 실행. 
		참고: 긍정적인 제어 (hPER2P 단계 1.2.4에서 정화) 부정적인 제어 (대장균 빈 벡터와 변형)에 포함 된 및.</li>
		<li>방향 19 플라스 미드 삽입의 순서를 확인 하려면 M13 앞으로 및 역방향 M13 뇌관을 사용 하 여 선택 된 플라스 미드 DNA 시퀀스. 
		주: 전기 및 올바른 방향에 hPER2P 및 시퀀싱 결과에서 시퀀스의 정확한 크기와 삽입을 했다 단 하나 식민지가 선정 됐다.</li>
		<li>인간의 PER2 발기인 조각 분석 (hPER2P, 941 bp) CCAATC, 전자 상자 모티브 (Bmal1 바인딩 사이트, 고양이/CGTG)를 포함 하 여 circadian 규제 요소에 대 한 시퀀싱 GC 상자, 및 녹음 방송 시작 사이트 (CAGCGG) 20.</li>
	</ol></li> <li>증폭 추가 하 여 선택 된 대장균 남은 2 mL 200 mL 파운드 문화 매체 50 µ g/mL 암 피 실린 포함 하 고 다음 200 rpm에서 떨고와 37 ° C에서 하룻밤 배양으로 대장균 배양.</li>
	<li>추출 DNA 플라스 미드도 없는 맥시와 당 키트 준비 제조 업체 &#39; s 명령 후는 분 광 광도 계와 OD 260 nm 파장에서 측정 하 여 계량 하는 고. 약 수와 저장소 플라스 미드 DNA: pGL [hPer2P/Luc2P/네오], 나중에 사용-80 ° C 냉장고.</li>
</ol> 2. 일시적인 Transfection <ol><li>구매 문화 MCF10A 셀 <ol><li>구입 상업에서 불멸 하 게 하 고, 변형 비 정상적인 인간 유 방 상피 세포 라인 (MCF10A) 세포 은행, 셀 cytogenetically는 어디 테스트와 함께 인증 된 짧은 탠덤 반복 동결 하기 전에 분석. 해 동 하 고 유지 하는 최대 8 주 문화에 냉동된 셀의 각 유리병. 
		참고: 다른 세포와 달리이 세포 있다 접촉 금지 그들은 ~ 70% 합류에 도착. 그 하위 ~ 70%에서 실시는 필요 합니다.</li>
		<li>유 방 상피 기저 매체 (MEBM), 성장 보조 제, 그리고 37 ° C, 습도 95%, 5% CO 2에서 셀 문화 인큐베이터에서 콜레라 독 소 유 방 상피 세포 성장 매체 (MEGM), 셀 문화. 
		참고: 준비-사용 성장 요인 제공 하는 SingleQuot (SQ)를 구매 하 고 별도로 콜레라 독 소를 얻을. 성장 보충의 최종 농도 0.4% 소 뇌 하 수 체 추출, 0.1% 인슐린, 0.1% 하이드로 코 티 손, 0.1% 인간 표 피 성장 인자, 100 ng/mL 콜레라 독 소, 그리고 0.05 %gentamycin 황산 및 0.05% 암포 B.</li>
		<li>10 mL 트립 신/대 한 EDTA를 가진 외피에 의해 10 cm 배양 접시에 셀 해리 ~ 20 분 다음 10 mL trypsin 중화 솔루션을 추가 하 여는 트립 신을 무력화. 모든 셀 HEPES 소금물 (HBSS)를 버퍼링 하는 수집.</li>
		<li>거꾸로 현미경 hemocytometer와 셀 단일 세포 현 탁 액의 농도 계산 하 고 필요에 따라 셀의 특정 숫자를 씨앗. 각 접시에 셀의 동등한 배급을 얻기 위해 철저 하 게 접시를 소용돌이 친다. 셀에서 37 ° C, 습도 95%, 5% CO 2 셀 문화 인큐베이터에서 품 어. 
		참고: 포함 된 트립 신/EDTA, 트립 신 중화 솔루션 및 사용 HBSS subculture 시 약 팩 구입.</li>
	</ol></li> <li>건설 circadian 벡터에 포함 된 셀의 과도 transfection.
	<ol><li>35mm 문화에 균등 하 게 시드 2 x 10 5 MCF10A 세포 MEGM와 접시와 20-30% 합류 (다음 날)에 성장.</li>
		<li>따뜻한은 감소를 혈 청 미디어 (예를 들어, Opti 메모리) 37 ° C 물 목욕과 transfection 시 약 30 분에 대 한 실 온에서 희석 플라스 미드 DNA 건설 (: pGL [hPer2P / Luc2P / 네오])와 엔도-독 소 무료 30 ng / µ L를 트리 스-EDTA (테) 버퍼 및 실내 온도 유지.</li>
		<li>63.6 µ L 따뜻한 감소 된 혈 청 미디어를 먼저 추가한 다음 추가 33.4 µ L (0.1 µ g) 플라스 미드 DNA, 플라스 미드 transfection 혼합물 1.5 mL microcentrifuge 튜브에서를 준비 하 고 pipetting, 하 transfection의 3 µ L에 마지막으로 추가 하 여 부드럽게 혼합 벽을 건드리지 않고 튜브의 센터에 직접 시 약. 부드럽게 pipetting으로 혼합, 후 30 분에 대 한 실 온에서 계속</li>
		<li>접시에 매체의 센터 표면에 직접 전체 플라스 미드 혼합물 (100 µ L)를 삭제 하 고 요리를 떨고 하 여 부드럽게 섞는다. 추가 48-72 헤에 대 한 CO 2 배양 기에서 셀 문화 
		참고: 그것은 최고의 transfection 효율 그들의 접촉 저해에 때문에이 세포의 40-70% 합류에 있을 것을 예상은 ~ 70%. 따라서, transfection 작품에서 최고의 시작 ~에서 20% ~ 70% 합류.</li>
	</ol></li></ol> 3. 뚜렷이 페 MCF10A 세포의 체 외에 생물 발광 분석 결과의 설립 <ol><li>24 h. 위한 성장 인자 없이 MEBM에서 (후 48-72 h transfection) 합류 점 ~ 70%에서 경작된 한 세포를 굶 어</li>
	<li>동기화 에이전트 (예를 들어, 50% 말 혈 청 (HS)) MEBM에 CO 2 배양 기에서 1.5 h에 대 한 세포 치료. 
	참고: 이상적인 동기화 에이전트, 10 µ M 산림, 1 nM 멜 라 토 닌, dexamethasone 0.1 µ M, 50 %HS, 및 100%의 선택을 위한 SQ 비교 되었다 circadian 진폭 및 기간 circadian 벡터 transfected 세포에. 100% 빈 벡터 transfected 세포 처리 됩니다 부정적인 컨트롤로 SQ.</li>
	<li>Pre-prepare 20 mL 녹음 매체 (10-30mm 문화 요리)에 대 한 MEGM의 5 mL, 15 mL MEBM, 150 µ L 나트륨 중 탄산염, 200 µ L HEPES, 및 40 µ L 소를 추가 하 여 재고 솔루션 (50 mM) 50 mL 소독 원심 분리기 튜브에서. 
