이 연구소는 건강 연구의 캐나다 연구소, 자연 과학 및 캐나다 공학 연구 협의회, 캐나다 (MSSC)의 다중 경화증 학회에 의해 지원되었습니다. GSTS는 MSSC에서 박사 학생이기의 수신자했다. 우리는이 원고에 많은 도움이 토론과 의견 박사 조안 Boggs (아픈 어린이, 토론토 병원)에 감사하고 있습니다. 우리는 추가 NucView 488 caspase - 3 그들의 관대한 선물 Biotium에 감사하고 있습니다.

1. 해동 및 Culturing 셀 <ol><li> 장기 액체 질소 상점에서 냉동 불후의 N19 - oligodendroglial 세포의 주식을 얻습니다. </li><li> 37 ° C의 물 목욕에서 세포를 포함 빠져 유리병은 세포 현탁액 완전히 해동되기 전까지. </li><li> 높은 포도당 10 % FBS (태아 소 혈청), 1 % 페니실린 / 10cm 문화 판에 스트렙토 마이신과 보충과 DMEM 7 ML (Dulbecco의 수정된 이글 매체)를 추가합니다. </li><li> 세포 현탁액 판 드롭 현명하고, 부드럽게 선동하고 균일하게 세포를 해산하기 위해 페트리 접시 바위를 추가합니다. </li><li> 34 ° C / 5% CO 2 배양기에서 세포 문화. </li><li> 후 4 시간 cryoprotectant로 사용했다 남아있는 DMSO (디메틸 sulphoxide)를 제거하고 신선한 미디어 (7 ML DMEM 높은 포도당 미디어 10% FBS와 보충, 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신)로 대체하는 접시에서 대기음 미디어 . </li></ol> 2. Passaging 셀 <ol><li> 70-80%에서합류는 (4-7일 성장), 세포에서 미디어를 기음. </li><li> 접시에 0.25 %의 트립신 1 ML을 추가합니다. 피펫 트립신은 세포를 (5 분) 분리 수 있습니다. </li><li> 실험 조건 및 통과에 대한 적절한 dilutions 세포 밀도가 아니 그보다 0.1 X 10 6 세포 / ML에서 이후의 실험에 대한 추가 10cm 판을 만듭니다. </li></ol> 참고 : 실험에 사용하기 전에 해동 후 최소 두 번 통과하여 세포를해야합니다. 3. 셀을 계산 및 도금 <ol><li> 라이브 세포 이미징을위한 플레이트 세포하려면 앞에서 설명한 것처럼 trypsinize. </li><li> 세포의 약 30 μL를 제거하고 혈구계를 사용하여 계산합니다. </li><li> 6 접시에 잘 uncoated 유리 coverslip을 놓습니다. 34 10 % FBS, 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신, ° C / 5퍼센트 CO 2와 보충이 ML 페놀없는 DMEM 높은 포도당 미디어 0.1 X 10 6 세포 / ML의 밀도에서 잘하는 세포를 추가합니다. </li><li> 허용34시 (16-20 H) 하룻밤 성장 세포 ° C / 5퍼센트 transfection하기 전에 CO 2. </li></ol> 4. Transfection <ol><li> 100 μL 혈청 프리 미디어, 플라스미드 DNA 및 4 μL FuGENE HD (Roche는)을 정화 0.5-4 μg을 결합합니다. 와동 부드럽게 혼합합니다. </li><li> 간략하게 다시 소용돌이와 실온에서 5 분 DNA 복잡하고, 다음 직접 교양 세포 FuGENE의 HD DNA 혼합물을 추가하실 수 있습니다. 가볍게 섞어 접시를 기울이기. </li><li> 34 ° C / 5% 이전 치료 실험에 CO 2에서 추가 48 H에 대한 문화가 세포. </li></ol> 5. 라이브 세포 이미징에 대비하여 전지 (LCI) <ol><li> 당신이 실험을 시작하려면 전에 LCI Chamlide 라이브 셀 인스 트루먼트 컨트롤 박스에 최소한 1 H를 돌려라. 컨트롤 박스는 또한 온도와 LCI Chamlide 내의 습도를 조절하고, premixed 5% CO 2의 흐름을 조절. </li></ol> 참고 :이하는 것이 좋습니다처음 실험은 전체 단계 34 ° C.에 도달하도록하기 전에 최대 3 H에 컨트롤 상자에 설정 이 단계는 이미징 동안 그 온도가 올라가면서 fluxulation 및 금속 무대의 열팽창으로 인해 초점 드리프트를 줄일 수 있습니다. <ol start="2"><li> 흐름 두건에서 일하는 것은, Chamlide 자석 타입 문화 챔버를 스프레이하고, 핀셋, 70 % 에탄올과 그들이 5 분 건조하실 수 있습니다. </li><li> 인큐베이터에서 세포를 제거하고 그들이 건강한 것을 확인합니다. 그들은 자기편 나타나고 수많은 멤브레인 처리로 유리 coverslip에 잘 확산됩니다. transfection에서 스트레스 아르 세포가 실험에 적합하지 있으며, 프로세스 확장의 감소 번호가되며, 종종 불규칙 모양의 핵이 있습니다. </li><li> 6 잘 플레이트의 기울기 조정 및 족집게로 coverslip을 제거합니다. 신속 문화 챔버의 바닥 접시에 coverslip 셀 측면을 넣으십시오. coverslip가 건조하는 것을 허용하지 않습니다. </li><li> 자기 주를 첨부문화 챔버의 신체와 coverslip의 상단에 원래 6 자 판에서 미디어 500 μL를 추가합니다. 다시 사용하여이 미디어 환경 변화에 의한 세포에 게재 스트레스의 양을 감소되며, 또한 세포외 분비 요소를 평가하는 데 유용할 수 있습니다. </li><li> 문화 챔버에 유리 커버를 놓습니다. </li><li> 현미경 방해 coverslip의 바닥에서 잔여 물질을 제거하는 70 %의 에탄올과 분무 KimWipe를 사용합니다. </li><li> 34 문화 챔버를 놓습니다 ° C / 5퍼센트 CO 2 배양기를 30 분. 이 단계는 챔버 자체가 34 체온이 있는지 확인합니다 ° 금속가 따뜻해 짐에 따라 C coverslip의 이동 줄일 수 있습니다. </li></ol> 6. 현미경 설정 이미지는 사용자 지정 릴레이 렌즈 여러 바퀴의 카트리지 로딩을위한 방출 필터 휠 하우징 (정족수 기술 주식 회사, G와 Leica DMIRE2 거꾸로 현미경을 사용하여 여기에 인수되었습니다uelph에). <ol><li> Brightfield - 램프 2.5 V 및 노출 240 MS 시간으로 설정합니다. </li><li> 적색 형광 단백질 (RFP) - 이득은 200 MS 140에 설정합니다. </li><li> 녹색 형광 단백질 (GFP) - 이득은 500 MS 140에 설정합니다. </li><li> 우리의 현미경은 세포가 사용할 수 빛의 양을 제어하는​​ 대신 회전하는 디스크보다 dimmable 램프가 있습니다. 우리는 최대 램프 강도의 90 %에 조명과 함께 실험을 실행합니다. </li></ol> 7. Apoptosis의 Inducers 및 NucView 488 Caspase - 3 기판과 세포의 치료 <ol><li> 농도는 실험 사이의 일관성 수 있도록 미리 apoptosis의 inducers 큰 주식을 준비하고 aliquots에서 그들을 동결하는 것이 중요합니다. </li><li> NucView 488 기판은 빛을 구분합니다. 알루미늄 포일로 덮여 -20 ° C에서 동결 / 해동 및 보관 튜브를 줄이기 위해 15 μL의 aliquots를 준비합니다. NucV의 노출을 줄이기 위해 가능한 한 낮은 주위 실내 조명와 함께iew 488 기판은 사전의 사용, 조명합니다. </li><li> 세포가 온도 감소에 노출되지 않도록 인큐베이터에서 빨리 문화 챔버를 검색합니다. 