우리는 기술 지원에 대 한 부인 아키코 시바타를 감사합니다. 이 작품 최고의 졸업 학교, 무거운 이온 치료제와 공학에 글로벌 리더 양성을 위한 프로그램에 대 한 교육, 문화, 스포츠, 과학, 그리고 일본의 기술에서 연구비 지원 했다.

1. 재료의 준비 <ol><li>압력솥 커버 전표.
	<ol><li>유리 비 커에 커버 전표 장소.</li>
		<li>호 유리 비 커를 커버.</li>
		<li>20 분에 대 한 15 psi에서 121 ° C에 고압</li>
		<li>문화 후드에 실 온에서 50 ° c.가 게에서 건조.</li>
	</ol></li> <li>고정 솔루션 준비: 3 %paraformaldehyde + 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)에 2% 자당.
	<ol><li>1000 mL 유리병 700 mL PBS와 30 g paraformaldehyde 추가. 
		주의: Paraformaldehyde 부식성, 적절 한 장갑을 착용 하십시오.</li>
		<li>전자 레인지를 사용 하 여 80 ° C에가 열 하 여 완전히 분해 paraformaldehyde. 
		주의: Paraformaldehyde 연기 독성, 마스크를 착용.</li>
		<li>하룻밤 실 온에 둡니다.</li>
		<li>추가 20 g 자당.</li>
		<li>1 총 볼륨을 추가 PBS L.</li>
		<li>약 수 50 ml에서 튜브입니다. -20 ° C에서 3 년 또는 4에서 3 개월간 고정 솔루션 저장 될 수 있다 ° c.</li>
	</ol></li></ol> 2. 세포 배양의 준비 참고:이 절차는 문화 후드에서 수행 되어야 합니다.
로그 성장 5를 유지 하기 위해 <ol><li>문화와 통로 U2OS 인간의 다리 셀. 
	참고: 다른 세포 유형 최적의 방사선 복용량을 결정 한 후에 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>70% 에탄올을 적신 종이 타월로 메스를 닦으십시오. 35 mm 셀 문화 접시에 커버 슬립을 배치, 메스를 사용 하 여 (이 단순히 라고도 &#34; 접시 &#34;). 
	참고: 한 접시에 커버 실수할 수는 실험에 따라 늘릴 수 있습니다 (토론 참조) 디자인.</li>
	<li>추가 1 mL 문화 미디어: 10% 태아 둔감 한 혈 청으로 보충 DMEM. 
	참고: 다른 미디어는 선택한 셀 형식을 사용할 수 있습니다.</li>
	종이 수건으로 닦아 <li>겸 70% 에탄올과 습. 커버 슬립의 중심을 잡고 부드럽게는 집게를 사용 하 여. 커버 슬립에 보류를 유지 하면서 접시에서 배양을 완전히 발음. 
	&#8203; 참고:이 단계는 접시 커버 슬립의 동원 정지 촉진.</li>
	<li>부착 배양된 세포를 트립 신 5를 사용 하 여 분리.
	<ol><li>배양 접시에서 발음.</li>
		<li>1 mL PBS를 추가 하 고 요리를 부드럽게 흔들어.</li>
		<li>접시에서 PBS 발음.</li>
		<li>1 mL의 트립 신 [0.25w/v% 트립 신-1mmol/L EDTA] 요리 추가.</li>
		<li>품 5% CO 2를 포함 하는 분위기에서 37 ° C에서 5 분.</li>
		<li>9 mL 문화 미디어 요리를 추가.</li>
		<li>1000 μ micropipette를 사용 하 여 단일 셀 서 스 펜 션 준비.</li>
	</ol></li> <li>계산 셀 5.
	<ol><li>1.5 mL 튜브에 더하고 0.9 mL 세포 현 탁 액 0.1 mL 0.4 %Trypan 블루 솔루션.</li>
		<li>는 hemocytometer 적용 10 μ.</li>
		<li>검사의 수는 반전 단계 현미경 셀 (즉, 라이브) 흠 없는.</li>
	</ol></li> <li>15ml 튜브에서 3 mL 세포 현 탁 액 0.5 x 10 5 셀/mL의 조밀도에 문화 미디어에서 준비. 
	참고: 셀 밀도 실험에 따라 수정할 수 있습니다 필요 (내용 참조).</li>
	<li>부드럽게 접시에 세포 현 탁 액의 2 개 mL를 추가.</li>
	<li>5% CO 2를 포함 하는 분위기에서 37 ° C에서 하룻밤 품.</li>
</ol> 3. 방사선 주의: 신중 하 게 제조 업체에 따라 x 선 irradiator 처리 &#39; s 지침.
<ol><li>거꾸로 위상 현미경 세포 검사. 커버 슬립 하 고 살아있는 셀 연결 되어 있는지 확인 하십시오.</li>
	<li>6 Gy 엑스레이와 접시를 비추는 (1.4 Gy/min, 300 KVP, 20 mA).</li>
	<li>품 5% CO 2를 포함 하는 분위기에서 37 ℃에서 72 h. 
	참고: 보육 시간 실험에 따라 변경 될 수 있다 (토론 참조) 디자인.</li>
</ol> 4. 고정 <ol><li>배양 접시에서 발음.</li>
	<li>사용이 위, 1000 μ micropipette의 끝을 잘라 팁 끝에서 5 mm. 
	참고: 컷된 팁 부드럽게 고정 솔루션을 적용 하는 데 도움이.</li>
	<li>접시의 측면 벽에서 접시에 1 mL (단계 1.2 준비) 고정 솔루션 컷된 팁을 사용 하 여 추가. 
	참고:이 단계 시간적 이며, 따라서 여러 샘플을 처리할 때 micropipette 팁을 변경 하지 않고 수행 되어야 한다. 접시의 바닥에 직접 고정 솔루션의 응용 프로그램은 세포를 손상 시킬 수 있습니다.</li>
	<li>광장 문화 접시에 접시를 놓습니다. 흔들어 균등 하 게 커버 슬립 고정 솔루션 배포를 부드럽게 광장 문화 접시.</li>
	<li>실 온에서 10 분 동안 품.</li>
	<li>접시에서 고정 솔루션 발음.</li>
	<li>접시의 측 벽에서 접시에 PBS의 2 개 mL를 추가. 
	참고: 응용 프로그램 PBS의 접시의 바닥을 직접 세포를 손상 시킬 수 있습니다.</li>
	<li>접시에서 PBS 발음.</li>
	<li>4.7-4.8 두 번 반복 단계. 
	참고: 접시 저장 될 수 있다 4 ° C에서 1 주 동안 2 mL PBS에에서 목욕 커버 미끄러져와.</li>
</ol> 5. DAPI 얼룩 <ol><li>슬라이드 유리, 5 μ 1 μ g/mL DAPI 얼룩 적용 시 약. 
	참고: 시 약 얼룩 DAPI는 6 개월에 대 한 안정적인 저장 될 때-20 이하로 빛 으로부터 보호 ° c.</li>
	<li>접시에서 커버 슬립을 제거, 메스를 사용 하 여.</li>
	<li>종이 타월 커버 슬립의 가장자리를 만져 커버 슬립에 초과 PBS에서 그릴.</li>
	<li>마운트 커버 슬립 DAPI 셀 DAPI 얼룩 시 약에 노출 되는 있도록 슬라이드 유리에 시 약을 얼룩의 드롭에 거꾸로. 
	참고:이 단계는 시간적. DAPI에서의 건조 시 약 얼룩 이어질 수 있는 차선의 얼룩.</li>
	<li>샘플-20에서 1 년 동안 저장 될 수 있다 ° c.</li>
</ol> 6. 이미지 수집 <ol><li>검사에는 형광 현미경 샘플. 핵 DAPI 필터를 사용 하 여 시각화 됩니다. 
	참고: 중 하나는 20 X 또는 60 X 오일 렌즈를 사용할 수 있습니다, 연구원에 따르면 &#39; s 관심. 60 X 오일 렌즈를 사용할 때 커버 슬립에 오일 한 방울을 추가 합니다. 샘플; 렌즈를 만지지 마십시오 조심 그렇지 않으면, 렌즈 손상 될 수 있습니다.</li>
	<li>다음 설정 및 매개 변수는 CCD 카메라와 디지털 이미지 수집 소프트웨어를 사용 하 여 핵의 이미지: DAPI 필터, 단층 이미지, 1 X, 및 자동 노출의 이득.</li>
	<li>완료 이미지 수집: 20 X 렌즈 렌즈 클리너 적신 종이 타월로 닦아. 클로 프롬을 적신 종이 타월로 기름 렌즈 X 60을 닦아.</li>
</ol> 7. Clonogenic 세포 죽음 모드의 평가 <ol><li>계산된 핵의 총 수는 300에 도달할 때까지 apoptosis, mitotic 재앙과 세포 노화에 대 한 기준을 충족 하는 핵의 수를 계산 하는 무작위로 선택 된 이미지에서. 각 실험 설정에 대 한 3 중에이 단계를 수행.
	<ol><li>Apoptosis에 대 한 기준: apoptotic 몸 (즉, 압축 및 조각난 핵) 6 , 7의 존재.</li>
		<li>기준 mitotic 재앙: 두 개 이상의 고유한 돌출부 또는 micronucl를 보여주는 핵의 존재이 8 , , 9 10.</li>