	참고: 각 부품의 최종 농도: 20% 광장 및 20 ng/mL 콜레라 독 소, 0.06% 나트륨 중 탄산염, 1% 페니실린/스, 그리고 10 mM HEPES. 따뜻하게 미리 준비 된 매체를 기록 하 고 37 ° C 물 욕조에 30 분 동안 1 x PBS를 소독. 사용 직전 100 µ M 소 추가.</li>
	<li>씻어 따뜻한 1 셀 Dulbecco x &#39; s Phosphate-Buffered 염 분 (D-PBS) 3에 대 한 동기화 에이전트와 함께 부 화 후 시간과 기록 매체 2 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>증발을 방지 하기 위해 다음 측에 레이블을 실리콘 윤활제를 사용 하 여 멸 균된 커버 클래스와 접시를 봉인.</li>
	<li>밀폐 접시 루미 노, 안쪽 자리에 놓고 폴더에 파일 위치를 저장 하기 위한 옵션 (세부 사항, 섹션 6을 참조).</li>
</ol> 4. 안정적으로 페 셀 선택 <ol><li>최적화 제조 업체에 따라 죽 일 곡선 분석 결과와 이상적인 G418 농도 (800 µ g/mL) &#39; 안정적 transfected 세포의 선택에 대 한 지침 s.</li>
	<li>48 h 또는 72 h에 대 한 과도 transfection, 후 subculture와 씨 5000 큰 요리에서 MEGM 셀 셀/접시 (100 mm). 24 시간 후 문화 (37 ° C, 습도 95%, 및 5% CO 2), 셀 문화 인큐베이터에서 매 3-4 일 2 주 동안 800 µ g/mL G418를 포함 하는 새로운 매체 오래 된 매체를 대체 하 여 G418의 800 µ g/mL로 세포 치료.</li>
	<li>Subculture 안정적으로 살아남은 500µg/mL G418 hPer2P/Luc2P의 안정적인 식 유지 하 고 차후 사용을 위해 액체 질소에서 동결을 포함 하는 MEGM와 함께 1-3 구절에 대 한 식민지 transfected.</li>
	<li>생물 발광 분석 결과 생체 외에서의 결과에 생물 발광 강도 많은 구절에서 사용 후 점차적으로 낮은 경우 일반 subculture 셀의 안정적 transfected 인구를 다시 선택 후 500µg/mL G418 치료.</li>
</ol> 5. 화학 물질과 치료 <ol>에서 <li>48 h 또는 72 h 후 transfection 24 헤에 대 한 MEBM에 성장 요인에서 세포를 굶 어</li>
	<li>50% 동기화 후 2 시간에 대 한 HS 치료 0.25 m m 또는 0.5 m m nitrosomethylurea (NMU), 20 nM EX527, 또는 MEBM 포함 하는 20 %1 h 1 µ M cambinol 셀 평방</li>
	<li>1 세척 후 x D-PBS, 혼자, 또는 20 EX527 또는 셀에 1 µ M cambinol와 함께 중간 포함 12.5 µ M MSC 기록 추가. 모니터링은 루미 노와 생물 발광.</li>
	<li>치료 안정적 transfected MCF10A / PER2-0.5, 1 또는 2 m m, 40 nm, EX527 또는 2.0 µ M, 50% 동기화 후 1 시간에 Cambinol에서 NMU dLuc 셀 HS, MSC의 중간 포함 12.5 µ M 기록에서 세포를 품 어 고 또는 n-진 (NAC)의 다른 복용량 (5, 10, 또는 20 µ M). 루미 노, 기록에에서 접시를 놓고 3.6 절에 설명 된 대로 4-8 일에는 생물 발광 루미 노에 의해 저장. 
	참고: NMU methylated nitrosourea 화합물, 발암 성, 변이 원 성 및 않았음 속성입니다. NMU는 직접 연기 alkylating 에이전트 있으며 짧은 반감기 (T 1/2 = ~ 30 분). 그것은 알칼리 성 상태 (pH 9-10)와 온도 20 ° c. 이상에서 불안정 하지만 산 성 상태 (pH 4-5)에서 안정 양측 검정 청소 벤치 표면 및 NMU soluti에 의해 잠재적으로 오염 하는 랩 실력에 대 한 효율적인 비활성화 요원으로 10%에서 표 백제를 사용 하는 따라서,. 남은 재고 솔루션은 선택 하 고 REHS에 의해 안전 하 게 폐기. 화학 물질의 행동의 모드에 따라, 동기화 된 세포는 녹음 매체에서 경작 하기 전에 짧은 시간에 대 한 치료 수 있습니다. 있으 나 셀 긴 시간 (몇 일) 녹화 매체에서 또한 대우 될 수 있다.</li>
</ol> 6. 데이터 수집, 분석, 및 프레 젠 테이 션 참고: 세포 생존 능력 표시 같은 시간에 대 한 동일한 농도에서 세포의 치료 후 표준 방법 (예: MTT 분석 결과)를 사용 하 여 결정 해야. 생체 외에서 생물 발광 분석 결과에서 사용 하는 모든 치료 농도 30% 치 사 농도 (LC30) 보다 낮은 했다. 모든 실험은 3 중에서 실시 됐다 그리고 대표 결과 발표 됐다.
<ol><li>로드 없이 H 2 O와 CO 2, 37 ° C에서 설정 하 고 컴퓨터에 연결 하는 인큐베이터 안에 유지 되는 루미 노에 좌석에 요리 접시 (3.5 단계) 씰링, 후.</li>
	<li>클릭 &#34; 저장 &#34; 폴더 및 해당 요리에서 기록 된 발광 신호 저장할 파일 이름을 입력 하 고. 
	참고: 시스템에 발광 신호를 감지 개별 위치에서 접시에 셀에서 실시간. 신호 광 전 증폭 관 관 4-광자-카운트를 통해 컴퓨터에 전송 및 저장 및 데이터 수집 소프트웨어에 의해 컴퓨터에 표시 됩니다.</li>
	<li>4-7 일, 중간 변경 및 필요한 경우 두 번째 주에 대 한 지속적인 기록에 따라 수에 대 한 녹음 후 신호 분석. 
	참고: circadian 매개 변수, 위상, 기간 길이, 및 포함 한 리듬 진폭, 속도, 댐핑을 우리 루미 노 분석 소프트웨어를 사용 생물 발광 데이터를 분석.</li>
	<li>실행 평균, 원시 데이터를 detrend 하 고 기간, 위상, 진폭, 고 속도 21 , 22 감쇠를 사인파에 최고 맞는 분석.</li>
	<li>치료 및 중간 변경 시 높은 과도 생물 발광으로 인해 분석에서 데이터의 첫 번째 사이클 제외.</li>
	<li>데이터 프레 젠 테이 션에 대 한 플롯 시간 (h 또는 주)에 대 한 원시 데이터 (생물 발광, 수/s). 필요한 경우 데이터 기준선을 뺍니다 진폭 및 위상 비교를 그릴 수 있습니다.</li>
</ol>