현미경의 환경 챔버에 문화 챔버를 삽입하고, 이동의 문화 챔버를 유지하기 위해 클램프를 사용합니다. 이 시점에서 당신은 방 불이 희미도한다. </li><li> 듀얼 레귤레이터와 5퍼센트 premixed CO 2 탱크를 켜십시오. </li><li> 10X 목적 사용, 밝은 필드 현미경을 사용하여 컴퓨터 모니터에 세포를 찾기 위해 집중. 참고 : 당신은 노출 시간을 줄이기 위해 원하는 배율로 목표에서 가장 큰 수치 조리개를 사용하고자합니다. </li><li> 세포 (우리의 경우 80 MM의 칼륨, 또는 100 MM의 글루 탐 산염)로 apoptosis의 inducers을 제공, 다음 방법 중 하나를 사용할 수 있습니다. 우리는 우리의 전형적인 문화 미디어에서 10X 집중으로 해산 KCl을 사용하여, 예를 들어 80 MM의 칼륨의 배달을 사용합니다. <ol><li> 미디어 교환 BY 느리고 지역 재관류 : - 80 MM의 칼륨을 포함하는 새로운 미디어와 문화 챔버의 교환 언론에 연동 펌프를 사용합니다. - 튜브의 한쪽 끝을은 챔버에서 미디어를 제거합니다 10 페놀없는 DMEM에 녹아있는 80 MM의 칼륨의 재고 ML, 그리고 튜브의 다른 쪽 끝을 전달합니다. - 당신은 챔버에 남아있는 미디어 칼륨의 정확한 농도를 가지고 있는지 확인하기 위해 미디어 적어도 10X 교환을 원한다. - 미디어가 교환된 후 챔버에있는 미디어 NucView 488 기판의 3 μL를 추가합니다. 섞어 피펫. </li><li> 80 MM K + 및 NucView 문화 챔버에서 미디어에 488 기판의 직접 외에도 : - 페놀없는 DMEM에 녹아있는 80 MM의 칼륨의 10X 재고 솔루션을 준비합니다. - 10X 80 MM의 칼륨 50 μL에 NucView 488 기판의 3 μL를 추가합니다. 섞어 피펫. 문화 챔버 500 μL 페놀 무료 DMEM에 추가합니다. 참고 :이 방법은당신이 성장하거나 원래의 미디어에 존재있을 수 있습니다 기타 분비 요인을 유지하거나 평가에 관심이있다면 선호. 우리는 NucView 488 기판은만큼 36 반장을 지속 실험을위한 세포 배양에 안정적인 것으로 나타났습니다 </li></ol></li></ol> 8. 라이브 세포 이미징 <ol><li> transfected 세포를 표시하는 빨간색 채널을 클릭합니다. </li><li> 선택하고 여러 transfected 세포가 열 프레임 주위에 저장하고, 이러한 &quot;XY 스테이지 포인트&quot;를 저장합니다. 컴퓨터 메모리의 양에 따라, 당신은 당신이 얻을 수있을 것입 무대 포인트의 수가 제한될 수 있습니다. </li><li> 이러한 저장 단계에서 현미경 캡처 이미지를 (밝은 필드, 빨강 채널과 녹색 채널)이하면 매 6 분 가리 킵니다. </li><li> 실험의 초기 단계 동안 표시되는 모든 녹색 얼룩 가능성이 높습니다 인해 일반적으로 transfection 및 / 또는 환경 스트레스에 이미 apoptosis를 겪고 아르 세포를 나타냅니다. Apopt실험 치료로 인한 osis이 실험에서 나중에 timepoint에 감지됩니다. </li></ol> 9. 통계 분석 <ol><li> 각 실험에 대한, 우리는 큰 데이터 세트를 효율적으로 수집하기 위해 여러 XY 포인트를 얻기위한 현미경을 프로그램입니다. 각 실험은 중복되거나 세중의에 수행되며, 데이터는 다른 요일에 수행 별도의 실험에서 컴파일됩니다. 각 데이터 집합에서, 우리는 전망의 15 분야까지 분석하고 caspase - 긍정 세포 (보기 / caspase - 양성 세포의 총수의 분야에서 세포의 총수)에 caspase - 부정적인 세포의 비율을 비교합니다. </li><li> 각 데이터 집합에서 기록 측정은 큰 샘플 집합으로 그룹화되며, 다음 하나 ANOVA 테이블 (P = 0.05가)를 사용하여 다른 비교됩니다. 우리는 각 실험의 의미 (SEM)의 표준 오류를 표시하고 어를 결정하기 위해 Tukey의 의미 비교 테스트 (P = 0.05이)를 수행하여 의미의 차이를 비교ich 트리 트먼트 서로 크게 다릅니다. </li></ol> 10. 대표 결과 우리는 NucView 488 기판이 높은 세포외 칼륨 농도와 치료를 다음과 N19 - OLG 세포 문화의 apoptosis의 증가 속도를 나타낼 수있는 방법을 설명하기위한 실험을 설명했습니다. N19 - 세포가 RFP와 함께 transfected했고, 중 3 μL NucView 488 기판 (제어), 또는 3 μL NucView 488 기판 80 밀리미터로 취급했다 [K +] (치료). 전지는 감시되었고 이미지는 신경 모욕 (그림 1A)을 포함한 연구에 적합 12 H 시간 코스를 통해 인수했다. 통제 조건에서 우리는 80 MM에 비해 apoptosis의 상당한 양을 관찰 아니 [K +] 12 H (그림 1B) 이후 약 45 %의 세포 죽음을 보여주 대우 문화 (해시 상자). 배경 녹색 신호가 관찰컨트롤 상태에서 D는 세포외 칼륨의 추가없이 apoptosis를 겪고있는 셀을 나타냅니다. 다른 상황에서 실험이 더 이상 실행하는 데 필요한 수 있지만 12 H의 시점에 의해 제어 실험 전시 apoptosis에서 세포의 거의 없음. 이미지는 10 배 목표를 사용하여 인수했다. 바 = 100 μm의. <img alt="그림 1A" src="/files/ftp_upload/3422/3422fig1.jpg" /> <img alt="그림 1B" src="/files/ftp_upload/3422/3422fig1b.jpg" /> 그림 1. N19 OLG 문화 (A) 12 H 시간 과정 실험 48 H NucView 488 기판 (녹색 채널) 3 μL와 함께 RFP - MBP (적색 채널)를 표현 후 transfection. 문화는 어느 80 mm의 최종 농도로 치료되었다 [K +] (왼쪽 패널) 또는 컨트롤 (오른쪽 패널)로 노 치료. 이미지는 6 분 간격으로 인수했고, 죽습 caspase - 3의 상당 활성화 (녹색 신호)은 관찰 수 있습니다죽습 caspase - 3 세포 (에 의한보기의 분야에서 세포의 총 수를 나누어 계산의 D 80 밀리미터로 치료 문화에 [K +] 제어 실험에 비해 세포 핵 (해시 상자) 이내. (B) 비율 caspase - 양성 세포의 총 수). 조건을 제어에 비해, 우리는 K 12 H.에 의해 + - 치료 다음과 같은 약 45 % 세포 사망을 관찰 sVideo 1. N19 - OLG 문화 12 H 시간 과정 실험 48 H 밝은 필드 이미지와 3 방법과 함께, NucView 488 기판 3 μL (녹색 채널)과 RFP - MBP (적색 채널)를 표현 후 transfection 병합된 이미지, 80 밀리미터와 치료에 따라 [K +]. sVideo 2. N19 - OLG 문화 12 H 시간 과정 실험 48 H NucView 488 기판 3 μL (녹색 채널)과 RFP - MBP (적색 채널)를 표현 후 transfection, 함께 밝은 필드 imag로초밖에와 3 방법 병합 이미지. 아무 치료 문화에 적용되지되었으며 N19 - OLGs가 80 밀리미터로 취급 셀 문화와는 달리 현미경 필드를 통해 마이 그 레이션을 볼 수 있습니다 [K +] (sVideo 1 비교).

