이 프로토콜에 제공된 세부 사항은 종종 기술적으로 어려운 인간의 피부 동등한 생성을 다룹니다. 새로운 인간 피부 동등한 프로토콜 요소, 예컨대 혈관 및 체적 이미징이 포함됩니다. 이 기술은 질병, 노화 및 개인화 된 의학 연구를위한 생체 내 조직과 보다 밀접하게 일치하는 피부 모델의 간단한 구성을 가능하게합니다.
이 프로토콜의 가장 어려운 부분은 침수와 공기 액체 인터페이스 사이의 전환입니다. 일관된 결과를 위해 타이밍과 미디어 수준을 최적화하는 데는 몇 가지 시험이 필요할 것입니다. 시작하려면, 차가운 덮인 튜브에 516 마이크로 리터의 마이크로 리터를 추가하고 즉시 1000 마이크로 리터 양성 변위 파이펫을 사용하여 차가운 콜라겐의 375 마이크로 리터를 추가합니다.
빈 파이펫 팁을 제거하고 준비된 250 마이크로리터 양성 변위 파이펫으로 전환하여 혼합합니다. 빠르게 혼합하지만, 부드럽게 과도한 거품 형성을 방지합니다. 용액에 팁을 유지, 용액이 동질 색상의 때까지 튜브의 다른 위치에서 균일하게 혼합, 이는 일반적으로 약 5 파이펫 주기 또는 10 초 소요.
즉시 12웰 배양 삽입물의 막에 세포 콜라겐 125 마이크로리터를 분산시킵니다. 균일한 커버리지를 보장하기 위해 플레이트를 기울이고 파이펫 팁을 사용하여 콜라겐을 부드럽게 퍼뜨리면 멤브레인을 페인트합니다. 즉시 12웰 플레이트를 섭씨 37도 세포 배양 인큐베이터로 이동하여 적어도 20 분 동안 젤을 할 수 있게합니다.
겔화 기간 후, 인큐베이터에서 세포 콜라겐의 12웰 플레이트를 가져 가라. 젖은 얼음에서 1.7 밀리리터 캡튜브를 제거한 다음, 냉장에서 스톡 콜라겐을 제거하고 뚜껑을 열고 젖은 얼음 위에 놓습니다. 냉각된 셀 서스펜션 516마이크로리터를 차가운 덮인 튜브에 추가합니다.
1000 마이크로리터 파이펫을 사용하여 차가운 콜라겐 용액 375 마이크로리터를 캡튜브 내부의 용액에 직접 피펫합니다. 파이펫에서 모든 콜라겐을 튜브로 추방하고 양수 변위 파이펫 팁을 폐기하십시오. 즉시 250 마이크로리터 파이펫으로 전환하고 콜라겐 용액을 혼합한 후 세포 콜라겐 용액 250마이크로리터를 세포콜라겐 지지체에 12웰 배양 인서트의 세포 콜라겐 지지체로 옮은 다음 12웰 플레이트를 섭씨 37도의 세포 배양 배양 배양으로 옮기다.
젤 타임 30분 후, 접시를 부드럽게 기울여 겔화를 평가하고 콜라겐이 고화되었는지 확인합니다. 각각 500 마이크로리터와 1000 마이크로리터의 블렌드 미디어를 인서드의 상부 챔버 및 하부 챔버에 추가합니다. 콜라겐 젤이 침수되어 필요한 경우 더 많은 미디어를 추가하십시오.
하룻밤 배양에 대 한 세포 배양 인큐베이터에 웰 플레이트를 배치 합니다. 7일째에 수동 파이펫을 사용하여 각 구조의 하단 및 상단 챔버에서 미디어를 수집하고 폐기합니다. 투과성 멤브레인 바로 아래에 붙어 있는 미디어를 수집하려면 파이펫 팁을 멤브레인 아래에 놓고 삽입물을 일시적으로 제자리에 두드립니다.
각 웰의 하부 챔버에 5%FPS로 보충된 인간 피부 등가 또는 HSE 매체의 1밀리리터를 각 우물의 상부 챔버에 200 마이크로리터를 첨가한다. 각질 을 진피 구조 표면에 직접 시드하고 인큐베이터에서 2 시간 동안 정착 할 수 있습니다. 각질 세포를 파종한 지 2시간 후, HSE 매체의 마이크로리터 300개를 조심스럽게 추가하여 각 구조의 상단 챔버에 5%FPS를 잘 보충합니다.
미디어를 로드한 후 컨스트럭처를 인큐베이터에 다시 배치합니다. 수동 파이펫을 사용하여 상부 챔버에서만 미디어 낭비를 제거하여 각 구조를 공기 액체 인터페이스 또는 ALI로 들어올립니다. 표피 층을 만지거나 손상시키지 않고 가능한 한 피피 레이어에 가깝게 지내려고 합니다.
