친절 하 게 우리는 세포 배양에 대 한 씨 차오 팡 감사합니다. 이 작품은 중국 (보조금 번호 81570403, 81371284);의 자연 과학 재단에서에서 교부 금에 의해 지원 되었다 안후이 성 자연 과학 재단 (보조금 번호 1408085MH158); 안후이 의과대학;의 뛰어난 젊은 수 사관 안후이 성의 대학에 우수한 젊은 인재에 대 한 프로그램을 지원합니다.

1. 세포 배양과 Transfection
<ol><li>
세포 배양 참고: HN4, HNSCC 셀 라인, HNSCC14를 가진 환자에서 파생 되었다.<ol>
<li>Dulbecco의 문화 HN4 셀이 글 중간 (DMEM, 4.5 g/L 포도 당) 10% 태아 둔감 한 혈 청 및 항생제 (100 U/mL 페니실린과 100 µ g/mL 스) 보완 수정. 셀 5% CO2와 37 ° C에서 품 어.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
세포 transfection
	<ol>
<li>Transfection, 전에 1 일 플레이트 5 x 105 셀 2 mL/6 잘 플레이트에 항생제 없이 문화 매체의.</li>
		<li>부드럽게 100 pmol CLIC4 siRNA 또는 감소 된 혈 청 미디어의 250 µ L에 스크램블 된 SiRNA를 희석. 감소 된 혈 청 미디어의 250 µ L에 5 µ L liposome 시 약을 희석 하 고 5 분 결합 희석된 liposome 시 약으로 희석된 siRNA에 품 어, 부드럽게, 혼합 실 온에서 20 분 동안 품 어.</li>
		<li>각 잘 셀 및 매체를 포함 하는 혼합물을 추가 합니다. 뒤로-및-앞뒤 판 락으로 부드럽게 혼합. 다음 Rh123 라벨링 절차를 진행 하기 전에 24 h에 대 한 CO2 배양 기에서 37 ° C에서 세포를 품 어. Transfection 후 정상적인 성장 매체 4 h와 매체를 교체 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Rh123 라벨
참고: Rh123 HN4 셀1MMP를 측정 하기 위하여 이용 되었다.
<ol><li>CLIC4 siRNA 치료 (제 1), 후 HN4 셀 6 잘 플레이트를 사용 하 여 다음과 같은 치료에 대 한. 각 HN4 셀의 양을 잘 coverslips에 10 번 실험을 반복에 충분 하다.</li>
	<li>새로운 12-잘 접시의 하단에 원형 coverslips를 넣어 핀셋을 사용 합니다. 격판덮개의 수는 실험 설계 (그림 1A)에 따라 설정 됩니다.</li>
	<li>12-잘 접시 안에 모든 coverslip의 중간에 100 µ g/mL polylysine의 150 µ L를 넣고 2 분 넣지는 coverslips 외부 polylysine에 주의 기 다. 다음 pipettor 여 polylysine를 철저 하 게 제거 (그림 1B).</li>
	<li>접시 안에 HN4 세포의 문화 매체를 제거 하 고 세포 분리를 1 mL 0.25 %trypsin 추가. 6 분 후 중화는 트립 신 2 mL 문화 매체를 추가 합니다. 부드럽게 믹스 pipettor에 의해 HN4 셀 5 번 및 씨앗 2-6 х 104 셀 원형 coverslips에. 5% CO2 (그림 1C) 37 ° C에는 인큐베이터에 배치 합니다.</li>
	<li>8 h 부 화 후 37 ° c.에 40 분 동안 2 µ / l Rh123 HN4 셀을 품 어 부드럽게 혼합 매체 (그림 1D)에 Rh123의 동등한 배급을 보장 하기 위해 중간 위아래 여러 번.</li>
	<li>준비 하는 충분 한 정상 생리 염 분 해결책 (NPSS); 만들려고 NPSS (mmol/L): 140 NaCl, 5 KCl, 1 MgCl2, 1 CaCl2, 10 포도 당, 및 5 HEPES, pH 7.4). 물 욕조에 37 ° C로 예 열.</li>
	<li>핀셋을 사용 하 여 제거 하는 coverslips 고 나머지 세척 간단 preheated NPBS 버퍼 (그림 1E)에 coverslips를 배치를 통해 액체.</li>
	<li>500 µ L 스테인레스 스틸 챔버의 하단에는 coverslips를 배치 ( 재료의 표참조) 교체 25 m m 유리 coverslip 바닥 o-ring에 의해 장소에서 봉인. (그림 1E) 약 실의 뚜껑을 강화 하 여 그것을 해결.</li>
	<li>450 µ L NPSS 버퍼 조립된 챔버에 preheated confocal 레이저 스캐닝 형광 현미경 (그림 1E) 형광 현미경의 시야에서 목욕을 넣어 추가 합니다.</li>
</ol>3입니다.는 MMP의 탐지
<ol><li>
일반적인 형광 현미경
	<ol>
<li>제조업체의 지침에 따라 형광 현미경을 켭니다. 참고: 일반적인 형광 현미경 수은 램프 fiberoptic 광원, FITC 필터 Rh123에 대 한 설정으로 달성 되었다 (480/40 여기 필터, 505 LP dichroic 거울 및 535/40 방출 필터) 실내 온도에. 20 X 목표 수행 라이브 셀 이미징에 사용 되었다.</li>
		<li>이미징 시스템 소프트웨어를 열고 (그림 2A) 새로운 실험을 시작 하려면 명령 모음에서 "새로 만들기" 버튼을 선택 합니다.</li>
		<li>시야와 하얀 빛에 셀의 위치를 찾는 데 초점을 조정 합니다.</li>
		<li>하얀 빛을 버튼을 빛을 끄고. 명령 모음에서 "초점" 버튼을 클릭 하 고 "시작 초점" 형광에 스위치를 선택 합니다. 507 nm 여기와 529 nm 긴 패스 방출 현미경을 통해 다시 셀의 위치를 찾아 파장 (실험 하기 전에 설정). (그림 2B) 필요한 경우 다시 시야 및 초점 조정 합니다.</li>
		<li>만 20 ~ 30 분리 HN4 셀을 포함 하는 visual 필드를 선택 합니다. 각 셀에 대 한 세포내 형광 신호 변화는 정확 하 게 기록 됩니다.</li>
		<li>일단 명확한 시야 달성 클릭 "닫기 초점" 초점 바에서. 한 세트의 이미지를 얻으려고 명령 모음에서 "취득 한"을 클릭 합니다. 명령 모음에서 "지역"을 클릭 하 고 측정 영역을 편집 하 고 "확인" 버튼을 클릭 합니다. 참고: 편집 영역 바에서 다른 지역 모양 연구에 따라 사용할 수 있습니다.</li>
		<li>개별 셀의 다른 모양에 맞게 "추적 영역" 도구와 동그라미 하나의 단일 셀의 영역 선택한 끝나면 두 번 클릭 합니다. 모든 셀 때까지 절차 동그라미 (그림 2C)를 반복 합니다. "완료"를 클릭 하 고 저장 된 위치를 찾으려면 "이미지 저장"을 선택 합니다.</li>
		<li>클릭 "Zeroclock"그리고 신속 하 게 형광 강도의 변화를 모니터링을 시작 하려면 f 4를 밀어. 레코드는 실시간 변경 형광 강도의 모든 5 번 5 분 (그림 2D)에 대 한 s.</li>
		<li>때 초기 안정 되 고, 추가 50 µ L NPSS pipettor 통해 상공 100 mmol/L ATP의 0.5 µ L와 혼합. 시야 (그림 2E)를 제거 하지 않으려면 챔버를 만지지를 기억 하십시오. 참고: 20 분 기록 됩니다 형광 이미지 하 고 실험 수동 작업을 통해 고용할 수 있습니다. 시간 기간 정기적으로 전체를 관찰 하기 위해 20 분에 대 한 정착 형광 변화. 그러나, 예기치 않은 요인 때 전체 과정은 20 분 미만 또는 곡선의 안정성에 영향을 미칠 때 캡처를 중지 하려면 수동 작업이 적용 됩니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Confocal 레이저 스캐닝 형광 현미경
	<ol>
<li>공초점 레이저 형광 현미경 제조업체의 지침에 따라 스캔 켜고 번들된 소프트웨어를 엽니다. 참고: 여기, Rh123 488에서 설정 하는 아르곤 레이저에 의해 흥분 했다 및 내보낸된 신호 TD488/543/633 필터의 응용을 통해 545-700 nm의 범위에서 기록 되었다.</li>
		<li>63 X를 선택 하 고 "취득" 메뉴에서 "목표"를 클릭 / 1.4 렌즈 없음 오일. 표본을 관찰 하 고 가벼운 분야에서 명확한 시야를 찾을.</li>
		<li>형광 모드로 전환 하 여 현미경을 통해 어둠에서 셀의 위치를 찾을 올바른 형광 필터 선택 "TL/IL" 버튼을 눌러. "셔터" 표본 관찰이 끝나면 보호를 밀어.</li>
		<li>"취득" 메뉴에서 적합 한 PMT 채널 조정 하 고 "달성" 정착된 광학 경로 (그림 3A) 활성화를 클릭 합니다. "구성" 메뉴에서 클릭 하 고 필요한 레이저 종류를 확인 하려면 "레이저"를 선택 하십시오. "아르곤" (그림 3B)이이 프로토콜에 대 한 것이 좋습니다.</li>
		<li>"라이브" 실시간 이미지 고 시야만 20 ~ 30 분리 HN4 셀이 들어 있는지 확인을 클릭 합니다. 각 셀에 대 한 세포내 형광 신호 변화는 정확 하 게 기록 됩니다.</li>
		<li>(그림 3C) "취득" 메뉴에서 "인수" 하위 메뉴에 획득 모드에서 "xyt"를 선택 합니다. 설정 5 s와 20 분 시간 간격 및 기간, 각각. 클릭"적용" 모든 매개 변수는 침전 하는 때.</li>
		<li>"계량" 메뉴 아래 "폴리라인 그리기" 도구 사용 하 여 각 셀의 기록 영역을 원형. "선 프로 파일"을 선택 하 고 "시작" 관찰을 선택 합니다. 5 분 (그림 3D-E)에 대 한 형광 강도의 실시간 변화를 기록 합니다.</li>