		<li>세포 노화에 대 한 기준: 노화 관련 heterochromatic foci (SAHF) (즉, 포함 하는 30-50, 밀도 foci 핵 DNA)의 존재 2 , 11.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Wouters, B. G., Joiner, M. C., van der Kogel, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+death+after+irradiation:+how,+when+and+why+cells+die.">Cell death after irradiation: how, when and why cells die.</a> Basic Clinical Radiobiology. 4th ed. , 27-40 (2009).</li><li>Aird, K. M., Zhang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+senescence-associated+heterochromatin+foci+(SAHF).">Detection of senescence-associated heterochromatin foci (SAHF).</a> Methods Mol. Biol. 965, 185-196 (2013).</li><li>Kobayashi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitotic+catastrophe+is+a+putative+mechanism+underlying+the+weak+correlation+between+sensitivity+to+carbon+ions+and+cisplatin.">Mitotic catastrophe is a putative mechanism underlying the weak correlation between sensitivity to carbon ions and cisplatin.</a> Sci. Rep. 7, 40588 (2017).</li><li>Amornwichet, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carbon-ion+beam+irradiation+kills+X-ray-resistant+p53-null+cancer+cells+by+inducing+mitotic+catastrophe.">Carbon-ion beam irradiation kills X-ray-resistant p53-null cancer cells by inducing mitotic catastrophe.</a> PLoS One. , 115121 (2014).</li><li>Masters, J. R., Stacey, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changing+medium+and+passaging+cell+lines.">Changing medium and passaging cell lines.</a> Nat. Protoc. 2, 2276-2284 (2007).</li><li>Sawai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effectiveness+of+sulforaphane+as+a+radiosensitizer+for+murine+osteosarcoma+cells.">Effectiveness of sulforaphane as a radiosensitizer for murine osteosarcoma cells.</a> Oncol. Rep. 29, 941-945 (2013).</li><li>Cummings, B. S., Wills, L. P., Schnellmann, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+cell+death+in+mammalian+cells.">Measurement of cell death in mammalian cells.</a> Curr. Protoc. Pharmacol. , (2012).</li><li>Oike, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C646,+a+selective+small+molecule+inhibitor+of+histone+acetyltransferase+p300,+radiosensitizes+lung+cancer+cells+by+enhancing+mitotic+catastrophe.">C646, a selective small molecule inhibitor of histone acetyltransferase p300, radiosensitizes lung cancer cells by enhancing mitotic catastrophe.</a> Radiother. Oncol. 111, 222-227 (2014).</li><li>Oike, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+synthetic+lethality-based+strategy+to+treat+cancers+harboring+a+genetic+deficiency+in+the+chromatin+remodeling+factor+BRG1.">A synthetic lethality-based strategy to treat cancers harboring a genetic deficiency in the chromatin remodeling factor BRG1.</a> Cancer Res. 73, 5508-5518 (2013).</li><li>Russo, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+in+vivo+radiosensitization+of+glioblastoma+cells+by+the+poly+(ADP-ribose)+polymerase+inhibitor+E7016.">In vitro and in vivo radiosensitization of glioblastoma cells by the poly (ADP-ribose) polymerase inhibitor E7016.</a> Clin. Cancer Res. 15, 607-612 (2009).</li><li>Di Micco, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interplay+between+oncogene-induced+DNA+damage+response+and+heterochromatin+in+senescence+and+cancer.">Interplay between oncogene-induced DNA damage response and heterochromatin in senescence and cancer.</a> Nat. Cell Biol. 13, 292-302 (2011).</li><li>Franken, N. A., Rodermond, H. M., Stap, J., Haveman, J., van Bree, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonogenic+assay+of+cells+in+vitro.">Clonogenic assay of cells in vitro.</a> Nat. Protoc. 1, 2315-2319 (2006).</li><li>Vakifahmetoglu, H., Olsson, M., Zhivotovsky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Death+through+a+tragedy:+mitotic+catastrophe.">Death through a tragedy: mitotic catastrophe.</a> Cell Death Differ. 15, 1153-1162 (2008).</li><li>Imreh, G., Norberg, H. V., Imreh, S., Zhivotovsky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+breaks+during+mitotic+catastrophe+trigger+&#947;H2AX-ATM-p53-mediated+apoptosis.">Chromosomal breaks during mitotic catastrophe trigger &#947;H2AX-ATM-p53-mediated apoptosis.</a> J. Cell Sci. 129, 1950 (2016).</li><li>Torres-Roca, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+molecular+assay+of+tumor+radiosensitivity:+a+roadmap+towards+biology-based+personalized+radiation+therapy.">A molecular assay of tumor radiosensitivity: a roadmap towards biology-based personalized radiation therapy.</a> Per. Med. 9, 547-557 (2012).</li></ol>