<ol>
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J., Menaker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sympathetic+input+modulates,+but+does+not+determine,+phase+of+peripheral+circadian+oscillators.">Sympathetic input modulates, but does not determine, phase of peripheral circadian oscillators.</a> Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 295 (1), R355-R360 (2008).</li><li>Schofl, C., Becker, C., Prank, K., von zur Muhlen, A., Brabant, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Twenty-four-hour+rhythms+of+plasma+catecholamines+and+their+relation+to+cardiovascular+parameters+in+healthy+young+men.">Twenty-four-hour rhythms of plasma catecholamines and their relation to cardiovascular parameters in healthy young men.</a> Eur J Endocrinol. 137 (6), 675-683 (1997).</li><li>Yu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+rhythm+of+circulating+fibroblast+growth+factor+21+is+related+to+diurnal+changes+in+fatty+acids+in+humans.">Circadian rhythm of circulating fibroblast growth factor 21 is related to diurnal changes in fatty acids in humans.</a> Clin Chem. 57 (5), 691-700 (2011).</li><li>Nakagawa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+circadian+rhythm+of+DNA+synthesis+in+tumor+cells+by+inhibiting+platelet-derived+growth+factor+signaling.">Modulation of circadian rhythm of DNA synthesis in tumor cells by inhibiting platelet-derived growth factor signaling.</a> J Pharmacol Sci. 107 (4), 401-407 (2008).</li><li>Yang, X., Guo, M., Wan, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deregulation+of+growth+factor,+circadian+clock,+and+cell+cycle+signaling+in+regenerating+hepatocyte+RXRalpha-deficient+mouse+livers.">Deregulation of growth factor, circadian clock, and cell cycle signaling in regenerating hepatocyte RXRalpha-deficient mouse livers.</a> Am J Pathol. 176 (2), 733-743 (2010).</li><li>Virag, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+poly(ADP-ribose)+polymerase-1:+role+in+oxidative+stress-related+pathologies.">Structure and function of poly(ADP-ribose) polymerase-1: role in oxidative stress-related pathologies.</a> Curr Vasc Pharmacol. 3 (3), 209-214 (2005).</li><li>Kon, N., Sugiyama, Y., Yoshitane, H., Kameshita, I., Fukada, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-based+inhibitor+screening+identifies+multiple+protein+kinases+important+for+circadian+clock+oscillations.">Cell-based inhibitor screening identifies multiple protein kinases important for circadian clock oscillations.</a> Commun Integr Biol. 8 (4), e982405 (2015).</li><li>Ramanathan, C., Khan, S. K., Kathale, N. D., Xu, H., Liu, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+Cell-autonomous+Circadian+Clock+Rhythms+of+Gene+Expression+Using+Luciferase+Bioluminescence+Reporters.">Monitoring Cell-autonomous Circadian Clock Rhythms of Gene Expression Using Luciferase Bioluminescence Reporters.</a> J Vis Exp. (67), e4234 (2012).</li><li>Welsh, D. K., Yoo, S. H., Liu, A. C., Takahashi, J. S., Kay, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescence+imaging+of+individual+fibroblasts+reveals+persistent,+independently+phased+circadian+rhythms+of+clock+gene+expression.">Bioluminescence imaging of individual fibroblasts reveals persistent, independently phased circadian rhythms of clock gene expression.</a> Curr Biol. 14 (24), 2289-2295 (2004).</li></ol>