		<li>때 초기 안정 되 고, 추가 50 µ L NPSS pipettor 통해 상공 100 mmol/L ATP의 0.5 µ L와 혼합. 시야를 제거 하지 않으려면 챔버를 만지지를 기억 하십시오. 참고: 형광 이미지 20 분 기록 됩니다 및 실험의 완료 다음.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 통계 분석
<ol><li>
일반적인 형광 현미경
	<ol>
<li>연산자의 설명서에 따라 정기적으로 형광 현미경을 켭니다. 이미징 시스템 소프트웨어 열고 저장 된 실험을 열려면 명령 모음에서 "열기" 버튼을 선택 합니다. ' 명령 모음 '에서 "지역"을 클릭 하 고 측정 영역을 편집 하려면 "확인" 버튼을 클릭 합니다.</li>
		<li>"추적 영역" 도구 선택 및 동그라미 하나의 단일 셀의 영역을 더블 클릭 할 때. 절차를 반복 하 여 모든 셀 원이 되었습니다. "완료"를 클릭 하 고 선택 합니다 "F4: 앞으로"를 형광 강도 보여주는 추적 버튼.</li>
		<li>완료 되 면, 그래프의 오른쪽 아래 모서리에 있는 아래쪽 화살표 단추를 클릭 하 고 "그래프 데이터 표시" (그림 2F)을 클릭 합니다. "확인"을 두 번 클릭 하 고 데이터 처리 소프트웨어의 인터페이스를 열고 "로그 데이터" 버튼을 선택 합니다. "로그 데이터"를 다시 클릭 하 고 실시간으로 변동 형광 강도의 레코드가 스프레드시트에 찾을. 참고: 각 셀에 대 한 MMP에 변화 ATP 또는 TG (F1/F0)의 응용 프로그램 전에 강도 기준으로 형광의 비로 표시 했다. 형광 강도 데이터 각 20-30 셀의 평균 했다. Rh123에 대 한 데이터는 평균 ± SE. 결과 2 그룹에서 양측 독립 t 검정 및 P 값에 의해 테스트로 제시 < 0.05 통계적 의미도 고려 되었다. 통계 분석 소프트웨어는이 실험에서 통계 분석을 적용 했다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Confocal 레이저 스캐닝 형광 현미경
	<ol>
<li>공초점 레이저 현미경 켜고 제조업체의 지침에 따라 번들된 소프트웨어에 로그인.</li>
		<li>"화재" 기록 된 실험을 열을 선택 합니다.</li>
		<li>"계량" 메뉴 아래 "스택 프로 파일" 도구를 선택, 선택 "모두 하나" "채널 및 ROIs 정렬 차트."에서</li>
		<li>원 셀 영역 "무승부 다각형" 도구를 사용 하 여 관찰에 대 한.</li>
		<li>"그래프" 메뉴를 선택 마우스 오른쪽 버튼을 클릭 하 고 "excel로 내보내기" 선택 스프레드시트 형광 강도의 값을 추가 하려면. 다음과 같은 분석은 일반 형광 현미경 (그림 3F) 일치 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Chen, J., Liao, W., Gao, W., Huang, J., Gao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intermittent+hypoxia+protects+cerebral+mitochondrial+function+from+calcium+overload.">Intermittent hypoxia protects cerebral mitochondrial function from calcium overload.</a> Acta Neurol Belg. 113, 507-513 (2013).</li><li>Gogol, P., Trzci&#324;ska, M., Bry&#322;a, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motility,+mitochondrial+membrane+potential+and+ATP+content+of+rabbit+spermatozoa+stored+in+extender+supplemented+with+GnRH+analogue+[des-Gly10,+D-Ala6]-LH-RH+ethylamide.">Motility, mitochondrial membrane potential and ATP content of rabbit spermatozoa stored in extender supplemented with GnRH analogue [des-Gly10, D-Ala6]-LH-RH ethylamide.</a> Pol J Vet Sci. 17, (2014).</li><li>Machiels, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+the+management+of+squamous+cell+carcinoma+of+the+head+and+neck.">Advances in the management of squamous cell carcinoma of the head and neck.</a> F1000Prime Rep. 6, 44 (2014).</li><li>Behera, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concurrent+therapy+with+taxane+versus+non-taxane+containing+regimens+in+locally+advanced+squamous+cell+carcinomas+of+the+head+and+neck+(SCCHN):+a+systematic+review.">Concurrent therapy with taxane versus non-taxane containing regimens in locally advanced squamous cell carcinomas of the head and neck (SCCHN): a systematic review.</a> Oral Oncol. 50, 888-894 (2014).</li><li>Pancari, P., Mehra, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+therapy+for+squamous+cell+carcinoma+of+the+head+and+neck.">Systemic therapy for squamous cell carcinoma of the head and neck.</a> Surgical Oncology Clinics of North America. 24, 437-454 (2015).</li><li>Peretti, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chloride+channels+in+cancer:+Focus+on+chloride+intracellular+channel+1+and+4+(CLIC1+AND+CLIC4)+proteins+in+tumor+development+and+as+novel+therapeutic+targets.">Chloride channels in cancer: Focus on chloride intracellular channel 1 and 4 (CLIC1 AND CLIC4) proteins in tumor development and as novel therapeutic targets.</a> Biochim Biophys Acta. 1848, 2523-2531 (2015).</li><li>Jentsch, T. J., Stein, V., Weinreich, F., Zdebik, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+structure+and+physiological+function+of+chloride+channels.">Molecular structure and physiological function of chloride channels.</a> Physiol Rev. 82, 503-568 (2002).</li><li>Ponnalagu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Data+supporting+characterization+of+CLIC1,+CLIC4,+CLIC5+and+DmCLIC+antibodies+and+localization+of+CLICs+in+endoplasmic+reticulum+of+cardiomyocytes.">Data supporting characterization of CLIC1, CLIC4, CLIC5 and DmCLIC antibodies and localization of CLICs in endoplasmic reticulum of cardiomyocytes.</a> Data Brief. 7, 1038-1044 (2016).</li><li>Fernandez-Salas, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mtCLIC/CLIC4,+an+Organellular+Chloride+Channel+Protein,+Is+Increased+by+DNA+Damage+and+Participates+in+the+Apoptotic+Response+to+p53.">mtCLIC/CLIC4, an Organellular Chloride Channel Protein, Is Increased by DNA Damage and Participates in the Apoptotic Response to p53.</a> Mol Cell Biol. 22, 3610-3620 (2002).