저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

프로토콜 내에서 중요 한 단계는 다음과 같습니다. 첫째, 세포 해야 될 성장 문화 접시에는 단층으로 다층 셀 어렵습니다 DAPI 스테인드 핵의 형태 평가 실시 하기 때문에. 2.9, 단계에서이 끝에 인큐베이터에 문화 접시의 주의 전송 것이 좋습니다; 문화 접시의 동요 문화 접시의 중앙에 세포의 농도에 이르게 중단된 셀의 소용돌이 생성 합니다. 또한, overconfluence 다층 셀 선도 피해 야 한다. 이 위해, 단계, 2.7에서에서 문화 접시에 시드 셀 수 시간과 방사선 및 고정 사이의 간격을 두 배로 하는 인구에 따라 수정할 수 있습니다. 고정 시간에 약 80의 합류는 것이 좋습니다. 둘째, 속도 고정 및 DAPI 얼룩 (즉, 4-5 단계)에서 중요 하다. 이러한 단계에 대 한 시간에 관한 간 샘플 불일치가 형태학 평가 애매 한 것이 핵에 DAPI 신호 강도 발생할 수 있습니다.
2.2 단계에서 단일 문화 접시에 커버 슬립의 수를 증가 수 있습니다; 4 덮개 미 끄 러 짐의 최대 35 mm 접시에 놓일 수 있다 그리고 더 큰 접시를 사용 하 여 수를 더 증가 될 수 있다. 여러 표지 전표 각 문화 접시에 배치 (즉, 커버 전표 관심의 여러 시간 점에서 문화 접시 하나 하나에서에서 수집 될 수 있습니다) 특정된 치료에 대 한 시간 코스 평가의 효율적인 운영 수 있습니다.
3.2 단계에서 방사선 복용량은 연구자의 관심에 따라 수정할 수 있습니다. 여러 셀 라인에 일관 된 복용량의 응용 프로그램에는 셀 라인 중 clonogenic 세포 죽음의 각 모드에 감도의 비교 수 있습니다. 다른 한편으로, 각 셀 라인에 대 한 iso clonogenic 생존 복용량의 사용 비교를 셀 라인 중 clonogenic 세포 죽음 프로필의 있습니다. Iso clonogenic 생존 복용량 clonogenic 생존 분석 결과12에의해 결정 될 수 있습니다. D10 값 10 %clonogenic 생존을 제공 하는 복용량 iso clonogenic 생존 복용량에 대 한 일반적인 끝점입니다.
3.3 단계에서 고정 하는 방사선에서 시간; 연구자의 관심에 따라 수정할 수 있습니다. 적외선 유도 된 apoptosis, mitotic 재앙과 세포 노화에 대 한 피크 시간 셀 라인 및 치료에 따라 다르기 때문에 이것이 중요 합니다. 이 문서에서는, 우리는 clonogenic 세포 죽음 프로필, 우리의 그룹에 의해 여러 연구에 따라의 초기 심사에 가장 유용할 것 이다 시간 지점으로 방사선 조사 후 72 h를 사용 하 고 다른 설명 다음과 같습니다1,2, 3 , 4 , 8 , 9: (i) X-레이-유도 된 apoptosis 단단한 종양에서 주로 설립 셀에 발생 하는 방사선 조사 후 몇 일. (두 번째 또는 세 번째에서 가장 눈에 띄게 발생 하는 암 세포에 mitotic 재앙 ii) X-레이-유도 방사선에 의해 유도 된 임시 세포 주기 검거에서 출시 후 유사 분열. 릴리스는 일반적으로 다음, 방사선 조사 후 약 24 시간 발생 반복된 mitoses 약 24 h. (iii)의 간격에 의해 X-레이-유도 세포 노화 된다 분명 후 셀 라인에 의존 간격: 2 일 후 일부 초기 사례 및 대부분의 셀 라인에 대 한 방사선 조사 후 7 일에 대 한 조사. 취득 후 clonogenic 셀의 전반적인 그림 죽음 프로필 초기 심사, 시간 과정 실험 clonogenic 세포 죽음의 상태 또는 특정 셀 라인의 각 모드에 대 한 피크 타임의 자세한 설명을 제공할 것입니다 이자4.
그 분석 결과 및 clonogenic 생존 시험을 얼룩이 지기 DAPI 방사선 민감도 평가 대 한 표준 메서드는 주목 한다. Apoptosis와 mitotic 재앙만 시간 지속. 따라서, 주어진된 시간 지점에 대 한 분석 결과 얼룩 DAPI apoptosis와 평가의 시간 지점에 mitotic 재앙을 감지 합니다. 다른 한편으로, clonogenic 생존의 결과 포인트 apoptosis와 mitotic 재앙 발생 했다 잠복기 동안 일반적으로 방사선 조사 후 10-14 일의 총 금액을 포함 하는 주어진된 시간에 시험. Apoptosis와 mitotic 재앙, 노화 세포에서 다른 문화 접시;에 남아 그들은 방사선 조사 후 시간이 지남에 따라 점차적으로 축적. 따라서, 둘 다의 결과 분석 결과 및 clonogenic 생존 시험을 얼룩이 지기 DAPI 반영 인큐베이션 기간 동안 발생 한 노화의 총 금액. 중요 한 것은, apoptosis, mitotic 혁명과 방사선에 의해 유도 된 노화의 비율이 다릅니다 널리 셀 선 및 방사선 복용량. 함께 찍은, 이론적으로, 한 시험의 결과 변환할 수 없습니다 그 다른 분석 결과에 직접.
DAPI 시험을 얼룩이 지는 몇 가지 제한이 있습니다. 첫째, mitotic 재앙 세포 죽음의 다른 모드 인지 논란이 남아 있습니다. 방사선 생물학의 분야, mitotic 재앙은 clonogenic 세포 죽음1의 다른 장치에서 IR 유도 된 세포 죽음의 주요 모드를 간주 됩니다. 다른 한편으로, 다른 그 mitotic 재앙은 세포 죽음 그러나 apoptosis와 괴 사13,14를 포함 하 여 세포 죽음 앞에 오히려 프로세스의 고유 모드 논쟁. 따라서, apoptosis와 mitotic 재앙은 어느 정도 겹칠 수 있습니다. 둘째, 이전 연구는 세포 노화 일부 세포 치료 설정2에서 SAHF의 부재에서 발생할 수 있습니다 것이 좋습니다. 각 clonogenic 셀을 위해 설계 된 현재, 다른 분석 실험에서 죽음 모드는 주어진된 실험의 결론의 견고성을 높이기 위해 사용 되어야 한다. 셋째, 시험을 얼룩이 DAPI apoptosis, mitotic 재앙, 세포 노화 (예, 괴 사 및 autophagy) 이외의 clonogenic 세포 죽음의 모드 평가 수 없습니다. 넷째, 분석 결과 종양 방사선 치료 반응의 예측으로 얼룩 DAPI 유틸리티 하지 병원에 해명 되었습니다. 이 관점에서 clonogenic 세포 죽음의 총 금액을 평가, clonogenic 생존 분석 결과 상관 관계 SF2, 셀 2 Gy와 반구의 살아남은 분수 간에 설정 된 때문에 시험을 얼룩이 DAPI에 우수한 X-레이, 그리고 방사선 치료15종양 응답. 그럼에도 불구 하 고, 그것은 데이터 수집을 위한 clonogenic 생존 분석 결과 주로 전문성의 높은 학위와는 오랜 기간 (즉, 14 일)에 대 한 요구 사항으로 인해 병원에 널리 활용 되지가 주목 된다. 비교 함으로써, DAPI 얼룩 분석 결과 대 한 절차 간단 하 고 시간이 크게 단축, 약 3-4 일, 결과를 생성. DAPI 얼룩의 유틸리티방사선 치료 종양 응답의 예언자로 서 분석 결과 가까운 장래에 병원에서 테스트 됩니다.
요약 하자면, 분석 결과 얼룩 DAPI clonogenic IR 유도 된 세포 죽음의 세 가지 주요 모드를 동시에 평가 하는 비용 효율적인 단계 분석 결과 이다. 이 이렇게 쉽게 elucidating 관심의 조건과 대상 세포에 세포 죽음의 메커니즘의 목표와 함께 다양 한 셀 라인, 치료 설정, 및 시간 포인트, clonogenic 세포 죽음의 모드에 있습니다.