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이 apoptosis 탐지에 사용할 수있는 유일한 형광 제품이 아니지만, NucView 488 기판을 사용하여 몇 가지 중요한 이점이 있습니다. 주요 혜택 중 하나는 대부분의 다른 제품 중 세포 용해 필요하거나 가난한 세포 투과성을 가지고 반면, 실시간으로 살고 세포에서 apoptosis를 수행하는 능력입니다. 다른 혜택은 caspase - 3 인식, 높은 세포 투자율, 낮은 세포 독성과 apoptosis의 진행과 함께 간섭없이 높은 감도를 포함합니다. 기판은 또한 그것이 죽습 때까지 낮은 배경 형광을 가지고 있으며 배경 형광을 제거 핵을갑니다. caspase - 3 인식 순서는 3 부정적인 요금을 포함하고있는 DNA - 바인딩 염색 한 긍정적인 요금이 있습니다. DEVD - NucView 488 분자 따라서 caspase가 활성화되지 않은 세포의 DNA에 대한 염료의 활성화 및 바인딩을 방지 그물 부정적인 요금을 가지고 있습니다. 엄마실험 사이 intaining 일관성이 복제 간의 의미있는 비교를 그릴 수 있도록해야합니다. 그것이 transfection의 속도에 영향을 미치는 등 일관성 유지의 주요 매개 변수 중 하나는, 세포 밀도이다. 높은 transfection 속도를 얻기 불후의 N19 - OLG 세포 배양하면 같은 HELA 또는 HEK293 같은 다른 일반적인 세포 라인보다 더 어렵습니다, 우리의 경험 12, 13, 밀도에 크게 의존합니다. 이러한 세포에 대한 최고의 transfection 효율이 Fugene HD (Roche는)를 취득하고 일반적으로 약 15 %입니다,하지만 구성에 따라 30 % 이상에 도달할 수있다. 주의 세포 계수는 일관성있는 transfection 속도를 얻기에 도움이됩니다. apoptosis의 속도를 측정하는 특히 다른 치료에서 환경 스트레스의 동일한 정도로 세포를 노출하는 것도 중요하다. 특히, 세포 transfection 시약의, 또는 빛의 노출의 양을에 노출되는 동안 시간의 길이는 중요한 환경 vari 있습니다ables 고려하고, 실험을 통해 지속적으로 유지됩니다. 우리의 어플 리케이션을 위해, 우리는 필드 수준의보기의 다수를 수집하는 것은 통계 - 중요한 비교를 만들기 위해 충분히 큰 표본 크기를 제공하는 것으로 나타났습니다 [ibid].