</li><li>Suh, K. S., Mutoh, M., Gerdes, M., Yuspa, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CLIC4,+an+intracellular+chloride+channel+protein,+is+a+novel+molecular+target+for+cancer+therapy.">CLIC4, an intracellular chloride channel protein, is a novel molecular target for cancer therapy.</a> J Invest Derm Symp P. 10, 105-109 (2005).</li><li>Zhong, J., Kong, X., Zhang, H., Yu, C., Xu, Y., Kang, J., Yu, H., Yi, H., Yang, X., Sun, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+CLIC4+Enhances+Autophagy+and+Triggers+Mitochondrial+and+ER+Stress-Induced+Apoptosis+in+Human+Glioma+U251+Cells+under+Starvation.">Inhibition of CLIC4 Enhances Autophagy and Triggers Mitochondrial and ER Stress-Induced Apoptosis in Human Glioma U251 Cells under Starvation.</a> PloS one. 7, 39378 (2012).</li><li>Ponnalagu, D., Singh, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anion+Channels+of+Mitochondria.">Anion Channels of Mitochondria.</a> Handbook of Experimental Pharmacology. , (2016).</li><li>Leanza, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+ion+channels+and+cancer.">Intracellular ion channels and cancer.</a> Front Physiol. 4, 227 (2013).</li><li>Kim, S. Y., Chu, K. C., Lee, H. R., Lee, K. S., Carey, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+characterization+of+nine+new+head+and+neck+cancer+cell+lines.">Establishment and characterization of nine new head and neck cancer cell lines.</a> Acta Oto-Laryngologica. 117, 775-784 (1997).</li><li>Jia, L., Liu, W., Guan, L., Lu, M., Wang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Calcium-Activated+Chloride+Channel+ANO1/TMEM16A+Suppresses+Tumor+Growth+and+Invasion+in+Human+Lung+Cancer.">Inhibition of Calcium-Activated Chloride Channel ANO1/TMEM16A Suppresses Tumor Growth and Invasion in Human Lung Cancer.</a> PloS one. 10, 0136584 (2015).</li><li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+CLIC4/mtCLIC+enhances+hydrogen+peroxide-induced+apoptosis+in+C6+glioma+cells.">Suppression of CLIC4/mtCLIC enhances hydrogen peroxide-induced apoptosis in C6 glioma cells.</a> Oncol Rep. 29, 1483-1491 (2013).</li><li>Zhu, W., Wang, X., Zhou, Y., Wang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C2-ceramide+induces+cell+death+and+protective+autophagy+in+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma+cells.">C2-ceramide induces cell death and protective autophagy in head and neck squamous cell carcinoma cells.</a> Int J Mol Sci. 15, 3336-3355 (2014).</li><li>McFarland, R., Taylor, R. W., Turnbull, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+neurological+perspective+on+mitochondrial+disease.">A neurological perspective on mitochondrial disease.</a> Lancet Neurol. 9, 829-840 (2010).</li><li>Alston, C. L., Rocha, M. C., Lax, N. Z., Turnbull, D. M., Taylor, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+and+pathology+of+mitochondrial+disease.">The genetics and pathology of mitochondrial disease.</a> J Pathol. 241, 236-250 (2017).</li><li>Zhang, W., Wang, X., Chen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resveratrol+induces+mitochondria-mediated+AIF+and+to+a+lesser+extent+caspase-9-dependent+apoptosis+in+human+lung+adenocarcinoma+ASTC-a-1+cells.">Resveratrol induces mitochondria-mediated AIF and to a lesser extent caspase-9-dependent apoptosis in human lung adenocarcinoma ASTC-a-1 cells.</a> Mol Cell Biochem. 354, 29-37 (2011).</li><li>Bernardi, P., Rasola, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+and+cell+death:+the+mitochondrial+connection.">Calcium and cell death: the mitochondrial connection.</a> Subcell Biochem. 45, 481-506 (2007).</li><li>Perveen, S., Yang, J. S., Ha, T. J., Yoon, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyanidin-3-glucoside+Inhibits+ATP-induced+Intracellular+Free+Ca(2+)+Concentration,+ROS+Formation+and+Mitochondrial+Depolarization+in+PC12+Cells.">Cyanidin-3-glucoside Inhibits ATP-induced Intracellular Free Ca(2+) Concentration, ROS Formation and Mitochondrial Depolarization in PC12 Cells.</a> Korean J Physiol Pharmacol. 18, 297-305 (2014).</li><li>Paddock, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+and+practices+of+laser+scanning+confocal+microscopy.">Principles and practices of laser scanning confocal microscopy.</a> Mol Biotechnol. 16, 127-149 (2000).</li><li>Paddock, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=To+boldly+glow...+applications+of+laser+scanning+confocal+microscopy+in+developmental+biology.">To boldly glow... applications of laser scanning confocal microscopy in developmental biology.</a> BioEssays : news and reviews in molecular, cellular and developmental biology. 16, 357-365 (1994).</li></ol>