이온화 방사선 (IR) clonogenic 세포 죽음의 여러 모드를 유도합니다. Clonogenic IR 유도 된 세포 죽음에 대 한 연구는 암 방사선 요법의 치료 효능을 증가 하는 방법을 개발 뿐만 아니라 정상 조직에 IR의 독성을 이해 하기 위한 중요 합니다. Apoptosis, mitotic 재앙과 세포 노화는 IR1에 의해 유도 된 clonogenic 세포 죽음의 주요 모드. Apoptosis는 DNA 손상1에 의해 시작 된 세포 죽음의 통제 모드입니다. Mitotic 재앙은 배달된 DNA 이중 가닥 나누기1에서 발생 하는 탈 선 유사 분열으로 인해 발생 하는 세포 죽음 이다. 세포 노화는 돌이킬 수 없는 세포 성장 체포2;의 상태로 정의 됩니다. 세포 노화 세포 죽음 본질적 아니다, 하지만 그것은 clonogenic 세포 죽음의 모드 때문에 노화 세포의 clonogenic 생존 곧 note.
다양 한 세포 기반 분석 실험 개별적으로 apoptosis, mitotic 재앙과 세포 노화를 평가 하기 위해 개발 되었습니다. Apoptosis 흐름 cytometry1터미널 deoxynucleotidyl 전이 효소 dUTP 닉-끝 레이블 (TUNEL) 얼룩, annexin V 얼룩, DNA 파편 분석 실험, 그리고 하위-G1 세포 주기 단계 결정으로 평가 될 수 있다. Mitotic 재앙 면역 형광 mitotic 마커, MPM2, TUNEL 염색, 전자 현미경1등에 대 한 얼룩에 의해 평가 될 수 있다. 세포 노화 노화 관련 된 β-galactosidase (SA-β-Gal) 얼룩, 성장 검거 분석 실험, 및 전자 현미경1에 의해 평가 될 수 있다. 중요 한 것은, clonogenic 세포 죽음의 우세 모드 셀 라인 및 치료 설정3,4마다 다릅니다. 따라서, 주어진된 실험 설정에 대 한 clonogenic 세포 죽음의 전반적인 프로필, 명료 하 모든 죽음의 이러한 모드를 포함 분석 하는 여러 실험 해야 합니다 실시 함께, 노동 및 비용 집중입니다.
이 문서에서 우리는 apoptosis, mitotic 혁명과 IR3,4에 의해 유도 된 세포 노화를 동시에 평가 대 한 분석 결과 신속 하 고 비용 효율적인 단계를 설명 합니다. 이 방법에서는, 커버 슬립에 성장 하는 세포는 엑스레이와 방사선 하 고 물 4', 6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI). 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여, apoptosis, mitotic 재앙과 세포 노화는 각각 식별 DAPI 스테인드 핵의 각각 특징적인 형태학에 기반. 이 방법은 다양 한 셀 라인, 치료 설정, 및 조사 대상 세포 조건에 세포 죽음의 메커니즘의 목표와 시간 포인트에서 clonogenic 세포 죽음 프로필에 대 한 심사를 포함 하 여 응용 프로그램에 대 한 도움이 될 것입니다. 관심입니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>cover slip</td>
			<td>Matsunami</td>
			<td>C013001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>84097-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphate-buffered saline</td>
			<td>Cosmo Bio</td>
			<td>16232000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scalpel</td>
			<td>Kai Medical</td>
			<td>No.20, 520-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm cell culture dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trypsin</td>
			<td>Wako</td>
			<td>201-16945</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inverted phase microscope</td>
			<td>Shimazu</td>
			<td>114-909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-ray irradiator</td>
			<td>Faxitron Bioptics</td>
			<td>Faxitron RX-650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>square culture dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>slide glass</td>
			<td>Matsunami</td>
			<td>Pro-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI staining reagent</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>8961S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fluorescence microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>ECLIPSE Ni</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fluorescence microscope DAPI filter</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>U-FUW, BP340-390, BA420IF, DM410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fluorescence microscope lens (20&#215;)</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Plan Apo &#955; 20X/0.75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fluorescence microscope lens (60&#215;, oil)</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Plan Apo &#955; 60X/1.40 oil</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oil</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>N5218600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD camera</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>DS-Qi2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>digital image acquisition software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>NIS-Elements Document</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lens cleaner</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>OT0552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chloroform</td>
			<td>Wako</td>
			<td>035-02616</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