저자는 공개 없다.

포유류 세포 주기 circadian 클록의 상호 transcriptional/변환 피드백 루프에 의해 통제 된다. Heterodimers의 Bmal1 시계 및 Npas2 코어 CGs, Per2 , 외침및 수많은 CCGs4등의 발기인의 E 상자 요소에 바인딩하여 circadian 전사 조절. 그들은 셀, heterodimers의 축적으로 당: 외침 post-translationally 수정 및 시계: Bmal1 transcriptional 활동을 억 누르기 위해 핵 수송. 이 부정적인 피드백 루프 코어를 ...

Circadian 시계 넓은 범위 조절 유전자 약 24 h. 역학의 주기 예측 가능한 리듬 동작 자를 일주 식에서 생물 학적 과정의 연구 좋습니다 circadian 그 만성 장애 리듬의 유 방 및 교대 근로자, 간호사, 항공 승무원1,2,3등 전립선 암 위험을 증가 시킵니다. 이러한 결과 지속적인 빛, 밤에 빛, 또는 빛 사이클-시차 증가 종양 발생률을 모방 하 고 종양 성장을4,5가속을 노출을 보여주는 설치류 연구에 의해 뒷받침 됩니다. 인간과 설치류 학문에서 데이터를 바탕으로, 암 연구에 대 한 국제 기구의 분류는 가능성이 인간의 발암 물질 (유형 2A) 20106교대 작업.
우리는 설명 하는 이전에 유 방 종양 특정 발암 물질, Nnitroso의 단일 발암 복용량-N-methylurea (NMU) 중단 circadian 표현의 주요 circadian 유전자 (CGs) (예를 들어, 기간 2 , Per2) 여러 circadian 제어 유전자 (CCGs), 포함 한 DNA 손상 응답 키 및 대상 유선 (에 간) (DDRR) 유전자를 복구. 또한, 정상을 향해 Per2 와 DDRR 유전자의 circadian 식 식이 L의 chemopreventive 처방에 의해 다시 설정-메 틸-셀레노시스테인 (MSC) 63%로 종양의 발생률을 감소. 이러한 연구 결과 circadian 리듬, 화학 발암 및 자성7,8간의 기계적 링크를 표시 하는 첫번째 이었다. 기타 환경 유독 circadian 유전자 식에 vivo에서 방해를 표시 하는 노출 환경 질병9,10의 증가 위험과 관련 된 있습니다. 환경 유독 병 인 여 circadian 중단 연결 메커니즘을 이해 질병 예방에 mechanistically 기반 접근을 이어질 수 있습니다. 그러나, 연구는 노출 사이 상호 작용을 정의 목적 및 circadian 리듬은 일반적으로 수행 vivo에서. 24 또는 48 h 동안 모든 3-4 h를 수집는 전형적인 vivo에서 실험 조사 circadian 리듬에 미치는 영향 필요, 동물의 많은 수에서 3 개 이상 조직 제어 및 3 노출된 동물 되어야 합니다. Vivo에서 관찰 및 메커니즘이 검증 된 시험관에 시스템의 개발 따라서 뿐만 아니라, 동물의 수를 줄일 것 이라고 하지만 실험 비용 및 요구 사항 또한 극적으로 감소 하는 연구팀은 24-48 h 동안 지속적으로 작동합니다. 또한, 시스템 검증 된 시험관에 circadian 리듬, 또는 환경 스트레스 또는 유독 그것의 응답에 영향을 주는 유전 변경 화합물의 높은 처리량 검열 사용 될 수 있습니다. 따라서, 생체 외에서 그리고 vivo에서 모델과 실험의 협력 조합 다른 초점으로 다른 통찰력을 얻기 위해 필요 합니다.
포유류에서 circadian 발진기는 SCN의 특수 신경 뿐만 아니라 가장 주변 셀 형식에 존재 한다. 이 분자 시계는 비슷합니다 설립된 fibroblast 세포 선 및 기본 섬유 아 세포에서 배아 또는 성인 동물; 그러나, 조직 유형 특정 휴대 전화 모델11에 대 한 필요가 있다. 따라서, 운동 활동에서 vivo에서, SCN의 전통적인 연구 explants 비보 전, 그리고 불멸 하 게 fibroblast 세포의 체 외에서 세포 기반 분석은 널리 셀 자치 circadian 결함을 공부 하는 데 사용 됩니다. 그러나, 생체 외에서 fibroblast 세포 기반 분석 결과 circadian 메커니즘을 정리 수 있습니다 나타내는 증거가 없다 하 고 다른 주변 장기에 vivo에서의 셀에 응답 제시. 다른 세포 유형 유전자 발현, xenobiotic 물질 대사, 및 DDRR, 독특한 패턴을 가질 수 있으며 독성과 circadian 유전자 발현 사이의 링크 셀 형 수 있습니다 특정 및 다른 생리 적인 매개 변수에 의해 변조. 또한, 섬유 기반 시스템에서 circadian 발진기는 하지 되었습니다 완전히 평가 환경 유독, 스트레스 및 질병 개발 및 예방의 메커니즘에 노출 링크 예방 에이전트에 대 한 응답에 대 한. 따라서, 손쉬운, 유효한 셀 유형 전용, 생체 외에서 생물 발광 분석 실험 연구 기관 특정 환경 circadian 분리기에 대 한 필요가 있다. 다양 한 세포 시계 모델 (예를 들어, 간, keratinocytes, 지방 세포 뿐만 아니라 다리 셀 선)는 최근 몇 년 동안12,,1314, 에서 개발 되었습니다. 15, 여기서 설명 하는 분석 결과 유 방 상피 세포, 그리고 vivo에서 환경 스트레스, 유독, 마약과 chemopreventive 대리인 응답을 정리를 첫 번째 데모에서 첫 번째 세포 시계 모델입니다.
Renilla luciferase (rLuc) 및 반딧불 luciferase 30-61 kDa 단위체 단백질 효소 활동에 대 한 처리 posttranslational 필요 하지 않은 및 번역 즉시 유전 기자로 서 기능을 할 수 있습니다. 일단 기판 연결 luciferase 효소, 생 화 확 적인 반응을 촉매 빛의 플래시를 생성 합니다. 따라서, luciferase 구문은 진 식 기자 시스템에서 생체 외에서 그리고 에 비보로 널리 사용 됩니다. 그러나, circadian 리듬 연구, luciferase 기자의 유틸리티 luciferase 단백질의 상대적으로 긴 반감기에 의해 제한 됩니다 (T1/2 = 3.68 h) 기간 (특히 짧은 기간) circadian 유전자에 변화에 대 한 상대적인 식; 그러나, 수많은 연구 년 동안 성공적으로 사용 luciferase 유전자 빠르게 분해 luciferase 같은 circadian 리듬, 특히 오랜 기간 함께 리듬에 대 한 보고를 위해 필요 하지 않을 수 있음을 나타내는 pGL3 벡터에 24 h입니다. 따라서, 기자 플라스 미드 정한 luciferase 벡터를 사용 하 여,: pGL [Luc2P/Neo] hPEST (단백질 불안 시퀀스)를 포함 하는 개발 되었습니다, 현재 체 외 circadian 기자 벡터로 사용 하 수 있도록 생물 발광 분석 결과. Luc2P 에 의해 단백질은 훨씬 더 짧은 반감기 (T1/2 = 0.84 h) 따라서, 응답 보다 신속 하 고 더 큰 크기와 변화에 야생-타입 보다 transcriptional 활동에 나그것은 될 수 있는 ndicating luciferase 실시간16에 정확 하 게 PER2 발기인에 의해 규제의 리듬 표현 모니터링 하는 데 사용.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>pLS[hPER2P/rLuc/Puro] vector</td>
			<td>SwitchGear Genomics</td>
			<td>S700000</td>
			<td>customized vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pGL4.18[Luc2P/Neo] vector</td>
			<td>Promega</td>
			<td>9PIE673</td>
			<td>destabilized luciferase expression vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15224041</td>
			<td>For subcloning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TOPO TA cloning kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>K4500-02</td>
			<td>with One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sac I</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R0156S</td>
			<td>Restriction enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hind III-HF</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R3104S</td>
			<td>Restriction enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CutSmart buffer</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>B7204S</td>
			<td>Restriction enzyme buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA gel extraction kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td>Purify DNA fragments from agarose gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Purification Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104</td>
			<td>DNA clean up</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Miller&#39;s modification</td>
			<td>TEKNOVA</td>
			<td>L8600</td>
			<td>For transformed E. Coli culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Agar Plate</td>
			<td>TEKNOVA</td>
			<td>L1902</td>
			<td>For white/blue selection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep spin miniprep Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27104</td>
			<td>For extraction of plasmide DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EndoFree plasmid maxi prep Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12362</td>
			<td>For extraction of plasmide DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FuGene HD</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E2311</td>
			<td>Transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM reduced serum medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31985-062</td>
			<td>For transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCF10A cell line</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>CRL-10317</td>
			<td>Mammary Epithelial Cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEGM BulletKit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3150</td>
			<td>Mammary Epithelial Growth Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEBM</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3151</td>
			<td>Mammary Epithelial Basal Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEGM SingleQuot Kit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-4136</td>
			<td>Suppliments &#38; Growth Factors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ReagentPack</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-5034</td>
			<td>Reagent for subculture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-PBS (10X)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1408</td>
			<td>Wash cells in culture dishes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Distilled Water</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10977</td>
			<td>Dilute 10X D-PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture dish (35 mm)</td>
			<td>BD/Falcon</td>
			<td>353001</td>
			<td>cell culture dish suitable to LumiCycle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon grease</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>NC9044707</td>
			<td>For sealing dish with recording medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round cover glass</td>
			<td>Harvard Bioscience</td>
			<td>64-1500 (CS-40R)</td>
			<td>For sealing dish with recording medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera toxin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8052</td>
			<td>Supplement for growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G418 sulfate (Geniticin)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10131035</td>
			<td>Antibiotic for selection of stabliy transfected cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9393</td>
			<td>For colony selection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forskolin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F6886</td>
			<td>Synchronization agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Melatonin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M5250</td>
			<td>Synchronization agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4902</td>
			<td>Synchronization agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H1138</td>
			<td>Synchronization agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>d-Luciferin, sodium salt</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L2912</td>
			<td>Luciferase substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IC261</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>10658</td>
			<td>Positive control for circadian disruptor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylnitrosourea (NMU)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N1517</td>
			<td>Mammary specific carcinogen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylselenocysteine (MSC)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M6680</td>
			<td>Organic selenium (chemopreventive agent)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EX527</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E7034</td>
			<td>SIRT1 specific inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cambinol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C0494</td>
			<td>SIRT1 &#38; SIRT2 inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>NanoDrop 8000</td>
			<td>Quantify nucleotide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneAmp PCR System 9700</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>N805-0200</td>
			<td>For molecular biology experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator</td>
			<td>NAPCO</td>
			<td>Series 8000 DH</td>
			<td>For cell culture at 5% CO2 at 37 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desktop centrifuge with refrezerator</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5430R</td>
			<td>For molecular biology experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge with swing bucket</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810 R</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>80124</td>
			<td>Phase contrast optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture hood</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>Class II A2</td>
			<td>BSL-2 certified</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LumiCycle 32</td>
			<td>Actimetrics</td>
			<td>Not Available</td>
			<td>Luminoscence detector</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro bioluminescence assay to characterize circadian rhythm in mammary epithelial cells