특정 시약 및 장비 표 <table border="1"><tr><th> 시약의 이름 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th></tr><tr><td> 라이브 세포 NucView 488 Caspase - 3 분석 키트 </td><td> Biotium </td><td> 30,029 </td></tr><tr><td> FuGENE의 HD transfection 시약 </td><td> 호슈 </td><td> 04709705001 </td></tr><tr><td> Dulbecco의 수정된 이글 중간 </td><td> Gibco </td><td> 31053-028 </td></tr><tr><td> 0.25 %의 트립신 </td><td> Gibco </td><td> 15050-065 </td></tr><tr><td> 태아 소 혈청 </td><td> Gibco </td><td> 12483-020 </td></tr><tr><td> 페니실린 / 스트렙토 마이신 </td><td> Gibco </td><td> 15140122 </td></tr><tr><td> # 1.5-25 mm 유리 coverslip </td><td> 워너 인 스트 루먼트 </td><td> 64-0715 </td></tr><tr><td> Chamlide CMB 자기 25mm에 대한 문화 챔버 coverslip </td&gt; <td> 쿼럼 기술 </td><td> CM - B - 40 </td></tr><tr><td> Cellstart 조직 문화 10cm 요리에게 </td><td> VWR </td><td> 82050-576 </td></tr><tr><td> BD 팔콘 6 - 잘 조직 문화 요리 </td><td> VWR </td><td> CA62406 - 161 </td></tr></table>

monitoring cleaved caspase-3 activity and apoptosis of immortalized oligodendroglial cells using live-cell imaging and cleaveable fluorogenic-dye substrates following potassium-induced membrane depolarization