one-step protocol for evaluation of the mode of radiation-induced clonogenic cell death by fluorescence microscopy

이온화 방사선 (IR)에 대 한 연구-유도 clonogenic 세포 죽음은 악성 종양과 정상 조직에 적외선의 효과 이해 하기 위한 중요 한. 여기, IR, 즉, apoptosis, mitotic 재앙과 세포 노화에 의해 유도 된 clonogenic 세포 죽음의 주요 모드를 동시에 평가 대 한 신속 하 고 비용 효율적인 단계 분석 결과 설명 합니다. 이 방법에서는, 커버 슬립에 성장 하는 세포는 엑스레이와 방사선 하 고 물 4', 6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI). 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여, apoptosis, mitotic 재앙과 세포 노화 식별 됩니다 DAPI 스테인드 핵의 특징적인 형태학에 따라. Apoptosis는 apoptotic 몸 (즉, 압축 및 조각난 핵)의 존재에 의해 결정 됩니다. Mitotic 재앙은 두 개 이상의 고유한 돌출부 및 micronuclei 핵의 존재에 의해 결정 됩니다. 세포 노화 노화 관련 heterochromatic foci (즉, 포함 하는 30-50, 밀도 foci 핵 DNA)의 존재에 의해 결정 됩니다. 이 방법은 쉽게 clonogenic 세포 죽음 모드 elucidating 관심의 조건과 대상 세포에 세포 죽음의 메커니즘의 목표와 함께 다양 한 셀 라인, 치료 설정, 또는 시간 포인트를 사용 하 여 화면을 실험 수 있습니다.

예를 들어, U2OS 인간 다리 셀 6 Gy 엑스레이와 치료, 72 h에 대 한 인 큐베이 팅 되었고 DAPI 얼룩이 지는 프로토콜에 따라 분석 결과를 받게. 그림 1 apoptosis, mitotic 혁명과 60 × 오일 렌즈를 사용 하 여 얻은 세포 노화와 관련 된 일반적인 핵 형태학에 대 한 확대 된 이미지를 보여줍니다. Clonogenic 세포 죽음의 각 모드에 대 한 특성 형태학에 대 한 단계 7.1.1-7.1.3를 참조 하십시오. 그림 2 20 X 렌즈를 사용 하 여 얻은 핵의 개요 이미지를 보여줍니다. 6 Gy 엑스레이와 방사선 유발 mitotic 재앙 자주, 자주, apoptosis와 세포 노화 거의. 이러한 방식으로, 낮은 배율 필드에서 검사는 주어진된 실험 설정에서 clonogenic 세포 죽음 프로필의 전체 그림을 한 눈에 파악 하 하나 수 있습니다. 그림 3 은 정량된 데이터의 그래픽 표현.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56338/56338fig1.jpg"> 
그림 1: DAPI 스테인드 핵 보여주는 apoptosis, mitotic 재앙과 세포 노화의 일반적인 형태학의 이미지를 확대. U2OS 셀 6 Gy 엑스레이 함께 조사 했다. 72 h 후 셀 고정 되었고 DAPI 스테인드. 핵 이미지 오일 렌즈 X 60을 사용 하 여 인수 했다. 눈금 막대 20 μ m =. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56338/56338fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56338/56338fig2.jpg"> 
그림 2: 개요 이미지 셀의 핵 DAPI 스테인드의 x-레이로 치료. U2OS 셀 6 Gy 엑스레이와 방사선 또는 모의 반구. 72 h 후 셀 고정 되었고 DAPI 스테인드. 핵의 이미지는 20 X 렌즈를 사용 하 여 인수 했다. 원, apoptosis; 화살표, mitotic 재앙입니다. 눈금 막대 = 50 μ m. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56338/56338fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56338/56338fig3.jpg"> 
그림 3: x-레이로 치료 하는 세포에서 유도 된 apoptosis, mitotic 재앙과 세포 노화에 대 한 정량된 데이터. U2OS 셀 6 Gy 엑스레이와 방사선 또는 모의 반구. 72 h 후 셀 고정 되었고 DAPI 스테인드. 핵의 이미지는 20 X 렌즈를 사용 하 여 인수 했다. 무작위 분야에서 총 300 핵 apoptosis (Ap), mitotic (MC), 혁명과 세포 노화 (Sns)에 대 한 평가 했다. 평가 3 중에서 수행 했다. 평균 값이 표시 됩니다, 그리고 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56338/56338fig3large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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One-step Protocol for Evaluation of the Mode of Radiation-induced Clonogenic Cell Death by Fluorescence Microscopy

형광 현미경 검사 법에 의해 방사선-유도 Clonogenic 세포 죽음의 모드의 평가 위한 1 단계 프로토콜

이온화 방사선 (IR)에 대 한 연구-유도 clonogenic 세포 죽음은 악성 종양과 정상 조직에 적외선의 효과 이해 하기 위한 중요 한. 여기, 우리는 4', 6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI)의 형태에 따라 clonogenic IR 유도 된 세포 죽음의 주요 모드를 평가 하기 위한 1 단계 분석 결과 설명-스테인드 핵 형광 현미경 검사 법에 의해 시각.