저자는 공개 없다.

잘 Cl− 채널 hemostasis 내부 환경의 유지에 필수적 이며 세포 증식 및 apoptosis15,16에 중요 한 역할을 문서화 되어있다. 따라서, 다양 한 암17에 대 한 더 나은 치료 방법의 찾을 큰 필요와 중요성의은 이온 채널 대상 개입 및 apoptosis의 관계를 이해. 미토 콘 드리 아 세포의 정상적인 생물학적 상태를 유지 하 고 기능 높은 막 침투성 ?...

Rh123 막 횡단 잠재력을 위한 지시자로 봉사 하는 양이온 형광 염료 이다. Rh123은 세포 막을 관통 하 고 막1내외의 잠재적인 차이 따라 미토 콘 드리 아 매트릭스 입력 가능 합니다. Apoptosis는 미토 콘 드 리아 멤브레인 무결성의 손상으로 이어집니다. Mitochondrion 침투성 전환 기 공 (MPTP) 열고에 미토 콘 드리 아의 바깥쪽에 Rh123의 방출 귀착되는 MMP의 축소로 이어질 것 이다. 마지막으로, 형광 현미경 강한 녹색 형광 신호를 감지 됩니다. 그것은 잘 MMP와 높은 막 침투성의 고갈 세포 apoptosis2의 초기 징후는 문서화 되어있다. 따라서, Rh123는 MMP 변화의 검출 및 세포 apoptosis의 발생에 적용할 수 있습니다.
세계에서 여섯번째 가장 일반적인 암으로 머리와 목 암 심각 하 게 사람의 건강3악화. 있지만 많은 접근은 최근 몇 년 동안에 개발 되었다, 머리와 목 편평 상피 세포 암 (HNSCC)에서 고통 받는 환자에 대 한 치료의 임상 결과 여전히 이상4. 새로운 치료 방법을 탐구 하는 것은 HNSCC5에 대 한 치료를 개선할 수 있습니다. 수많은 생물 학적 프로세스를 포함 하는 이온 채널 다른 암6의 개발에 중요 한 역할을 표시 합니다. Cl- 채널의 부분 또는 전체 참여 매우 활성 마이그레이션, 확산 및 침해의 높은 비율을 포함 하 여 종양 약의 다양 한 속성에 포함 된다. 이 비추어 클릭, 비 발한 단백질 가족, 암 치료6,7에 대 한 치료 목표의 유망한 클래스 나열 되었습니다. 최근 연구는 계시 했다 CLIC1, CLIC4, CLIC5, 등 클릭 가족의 심장 미토 콘 드리 아를 지역화 반응성 산소 종 (선생님) 레벨 이며 CLIC5에 의해 upregulated Cl 있는 미토 콘 드리 아의 기능 역할을 나타내는 - apoptotic 응답8채널. CLIC4, (일컬어 mtCLIC, P64H1, 및 RS43), 클릭 가족의 한 구성원을 가장 광범위 하 게 암 세포 및 subcellular 위치 등 골, 바인딩과 그물 mitochondrion 인간의 apoptotic 규칙 속성에 대 한 공부 하고있다 keratinocytes7,,910. CLIC4의 식 프로필 종양 괴 사 인자-α (TNF-α), P53, 그리고 외부 자극에 의해 규제 했다. Overexpression 및 CLIC4의 downregulation Bcl-2 가족 구성원의 불균형 caspase 캐스케이드의 활성화 및 시 토 크롬 C11, 의 출시와 함께 미토 콘 드리 아 통로 통해 주로 apoptotic 응답 방 아 쇠 12 , 13. 따라서, MMP 측정 하는 중요 한 탐구 CLIC4 관련 apoptosis 그리고 Rh123 이상적인 형광 표시기로 제공.
현재 연구 HN4 셀에 CLIC4 최저 유도 된 apoptosis를 공부 하는 MMP의 검출에 대 한 자세한 프로토콜을 설명 합니다. Rh123 형광 프로브로는 MMP의 변화를 관찰 하는 데 사용 됩니다. 일반적인 형광 현미경, 공초점 레이저 스캐닝 형광 현미경 아래는 MMP의 실시간 변동 해결 될 수 있습니다. 우리는 장점과 confocal 레이저 스캐닝 자세히, 형광 현미경의 응용 프로그램의 한계를 토론 하 고 또한 다른 방법으로 그것을 비교 하 여. 이 프로토콜도 다른 apoptosis 관련 연구에 적용할 수 있습니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1296px;" width="1294">
	<colgroup>
		<col />
		<col span="2" />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:372px;">HNSCC cells</td>
			<td style="width:183px;">ATCC</td>
			<td style="width:183px;">CRL-3241</td>
			<td style="width:559px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Polylysine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>P4981</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;">Specific siRNA for human CLIC4</td>
			<td>Biomics</td>
			<td>NM_013943</td>
			<td style="width:559px;">(accession numbers, NM_013943; corresponding to the cDNA sequence 
			5-GCTGAAGGAGGAGGACAAAGA-3) and scrambled siRNA (5 ACGCGUAACGCGGGAAUUU-3) were designed and obtained from Biomics Company</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Lipofectamine 2000 Transfection Reagent&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>L3000-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Opti-MEM I Reduced Serum Medium, GlutaMAX</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>51985-042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Rhodamine 123, FluoroPure grede</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R22420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:372px;">Dulbecco&#8217;smodified Eagle medium (DMEM, 4.5 g/L glucose)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965-084</td>