중추 신경계는 강조하고 궁극적으로의 연결 인구와 기능의 감소로 이어질 수많은 불리한 영향을 미칠 수 신경학적인 모욕의 숫자를 경험할 수 있습니다. 손상된 axons은 차례로, astrocytes와 oligodendrocytes 8, 16을 포함하여 지원 glial 세포에 대한 모욕과 부상을 생산할 수있는 세포외 기질로 칼륨 또는 글루 탐 산염을 포함하여 흥분성의 분자를 릴리스 수 있습니다. 모욕가 지속되면 세포가 잘 설립 신호 전달의 폭포 ​​14 숫자 규제 및 활성화 프로그램 세포 사망 (apoptosis)를 받아야합니다. Apoptosis와 조직 괴사는 외상성 뇌 손상, 뇌성 국소 빈혈과 발작이 끝나면 발생할 수 있습니다. apoptotic 규정의 고전 예제 시스테인 종속 aspartate - 감독 프로 테아제, 또는 caspases의 가족입니다. caspases를 포함한 활성 프로 테아제는 만성 신경에 대한 응답으로 세포의 죽음에 연루되어있다알츠하이머 병, 헌팅턴, 그리고 다중 경화증 4, 14, 3, 11, 7을 포함한 퇴행성 질환. 이 프로토콜에서는 이러한 높은 농도 등 다양한 세포 스트레스에 노출 다음, 불후의 N19 - oligodendrocyte (OLG) 세포 배양 15, 5 caspase - 3 매개 apoptosis의 속도를 측정하는 NucView 488 caspase - 3 기판의 사용을 설명 칼륨 또는 글루 탐 산염. 조건부 - 불후의 N19 - OLG 전지 라인 (O2A의 시조를 대표) 박사는 안소니 Campagnoni (신경 과학에 대한 UCLA 시멜은 연구소) 15, 5로부터 얻은 것입니다, 그리고 이전에 myelin의 유전자 발현과 최고의 신호 전달의 분자 메커니즘을 연구하는 데 사용되었습니다 차별화 (예 : 6, 10) OLG 수 있습니다. 우리는 외인성 myelin 기본 단백질 (MBP)로 transfection에 대하여 강력한 것으로이 세포 라인을 찾았 RFP 또는 GFP (빨간색 또는 녹색 형광 단백질) 13, 중 하나에 융합 구조12. 여기, N19 - OLG 세포 문화는 9 apoptosis 유도하는 세포외 매트릭스에 axonal 누출을 모방 80 MM의 칼륨 염화물 또는 100 MM 나트륨 글루 탐 산염 중 하나와 함께 치료를했다. 우리는 DEVD (ASP - GLU - 발 - ASP) caspase - 3 인식 subunit와 DNA 결합 염료 2를 포함하는 이중 기능성 caspase - 3 기판을 사용. 기판을 신속하게 그것이 세포내 caspase - 3에 의해 죽습니다 세포질로 들어간다. 염료, NucView 488가 발표하고 apoptosis 신호, 488 NM에서 DNA와 fluoresces 녹색 바인딩 위치를 세포 핵을 입력합니다. NucView 488 caspase - 3 기판의 사용은 실시간 1, 10에 살고있는 세포 이미징을 허용합니다. 이 비디오에서는, 우리는 또한 culturing 및 transfection 불후의 N19 - OLG의 세포뿐만 아니라 라이브 세포 이미징 기술을 설명합니다.

Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Cleaved Caspase-3 Activity and Apoptosis of Immortalized Oligodendroglial Cells using Live-cell Imaging and Cleaveable Fluorogenic-dye Substrates F

Monitoring Cleaved Caspase-3 Activity and Apoptosis of Immortalized Oligodendroglial Cells using Live-cell Imaging and Cleaveable Fluorogenic-dye Substrates Following Potassium-induced Membrane Depola

불후의 N19 - oligodendrocyte 세포 문화에 caspase - 3의 중재 apoptosis의 라이브 세포 이미징의를 사용하여<em&gt; NucView</em&gt; 488 caspase - 3 기판. 이 기술은 세포 유형과 조직의 다양한 실시간으로 프로그램된 세포 사망 assays에 대해 적용됩니다.

모니터링 죽습 Caspase - 3 활동 및 칼륨 - 유도 막 탈분극 다음 라이브 세포 이미징 및 Cleaveable 형광 염색 기판을 사용하여 불후의 Oligodendroglial 세포의 Apoptosis

The central nervous system can experience a number of stresses and neurological insults, which can have numerous adverse effects that ultimately lead to a ...

monitoring-cleaved-caspase-3-activity-apoptosis-immortalized

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Monitoring Cleaved Caspase-3 Activity and Apoptosis of Immortalized Oligodendroglial Cells using Live-cell Imaging and Cleaveable Fluorogenic-dye Substrates Following Potassium-induced Membrane Depolarization

15.8K 조회수.  University of Guelph. 불후의 N19 - oligodendrocyte 세포 문화에 caspase - 3의 중재 apoptosis의 라이브 세포 이미징의를 사용하여 NucView 488 caspase - 3 기판. 이 기술은 세포 유형과 조직의 다양한 실시간으로 프로그램된 세포 사망 assays에 대해 적용됩니다.

비디오: Monitoring Cleaved Caspase-3 Activity and Apoptosis of Immortalized Oligodendroglial Cells using Live-cell Imaging and Cleaveable Fluorogenic-dye Substrates Following Potassium-induced Membrane Depola

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding fundamental biological mechanisms. Striking progress has been particularly evident in Drosophila, whose extensive toolkit of mutants and transgenic lines provides a convenient model to study evolutionarily-conserved developmental and cell biological mechanisms. We are interested in understanding the mechanisms that control cell fate specification in the adult peripheral nervous system (PNS) in Drosophila. Bristles that cover the head, thorax, abdomen, legs and wings of the adult fly are individual mechanosensory organs, and have been studied as a model system for understanding mechanisms of Notch-dependent cell fate decisions. Sensory organ precursor (SOP) cells of the microchaetes (or small bristles), are distributed throughout the epithelium of the pupal thorax, and are specified during the first 12 hours after the onset of pupariation. After specification, the SOP cells begin to divide, segregating the cell fate determinant Numb to one daughter cell during mitosis. Numb functions as a cell-autonomous inhibitor of the Notch signaling pathway.
Here, we show a method to follow protein dynamics in SOP cell and its progeny within the intact pupal thorax using a combination of tissue-specific Gal4 drivers and GFP-tagged fusion proteins 1,2.This technique has the advantage over fixed tissue or cultured explants because it allows us to follow the entire development of an organ from specification of the neural precursor to growth and terminal differentiation of the organ. We can therefore directly correlate changes in cell behavior to changes in terminal differentiation. Moreover, we can combine the live imaging technique with mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) system to assess the dynamics of tagged proteins in mitotic SOPs under mutant or wildtype conditions. Using this technique, we and others have revealed novel insights into regulation of asymmetric cell division and the control of Notch signaling activation in SOP cells (examples include references 1-6,7 ,8).