접시를 다른 각도로 약간 기울여 미디어를 수집한 다음, 일관된 습도를 유지하기 위해 접시의 주변 우물에 약 2밀리리터의 멸균물을 넣습니다. 몇 시간 후에 각질 세포가 ALI에 남아 있는지 확인하십시오. 상부 챔버의 미디어를 제거하여 각 우물에서 제거되는 미디어의 양을 추적합니다.
표피 층은 건조하지 않고 수분을 공급받아야 하지만 구성 위에 미디어가 풀려져서는 안 됩니다. 면역형염색물 염색을 위한 구조물을 준비하려면 인서트를 거꾸로 뒤집어 웰 플레이트 위에 놓습니다. 미세 팁 집게 또는 정밀 나이프를 사용하여 멤브레인 의 둘레의 약 절반을 자르는 동안 한 손으로 인서트를 안정화하십시오.
가능한 한 플라스틱 하우징에 가깝게 잘라. 미세 팁 집게를 사용하여 절단 멤브레인 플랩의 가장자리를 잡고 VHSE 구조뿐만 아니라 인서트에서 다공성 멤브레인을 부드럽게 벗깁니다. 구성이 챔버의 측면에 붙어있는 경우, 우물로 이동 미세 팁 집게 또는 작은 스쿠쿨을 사용합니다.
VHSE가 잘 되면, 삽입 막의 남은 조각을 버리고 배양 삽입 하우징을 각 우물에 보관하여 염색 중에 잠수된 위치에 VHSEs를 고정하십시오. 이미징 하기 이틀 전에 폴리디메틸실록산 또는 PDMS를 준비하십시오. 깨끗한 믹싱 용기는 계량 저울에 놓고 스케일을 세레합니다.
베이스를 추가한 다음 크로스링커를 추가합니다. 용액을 4분 이상 격렬하게 저어작은 거품을 만듭니다. 충분한 혼합 후, 90 또는 100밀리미터 페트리 접시에 PDMS를 붓습니다.
모든 기포가 사라지고 PDMS가 명확해질 때까지 진공 챔버에서 PDMS를 제거합니다. 진공을 천천히 풀어 PDMS를 제거합니다. 오븐에 접시를 넣고 하룻밤 동안 50~60°C까지 치료하여 PDMS가 균등하게 치료할 수 있도록 평평하게 앉아 있습니다.
이미징 을 하루 전에 강철 펀치 또는 핸드헬드 정밀 나이프를 사용하여 VHSE 구조와 동일한 크기로 PDMS 시트에서 원형을 잘 펀치하거나 잘라냅니다. 원형 주위에 사각형 패치를 잘 잘라 하나의 PDMS를 잘 만듭니다. PDMS와 유사한 크기의 유리 커버 슬립을 사용하면 PDMS의 하단 표면에 시아노아크라이레이트 접착제를 추가하고 일회용 파이펫 팁으로 고르게 얼룩을 추가합니다.
유리를 중앙에 대고 펀치 원 안에 투명한 유리 창을 남기면서 PDMS에 잘 누릅니다. 사용하기 전에 접착제가 밤새 건조하게하십시오. 표피와 진피의 특성화는 VHSE 구조에서 인간의 피부에 적합한 면역 형광 마커를 보여줍니다.
사이토케라틴(10)은 피부 등가물에서 모든 초라바살 층을 일반적으로 표시하는 초기 분화 각질 세포 마커이다. Involucrin및 filaggrin은 각질 세포에 있는 늦은 분화 마커이고 피부 등가물에서 상부 최상층 표시합니다. VHSE를 지우면 한 설정에서 간단한 이미징을 허용하고 진피와 표피를 별도로 이미지화하기 위해 구조방향을 조정할 필요성을 제거했습니다.
볼륨 이미지를 통해 각 구문 전체에 걸쳐 혈관을 매핑하는 3D 렌더링을 생성할 수 있습니다. 이미지 스택은 계산 소프트웨어에 로드되었고 사용자 지정 알고리즘은 3D 렌더링 및 정량화에 사용되었습니다. 골격화는 각 콜라겐 IV 표시 용기의 최종 중심을 결정하고 결과 데이터는 혈관 분획뿐만 아니라 혈관 직경을 계산하는 데 사용되었다.
이 절차에 따라, 장벽 분석, 주사 전자 현미경 검사, 지질 프로파일 및 기타와 같은 특성화 방법은 혈관이 표피 성숙과 안정성에 특히 미치는 영향을 이해하기 위해 수행 될 수있다. 이 프로토콜은 혈관 피부 모델에서 조직 관련 및 세포 유형 별 연구를 가능하게 합니다. 그것은 노화와 개인화 된 의학에 있는 연구에 특히 적합합니다.