			<td style="width:559px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:372px;">Fetal Bovine Serum, Qualified, Australia Origin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10099141</td>
			<td style="width:559px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:372px;">Trypsin-EDTA Solution</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C0201</td>
			<td style="width:559px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:372px;">Antibiotic-Antimycotic, 100X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240062</td>
			<td style="width:559px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Laser Scanning Confocal Microscopy</td>
			<td>Leica Microsystems GmbH</td>
			<td>LEICA.SP5-DMI6000-DIC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Nikon Eclipse TE300 Inverted Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Metaflour, V7.5.0.0</td>
			<td>Universal Imaging Corporation</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Leica application suite, v2.6.0.7266</td>
			<td>Leica Microsystems GmbH</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Microsoft office Excel 2007</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sigma Plot 12.5</td>
			<td>Systat Software</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Attofluor Cell Chamber</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A7816</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of mitochondria membrane potential to study clic4 knockdown-induced hn4 cell apoptosis in vitro

(MMP, ΔΨm) 잠재적인 미토 콘 드 리아 멤브레인의 고갈 apoptotic 캐스케이드에 초기 이벤트로 간주 됩니다. 그것은 심지어 핵 apoptotic 특성, chromatin 응축 및 DNA 파손 등 앞서 발생 합니다. 일단 MMP 붕괴, 세포 apoptosis 돌이킬 시작 됩니다. 질 성 양이온 염료의 일련 수 있습니다 세포 막 통과 mitochondrion, 매트릭스 내부 집계 및 MMP 변화를 평가 하기 위해 형광 마커 역할. Cl- 세포내 채널 (클릭) 가족의 6 멤버 중 하나로 CLIC4 주로 미토 콘 드리 아 통로 통해 셀 apoptotic 과정에 참여합니다. 여기 우리가 Rhodamine 123 (Rh123),이 통해 우리가 공부 CLIC4 최저에 의해 유도 된 apoptosis의 형광 변동 모니터링 통해 MMP를 측정 하는 상세한 프로토콜을 설명 합니다. 우리는 장점과 confocal 레이저 스캐닝 및 세부 사항에, 일반 형광 현미경의 응용 프로그램의 한계를 토론 하 고 또한 다른 방법으로 그것을 비교 하 여.

현재 연구에서 Rh123는 MMP 감지에 적용 되었습니다. 처음, HN4 셀 다음 형광 실험을 얼룩에 대 한 교양 했다. 핀셋 6 잘 플레이트(그림 1)의 하단에 원형 coverslips를 넣어 사용 했다. 5 분에 대 한 polylysine는 coverslips 코팅 했다 고는 polylysine pipettor (그림 1B)를 통해 제거 하는 다음. 다음 HN4 셀 trypsinized 되었고 6 ?...

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Detection of Mitochondria Membrane Potential to Study CLIC4 Knockdown-induced HN4 Cell Apoptosis In Vitro

여기 선물이 rhodamine 123 미토 콘 드 리아 멤브레인 잠재적인 (MMP)를 식별 하 여 CLIC4 최저 유도 HN4 세포 apoptosis 체 외연구의 응용 프로그램에 대 한 자세한 프로토콜. 일반적인 형광 현미경, 공초점 레이저 스캐닝 형광 현미경 아래는 MMP의 실시간 변화 기록 했다.

CLIC4 최저 유도 HN4 세포 Apoptosis에서 체 외에 미토 콘 드리 아 막 잠재력의 발견

Depletion of the mitochondrial membrane potential (MMP, &#916;&#936;m) is considered the earliest event in the apoptotic cascade. It even occurs ahead of ...

detection-mitochondria-membrane-potential-to-study-clic4-knockdown

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Detection of Mitochondria Membrane Potential to Study CLIC4 Knockdown-induced HN4 Cell Apoptosis In Vitro

10.2K 조회수.  Anhui Medical University. 여기 선물이 rhodamine 123 미토 콘 드 리아 멤브레인 잠재적인 (MMP)를 식별 하 여 CLIC4 최저 유도 HN4 세포 apoptosis 체 외연구의 응용 프로그램에 대 한 자세한 프로토콜. 일반적인 형광 현미경, 공초점 레이저 스캐닝 형광 현미경 아래는 MMP의 실시간 변화 기록 했다.