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

In this video, we describe a method for live cell imaging of asymmetrically dividing sensory organ progenitor cells and epidermal cells in intact Drosophila pupae

손상의 감각 오르간 전구체 세포 라이브 셀 이미징 Drosophila Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

연구

신경과학

Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis. Retrieved SVs are then refilled with neurotransmitter and rejoin the recycling pool, defined as SVs that are available for exocytosis1,2. The recycling pool can generally be subdivided into two distinct pools - the readily releasable pool (RRP) and the reserve pool (RP). As their names imply, the RRP consists of SVs that are immediately available for fusion while RP SVs are released only during intense stimulation1,2. It is important to have a reliable assay that reports the differential replenishment of these SV pools in order to understand 1) how SVs traffic after different modes of endocytosis (such as clathrin-dependent endocytosis and activity-dependent bulk endocytosis) and 2) the mechanisms controlling the mobilisation of both the RRP and RP in response to different stimuli.
FM dyes are routinely employed to quantitatively report SV turnover in central nerve terminals3-8. They have a hydrophobic hydrocarbon tail that allows reversible partitioning in the lipid bilayer, and a hydrophilic head group that blocks passage across membranes. The dyes have little fluorescence in aqueous solution, but their quantum yield increases dramatically when partitioned in membrane9. Thus FM dyes are ideal fluorescent probes for tracking actively recycling SVs. The standard protocol for use of FM dye is as follows. First they are applied to neurons and are taken up during endocytosis (Figure 1). After non-internalised dye is washed away from the plasma membrane, recycled SVs redistribute within the recycling pool. These SVs are then depleted using unloading stimuli (Figure 1). Since FM dye labelling of SVs is quantal10, the resulting fluorescence drop is proportional to the amount of vesicles released. Thus, the recycling and fusion of SVs generated from the previous round of endocytosis can be reliably quantified.
Here, we present a protocol that has been modified to obtain two additional elements of information. Firstly, sequential unloading stimuli are used to differentially unload the RRP and the RP, to allow quantification of the replenishment of specific SV pools. Secondly, each nerve terminal undergoes the protocol twice. Thus, the response of the same nerve terminal at S1 can be compared against the presence of a test substance at phase S2 (Figure 2), providing an internal control. This is important, since the extent of SV recycling across different nerve terminals is highly variable11.
Any adherent primary neuronal cultures may be used for this protocol, however the plating density, solutions and stimulation conditions are optimised for cerebellar granule neurons (CGNs)12,13.

A live fluorescence imaging technique to quantify the replenishment and mobilisation of specific synaptic vesicle (SV) pools in central nerve terminals is described. Two rounds of SV recycling are monitored in the same nerve terminals providing an internal control.

FM 염료를 사용하여 양식 소뇌 과립 뉴런에서 시냅틱 소포 풀 보충의 정량 분석

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis.  Retrieved SVs are then refilled with ...

Caspase-3 Activity in the Rat Amygdala Measured by Spectrofluorometry After Myocardial Infarction

Myocardial infarction (MI) has dramatic mid- and long-term consequences at the physiological and behavioral levels, but the mechanisms involved are still unclear. Our laboratory has developed a rat model of post-MI syndrome that displays impaired cardiac functions, neuronal loss in the limbic system, cognitive deficits and behavioral signs of depression. At the neuronal level, caspase-3 activation mediates post-MI apoptosis in different limbic regions, such as the amygdala &#8211; peaking at 3 days post-MI. Cognitive and behavioral impairments appear 2-3 weeks post-MI and these correlate statistically with measures of caspase-3 activity. The protocol described here is used to induce MI, collect amygdala tissue and measure caspase-3 activity using spectrofluorometry. To induce MI, the descending coronary artery is occluded for 40 min. The protocol for evaluation of caspase-3 activation starts 3 days after MI: the rats are sacrificed and the amygdala isolated rapidly from the brain. Samples are quickly frozen in liquid nitrogen and kept at -80 &#176;C until actual analysis. The technique performed to assess caspase-3 activation is based on cleavage of a substrate (DEVD-AMC) by caspase-3, which releases a fluorogenic compound that can be measured by spectrofluorometry. The methodology is quantitative and reproducible but the equipment required is expensive and the procedure for quantifying the samples is time-consuming. This technique can be applied to other tissues, such as the heart and kidneys. DEVD-AMC can be replaced by other substrates to measure the activity of other caspases.

Myocardial infarction (MI) is not only followed by impaired cardiac function but also by apoptosis in the amygdala, a brain region involved in the behavioral consequences of MI. This protocol describes how to induce MI, collect amygdala tissue and measure caspase-3 activity, a marker of apoptosis, therein.

심근 경색 후 Spectrofluorometry에 의해 측정 된 쥐 편도체에서 카스파 제 3 활동

Myocardial infarction (MI) has dramatic mid- and long-term consequences at the physiological and behavioral levels, but the mechanisms involved are still ...

Live-cell Measurement of Odorant Receptor Activation Using a Real-time cAMP Assay

The enormous sizes of the mammalian odorant receptor (OR) families present difficulties to find their cognate ligands among numerous volatile chemicals. To efficiently and accurately deorphanize ORs, we combine the use of a heterologous cell line to express mammalian ORs and a genetically modified biosensor plasmid to measure cAMP production downstream of OR activation in real time. This assay can be used to screen odorants against ORs and vice versa. Positive odorant-receptor interactions from the screens can be subsequently confirmed by testing against various odor concentrations, generating concentration-response curves. Here we used this method to perform a high-throughput screening of an odorous compound against a human OR library expressed in Hana3A cells and confirmed that the positively-responding receptor is the cognate receptor for the compound of interest. We found this high-throughput detection method to be efficient and reliable in assessing OR activation and our data provide an example of its potential use in OR functional studies.