Circadian 리듬 동작 자 유전자 발현에서 배열 하는 생물 학적 과정을 조절 하는 기본적인 생리 과정 모든 생물에 존재 이다. 척추 동물, circadian 리듬 (SCN, 중앙 맥 박 조정기) suprachiasmatic 핵 및 가장 주변 조직을 구성 하는 개별 셀 기능 분자 발진기에 의해 제어 됩니다. 더 중요 한 것은, 밤에 빛, 환경 스트레스 또는 유독 하 여 circadian 리듬의 만성 질환과 노화의 위험 증가와 연결 됩니다. 중앙 및 주변 생물 학적 시계를 중단 시킬 수 있는 에이전트와 에이전트 방지 또는 circadian 중단의 효과 완화 수 있는 식별 수 만성 질환의 예방에 중요 한 의미를 갖는다. 설치류 모델 노출 및 유도 또는 circadian 중단 방지/완화 하는 에이전트를 식별 하는 데 수 있습니다, 비록이 실험 동물의 많은 수를 필요 합니다. Vivo에서 연구는 또한 중요 한 자원과 인프라를 요구 하 고 밤새 일 하는 연구원을 필요로. 따라서, 있다 시스템 적절 한 체 외에서 세포 형에 대 한 긴급 한 필요 환경 circadian 분리기 및 강화 셀 형식에 대 한 화면을 다른 기관과 질병 상태에서. 우리는 인간 기간 2 유전자 발기인의 제어에서 진 핵 세포에서 정한 luciferase의 전사를 구동 하는 벡터를 건설 한다. 이 circadian 기자 구조는 안정적으로 인간 유 방 상피 세포로 페 그리고 circadian 응답 기자 세포 생체 외에서 생물 발광 분석 결과 개발 하기 위해 선정 됐다. 여기, 우리는 상세한 프로토콜을 설정 하 고 분석 결과 제시. 우리는 더는 vivo에서 다양 한 화학 물질의 효과 세포 생물 학적 시계에 정리 분석 결과 생체 외에서 우리의 수를 보여주는 개념 실험의 증거에 대 한 세부 정보를 제공 합니다. 결과 분석 결과 다양 한 종류의 세포에 대해 환경 분리기 및 circadian clock의 chemopreventive 강화를 적용할 수 있습니다 나타냅니다.