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Coculture Assays to Study Macrophage and Microglia Stimulation of Glioblastoma Invasion

Glioblastoma multiforme (grade IV glioma) is a very aggressive human cancer with a median survival of 1 year post diagnosis. Despite the increased understanding of the molecular events that give rise to glioblastomas, this cancer still remains highly refractory to conventional treatment. Surgical resection of high grade brain tumors is rarely complete due to the highly infiltrative nature of glioblastoma cells. Therapeutic approaches which attenuate glioblastoma cell invasion therefore is an attractive option. Our laboratory and others have shown that tumor associated macrophages and microglia (resident brain macrophages) strongly stimulate glioblastoma invasion. The protocol described in this paper is used to model glioblastoma-macrophage/microglia interaction using in vitro culture assays. This approach can greatly facilitate the development and/or discovery of drugs that disrupt the communication with the macrophages that enables this malignant behavior. We have established two robust coculture invasion assays where microglia/macrophages stimulate glioma cell invasion by 5 - 10 fold. Glioblastoma cells labelled with a fluorescent marker or constitutively expressing a fluorescent protein are plated without and with macrophages/microglia on matrix-coated polycarbonate chamber inserts or embedded in a three dimensional matrix. Cell invasion is assessed by using fluorescent microscopy to image and count only invasive cells on the underside of the filter. Using these assays, several pharmacological inhibitors (JNJ-28312141, PLX3397, Gefitinib, and Semapimod), have been identified which block macrophage/microglia stimulated glioblastoma invasion.

Understanding the malignant behavior of cancer requires creating accurate models of how tumor cells interact with components of the tumor microenvironment, such as macrophages. Here we describe two methods to study glioblastoma cell interaction with tumor associated macrophages and microglia where the effect on glioblastoma invasion is assessed.

공동 배양 시험 법은 아교 모세포종 침략의 대 식세포와 미세 아교 세포 자극을 공부하기

Glioblastoma multiforme (grade IV glioma) is a very aggressive human cancer with a median survival of 1 year post diagnosis. Despite the increased ...

연구

암 연구학

How to Study Basement Membrane Stiffness as a Biophysical Trigger in Prostate Cancer and Other Age-related Pathologies or Metabolic Diseases

Here we describe a protocol that can be used to study the biophysical microenvironment related to increased thickness and stiffness of the basement membrane (BM) during age-related pathologies and metabolic disorders (e.g. cancer, diabetes, microvascular disease, retinopathy, nephropathy and neuropathy). The premise of the model is non-enzymatic crosslinking of reconstituted BM (rBM) matrix by treatment with glycolaldehyde (GLA) to promote advanced glycation endproduct (AGE) generation via the Maillard reaction. Examples of laboratory techniques that can be used to confirm AGE generation, non-enzymatic crosslinking and increased stiffness in GLA treated rBM are outlined. These include preparation of native rBM (treated with phosphate-buffered saline, PBS) and stiff rBM (treated with GLA) for determination of: its AGE content by photometric analysis and immunofluorescent microscopy, its non-enzymatic crosslinking by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS PAGE) as well as confocal microscopy, and its increased stiffness using rheometry. The procedure described here can be used to increase the rigidity (elastic moduli, E) of rBM up to 3.2-fold, consistent with measurements made in healthy versus diseased human prostate tissue. To recreate the biophysical microenvironment associated with the aging and diseased prostate gland three prostate cell types were introduced on to native rBM and stiff rBM: RWPE-1, prostate epithelial cells (PECs) derived from a normal prostate gland; BPH-1, PECs derived from a prostate gland affected by benign prostatic hyperplasia (BPH); and PC3, metastatic cells derived from a secondary bone tumor originating from prostate cancer. Multiple parameters can be measured, including the size, shape and invasive characteristics of the 3D glandular acini formed by RWPE-1 and BPH-1 on native versus stiff rBM, and average cell length, migratory velocity and persistence of cell movement of 3D spheroids formed by PC3 cells under the same conditions. Cell signaling pathways and the subcellular localization of proteins can also be assessed.

Here we explain a protocol for modelling the biophysical microenvironment where crosslinking and increased stiffness of the basement membrane (BM) induced by advanced glycation endproducts (AGEs) has pathological relevance.

전립선 암과 기타 노화 관련 병리 또는 대사 질환의 생물 물리학 트리거로 지하실 막 강성을 공부하는 방법

Here we describe a protocol that can be used to study the biophysical microenvironment related to increased thickness and stiffness of the basement ...

A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer

Breast cancer is the leading cause of cancer-related mortality in women worldwide. Liver metastasis is involved in upwards of 30% of cases with breast cancer metastasis, and results in poor outcomes with median survival rates of only 4.8 - 15 months. Current rodent models of breast cancer metastasis, including primary tumor cell xenograft and spontaneous tumor models, rarely metastasize to the liver. Intracardiac and intrasplenic injection models do result in liver metastases, however these models can be confounded by concomitant secondary-site metastasis, or by compromised immunity due to removal of the spleen to avoid tumor growth at the injection site. To address the need for improved liver metastasis models, a murine portal vein injection method that delivers tumor cells firstly and directly to the liver was developed. This model delivers tumor cells to the liver without complications of concurrent metastases in other organs or removal of the spleen. The optimized portal vein protocol employs small injection volumes of 5 - 10 &#956;l, &#8805; 32 gauge needles, and hemostatic gauze at the injection site to control for blood loss. The portal vein injection approach in Balb/c female mice using three syngeneic mammary tumor lines of varying metastatic potential was tested; high-metastatic 4T1 cells, moderate-metastatic D2A1 cells, and low-metastatic D2.OR cells. Concentrations of &#8804; 10,000 cells/injection results in a latency of ~ 20 - 40 days for development of liver metastases with the higher metastatic 4T1 and D2A1 lines, and &#62; 55 days for the less aggressive D2.OR line. This model represents an important tool to study breast cancer metastasis to the liver, and may be applicable to other cancers that frequently metastasize to the liver including colorectal and pancreatic adenocarcinomas.

A surgical procedure was developed to deliver mammary tumor cells to the murine liver via portal vein injection. This model permits investigation of late stages of liver metastasis in a fully immune competent host, including tumor cell extravasation, seeding, survival, and metastatic outgrowth in the liver.