Characterizing the function of odorant receptors serves an indispensable part in the deorphanization process. We describe a method to measure the activation of odorant receptors in real time using a cAMP assay.

라이브 셀 측정의 Odorant 수용 체 활성화를 사용 하 여 분석 결과 실시간 캠프

The enormous sizes of the mammalian odorant receptor (OR) families present difficulties to find their cognate ligands among numerous volatile chemicals. ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in adult mammalian animals remains elusive. In this study, we describe an experimental procedure for measuring calcium dynamics through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy. This method enables recordings and quantifications of neural activity in bilateral mouse brain regions one at a time in the same experiment for a prolonged period in vivo. Key aspects of this method, which can be completed within an hour, include minimally invasive surgery procedures for creating dual optical windows, and the use of 2P imaging. Although we only demonstrate the technique in the S1 area, the method can be applied to other regions of the living brain facilitating the elucidation of structural and functional complexities of brain neural networks.

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

We describe an experimental procedure for measuring neuronal activity through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy in vivo.

Thy1를 사용 하 여 기본 Somatosensory 피 질에서 신경 활동을 이미징-GCaMP6s 유전자 변형 쥐

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

Analyzing Neural Activity and Connectivity Using Intracranial EEG Data with SPM Software

Measuring neural activity and connectivity associated with cognitive functions at high spatial and temporal resolutions is an important goal in cognitive neuroscience. Intracranial electroencephalography (EEG) can directly record electrical neural activity and has the unique potential to accomplish this goal. Traditionally, averaging analysis has been applied to analyze intracranial EEG data; however, several new techniques are available for depicting neural activity and intra- and inter-regional connectivity. Here, we introduce two analytical protocols we recently applied to analyze intracranial EEG data using the Statistical Parametric Mapping (SPM) software: time-frequency SPM analysis for neural activity and dynamic causal modeling of induced responses for intra- and inter-regional connectivity. We report our analysis of intracranial EEG data during the observation of faces as representative results. The results revealed that the inferior occipital gyrus (IOG) showed gamma-band activity at very early stages (110 ms) in response to faces, and both the IOG and amygdala showed rapid intra- and inter-regional connectivity using various types of oscillations. These analytical protocols have the potential to identify the neural mechanisms underlying cognitive functions with high spatial and temporal profiles.

We present two analytical protocols that can be used to analyze intracranial electroencephalography data using the Statistical Parametric Mapping (SPM) software: time-frequency statistical parametric mapping analysis for neural activity, and dynamic causal modeling of induced responses for intra- and inter-regional connectivity.

신경 활동과 연결 Intracranial 뇌 파 데이터를 사용 하 여 SPM 소프트웨어 분석

Measuring neural activity and connectivity associated with cognitive functions at high spatial and temporal resolutions is an important goal in cognitive ...

ROS Live Cell Imaging During Neuronal Development

Reactive oxygen species (ROS) are well-established signaling molecules, which are important in normal development, homeostasis, and physiology. Among the different ROS, hydrogen peroxide (H2O2) is best characterized with respect to roles in cellular signaling. H2O2 has been implicated during the development in several species. For example, a transient increase in H2O2 has been detected in zebrafish embryos during the first days following fertilization. Furthermore, depleting an important cellular H2O2 source, NADPH oxidase (NOX), impairs nervous system development such as the differentiation, axonal growth, and guidance of retinal ganglion cells (RGCs) both in&#160;vivo and in vitro. Here, we describe a method for imaging intracellular H2O2 levels in cultured zebrafish neurons and whole larvae during development using the genetically encoded H2O2-specific biosensor, roGFP2-Orp1. This probe can be transiently or stably expressed in zebrafish larvae. Furthermore, the ratiometric readout diminishes the probability of detecting artifacts due to differential gene expression or volume effects. First, we demonstrate how to isolate and culture RGCs derived from zebrafish embryos that transiently express roGFP2-Orp1. Then, we use whole larvae to monitor H2O2 levels at the tissue level. The sensor has been validated by the addition of H2O2. Additionally, this methodology could be used to measure H2O2 levels in specific cell types and tissues by generating transgenic animals with tissue-specific biosensor expression. As zebrafish facilitate genetic and developmental manipulations, the approach demonstrated here could serve as a pipeline to test the role of H2O2 during neuronal and general embryonic development in vertebrates.

This protocol describes the use of a genetically encoded hydrogen peroxide (H2O2)-biosensor in cultured zebrafish neurons and larvae for assessing the physiological signaling roles of H2O2 during nervous system development. It can be applied to different cell types and modified with experimental treatments to study reactive oxygen species (ROS) in general development.

신경 발달 도중 ROS 살아있는 세포 화상 진찰

Reactive oxygen species (ROS) are well-established signaling molecules, which are important in normal development, homeostasis, and physiology. Among the ...