Circadian 생물 발광 기자 벡터: 인간의 PER2 발기인 기반 표현의 정한 luciferase 변종
941 bp 조각으로 구성 된 DNA 순서: pGL circadian 기자 벡터를 생성 하는 데 사용 하는 인간의 PER2 발기인에서 파생 된 [hPer2P/Luc2P/Neo, 처음 규제 요소 규제 알려진 존재에 대 한 분석 circadian 진 식입니다. 생물 정보학 분석이 보여?...

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In Vitro Bioluminescence Assay to Characterize Circadian Rhythm in Mammary Epithelial Cells

생체 외에서 생물 발광 분석 결과 유 방 상피 세포에서 세포 circadian 리듬을 결정 하기 위해 제공 됩니다. 이 메서드는 기간 2 유전자 발기인의 제어에서 정한 luciferase 표현 하는 포유류 세포 기자 플라스 미드를 활용 합니다. 그것은 다른 세포 유형 circadian 리듬에 기관 특정 효과 평가 하 게 적응 될 수 있다.

생체 외에서 유 방 상피 세포에서 Circadian 리듬 특성 분석 결과 생물 발광

The circadian rhythm is a fundamental physiological process present in all organisms that regulates biological processes ranging from gene expression to ...

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Research

JoVE Journal

Genetics

In Vitro Bioluminescence Assay to Characterize Circadian Rhythm in Mammary Epithelial Cells

9.7K 조회수.  Rutgers University. 생체 외에서 생물 발광 분석 결과 유 방 상피 세포에서 세포 circadian 리듬을 결정 하기 위해 제공 됩니다. 이 메서드는 기간 2 유전자 발기인의 제어에서 정한 luciferase 표현 하는 포유류 세포 기자 플라스 미드를 활용 합니다. 그것은 다른 세포 유형 circadian 리듬에 기관 특정 효과 평가 하 게 적응 될 수 있다.

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Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

Gene deletion plays an important role in the analysis of gene function. One of the most efficient methods to disrupt genes in a targeted manner is the replacement of the entire gene with a selectable marker via homologous recombination. During homologous recombination, exchange of DNA takes place between sequences with high similarity. Therefore, linear genomic sequences flanking a target gene can be used to specifically direct a selectable marker to the desired integration site. Blunt ends of the deletion construct activate the cell&#39;s DNA repair systems and thereby promote integration of the construct either via homologous recombination or by non-homologous-end-joining. In organisms with efficient homologous recombination, the rate of successful gene deletion can reach more than 50% making this strategy a valuable gene disruption system. The smut fungus Ustilago maydis is a eukaryotic model microorganism showing such efficient homologous recombination. Out of its about 6,900 genes, many have been functionally characterized with the help of deletion mutants, and repeated failure of gene replacement attempts points at essential function of the gene. Subsequent characterization of the gene function by tagging with fluorescent markers or mutations of predicted domains also relies on DNA exchange via homologous recombination. Here, we present the U. maydis strain generation strategy in detail using the simplest example, the gene deletion.

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

We describe a robust gene replacement strategy to genetically manipulate the smut fungus Ustilago maydis. This protocol explains how to generate deletion mutants to investigate infection phenotypes. It can be extended to modify genes in any desired way, e.g., by adding a sequence encoding a fluorescent protein tag.

플랜트 병원체의 유전자 조작<em&gt; Ustilago maydis</em&gt; 곰팡이 생물과 식물 미생물 상호 작용을 연구하는

Gene deletion plays an important role in the analysis of gene function. One of the most efficient methods to disrupt genes in a targeted manner is the ...

연구

유전학

Parallel Measurement of Circadian Clock Gene Expression and Hormone Secretion in Human Primary Cell Cultures

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental changes. Considerable progress in our understanding of the tight connection between the circadian clock and most aspects of physiology has been made in the field over the last decade. However, unraveling the molecular basis that underlies the function of the circadian oscillator in humans stays of highest technical challenge. Here, we provide a detailed description of an experimental approach for long-term (2-5 days) bioluminescence recording and outflow medium collection in cultured human primary cells. For this purpose, we have transduced primary cells with a lentiviral luciferase reporter that is under control of a core clock gene promoter, which allows for the parallel assessment of hormone secretion and circadian bioluminescence. Furthermore, we describe the conditions for disrupting the circadian clock in primary human cells by transfecting siRNA targeting CLOCK. Our results on the circadian regulation of insulin secretion by human pancreatic islets, and myokine secretion by human skeletal muscle cells, are presented here to illustrate the application of this methodology. These settings can be used to study the molecular makeup of human peripheral clocks and to analyze their functional impact on primary cells under physiological or pathophysiological conditions.

Here, we describe settings to monitor in parallel circadian bioluminescence and the secretory activity of human islet cells and primary myotubes. For this, we employed lentiviral gene delivery of a luciferase core clock reporter, followed by in vitro synchronization and collection of outflow medium by continuous cell perifusion.

인간의 기본 세포 배양의 일주기 시계 유전자 발현 및 호르몬 분비의 병렬 측정

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental ...

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most mutagenesis-based screens, researchers have relied on the use of toxic chemicals, carcinogens, or irradiation, which requires designated equipment, safety setup, and/or disposal of hazardous materials. We have developed a simple approach to induce heritable mutations in C. elegans using germline-expressed histone-miniSOG, a light-inducible potent generator of reactive oxygen species. This mutagenesis method is free of toxic chemicals and requires minimal laboratory safety and waste management. The induced DNA modifications include single-nucleotide changes and small deletions, and complement those caused by classical chemical mutagenesis. This methodology can also be used to induce integration of extrachromosomal transgenes. Here, we provide the details of the LED setup and protocols for standard mutagenesis and transgene integration.