포탈 정맥 주입 모델 간 전이 유방암의 공부를

Breast cancer is the leading cause of cancer-related mortality in women worldwide. Liver metastasis is involved in upwards of 30% of cases with breast ...

Characterization of Cell Membrane Extensions and Studying Their Roles in Cancer Cell Adhesion Dynamics

The cell membrane&#39;s extension repertoire modulates various malignant behaviors of cancer cells, including their adhesive and migratory potentials. The ability to accurately classify and quantify cell extensions and measure the effect on a cell&#39;s adhesive capacity is critical to determining how cell-signaling events impact cancer cell behavior and aggressiveness. Here, we describe the in vitro design and use of a cell extension quantification method in conjunction with an adhesion capacity assay in an established in vitro model for adrenocortical carcinoma (ACC). Specifically, we test the effects of DKK3, a putative tumor suppressor and a pro-differentiation factor, on the membrane extension phenotype of the ACC cell line, SW-13. We propose these assays to provide relatively simple, reliable, and easily interpretable metrics to measures these characteristics under various experimental conditions.

This study demonstrates the utility and ease of quantitative cell membrane extension measurement and its correlation to adhesive capacity of cells. As a representative example, we show here that Dickkopf-related protein 3 (DKK3) promotes increased lobopodia formation and cell adhesiveness in adrenocortical carcinoma cells in vitro.

세포 막 확장 하 고 공부 하는 암 세포 접착 역동성에 있는 그들의 역할의 특성

The cell membrane&#39;s extension repertoire modulates various malignant behaviors of cancer cells, including their adhesive and migratory potentials. The ...

Flow Cytometric Detection of Newly-formed Breast Cancer Stem Cell-like Cells After Apoptosis Reversal

Cancer recurrence has long been studied by oncologists while the underlying mechanisms remain unclear. Recently, we and others found that a phenomenon named apoptosis reversal leads to increased tumorigenicity in various cell models under different stimuli. Previous studies have been focused on tracking this process in vitro and in vivo; however, the isolation of real reversed cells has yet to be achieved, which limits our understanding on the consequences of apoptosis reversal. Here, we take advantage of a Caspase-3/7 Green Detection dye to label cells with activated caspases after apoptotic induction. Cells with positive signals are further sorted out by fluorescence-activated cell sorting (FACS) for recovery. Morphological examination under confocal microscopy helps confirm the apoptotic status before FACS. An increase in tumorigenicity can often be attributed to the elevation in the percentage of cancer stem cell (CSC)-like cells. Also, given the heterogeneity of breast cancer, identifying the origin of these CSC-like cells would be critical to cancer treatment. Thus, we prepare breast non-stem cancer cells before triggering apoptosis, isolating caspase-activated cells and performing the apoptosis reversal procedure. Flow cytometry analysis reveals that breast CSC-like cells re-appear in the reversed group, indicating breast CSC-like cells are transited from breast non-stem cancer cells during apoptosis reversal. In summary, this protocol includes the isolation of apoptotic breast cancer cells and detection of changes in CSC percentage in reversed cells by flow cytometry.

Here, we present a protocol to isolate apoptotic breast cancer cells by fluorescence-activated cell sorting and further detect the transition of breast non-stem cancer cells to breast cancer stem cell-like cells after apoptosis reversal by flow cytometry.

새로 형성 된 유방암 줄기 세포와 같은 세포 Apoptosis 반전 후 흐름 Cytometric 감지

Cancer recurrence has long been studied by oncologists while the underlying mechanisms remain unclear. Recently, we and others found that a phenomenon ...

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful immunotherapies. Several studies have indicated that tumor infiltrating myeloid cells (e.g., myeloid-derived suppressor cells (MDSCs) and tumor-associated macrophages (TAMs)) suppress cytotoxicity of CD8+ T cells in the tumor microenvironment, and that targeting these regulatory myeloid cells can improve immunotherapies. Here, we present an in vitro assay system to evaluate immune suppressive effects of monocytic-MDSCs and TAMs on the tumor-killing ability of CD8+ T cells. To this end, we first cultured na&#239;ve splenic CD8+ T cells with anti-CD3/CD28 activating antibodies in the presence or absence of suppressor cells, and then co-cultured the pre-activated T cells with target cancer cells in the presence of a fluorogenic caspase-3 substrate. Fluorescence from the substrate in cancer cells was detected by real-time fluorescence microscopy as an indicator of T-cell induced tumor cell apoptosis. In this assay, we can successfully detect the increase of tumor cell apoptosis by CD8+ T cells and its suppression by pre-culture with TAMs or MDSCs. This functional assay is useful for investigating CD8+ T cell suppression mechanisms by regulatory myeloid cells and identifying druggable targets to overcome it via high throughput screening.

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

We describe here a protocol to investigate cytotoxicity of pre-activated CD8+ T cells against cancer cells by detecting apoptotic cancer cells via real-time microscopy. This protocol can investigate mechanisms behind myeloid cell-induced T cell suppression and evaluate compounds aimed at replenishing T cells via blockade of immune suppressive myeloid cells.

실시간 탐지의 체 외 종양 세포 Apoptosis에 CD8에 의해 유도 된+ T 세포 종양 침투 골수성 세포의 면역 진압 기능 연구

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful ...

Transfer of Manipulated Tumor-associated Neutrophils into Tumor-Bearing Mice to Study their Angiogenic Potential In Vivo

The contribution of neutrophils to the regulation of tumorigenesis is getting increased attention. These cells are heterogeneous, and depending on the tumor milieu can possess pro- or anti-tumor capacity. One of the important cytokines regulating neutrophil functions in a tumor context are type I interferons. In the presence of interferons, neutrophils gain anti-tumor properties, including cytotoxicity or stimulation of the immune system. Conversely, the absence of an interferon signaling results in prominent pro-tumor activity, characterized with strong stimulation of tumor angiogenesis. Recently, we could demonstrate that pro-angiogenic properties of neutrophils depend on the activation of nicotinamide phosphoribosyltransferase (NAMPT) signaling pathway in these cells. Inhibition of this pathway in tumor-associated neutrophils leads to their potent anti-angiogenic phenotype. Here, we demonstrate our newly established model allowing in vivo evaluation of tumorigenic potential of manipulated tumor-associated neutrophils (TANs). Shortly, pro-angiogenic tumor-associated neutrophils can be isolated from tumor-bearing interferon-deficient mice and repolarized into anti-angiogenic phenotype by blocking of NAMPT signaling. The angiogenic activity of these cells can be subsequently evaluated using an aortic ring assay. Anti-angiogenic TANs can be transferred into tumor-bearing wild type recipients and tumor growth should be monitored for 14 days. At day 14 mice are sacrificed, tumors removed and cut with their vascularization assessed. Overall, our protocol provides a novel tool to in vivo evaluate angiogenic capacity of primary cells, such as tumor-associated neutrophils, without a need to use artificial neutrophil cell line models. vc