Microfluidics-Assisted Selective Depolarization of Axonal Mitochondria

Mitochondria are the primary suppliers of ATP (adenosine triphosphate) in neurons. Mitochondrial dysfunction is a common phenotype in many neurodegenerative diseases. Given some axons' elaborate architecture and extreme length, it is not surprising that mitochondria in axons can experience different environments compared to their cell body counterparts. Interestingly, dysfunction of axonal mitochondria often precedes effects on the cell body. To model axonal mitochondrial dysfunction in vitro, microfluidic devices allow treatment of axonal mitochondria without affecting the somal mitochondria. The fluidic pressure gradient in these chambers prevents diffusion of molecules against the gradient, thus allowing for analysis of mitochondrial properties in response to local pharmacological challenges within axons. The current protocol describes the seeding of dissociated hippocampal neurons in microfluidic devices, staining with a membrane-potential sensitive dye, treatment with a mitochondrial toxin, and the subsequent microscopic analysis. This versatile method to study axonal biology can be applied to many pharmacological perturbations and imaging readouts, and is suitable for several neuronal subtypes.

The present protocol describes the seeding and staining of neuronal mitochondria in microfluidic chambers. The fluidic pressure gradient in these chambers allows for the selective treatment of mitochondria in axons to analyze their properties in response to pharmacological challenges without affecting the cell body compartment.

축삭 미토콘드리아의 미세 유체 보조 선택적 탈분극

Mitochondria are the primary suppliers of ATP (adenosine triphosphate) in neurons. Mitochondrial dysfunction is a common phenotype in many ...

Human Microglia-like Cells: Differentiation from Induced Pluripotent Stem Cells and In Vitro Live-cell Phagocytosis Assay using Human Synaptosomes

Microglia are the resident immune cells of myeloid origin that maintain homeostasis in the brain microenvironment and have become a key player in multiple neurological diseases. Studying human microglia in health and disease represents a challenge due to the extremely limited supply of human cells. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) derived from human individuals can be used to circumvent this barrier. Here, it is demonstrated how to differentiate human iPSCs into microglia-like cells (iMGs) for in vitro experimentation. These iMGs exhibit the expected and physiological properties of microglia, including microglia-like morphology, expression of proper markers, and active phagocytosis. Additionally, documentation for isolating and labeling synaptosome substrates derived from human iPSC-derived lower motor neurons (i3LMNs) is provided. A live-cell, longitudinal imaging assay is used to monitor engulfment of human synaptosomes labeled with a pH-sensitive dye, allowing for investigations of iMG's phagocytic capacity. The protocols described herein are broadly applicable to different fields that are investigating human microglia biology and the contribution of microglia to disease.

Human Microglia-like Cells: Differentiation from Induced Pluripotent Stem Cells and In Vitro Live-cell Phagocytosis Assay using Human Synaptosomes

This protocol describes the differentiation process of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) into microglia-like cells for in vitro experimentation. We also include a detailed procedure for generating human synaptosomes from iPSC-derived lower motor neurons that can be used as a substrate for in vitro phagocytosis assays using live-cell imaging systems.

인간 미세아교세포 유사 세포: 유도만능줄기세포로부터의 분화 및 인간 시냅토좀을 이용한 체외 생세포 식균작용 분석

Microglia are the resident immune cells of myeloid origin that maintain homeostasis in the brain microenvironment and have become a key player in multiple ...

STED 현미경을 사용한 뉴런의 미토콘드리아 초세구조 규명

Using Live Cell STED Imaging to Visualize Mitochondrial Inner Membrane Ultrastructure in Neuronal Cell Models

Mitochondria play many essential roles in the cell, including energy production, regulation of Ca2+ homeostasis, lipid biosynthesis, and production of reactive oxygen species (ROS). These mitochondria-mediated processes take on specialized roles in neurons, coordinating aerobic metabolism to meet the high energy demands of these cells, modulating Ca2+ signaling, providing lipids for axon growth and regeneration, and tuning ROS production for neuronal development and function. Mitochondrial dysfunction is therefore a central driver in neurodegenerative diseases. Mitochondrial structure and function are inextricably linked. The morphologically complex inner membrane with structural infolds called cristae harbors many molecular systems that perform the signature processes of the mitochondrion. The architectural features of the inner membrane are ultrastructural and therefore, too small to be visualized by traditional diffraction-limited resolved microscopy. Thus, most insights on mitochondrial ultrastructure have come from electron microscopy on fixed samples. However, emerging technologies in super-resolution fluorescence microscopy now provide resolution down to tens of nanometers, allowing visualization of ultrastructural features in live cells. Super-resolution imaging therefore offers an unprecedented ability to directly image fine details of mitochondrial structure, nanoscale protein distributions, and cristae dynamics, providing fundamental new insights that link mitochondria to human health and disease. This protocol presents the use of stimulated emission depletion (STED) super-resolution microscopy to visualize the mitochondrial ultrastructure of live human neuroblastoma cells and primary rat neurons. This procedure is organized into five sections: (1) growth and differentiation of the SH-SY5Y cell line, (2) isolation, plating, and growth of primary rat hippocampal neurons, (3) procedures for staining cells for live STED imaging, (4) procedures for live cell STED experiments using a STED microscope&#160;for reference, and (5) guidance for segmentation and image processing using examples to measure and quantify morphological features of the inner membrane.

저자 스포트라이트: 미토콘드리아 노화 해독 

This protocol presents a workflow for the propagation, differentiation, and staining of cultured SH-SY5Y cells and primary rat hippocampal neurons for mitochondrial ultrastructure visualization and analysis using stimulated emission depletion (STED) microscopy.

신경 세포 모델에서 미토콘드리아 내막 초세구조를 시각화하기 위한 라이브 셀 STED 이미징 사용

Mitochondria play many essential roles in the cell, including energy production, regulation of Ca2+ homeostasis, lipid biosynthesis, and production of ...