Research on ionizing radiation (IR)-induced clonogenic cell death is important for understanding the effect of IR on malignant tumors and normal tissues. ...

one-step-protocol-for-evaluation-mode-radiation-induced-clonogenic

Research

JoVE Journal

Cancer Research

11.1K 조회수.  Gunma University Graduate School of Medicine. 이온화 방사선 (IR)에 대 한 연구-유도 clonogenic 세포 죽음은 악성 종양과 정상 조직에 적외선의 효과 이해 하기 위한 중요 한. 여기, 우리는 4', 6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI)의 형태에 따라 clonogenic IR 유도 된 세포 죽음의 주요 모드를 평가 하기 위한 1 단계 분석 결과 설명-스테인드 핵 형광 현미경 검사 법에 의해 시각.

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A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG)

Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG) is a childhood brainstem tumor that carries a universally fatal prognosis. Because surgical resection is not a viable treatment strategy and biopsy is not routinely performed, the availability of patient samples for research is limited. Consequently, efforts to study this disease have been challenged by a paucity of faithful disease models. To address this need, we describe here a protocol for the rapid processing of post-mortem autopsy tissue samples in order to generate durable patient-derived cell culture models that can be used in in vitro assays or in vivo orthotopic xenograft experiments. These models can be used to screen for potential drug targets and to study fundamental pathobiological processes within DIPG. This protocol can further be extended to analyze and isolate tumor and microenvironmental cells using Fluorescence-activated Cell Sorting (FACS), which enables subsequent analysis of gene expression, protein expression, or epigenetic modifications of DNA at the bulk cell or single cell level. Finally, this protocol can also be adapted to generate patient-derived cultures for other central nervous system tumors.

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma DIPG

This protocol describes a method for the rapid processing of post-mortem diffuse intrinsic pontine glioma samples for the establishment of patient-derived cell culture models or direct characterization of tumor and microenvironmental cells.

확산 내장 뇌교 신경 교종의 신속한 사후 세포 배양을위한 프로토콜 (DIPG)

Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG) is a childhood brainstem tumor that carries a universally fatal prognosis. Because surgical resection is not a ...

연구

암 연구학

Evaluation of the Feasibility, Safety, and Accuracy of an Intraoperative High-intensity Focused Ultrasound Device for Treating Liver Metastases

Today, the only potentially curative option in patients with colorectal liver metastases is surgery. However, liver resection is feasible in less than 20% of patients. Surgery has been widely used in association with radiofrequency, cryotherapy, or microwaves to expand the number of treatments performed with a curative intent. Nevertheless, several limitations have been documented when using these techniques (i.e., a traumatic puncture of the parenchyma, a limited size of lesions, and an inability to monitor the treatment in real-time).High-intensity focused ultrasound (HIFU) technology can achieve precise ablations of biological tissues without incisions or radiation. Current HIFU devices are based on an extracorporeal approach with limited access to the liver. We have developed a HIFU device designed for intraoperative use. The use of a toroidal transducer enables an ablation rate (10 cm3&#183;min-1) higher than any other treatment and is independent of perfusion.
The feasibility, safety, and accuracy of intraoperative HIFU ablation were evaluated during an ablate-and-resect prospective study. This clinical phase I and IIa study was performed in patients undergoing hepatectomy for liver metastases. The HIFU treatment was performed on healthy tissue scheduled for resection.Liver metastases measuring less than 20 mm will be targeted during phase IIb (currently ongoing). This set-up allows the real-time evaluation of HIFU ablation while protecting participating patients from any adverse effects related to this new technique.
Fifteen patients were included in phase I&#8211;IIa and 30 HIFU ablations were safely created within 40 s and with a precision of 1&#8211;2 mm. The average dimensions of the HIFU ablations were 27.5 x 21.0 mm2, corresponding to a volume of approximately 7.5 cm3. The aim of the ongoing phase IIb is to ablate metastases of less than 20 mm in diameter with a 5 mm margin.

Here, we present an ablate-and-resect prospective study to evaluate the feasibility, safety, and accuracy of intraoperative high-intensity focused ultrasound ablation in patients undergoing hepatectomy for liver metastases.

간 전이 치료를 위한 초음파 장치 타당성, 안전, 그리고 자가 고 강도의 정확도의 평가 초점을 맞춘

Today, the only potentially curative option in patients with colorectal liver metastases is surgery. However, liver resection is feasible in less than 20% ...

Evaluation of Biomarkers in Glioma by Immunohistochemistry on Paraffin-Embedded 3D Glioma Neurosphere Cultures

Analysis of protein expression in glioma is relevant for several aspects in the study of its pathology. Numerous proteins have been described as biomarkers with applications in diagnosis, prognosis, classification, state of tumor progression, and cell differentiation state. These analyses of biomarkers are also useful to characterize tumor neurospheres (NS) generated from glioma patients and glioma models. Tumor NS provide a valuable in vitro model to assess different features of the tumor from which they are derived and can more accurately mirror glioma biology. Here we describe a detailed method to analyze biomarkers in tumor NS using immunohistochemistry (IHC) on paraffin-embedded tumor NS.

Neurospheres grown as 3D cultures constitute a powerful tool to study glioma biology. Here we present a protocol to perform immunohistochemistry while maintaining the 3D structure of glioma neurospheres through paraffin embedding. This method enables the characterization of glioma neurosphere properties such as stemness and neural differentiation.