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Genetically-encoded histone-miniSOG induces genome-wide heritable mutations in a blue&#160;light-dependent manner. This mutagenesis method is simple, fast, free of toxic chemicals, and well-suited for forward genetic screening and transgene integration.

히스톤 - miniSOG에서 사용 Optogenetic 무작위 돌연변이 유발<em&gt; C. 엘레</em

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most ...

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative without tools to study gene function. The development and sharing of detailed protocols for the establishment of new model systems in laboratories, and for tools to carry out functional studies, is thus crucial for leveraging the power of genomics. Coleoptera (beetles) are the largest clade of insects and occupy virtually all types of habitats on the planet. In addition to providing ideal models for fundamental research, studies of beetles can have impacts on pest control as they are often pests of households, agriculture, and food industries. Detailed protocols for rearing and maintenance of D. maculatus laboratory colonies and for carrying out dsRNA-mediated interference in D. maculatus are presented. Both embryonic and parental RNAi procedures-including apparatus set up, preparation, injection, and post-injection recovery-are described. Methods are also presented for analyzing embryonic phenotypes, including viability, patterning defects in hatched larvae, and cuticle preparations for unhatched larvae. These assays, together with in situ hybridization and immunostaining for molecular markers, make D. maculatus an accessible model system for basic and applied research. They further provide useful information for establishing procedures in other emerging insect model systems.

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Here, we present protocols for rearing an intermediate-germ beetle, Dermestes maculatus (D. maculatus) in the lab. We also share protocols for embryonic and parental RNAi and methods for analyzing embryonic phenotypes to study gene function in this species.

양육 및 숨기기 비틀에 RNA 매개 유전자 최저를 두 번 좌초,<em&gt; Dermestes maculatus</em

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative ...

CRISPR-Mediated Reorganization of Chromatin Loop Structure

Recent studies have clearly shown that long-range, three-dimensional chromatin looping interactions play a significant role in the regulation of gene expression, but whether looping is responsible for or a result of alterations in gene expression is still unknown. Until recently, how chromatin looping affects the regulation of gene activity and cellular function has been relatively ambiguous, and limitations in existing methods to manipulate these structures prevented in-depth exploration of these interactions. To resolve this uncertainty, we engineered a method for selective and reversible chromatin loop re-organization using CRISPR-dCas9 (CLOuD9). The dynamism of the CLOuD9 system has been demonstrated by successful localization of CLOuD9 constructs to target genomic loci to modulate local chromatin conformation. Importantly, the ability to reverse the induced contact and restore the endogenous chromatin conformation has also been confirmed. Modulation of gene expression with this method establishes the capacity to regulate cellular gene expression and underscores the great potential for applications of this technology in creating stable de novo chromatin loops that markedly affect gene expression in the contexts of cancer and development.

Chromatin looping plays a significant role in gene regulation; however, there have been no technological advances that allow for selective and reversible modification of chromatin loops. Here we describe a powerful system for chromatin loop re-organization using CRISPR-dCas9 (CLOuD9), demonstrated to selectively and reversibly modulate gene expression at targeted loci.

Recent studies have clearly shown that long-range, three-dimensional chromatin looping interactions play a significant role in the regulation of gene ...

Using In Vitro and In-cell SHAPE to Investigate Small Molecule Induced Pre-mRNA Structural Changes

In the process of drug development of RNA-targeting small molecules, elucidating the structural changes upon their interactions with target RNA sequences is desired. We herein provide a detailed in vitro and in-cell selective 2&#39;-hydroxyl acylation analyzed by primer extension (SHAPE) protocol to study the RNA structural change in the presence of an experimental drug for spinal muscular atrophy (SMA), survival of motor neuron (SMN)-C2, and in exon 7 of the pre-mRNA of the SMN2 gene. In in vitro SHAPE, an RNA sequence of 140 nucleotides containing SMN2 exon 7 is transcribed by T7 RNA polymerase, folded in the presence of SMN-C2, and subsequently modified by a mild 2&#39;-OH acylation reagent, 2-methylnicotinic acid imidazolide (NAI). This 2&#39;-OH-NAI adduct is further probed by a 32P-labeled primer extension and resolved by polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE). Conversely, 2&#39;-OH acylation in in-cell SHAPE takes place in situ with SMN-C2 bound cellular RNA in living cells. The pre-mRNA sequence of exon 7 in the SMN2 gene, along with SHAPE-induced mutations in the primer extension, was then amplified by PCR and subject to next-generation sequencing. Comparing the two methodologies, in vitro SHAPE is a more cost-effective method and does not require computational power to visualize results. However, the in vitro SHAPE-derived RNA model sometimes deviates from the secondary structure in a cellular context, likely due to the loss of all interactions with RNA-binding proteins. In-cell SHAPE does not need a radioactive material workplace and yields a more accurate RNA secondary structure in the cellular context. Furthermore, in-cell SHAPE is usually applicable for a larger range of RNA sequences (~1,000 nucleotides) by utilizing next-generation sequencing, compared to in vitro SHAPE (~200 nucleotides) that usually relies on PAGE analysis. In case of exon 7 in SMN2 pre-mRNA, the in vitro and in-cell SHAPE derived RNA models are similar to each other.

Detailed protocols for both in vitro and in-cell selective 2&#39;-hydroxyl acylation analyzed by primer extension (SHAPE) experiments to determine the secondary structure of pre-mRNA sequences of interest in the presence of an RNA-targeting small molecule are presented in this article.

작은 분자 조사를 시험관 및 셀 모양을 사용 하 여 사전 mRNA 구조 변화 유도

In the process of drug development of RNA-targeting small molecules, elucidating the structural changes upon their interactions with target RNA sequences ...