Here, we show therapeutic potential of anti-angiogenic tumor-associated neutrophils after their transfer into tumor-bearing mice. This protocol can be used to manipulate neutrophil activity ex vivo and to subsequently evaluate their functionality in vivo&#160;in developing tumors. It is an appropriate model for studying potential neutrophil-based immunotherapies.

조작된 종양 관련 호중구를 종양 베어링 마우스로 옮겨 생체 내 혈관신생 잠재력을 연구합니다.

The contribution of neutrophils to the regulation of tumorigenesis is getting increased attention. These cells are heterogeneous, and depending on the ...

In Vivo Immunofluorescence Localization for Assessment of Therapeutic and Diagnostic Antibody Biodistribution in Cancer Research

Monoclonal antibodies (mAbs) are important tools in cancer detection, diagnosis, and treatment. They are used to unravel the role of proteins in tumorigenesis, can be directed to cancer biomarkers enabling tumor detection and characterization, and can be used for cancer therapy as mAbs or antibody-drug conjugates to activate immune effector cells, to inhibit signaling pathways, or directly kill cells carrying the specific antigen. Despite clinical advancements in the development and production of novel and highly specific mAbs, diagnostic and therapeutic applications can be impaired by the complexity and heterogeneity of the tumor microenvironment. Thus, for the development of efficient antibody-based therapies and diagnostics, it is crucial to assess the biodistribution and interaction of the antibody-based conjugate with the living tumor microenvironment. Here, we describe In Vivo Immunofluorescence Localization (IVIL) as a new approach to study interactions of antibody-based therapeutics and diagnostics in the in vivo physiological and pathological conditions. In this technique, a therapeutic or diagnostic antigen-specific antibody is intravenously injected in&#160;vivo and localized ex vivo with a secondary antibody in isolated tumors. IVIL, therefore, reflects the in vivo biodistribution of antibody-based drugs and targeting agents. Two IVIL applications are described assessing the biodistribution and accessibility of antibody-based contrast agents for molecular imaging of breast cancer. This protocol will allow future users to adapt the IVIL method for their own antibody-based research applications.

The in vivo immunofluorescence localization (IVIL) method can be used to examine in vivo biodistribution of antibodies and antibody conjugates for oncological purposes in living organisms using a combination of in vivo tumor targeting and ex vivo immunostaining methods.

암 연구에서 치료 및 진단 항체 바이오 유통 평가를 위한 생체내 면역형광 국소화

Monoclonal antibodies (mAbs) are important tools in cancer detection, diagnosis, and treatment. They are used to unravel the role of proteins in ...

In Vitro Assay to Study Tumor-macrophage Interaction

Tumor associated macrophages (TAMs) account for a large percentage of cells in the tumor mass for different types of cancers. Glioblastoma (GBM), a malignant brain tumor with no cure, has up to a half the tumor mass TAMs. TAMs can be pro-tumoral or anti-tumoral, depending on the activation of specific genes in the cells. Genetic mutations in the tumors, through regulating cytokine expression, can affect recruitment of TAMs to the tumor microenvironment. Here, we describe a quantitative cell-based assay to assess macrophage recruitment by the conditioned medium from the tumor cells. This assay uses the human macrophage cell line MV-4-11 to study macrophage attraction by the conditioned medium from glioblastoma, allowing for high reproducibility and low variability. Data generated with this assay can contribute to a better understanding of the interaction between the tumor and the tumor microenvironment. Similar assay can be used to assess interaction between the tumor cells and other immune cells, including T cells and natural killer (NK) cells.

This article represents a useful in vitro assay to evaluate the capability of conditioned medium from tumor cells to attract macrophages.

종양 대식 세포 상호 작용을 연구 하는 시험관 내 분석

Tumor associated macrophages (TAMs) account for a large percentage of cells in the tumor mass for different types of cancers. Glioblastoma (GBM), a ...

Cell Cycle-specific Measurement of &#947;H2AX and Apoptosis After Genotoxic Stress by Flow Cytometry

The presented method or slightly modified versions have been devised to study specific treatment responses and side effects of various anti-cancer treatments as used in clinical oncology. It enables a quantitative and longitudinal analysis of the DNA damage response after genotoxic stress, as induced by radiotherapy and a multitude of anti-cancer drugs. The method covers all stages of the DNA damage response, providing endpoints for induction and repair of DNA double-strand breaks (DSBs), cell cycle arrest and cell death by apoptosis in case of repair failure. Combining these measurements provides information about cell cycle-dependent treatment effects and thus allows an in-depth study of the interplay between cellular proliferation and coping mechanisms against DNA damage. As the effect of many cancer therapeutics including chemotherapeutic agents and ionizing radiation is limited to or strongly varies according to specific cell cycle phases, correlative analyses rely on a robust and feasible method to assess the treatment effects on the DNA in a cell cycle-specific manner. This is not possible with single-endpoint assays and an important advantage of the presented method. The method is not restricted to any particular cell line and has been thoroughly tested in a multitude of tumor and normal tissue cell lines. It can be widely applied as a comprehensive genotoxicity assay in many fields of oncology besides radio-oncology, including environmental risk factor assessment, drug screening and evaluation of genetic instability in tumor cells.

The presented method combines the quantitative analysis of DNA double-strand breaks (DSBs), cell cycle distribution and apoptosis to enable cell cycle-specific evaluation of DSB induction and repair as well as the consequences of repair failure.

CLIC4 최저 유도 HN4 세포 Apoptosis에서 체 외에 미토 콘 드리 아 막 잠재력의 발견

요약

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