Immunohistochemistry 파라핀 임베디드 3D Glioma Neurosphere 문화에 의해 Glioma 바이오 마커의 평가

Analysis of protein expression in glioma is relevant for several aspects in the study of its pathology. Numerous proteins have been described as ...

In Vitro Tumor Cell Rechallenge For Predictive Evaluation of Chimeric Antigen Receptor T Cell Antitumor Function

The field of chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy is rapidly advancing with improvements in CAR design, gene-engineering approaches and manufacturing optimizations. One challenge for these development efforts, however, has been the establishment of in vitro assays that can robustly inform selection of the optimal CAR T cell products for in vivo therapeutic success. Standard in vitro tumor-lysis assays often fail to reflect the true antitumor potential of the CAR T cells due to the relatively short co-culture time and high T cell to tumor ratio. Here, we describe an in vitro co-culture method to evaluate CAR T cell recursive killing potential at high tumor cell loads. In this assay, long-term cytotoxic function and proliferative capacity of CAR T cells is examined in vitro over 7 days with additional tumor targets administered to the co-culture every other day. This assay can be coupled with profiling T cell activation, exhaustion and memory phenotypes. Using this assay, we have successfully distinguished the functional and phenotypic differences between CD4+ and CD8+ CAR T cells against glioblastoma (GBM) cells, reflecting their differential in vivo antitumor activity in orthotopic xenograft models. This method provides a facile approach to assess CAR T cell potency and to elucidate the functional variations across different CAR T cell products.

Here, we describe an in vitro co-culture method to recursively challenge tumor-targeted T cells, which allows for phenotypic and functional analysis of antitumor T cell activity.

체 외 종양 세포 Rechallenge 공상 항 원 수용 체 T 세포 Antitumor 기능 예측 평가

The field of chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy is rapidly advancing with improvements in CAR design, gene-engineering approaches and ...

Assessing Cell Viability and Death in 3D Spheroid Cultures of Cancer Cells

Three-dimensional spheroids of cancer cells are important tools for both cancer drug screens and for gaining mechanistic insight into cancer cell biology. The power of this preparation lies in its ability to mimic many aspects of the in vivo conditions of tumors while being fast, cheap, and versatile enough to allow relatively high-throughput screening. The spheroid culture conditions can recapitulate the physico-chemical gradients in a tumor, including the increasing extracellular acidity, increased lactate, and decreasing glucose and oxygen availability, from the spheroid periphery to its core. Also, the mechanical properties and cell-cell interactions of in vivo tumors are in part mimicked by this model. The specific properties and consequently the optimal growth conditions, of 3D spheroids, differ widely between different types of cancer cells. Furthermore, the assessment of cell viability and death in 3D spheroids requires methods that differ in part from those employed for 2D cultures. Here we describe several protocols for preparing 3D spheroids of cancer cells, and for using such cultures to assess cell viability and death in the context of evaluating the efficacy of anticancer drugs.

Here, we present several simple methods for evaluating viability and death in 3D cancer cell spheroids, which mimic the physico-chemical gradients of in vivo tumors much better than the 2D culture. The spheroid model, therefore, allows evaluation of the cancer drug efficacy with improved translation to in vivo conditions.

암세포의 3D 스페로이드 배양에서 세포 생존력과 사망 평가

Three-dimensional spheroids of cancer cells are important tools for both cancer drug screens and for gaining mechanistic insight into cancer cell biology. ...

Characterize Disease-related Mutants of RAF Family Kinases by Using a Set of Practical and Feasible Methods

The rapidly accelerated fibrosarcoma (RAF) family kinases play a central role in cell biology and their dysfunction leads to cancers and developmental disorders. A characterization of disease-related RAF mutants will help us select appropriate therapeutic strategies for treating these diseases. Recent studies have shown that RAF family kinases have both catalytic and allosteric activities, which are tightly regulated by dimerization. Here, we constructed a set of practical and feasible methods to determine the catalytic and allosteric activities and the relative dimer affinity/stability of RAF family kinases and their mutants. Firstly, we amended the classical in vitro kinase assay by reducing the detergent concentration in buffers, utilizing a gentle quick wash procedure, and employing a glutathione S-transferase (GST) fusion to prevent RAF dimers from dissociating during purification. This enables us to measure the catalytic activity of constitutively active RAF mutants appropriately. Secondly, we developed a novel RAF co-activation assay to evaluate the allosteric activity of kinase-dead RAF mutants by using N-terminal truncated RAF proteins, eliminating the requirement of active Ras in current protocols and thereby achieving a higher sensitivity. Lastly, we generated a unique complementary split luciferase assay to quantitatively measure the relative dimer affinity/stability of various RAF mutants, which is more reliable and sensitive compared to the traditional co-immunoprecipitation assay. In summary, these methods have the following advantages: (1) user-friendly; (2) able to carry out effectively without advanced equipment; (3) cost-effective; (4) highly sensitive and reproducible.

In this article, we presented a set of practical and feasible methods for characterizing disease-related mutants of RAF family kinases, which include in vitro kinase assay, RAF co-activation assay, and complementary split luciferase assay.

실용적이고 실행 가능한 방법 세트를 사용하여 RAF 패밀리 키나아제의 질병 관련 돌연변이 특성화

The rapidly accelerated fibrosarcoma (RAF) family kinases play a central role in cell biology and their dysfunction leads to cancers and developmental ...

Characterization of the Effects of Migrastatic Inhibitors on 3D Tumor Spheroid Invasion by High-resolution Confocal Microscopy

Drug discovery and development in cancer research is increasingly being based on drug screens in a 3D format. Novel inhibitors targeting the migratory and invasive potential of cancer cells, and consequently the metastatic spread of disease, are being discovered and considered as complementary treatments in highly invasive cancers such as gliomas. Thus, generating data enabling the detailed analyses of cells in a 3D environment following the addition of a drug is required. The methodology described here, combining spheroid invasion assays with high-resolution image capture and data analysis by confocal laser scanning microscopy (CLSM), enabled detailed characterization of the effects of the potential anti-migratory inhibitor MI-192 on glioma cells. Spheroids were generated from cell lines for invasion assays in low adherent 96-well plates and then prepared for CLSM analysis. The described workflow was preferred over other commonly used spheroid-generating techniques due to both ease and reproducibility. This, combined with the enhanced image resolution attained by confocal microscopy compared to conventional wide-field approaches, allowed the identification and analysis of distinct morphological changes in migratory cells in a 3D environment following treatment with the migrastatic drug MI-192.