Characterizing Histone Post-translational Modification Alterations in Yeast Neurodegenerative Proteinopathy Models

Neurodegenerative diseases, such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and Parkinson&#39;s disease (PD), cause the loss of hundreds of thousands of lives each year. Effective treatment options able to halt disease progression are lacking. Despite the extensive sequencing efforts in large patient populations, the majority of ALS and PD cases remain unexplained by genetic mutations alone. Epigenetics mechanisms, such as the post-translational modification of histone proteins, may be involved in neurodegenerative disease etiology and progression and lead to new targets for pharmaceutical intervention. Mammalian in vivo and in vitro models of ALS and PD are costly and often require prolonged and laborious experimental protocols. Here, we outline a practical, fast, and cost-effective approach to determining genome-wide alterations in histone modification levels using Saccharomyces cerevisiae as a model system. This protocol allows for comprehensive investigations into epigenetic changes connected to neurodegenerative proteinopathies that corroborate previous findings in different model systems while significantly expanding our knowledge of the neurodegenerative disease epigenome.

This protocol outlines experimental procedures to characterize genome-wide changes in the levels of histone post-translational modifications (PTM) occurring in connection with the overexpression of proteins associated with ALS and Parkinson&#39;s disease in Saccharomyces cerevisiae models. After SDS-PAGE separation, individual histone PTM levels are detected with modification-specific antibodies via Western blotting.

효 모 신경 Proteinopathy 모델에서 특성화 히스톤 포스트 번역 상 수정 변경

Neurodegenerative diseases, such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and Parkinson&#39;s disease (PD), cause the loss of hundreds of thousands of lives ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay Using Micrococcal Nucleases in Mammalian Cells

To express cellular phenotypes in organisms, living cells execute gene expression accordingly, and transcriptional programs play a central role in gene expression. The cellular transcriptional machinery and its chromatin modification proteins coordinate to regulate transcription. To analyze transcriptional regulation at the molecular level, several experimental methods such as electrophoretic mobility shift, transient reporter and chromatin immunoprecipitation (ChIP) assays are available. We describe a modified ChIP assay in detail in this article because of its advantages in directly showing histone modifications and the interactions between proteins and DNA in cells. One of the key steps in a successful ChIP assay is chromatin shearing. Although sonication is commonly used for shearing chromatin, it is difficult to identify reproducible conditions. Instead of shearing chromatin by sonication, we utilized enzymatic digestion with micrococcal nuclease (MNase) to obtain more reproducible results. In this article, we provide a straightforward ChIP assay protocol using MNase.

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool for understanding the molecular mechanisms of gene regulation. However, the method involves difficulties in obtaining reproducible chromatin fragmentation by mechanical shearing. Here, we provide an improved protocol for a ChIP assay using enzymatic digestion.

포유류 세포에서 미세 Coccal 뉴클레아제사용 염색질 면역침전 분석

To express cellular phenotypes in organisms, living cells execute gene expression accordingly, and transcriptional programs play a central role in gene ...

An In Vitro Protocol for Evaluating MicroRNA Levels, Functions, and Associated Target Genes in Tumor Cells

MicroRNAs (miRNAs) are small regulatory RNAs which are recognized to modulate numerous intracellular signaling pathways in several diseases including cancers. These small regulatory RNAs mainly interact with the 3&#8217; untranslated regions (3&#8217; UTR) of their target messenger RNAs (mRNAs) ultimately resulting in the inhibition of decoding processes of mRNAs and the augmentation of target mRNA degradations. Based on the expression levels and intracellular functions, miRNAs are able to serve as regulatory factors of oncogenic and tumor-suppressive mRNAs. Identification of bona fide target genes of a miRNA among hundreds or even thousands of computationally predicted targets is a crucial step to discern the roles and basic molecular mechanisms of a miRNA of interest. Various miRNA target prediction programs are available to search possible miRNA-mRNA interactions. However, the most challenging question is how to validate direct target genes of a miRNA of interest. This protocol describes a reproducible strategy of key methods on how to identify miRNA targets related to the function of a miRNA. This protocol presents a practical guide on step-by-step procedures to uncover miRNA levels, functions, and related target mRNAs using the probe-based real-time polymerase chain reaction (PCR), sulforhodamine B (SRB) assay following a miRNA mimic transfection, dose-response curve generation, and luciferase assay along with the cloning of 3&#8217; UTR of a gene, which is necessary for proper understanding of the roles of individual miRNAs.

This protocol uses a probe-based real-time polymerase chain reaction (PCR), a sulforhodamine B (SRB) assay, 3&#8217; untranslated regions (3&#8217; UTR) cloning, and a luciferase assay to verify the target genes of a miRNA of interest and to understand the functions of miRNAs.

종양 세포에서 MicroRNA 수준, 기능 및 관련 표적 유전자를 평가하기 위한 시험관 내 프로토콜

MicroRNAs (miRNAs) are small regulatory RNAs which are recognized to modulate numerous intracellular signaling pathways in several diseases including ...

The Use of Mouse Mammary Tumor Cells in an In Vitro Invasion Assay as a Measure of Oncogenic Cell Behavior

The in vitro invasion assay uses a protein-rich matrix in a Boyden chamber to measure the ability of cultured cells to pass through the matrix and a porous membrane in a process analogous to the initial steps of cancer cell metastasis. The tested cells can be altered for the gene expression or treated with inhibitors to test for changes in the invasion potential. This experiment tests the aggressive phenotype of the mouse mammary tumor cells to discover and characterize the potential oncogenes that promote cell invasion. This technique, however, can be versatile and adapted to many different applications. The experiment itself can be done in one day and the results are acquired by light microscopy in less than a day. The results include counts of the number of invading cells for comparison and analysis. The in vitro invasion assay is a rapid, inexpensive, and clear-cut method for determining cell behavior in a culture that can be used as an initial assessment before more involved in vivo assays.

The in vitro cell invasion assay is used to measure the potential of cancer metastasis by quantifying the cellular potential for invasion and migration using cell culture inserts containing protein matrix. Cells are challenged to migrate through the protein matrix and a porous membrane, towards a chemoattractant, and then quantified by light microscopy.

종양 발생 세포 행동의 척도로 시험관 내 침략 분석에서 마우스 유방 종양 세포의 사용

The in vitro invasion assay uses a protein-rich matrix in a Boyden chamber to measure the ability of cultured cells to pass through the matrix and a ...

생체 외에서 유 방 상피 세포에서 Circadian 리듬 특성 분석 결과 생물 발광

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