The effects of migrastatic inhibitors on glioma cancer cell migration in three-dimensional (3D) invasion assays using a histone deacetylase (HDAC) inhibitor are characterized by high-resolution confocal microscopy.

고분해능 공초점 현미경검사법에 의한 3D 종양 스페로이드 침습에 대한 Migrastatic 억제제의 특성화

Drug discovery and development in cancer research is increasingly being based on drug screens in a 3D format. Novel inhibitors targeting the migratory and ...

Evaluating Cell Death Using Cell-Free Supernatant of Probiotics in Three-Dimensional Spheroid Cultures of Colorectal Cancer Cells

This manuscript describes a protocol to evaluate cancer cell deaths in three dimensional (3D) spheroids of multicellular types of cancer cells using supernatants from Lactobacillus fermentum cell culture, considered as probiotics cultures. The use of 3D cultures to test Lactobacillus cell-free supernatant (LCFS) are a better option than testing in 2D monolayers, especially as L. fermentum can produce anti-cancer effects within the gut. L. fermentum supernatant was identified to possess increased anti-proliferative effects against several colorectal cancer (CRC) cells in 3D culture conditions. Interestingly, these effects were strongly related to the culture model, demonstrating the notable ability of L. fermentum to induce cancer cell death. Stable spheroids were generated from diverse CRCs (colorectal cancer cells) using the protocol presented below. This protocol of generating 3D spheroid is time saving and cost effective. This system was developed to easily investigate the anti-cancer effects of LCFS in multiple types of CRC spheroids. As expected, CRC spheroids treated with LCFS strongly induced cell death during the experiment and expressed specific apoptosis molecular markers as analyzed by qRT-PCR, western blotting, and FACS analysis. Therefore, this method is valuable for exploring cell viability and evaluating the efficacy of anti-cancer drugs.

Here methods are presented to understand anti-cancer effects of Lactobacillus cell-free supernatant (LCFS). Colorectal cancer cell lines show cell deaths when treated with LCFS in 3D cultures. The process of generating spheroids can be optimized depending on the scaffold and the analysis methods presented are useful for evaluating the involved signaling pathways.

대장암세포의 3차원 스페로이드 배양에서 프로바이오틱스의 세포없는 슈퍼네탄을 사용하여 세포 사멸 평가

This manuscript describes a protocol to evaluate cancer cell deaths in three dimensional (3D) spheroids of multicellular types of cancer cells using ...

Detection of Cell-Free DNA in Blood Plasma Samples of Cancer Patients

Identifying mutations in tumors of cancer patients is a very important step in disease management. These mutations serve as biomarkers for tumor diagnosis as well as for the treatment selection and its response in cancer patients. The current gold standard method for detecting tumor mutations involves a genetic test of tumor DNA by means of tumor biopsies. However, this invasive method is difficult to be performed repeatedly as a follow-up test of the tumor mutational repertoire. Liquid biopsy is a new and emerging technique for detecting tumor mutations as an easy-to-use and non-invasive biopsy approach.
Cancer cells multiply rapidly. In parallel, numerous cancer cells undergo apoptosis. Debris from these cells are released into a patient&#8217;s circulatory system, together with finely fragmented DNA pieces, called cell-free DNA (cfDNA) fragments, which carry tumor DNA mutations. Therefore, for identifying cfDNA based biomarkers using liquid biopsy technique, blood samples are collected from the cancer patients, followed by the separation of plasma and buffy coat. Next, plasma is processed for the isolation of cfDNA, and the respective buffy coat is processed for the isolation of a patient&#39;s genomic DNA. Both nucleic acid samples are then checked for their quantity and quality; and analyzed for mutations using next-generation sequencing (NGS) techniques.
In this manuscript, we present a detailed protocol for liquid biopsy, including blood collection, plasma, and buffy coat separation, cfDNA and germline DNA extraction, quantification of cfDNA or germline DNA, and cfDNA fragment enrichment analysis.

In this paper we present a detailed protocol for non-invasive liquid biopsy technique, including blood collection, plasma and buffy coat separation, cfDNA and germline DNA extraction, quantification of cfDNA or germline DNA, and cfDNA fragment enrichment analysis.

암 환자의 혈장 샘플에서 세포없는 DNA 의 검출

Identifying mutations in tumors of cancer patients is a very important step in disease management. These mutations serve as biomarkers for tumor diagnosis ...

In Vitro Evaluation of Oncogenic Transformation in Human Mammary Epithelial Cells

Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile conditions. Different tests seek to identify and quantify these hallmarks of cancerous cells; however, they often focus on a single aspect of cellular transformation and, in fact, multiple tests are required for their proper characterization. The purpose of this work is to provide researchers with a set of tools to assess cellular transformation in vitro from a broad perspective, thereby making it possible to draw sound conclusions.
A sustained proliferative signaling activation is the major feature of tumoral tissues and can be easily monitored under in vitro conditions by calculating the number of population doublings achieved over time. Besides, the growth of cells in 3D cultures allows their interaction with surrounding cells, resembling what occurs in vivo. This enables the evaluation of cellular aggregation and, together with immunofluorescent labeling of distinctive cellular markers, to obtain information on another relevant feature of tumoral transformation: the loss of proper organization. Another remarkable characteristic of transformed cells is their capacity to grow without attachment to other cells and to the extracellular matrix, which can be evaluated with the anchorage assay.
Detailed experimental procedures to evaluate cell growth rate, to perform immunofluorescent labeling of cell lineage markers in 3D cultures, and to test anchorage-independent cell growth in soft agar are provided. These methodologies are optimized for Breast Primary Epithelial Cells (BPEC) due to its relevance in breast cancer; however, procedures can be applied to other cell types after some adjustments.

This protocol provides experimental in vitro tools to evaluate the transformation of human mammary cells. Detailed steps to follow-up cell proliferation rate, anchorage-independent growth capacity, and distribution of cell lineages in 3D cultures with basement membrane matrix are described.